CN109511704A - 一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，包括以下步骤：将柿子经过CO2或乙醇处理后打浆，制得果汁，加入低碳醇或丙酮处理得到沉淀物；再加入果胶酶或果胶复合酶酶解，再经过纯化、浓缩、干燥得到柿子多酚产品。本发明采用脱苦脱涩的原料进行酶处理，去除了传统多酚类的苦涩味，显著提升了柿子多酚提取率，具有良好的工业化应用前景；所制得柿子多酚是一种具有全新骨架结构的多酚类物质，具有高α‑葡萄糖基水解酶、α‑淀粉酶抑制活性，可以阻断人体所摄入淀粉等食物在体内被α‑淀粉水解酶及α‑葡萄糖甙水解酶水解为葡萄糖，具有传统多酚的抗氧化活性以及类似于西药阿卡波糖的强降糖作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法及其应用。
背景技术
柿子隶属柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros L.f.)多年生落叶果树,原产我国。我国五大水果(葡萄、柑桔、香蕉、苹果、柿子)之一。成熟季节在十月左右，果实形状较多，如球形、扁桃、近似锥形、方形等，不同的品种颜色从浅橘黄色到深橘红色不等，大小从2厘米到10厘米，重量从100克到450克。
目前关于植物中多酚成分的提取、纯化与分离的研究有大量的文献报道，从柿子中提取总多酚的研究也见报道。
如：Gorinstein等采用95％乙醇(v/v)按照12.5：1的液固比匀浆柿果1min后水浴提取柿子多酚，得率为1.45mg/(100g Fw)；Suzlll等采用80℃蒸馏水，经90min提取后，加入同体积的氯仿萃取，将水相再用乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯相再经浓缩、干燥得到柿子多酚提取物；顾海峰等采用含1％盐酸(v/v)的无水甲醇于90℃提取后减压浓缩得到柿子多酚。
又如：中国专利CN104435061B“一种从柿子中提取柿子多酚的方法”，其包括下述步骤：1)原料处理：将七八分成熟的柿子清洗、破碎；2)超高压处理：破碎后的柿子中加入5～10倍重量份的纯净水，压力350MPa，作用温度40～50℃，超高压处理2～5min；3)超声波处理：将步骤2)得到溶液，超声波处理5～10min，作用温度40～50℃，功率为300W；4)萃取：将步骤3)得到溶液过滤，用与滤液等体积的乙酸乙酯进行反复萃取，直至乙酸乙酯相中无色，收集合并乙酸乙酯相；5)干燥：将步骤4)得到的乙酸乙酯相浓缩，以不高于40℃的条件下蒸发除去乙酸乙酯相中的乙酸乙酯，得到柿子多酚。
本发明人前期申请的中国专利CN100425605C“一种从柿子中提取柿子多酚的方法”，该方法以柿子为原料，经提取溶媒提取、浓缩、分离纯化、干燥提取柿子多酚的方法，它以水或低碳醇如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等作为溶媒；提取的方法采用水或低碳醇加热提取，也可以采用超声波提取、或者微波提取；分离纯化可以采用柱层析分离纯化。
上述传统的柿子多酚的提取工艺一般是采用苦涩未成熟的果实或果皮作为原料，用乙醇提取后，过大孔吸附树脂进行纯化得到多酚类产品。此类柿子多酚产品味苦涩，具备传统多酚的性质，由于其浓烈的苦涩味而影响了产品的广泛应用。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供了一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法及其应用，本发明通过创新工艺及技术改进，采用脱苦脱涩的原料进行提取，而且过程中还去除了醇可溶性苦涩多酚类物质，通过果胶酶处理，凝胶柱层析，得到一种全新骨架结构的多酚类物质，跟传统多酚比较，它没有苦涩味，具有传统多酚的抗氧化活性以及高效的降糖作用，而且现有的专利和已公开发表的论文均没有报道，属首次公开发明创造，具有更加广泛的市场应用空间。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
1.一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将柿子通入CO2或加入乙醇处理；
2)将步骤1)所得柿子打浆，取果汁，加低碳醇或丙酮，收集沉淀物；
3)将步骤2)所得沉淀物加水搅拌均匀，20～55℃加入果胶酶或果胶复合酶，PH值2～7，酶解1～36小时后灭活，离心过滤，得滤液；
4)滤液用树脂吸附，加有机溶剂洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥得多酚产品；
优选的，在步骤3)中，所述酶处理条件为30～50℃，PH值3～6，酶解时间5～25小时；
优选的，在步骤3)中，所述酶处理条件为43～48℃，PH值4～5，酶解时间10～15小时；
优选的，在步骤3)中，所述灭活条件为90～100℃，时间5～30分钟；
优选的，在步骤1)中，所述的柿子为具有苦涩味的新鲜柿子或柿饼；
优选的，在步骤1)中，所述CO2的体积浓度为55～75％；
优选的，在步骤1)中，所述乙醇体积浓度为20％～95％；
优选的，在步骤2)中，所述低碳醇为甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、丁醇、丁二醇、戊醇中的一种；
优选的，在步骤4)中，所述树脂为Sephadex凝胶树脂或大孔吸附树脂，
优选的，在步骤4)中，所述有机溶剂为40％～90％体积浓度的乙醇水溶液；
2.本发明还提供一种由上述制备方法制得的的柿子多酚；
3.本发明还提供一种由上述制备方法制得的柿子多酚的应用，将所述的柿子多酚用于饮品、甜品、香精香料类产品的抗氧化剂；
优选的，将柿子多酚应用于减肥/控糖代餐类产品；
优选的，所述的减肥/代餐类产品为功能性饮料、饼干、酸奶、蛋糕、方便面、功能性食品、巧克力、烘培点心、谷物食品、煎饼面糊、乳酸菌发酵饮料。
本发明的优点：
1.本发明采用具有苦涩味的新鲜柿子或柿饼(干柿)作为原料，通过CO2或加入乙醇处理方法去除醇可溶性苦涩多酚类物质，达到脱涩效果。
2.本发明采用脱苦脱涩的原料进行酶解，而且去除传统多酚类的苦涩味，显著提升了柿子多酚提取率，具有良好的工业化应用前景。
3.本发明通过果胶酶或果胶复合酶作用，得到一种全新骨架结构的多酚类物质，其具有如下特点：水溶性好，没有传统多酚类的苦涩味，分子结构中的取代糖基为果胶水解片段，具有高α-葡萄糖基水解酶、α-淀粉酶抑制活性，可以阻断人体所摄入淀粉等食物在体内被α-淀粉水解酶及α-葡萄糖甙水解酶水解为葡萄糖，具有传统多酚的抗氧化活性以及高效的降糖作用。
附图说明
图1本发明实施例7提取得到的多酚类物质化学结构图。
图2本发明实施例7提取得到的多酚类物质体外对α-淀粉酶的抑制活性图。
图3本发明实施例7提取得到的多酚类物质体外对α-葡萄糖甙水解酶活性抑制图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述；以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
取新鲜柿子580g，将原料放入密闭的空间，先用体积浓度为55％的CO2处理24小时脱涩，加入1000ml水打浆后，离心处理去掉不溶物得果汁，然后加入95％的乙醇到4L，室温搅拌2小时，过滤，滤液回收乙醇；离心沉淀加1000ml水悬浮溶解，调PH值为2，加入3ml果胶酶，40℃酶解3小时，然后加温灭活，冷却至室温，离心过滤，弃去沉淀，滤液过大孔吸附树脂，水洗干净后用60％的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥得产品。
实施例2
取新鲜柿子580g，将原料放入密闭的空间，先用体积浓度为20％的乙醇处理20小时脱涩，加入1000ml水打浆后，离心处理去掉不溶物得果汁，然后加入丙酮到4L，室温搅拌2小时，过滤，滤液回收乙醇；离心沉淀加1000ml水悬浮溶解，调PH值为6，加入3ml果胶复合酶，50℃酶解25小时，然后加温灭活，冷却至室温，离心过滤，弃去沉淀，滤液过大孔吸附树脂，水洗干净后用60％的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥得产品。
实施例3
选取具有苦涩味的柿子580g，将原料放入密闭的空间，通入体积浓度为75％的CO2，放置24小时处理至苦涩味消失；将处理好的柿子打浆，去掉不溶物得果汁，往果汁中加入甲醇处理，收集沉淀物；将沉淀物加水悬浮，调PH值为2，20℃加入果胶酶，酶解1小时后灭活，灭活条件为90℃，时间5分钟，冷却至室温，离心过滤，得滤液。将滤液用Sephadex凝胶色谱柱吸附，水洗干净后，用70％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，浓缩、干燥得多酚产品。
实施例4
选取具有苦涩味柿饼580g，将原料放入密闭的空间，喷洒体积浓度为95％的乙醇，放置24小时处理至苦涩味消失；将处理好的柿子打浆，去掉不溶物得果汁，往果汁中加入丙醇处理，收集沉淀物；将沉淀物加水悬浮，调PH值为7，55℃加入果胶复合酶，酶解36小时后灭活，灭活条件为100℃，时间30分钟，冷却至室温，离心过滤，得滤液，将滤液用Sephadex凝胶色谱柱吸附，水洗干净后，用90％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，浓缩、干燥得多酚产品。
实施例5
选取具有苦涩味柿饼580g，将原料放入密闭的空间，喷洒体积浓度为20％的乙醇，放置15小时处理至苦涩味消失；将处理好的柿子打浆，去掉不溶物得果汁，往果汁中加入丙二醇处理，收集沉淀物；将沉淀物加水悬浮，调PH值为4，43℃加入果胶酶，酶解10小时后灭活，灭活条件为95℃，时间20分钟，冷却至室温，离心过滤，得滤液；将滤液用大孔吸附树脂柱吸附，水洗干净后，用80％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，浓缩、干燥得多酚产品。
实施例6
选取具有苦涩味的柿子580g，将原料放入密闭的空间，喷洒体积浓度为75％的乙醇，放置24小时处理至苦涩味消失；将处理好的柿子打浆，去掉不溶物得果汁，往果汁中加入戊醇丙酮处理，收集沉淀物；将沉淀物加水悬浮，调PH值为5，48℃加入果胶复合酶，酶解15小时后灭活，灭活条件为98℃，时间25分钟，冷却至室温，离心过滤，得滤液；将滤液用大孔吸附树脂柱吸附，水洗干净后，用85％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，浓缩、干燥得多酚产品。
实施例7
选取具有苦涩味的柿子580g，将原料放入密闭的空间，喷洒体积浓度为75％的乙醇，放置24小时处理至苦涩味消失；将处理好的柿子打浆，去掉不溶物得果汁，往果汁中加入乙醇处理，收集沉淀物；将沉淀物加水悬浮，调PH值为5，45℃加入果胶酶，酶解12小时后灭活，灭活条件为100℃，时间10分钟，冷却至室温，离心过滤，得滤液；将滤液用Sephadex凝胶色谱柱吸附，水洗干净后，用80％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，浓缩、干燥得多酚产品。
实施例8
选取具有苦涩味的柿子580g，将原料放入密闭的空间，通入体积浓度为60％的CO2，放置24小时处理至苦涩味消失；将处理好的柿子打浆，去掉不溶物得果汁，往果汁中加入丙酮处理，收集沉淀物；将沉淀物加水悬浮，调PH值为3，30℃加入果胶复合酶，酶解5小时后灭活，灭活条件为92℃，时间15分钟，冷却至室温，离心过滤，得滤液；将滤液用Sephadex凝胶色谱柱吸附，水洗干净后，用85％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，浓缩、干燥得多酚产品。
对比例1～2用于评价本发明提取物柿子多酚脱苦脱涩效果
对比例1：参考中国专利CN104435061B“一种从柿子中提取柿子多酚的方法”的步骤，具体操作如下：
1)原料处理：将10kg七八分成熟的柿子清洗、破碎；2)超高压处理：破碎后的柿子中加入100kg的纯净水，压力350MPa，作用温度40℃，超高压处理5min；3)超声波处理：将步骤2)得到溶液，超声波处理5min，作用温度45℃，功率为300W；4)萃取：将步骤3)得到溶液过滤，用与滤液等体积的乙酸乙酯进行反复萃取，直至乙酸乙酯相中无色，收集合并乙酸乙酯相；5)干燥：将步骤4)得到的乙酸乙酯相浓缩，以不高于40℃的条件下蒸发除去乙酸乙酯相中的乙酸乙酯，得到柿子多酚。
对比例2：参照本发明人前期申请的中国专利CN100425605C“一种从柿子中提取柿子多酚的方法”，具体操作如下：
1)前处理：将拣选、剔除杂质后的柿子干果和鲜果破碎；2)提取：将合格的原料投入到洁净的提取罐中，加入5倍量65％(v/v)乙醇，第一次回流提取3h，从溶媒沸腾计时，控制温度80℃，保温到时，压出药液，第二次再加入3倍量65％(v/v)的乙醇回流提取2h，合并滤液；3)回收乙醇：将提取的药液抽入浓缩罐中进行减压浓缩、回收乙醇，温度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上。回收至无醇味后，将药液压入储液罐；4)加水，静置，冷却：回收乙醇的药液与原料比应控制在1∶4左右，不够则加水，静置，冷却；5)离心：将冷却的药液用离心机离心，药液应是无任何沉淀物；6)柱吸附：将离心后的药液进D101树脂柱；7)水洗：吸附完毕后，用去离子水进行水洗，水洗约2h左右。8)洗脱：用70％(v/v)乙醇进行洗脱，收集略带醇味，且洗脱液澄清，透明，收集洗脱液约是树脂量的3倍左右；9)浓缩：洗脱液进行减压浓缩，温度控制在60℃以下，真空度应控制在0.06MPa以上，浓缩至15波美度左右。10)喷雾干燥、灭菌包装。
对比例3～5用于评价本发明果胶酶或果胶复合酶处理对提取物中柿子多酚的影响。
对比例3
以纤维素酶取代了本发明的果胶酶或果胶复合酶，酶最适合反应条件参考纤维素酶，其它步骤同实施例7，具体操作如下：
选取具有苦涩味的柿子580g，将原料放入密闭的空间，喷洒体积浓度为75％的乙醇，放置24小时处理至苦涩味消失；将处理好的柿子打浆，去掉不溶物得果汁，往果汁中加入乙醇处理，收集沉淀物；将沉淀物加水悬浮，50℃加入纤维素酶，酶解12小时后灭活，灭活条件为100℃，时间10分钟，冷却至室温，离心过滤，得滤液；将滤液用Sephadex凝胶色谱柱吸附，水洗干净后，用80％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，浓缩、干燥得多酚产品1.3g。
对比例4
以半纤维素酶取代了本发明的果胶酶或果胶复合酶，酶最适合反应条件参考半纤维素酶，其它步骤同实施例7，具体操作如下：
选取具有苦涩味的柿子580g，将原料放入密闭的空间，喷洒体积浓度为75％的乙醇，放置24小时处理至苦涩味消失；将处理好的柿子打浆，去掉不溶物得果汁，往果汁中加入乙醇处理，收集沉淀物；将沉淀物加水悬浮，55℃加入半纤维素酶，酶解12小时后灭活，灭活条件为100℃，时间10分钟，冷却至室温，离心过滤，得滤液；将滤液用Sephadex凝胶色谱柱吸附，水洗干净后，用80％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，浓缩、干燥得多酚产品1.6g。
对比例5
以角质酶取代了本发明的果胶酶或果胶复合酶，酶最适合反应条件参考角质酶，其它步骤同实施例7，具体操作如下：
选取具有苦涩味的柿子580g，将原料放入密闭的空间，喷洒体积浓度为75％的乙醇，放置24小时处理至苦涩味消失；将处理好的柿子打浆，去掉不溶物得果汁，往果汁中加入乙醇处理，收集沉淀物；将沉淀物加水悬浮，45℃加入角质酶，酶解12小时后灭活，灭活条件为100℃，时间10分钟，冷却至室温，离心过滤，得滤液；将滤液用Sephadex凝胶色谱柱吸附，水洗干净后，用80％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，浓缩、干燥得多酚产品1.5g。
结果与分析
1、柿子多酚提取效率
将各个实施例中提取物的重量进行统计，计算最终产品的提取率、提取物中多酚含量，具体结果如下：
表1柿子多酚提取效果表
本发明通过果胶酶或果胶复合酶高效作用，与对比例3～5采用纤维素酶、半纤维素酶、角质酶等对比，本发明的柿子多酚提取率为对比例3～5的3倍以上，柿子多酚含量也显著高于对比例，提高了柿子多酚产品得率，具有良好的工业化应用前景。
2、柿子多酚脱涩效果
将98％含量的茶多酚配成浓度为1.0mg/ml的液体，把此浓度的参比样品的苦涩度定为10度，把各实施例所得柿子多酚配成相同浓度，通过采用了食品领域常规味道的评定方法，采用100人次的以10份制为满分的评价打分并取平均值，通过合适数量如高达百人的综合评价，而取得了客观的评定结果，从而实现对相关产品的苦涩度做一个盲测，具体结果如表2。
表2各实施例柿子多酚苦涩味比较
苦涩感的评定分数越低，则意味着苦涩感越低，苦涩感越不容易感觉。上述测试结果表明，本发明方法所得到的柿子多酚没有明显的传统多酚类的苦涩味，低浓度时，人基本感知不出苦涩味，且操作方法简单，用途广泛，值得推广和使用。
3、柿子多酚降糖及减肥应用研究
将各实施例及对比例中所取得的样品用乙醇溶解，用磷酸盐缓冲液稀释成不同浓度的待测液，储存于-20℃冰箱备用，阿卡波糖和茶黄素为阳性对照。取1g鼠小肠丙酮粉用10mL0.9％NaCl溶解，依次进行超声(1min×3)，离心(3000rpm
×30min)处理，取上清液用水稀释4倍作为酶溶液备用。蔗糖、麦芽糖和样品均用100mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.9)配成所需浓度。取底物(0.2mL的3.5mM麦芽糖溶液或0.4mL的56mM蔗糖溶液)于10mL比色管中，加入50μL待测液，于37℃的水浴中孵育5min。然后，添加0.2mL酶溶液，37℃继续反应20min。最后，将比色管放入沸水浴，5min进行灭酶。冷却后用葡萄糖检测试剂盒检测样品吸光度。以阿卡波糖和茶黄素为阳性对照，同时设定空白组(缓冲液+酶液+底物)，空白对照组(缓冲液+缓冲液+底物)，样品测定组(样品+酶液+底物)，样品对照组(样品+缓冲液+底物)。
α-葡萄糖甙酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到降糖效果的物质，其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖甙酶，使淀粉分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。其活性测试原理是：对硝基苯酚-α-葡萄糖甙(pNPG)作反应底物，该底物无色，经α-葡萄糖甙酶水解后可以释放出对硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP的浓度成正比关系)。吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大，α-葡萄糖甙酶抑制剂的活性越强。
其体外对α-淀粉酶及α-葡萄糖甙水解酶的抑制活性分别见图2、图3。
柿子提取物中的主要成分为一类特殊结构的多酚，相比常规已知的多酚类化合物，它具有如下特点：水溶性好，没有传统多酚类的苦涩味，分子结构中的取代糖基为果胶水解片段，具有高α-葡萄糖基水解酶、α-淀粉酶抑制活性，可以阻断人体所摄入淀粉等食物在体内被α-淀粉水解酶及α-葡萄糖甙水解酶水解为葡萄糖，从而达到降糖及减肥的功效。
本发明其化学结构见图1，其中糖取代基为果胶酶解片段。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (14)
1.一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将柿子通入CO2或加入乙醇处理；
2)将步骤1)所得柿子打浆，取果汁，加低碳醇或丙酮，收集沉淀物；
3)将步骤2)所得沉淀物加水搅拌均匀，20～55℃加入果胶酶或果胶复合酶，PH值2～7，酶解1～36小时后灭活，离心过滤，得滤液；
4)滤液用树脂吸附，加有机溶剂洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥得多酚产品。
2.如权利要求1所述的一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述酶处理条件为30～50℃，PH值3～6，酶解时间5～25小时。
3.如权利要求2所述的一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述酶处理条件为43～48℃，PH值4～5，酶解时间10～15小时。
4.如权利要求1所述的一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述灭活条件为90～100℃，时间5～30分钟。
5.如权利要求1所述的一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述的柿子为具有苦涩味的新鲜柿子或柿饼。
6.如权利要求1所述的一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述CO2的体积浓度为55～75％。
7.如权利要求1所述的一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述乙醇体积浓度为20％～95％。
8.如权利要求1所述的一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述低碳醇为甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、丁醇、丁二醇、戊醇中的一种。
9.如权利要求1所述的一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，所述树脂为Sephadex凝胶树脂或大孔吸附树脂，
10.如权利要求1所述的一种无苦涩味的柿子多酚的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，所述有机溶剂为40％～90％体积浓度的乙醇水溶液。
11.如权利要求1～10任一所述的无苦涩味的柿子多酚的制备方法制得的柿子多酚。
12.如权利要求11所述的柿子多酚的应用，其特征在于，将所述的柿子多酚用于饮品、甜品、香精香料类产品的抗氧化剂。
13.如权利要求11所述的柿子多酚的应用，其特征在于，将柿子多酚应用于减肥/控糖代餐类产品。
14.如权利要求13所述的柿子多酚的应用，其特征在于，所述的减肥/代餐类产品为功能性饮料、饼干、酸奶、蛋糕、方便面、功能性食品、巧克力、烘培点心、谷物食品、煎饼面糊、乳酸菌发酵饮料。
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