CN115228133B - 一种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是一种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法，它包括：杂粮原料粉碎至60目以下得到杂粮粉；提取游离态多酚，得到杂粮提取液；分离杂粮提取液中游离态多酚，得到杂粮渣；连续复合酶解：将一定质量杂粮渣加入超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为4.5～5.5，加入纤维素酶，逐渐升温至45～55℃，酶解；调节酶解液pH值为6.5～8.0，加入碱性蛋白酶，将温度加热至55～65℃，继续水解，得到酶解液；灭酶；离心浓缩，干燥得到酶解结合态多酚样品。本发明避免了有机溶剂和强酸强碱残留带来的危害，所提取的结合态多酚安全无毒，酶解样品的结合态多酚提取率提高了16.5～50.2%。
Description
一、 技术领域：
本发明涉及植物多酚的提取技术，具体涉及的是连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法。
二、背景技术：
杂粮富含多种营养成分，具有多种活性功能，在调整膳食结构、防控慢性疾病和维持人体健康等方面具有重要作用。杂粮对人体健康发挥作用得益于其独特的植物化学成分。杂粮中的功能性成分主要包括多酚、糖醇、蒽醌等。多酚类物质被称为“第七类营养素”，是指分子结构中具有一个或多个酚羟基的一类植物次生代谢物的总称，包括酚酸类、黄酮类、单宁类以及花色苷类。在以往大多数的研究中，杂粮中的多酚类化合物含量通过传统有机溶剂提取后直接测定往往会被低估，那是因为多酚类化合物在自然界中通常以游离态、结合态和共轭结构这三种形式存在，传统提取和检测技术测定的大多是游离态多酚，而杂粮中发挥生物活性的多酚类化合物大多以另外两种形式存在。
结合态多酚通过共价键与植物中的蛋白质、纤维素和多糖等成分相连接，并连接在植物细胞壁组成成分上。常见的结合态酚类包括绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、没食子酸等。在人们日常食用的谷物、水果和蔬菜中含有丰富的结合态多酚。通常提取结合态多酚需要两个步骤：首先将植物原料干燥并脱脂，然后利用有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮）提取游离态多酚；然后用盐酸溶液或者氢氧化钠溶液水解残留物，释放结合态多酚，再通过有机溶液（乙酸乙酯等）萃取得到结合态多酚。此方法虽然可以得到植物中结合态的多酚，但提取过程涉及到有机溶剂和强酸强碱，加工过程污染较大。强酸强碱消化原料不仅耗时较长，而且非靶向断裂化学键，还有可能破坏多酚化合物的生物活性。因此，亟需一种加工便捷，无溶剂残留，并且能够真正有效释放杂粮中结合态多酚化合物的技术方法，来实现杂粮的高效、高质和高附加值利用。
三、发明内容：
本发明的目的是一种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法，这种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法用于解决现有技术中提取杂粮中结合态多酚时有机溶剂和强酸强碱残留带来的危害问题，所提取的结合态多酚安全无毒。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法包括如下步骤：
S1、杂粮原料粉碎：将筛选的优质杂粮原料粉碎至60目以下得到杂粮粉；
S2、提取游离态多酚，得到杂粮提取液；
S3、分离杂粮提取液中游离态多酚，得到杂粮渣；
S4、连续复合酶解：将一定质量杂粮渣加入8～10倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为4.5～5.5，按照杂粮渣质量的0.2～0.4%加入纤维素酶，逐渐升温至45～55℃，酶解时间为1.0～1.5 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为6.5～8.0，按照杂粮渣质量的0.1～0.3%加入碱性蛋白酶，将温度加热至55～65℃，继续水解1.0～1.5h，得到酶解液；
S5、灭酶：将酶解液加热至85℃，持续10～15 min进行灭酶处理；
S6、离心浓缩：将灭酶处理后的酶解液过滤，再在4000 rpm/min条件下离心10～15min，取上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到酶解结合态多酚样品。
上述方案中S1中杂粮原料为小米、苦荞、燕麦、玉米、高粱、甜荞麦、绿豆之一。
上述方案S4中纤维素酶为诺维信Celluclast 1.5 L，标称活力700 EGU/g；碱性蛋白酶为诺维信Alcalase 2.4 L FG，标称活力2.4 AU-A/g。
上述方案中S2的具体方法：在15～20℃温度条件下，将杂粮粉与预冷的体积比75%的乙醇水溶液按照质量比1:60～100混合，浸泡2～3 h，期间每隔0.5 h摇匀一次，得到杂粮提取液。
上述方案中S3的具体方法：将杂粮提取液在温度4℃，转速4000 rpm/min条件下离心10～15 min，上清液为杂粮中的游离态多酚提取液，弃去不用，将剩余残渣用超纯水反复清洗至无乙醇残留，甩干水分得到杂粮渣。
有益效果：
1. 杂粮富含多酚类化合物，但多以结合态形式存在于植物体内。本发明采用复合生物酶法提取杂粮中结合态多酚的工艺新方法，加工过程安全环保，避免了有机溶剂和强酸强碱残留带来的危害，所提取的结合态多酚安全无毒；
2. 本发明从游离态多酚提取后的杂粮渣中提取结合态多酚，不仅实现了副产物的综合利用，同时提供了一种杂粮的高附加值加工方式；
3. 本发明采用一步法对杂粮渣中的结合态多酚进行复合酶解，两种不同性质的生物酶能够实现分阶段连续酶解，同步灭酶，节约时间，提高效率，减少工序，适于连续化工业生产；
4. 本发明分别对杂粮水解样品、碱解样品和酶解样品中的总多酚含量进行了测定，分别计算了提取率。结果显示，不同品种杂粮酶解样品的结合态多酚提取率达41.1～80.5%；与不加酶相比，酶解样品的结合态多酚提取率提高了16.5～50.2%。
四、附图说明：
图1为没食子酸标准曲线。
五、具体实施方式：
实施例1：
这种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法包括如下步骤：
S1、原料粉碎：挑选成熟、颗粒饱满小米，粉碎至60目以下得到小米粉；
S2、提取游离态多酚：在20℃温度条件下，将小米粉与预冷的体积比75%的乙醇水溶液按照质量比1:100混合，浸泡3 h，期间每隔0.5 h摇匀一次，得到小米提取液；
S3、分离游离态多酚：将小米提取液在温度4℃，转速4000 rpm/min条件下离心10min，上清液为小米游离态多酚提取液，弃去不用，将剩余残渣用超纯水反复清洗至无乙醇残留，甩干水分得到小米渣；
S4、连续复合酶解：将500 g小米渣加入10倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为5.5，加入1.0 mL纤维素酶(加入纤维素酶的体积是按照杂粮渣质量的0.2～0.4%计算得到的，以下各实施例相同)，逐渐升温至55℃，酶解时间为1.0 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为7.0，加入0.5 mL碱性蛋白酶（加入碱性蛋白酶的体积是按照杂粮渣质量的0.1～0.3%计算得到的，以下各实施例相同），将温度加热至60℃，继续水解1.0h，得到酶解液。
S5、灭酶：将酶解液加热至85℃，持续10 min进行灭酶处理；
S6、离心浓缩：将灭酶后的酶解液和过滤后在4000 rpm/min条件下离心10 min，取上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到小米酶解结合态多酚样品（简称酶解样品）。
对比实验1：
测定本实施例得到的小米酶解结合态多酚样品和小米水解结合态多酚样品的总多酚含量和提取率。
取一份500 g小米渣，按照S4同样的温度和pH条件但不加酶提取小米水解结合态多酚，小米水解结合态多酚样品（简称水解样品）。
水解样品制备的具体方法为：将一定质量杂粮渣加入8～10倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为4.5～5.5，逐渐升温至45～55℃，加热时间为1.0～1.5 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为6.5～7.5，逐渐升温至55～65℃，继续加热1.0～1.5 h，然后将提取液加热至85℃，持续10～15 mim，过滤后在4000 rpm/min条件下离心10～15 min，收集上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥。
本实施例中水解样品制备的具体方法为：将500 g小米渣加入10倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为5.5，逐渐升温至55℃，加热时间为1.0 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为7.0，逐渐升温至60℃，继续加热1.0h，然后将提取液加热至85℃，持续10mim，过滤后在4000 rpm/min条件下离心10min，收集上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到小米水解结合态多酚样品。
利用氢氧化钠碱解法制备碱解结合态多酚样品（简称碱解样品）。
碱解样品制备的具体方法，将一定质量杂粮渣加入2 mol/L氢氧化钠水溶液，在充氮气条件下水解2.0 h，然后加入盐酸水溶液中和至中性，将混合物用乙酸乙酯反复提取五次，在4000 rpm/min条件下离心10 min合并上清液，将上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥。
本实施例中碱解样品的具体方法为：取一份50 g小米渣加入2 mol/L氢氧化钠水溶液，在充氮气条件下水解2.0 h，然后加入盐酸水溶液中和至中性，将混合物用乙酸乙酯反复提取五次，在4000 rpm/min条件下离心10 min合并上清液，将上清液在减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到小米碱解结合态多酚样品。
本发明测定总多酚含量的方法，包括以下主要步骤：
a、样品冻干粉用超纯水充分溶解后稀释成合适浓度样品溶液，没食子酸标准品溶液的浓度梯度分别为10 µg/mL，20 µg/mL，30 µg/mL，40 µg/mL和50 µg/mL，空白为超纯水；
b、样品溶液、没食子酸标准品溶液和空白各1.0 mL，加入福林酚试剂1.0 mL，充分混匀后，再加入2.0 mol/L氢氧化钠水溶液4.0 mL，用超纯水定容至10.0 mL，25℃避光反应1 h，在760 nm处测定吸光值，每个样品做三组平行。以吸光值为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线，参阅图1，利用绘制的标准曲线计算样品溶液的总多酚含量。
c、本发明中水解样品提取率为水解样品总多酚含量与碱解样品总多酚含量的百分比，酶解样品提取率为酶解样品总多酚含量与碱解样品总多酚含量的百分比。
然后按照上述方法分别测定样品的总多酚含量和提取率，结果显示小米水解结合态多酚提取率为14.0%，本发明酶解结合态多酚提取率41.1%，与不加酶相比，本发明复合酶解法提取的小米结合多酚提取率提高了27.1%。
实施例2：
这种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法包括如下步骤：
S1、原料粉碎：挑选成熟、颗粒饱满苦荞，粉碎至60目以下得到苦荞粉；
S2、提取游离态多酚：在20℃温度条件下，将苦荞粉与预冷的体积比75%的乙醇水溶液按照质量比1:80混合，浸泡2 h，期间每隔0.5 h摇匀一次，得到苦荞提取液；
S3、分离游离态多酚：将苦荞提取液在温度4℃，转速4000 rpm/min条件下离心15min，上清液为苦荞游离态多酚提取液，本试验弃去不用。将剩余残渣用超纯水反复清洗至无乙醇残留，甩干水分得到苦荞渣；
S4、连续复合酶解：将500 g苦荞渣加入8倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为5.0，加入1.5 mL纤维素酶，逐渐升温至45℃，酶解时间为1.5 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为6.5，加入1.0 mL碱性蛋白酶，将温度加热至65℃，继续水解1.0h。同时，另取一份500 g苦荞渣，按照同样的温度和pH条件但不加酶提取苦荞水解结合态多酚；
S5、灭酶：将酶解液加热至85℃，持续15 min进行灭酶处理；
S6、离心浓缩：过滤后在4000 rpm/min条件下离心15 min，取上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到苦荞酶解结合态多酚样品和苦荞水解结合态多酚样品。
另一份取50 g苦荞渣加入2 mol/L氢氧化钠水溶液，在充氮气条件下水解2.0 h，然后加入盐酸水溶液中和至中性，将混合物用乙酸乙酯反复提取五次，在4000 rpm/min条件下离心10 min合并上清液，将上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到苦荞碱解结合态多酚样品。
然后按照上述方法分别测定样品的总多酚含量和提取率，结果显示苦荞水解结合态多酚提取率为64.0%，酶解结合态多酚提取率80.5%，与不加酶相比，复合酶解法提取的苦荞结合态多酚提取率提高了16.5%。
实施例3：
这种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法包括如下步骤：
S1、原料粉碎：挑选成熟、颗粒饱满燕麦，粉碎至60目以下得到燕麦粉；
S2、提取游离态多酚：在15℃温度条件下，将燕麦粉与预冷的体积比75%的乙醇水溶液按照质量比1:100混合，浸泡3 h，期间每隔0.5 h摇匀一次，得到燕麦提取液；
S3、分离游离态多酚：将燕麦提取液在温度4℃，转速4000 rpm/min条件下离心15min，上清液为燕麦游离态多酚提取液，本试验弃去不用。将剩余残渣用超纯水反复清洗至无乙醇残留，甩干水分得到燕麦渣；
S4、连续复合酶解：将500 g燕麦渣加入10倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为5.5，加入2.0 mL纤维素酶，逐渐升温至45℃，酶解时间为1.5 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为7.5，加入1.5 mL碱性蛋白酶，将温度加热至55℃，继续水解1.5 h。同时，另取一份500 g燕麦渣，按照同样的温度和pH条件但不加酶提取燕麦水解结合态多酚；
S5、灭酶：将酶解液加热至85℃，持续10 min进行灭酶处理；
S6、离心浓缩：过滤后在4000 rpm/min条件下离心15 min，取上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到燕麦酶解结合态多酚样品和燕麦水解结合态多酚样品。
另一份取50 g燕麦渣加入2 mol/L氢氧化钠水溶液，在充氮气条件下水解2.0 h时，然后加入盐酸水溶液中和至中性，将混合物用乙酸乙酯反复提取五次，在4000 rpm/min条件下离心10 min合并上清液，将上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到燕麦碱解结合态多酚样品。
然后按照上述方法分别测定样品的总多酚含量和提取率，结果显示燕麦水解结合态多酚提取率为22.5%，酶解结合态多酚提取率72.7%，与不加酶相比，复合酶解法提取的燕麦结合态多酚提取率提高了50.2%。
实施例4：
这种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法包括如下步骤：
S1、原料粉碎：挑选成熟、颗粒饱满高粱，粉碎至60目以下得到高粱粉；
S2、提取游离态多酚：在15℃温度条件下，将高粱粉与预冷的体积比75%的乙醇水溶液按照质量比1:100混合，浸泡3 h，期间每隔0.5 h摇匀一次，得到高粱提取液；
S3、分离游离态多酚：将高粱提取液在温度4℃，转速4000 rpm/min条件下离心10min，上清液为高粱游离态多酚提取液，本试验弃去不用。将剩余残渣用超纯水反复清洗至无乙醇残留，甩干水分得到高粱渣；
S4、连续复合酶解：将500 g高粱渣加入10倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为5.0，加入2.0 mL纤维素酶，逐渐升温至55℃，酶解时间为1.5 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为6.5，加入1.0 mL碱性蛋白酶，将温度加热至65℃，继续水解1.0 h。同时，另取一份500 g高粱渣，按照同样的温度和pH条件但不加酶提取高粱水解结合态多酚；
S5、灭酶：将酶解液加热至85℃，持续10 min进行灭酶处理；
S6、离心浓缩：过滤后在4000 rpm/min条件下离心15 min，取上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到高粱酶解结合态多酚样品和高粱水解结合态多酚样品。
另一份取50 g高粱渣加入2 mol/L氢氧化钠水溶液，在充氮气条件下水解2.0 h，然后加入盐酸水溶液中和至中性，将混合物用乙酸乙酯反复提取五次，在4000 rpm/min条件下离心10 min合并上清液，将上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到高粱碱解结合态多酚样品。
然后按照上述方法分别测定样品的总多酚含量和提取率，结果显示高粱水解结合态多酚提取率为26.5%，酶解结合态多酚提取率46.2%，与不加酶相比，复合酶解法提取的高粱结合态多酚提取率提高了19.7%。
实施例5：
这种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法包括如下步骤：
S1、原料粉碎：挑选成熟、颗粒饱满甜荞麦，粉碎至60目以下得到甜荞麦粉；
S2、提取游离态多酚：在20℃温度条件下，将甜荞麦粉与预冷的体积比75%的乙醇水溶液按照质量比1:80混合，浸泡2 h，期间每隔0.5 h摇匀一次，得到甜荞麦提取液；
S3、分离游离态多酚：将甜荞麦提取液在温度4℃，转速4000 rpm/min条件下离心15 min，上清液为甜荞麦游离态多酚提取液，本试验弃去不用。将剩余残渣用超纯水反复清洗至无乙醇残留，甩干水分得到甜荞麦渣；
S4、连续复合酶解：将500 g甜荞麦渣加入8倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为5.5，加入1.0 mL纤维素酶，逐渐升温至50℃，酶解时间为1.0 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为7.0，加入0.5 mL碱性蛋白酶，将温度加热至60℃，继续水解1.5 h。同时，另取一份500 g甜荞麦渣，按照同样的温度和pH条件但不加酶提取甜荞麦水解结合态多酚；
S5、灭酶：将酶解液加热至85℃，持续10 min进行灭酶处理；
S6、离心浓缩：过滤后在4000 rpm/min条件下离心15 min，取上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到甜荞麦酶解结合态多酚样品和甜荞麦水解结合态多酚样品。
另一份取50 g甜荞麦渣加入2 mol/L氢氧化钠水溶液，在充氮气条件下水解2.0h，然后加入盐酸水溶液中和至中性，将混合物用乙酸乙酯反复提取五次，在4000 rpm/min条件下离心10 min合并上清液，将上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到甜荞麦碱解结合态多酚样品。
然后按照上述方法分别测定样品的总多酚含量和提取率，结果显示甜荞麦水解结合态多酚提取率为34.5%，酶解结合态多酚提取率67.9%，与不加酶相比，复合酶解法提取的甜荞麦结合态多酚提取率提高了33.4%。
实施例6：
这种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法包括如下步骤：
S1、原料粉碎：挑选成熟、颗粒饱满绿豆，粉碎至60目以下得到绿豆粉；
S2、提取游离态多酚：在15℃温度条件下，将绿豆粉与预冷的体积比75%的乙醇水溶液按照质量比1:100混合，浸泡3 h，期间每隔0.5 h摇匀一次，得到绿豆提取液；
S3、分离游离态多酚：将绿豆提取液在温度4℃，转速4000 rpm/min条件下离心15min，上清液为绿豆游离态多酚提取液，本试验弃去不用。将剩余残渣用超纯水反复清洗至无乙醇残留，甩干水分得到绿豆渣；
S4、连续复合酶解：将500 g绿豆渣加入10倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为5.0，加入1.5 mL纤维素酶，逐渐升温至45℃，酶解时间为1.0 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为7.5，加入1.5 mL碱性蛋白酶，将温度加热至65℃，继续水解1.5 h。同时，另取一份500 g绿豆渣，按照同样的温度和pH条件但不加酶提取绿豆水解结合态多酚；
S5、灭酶：将酶解液加热至85℃，持续15 min进行灭酶处理；
S6、离心浓缩：过滤后在4000 rpm/min条件下离心15 min，取上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到绿豆酶解结合态多酚样品和绿豆水解结合态多酚样品。
另一份取50 g绿豆渣加入2 mol/L氢氧化钠水溶液，在充氮气条件下水解2.0 h，然后加入盐酸水溶液中和至中性，将混合物用乙酸乙酯反复提取五次，在4000 rpm/min条件下离心10 min合并上清液，将上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到绿豆碱解结合态多酚样品。
然后按照上述方法分别测定样品的总多酚含量和提取率，结果显示绿豆水解结合态多酚提取率为42.1%，酶解结合态多酚提取率62.8%，与不加酶相比，复合酶解法提取的绿豆结合态多酚提取率提高了20.7%。
本发明为一种连续酶法提取杂粮中的结合态多酚的方法，本发明中的杂粮原料包括小米、苦荞、燕麦、玉米、高粱、甜荞麦、绿豆等杂粮，但不仅限于此。
Claims (3)
1.一种连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、杂粮原料粉碎：将筛选的优质杂粮原料粉碎至60目以下得到杂粮粉；杂粮原料为燕麦或绿豆；
S2、提取游离态多酚，得到杂粮提取液；
S3、分离杂粮提取液中游离态多酚，得到杂粮渣；
S4、连续复合酶解：将一定质量杂粮渣加入8～10倍超纯水，利用食品级柠檬酸水溶液调节pH为4.5～5.5，按照杂粮渣质量的0.2～0.4%加入纤维素酶，逐渐升温至45～55℃，酶解时间为1.0～1.5 h；然后利用食品级碳酸钠水溶液调节酶解液pH值为7.5～8.0，按照杂粮渣质量的0.1～0.3%加入碱性蛋白酶，将温度加热至55～65℃，继续水解1.0～1.5 h，得到酶解液；纤维素酶为诺维信Celluclast 1.5 L，标称活力700 EGU/g；碱性蛋白酶为诺维信Alcalase 2.4 L FG，标称活力2.4 AU-A/g；
S5、灭酶：将酶解液加热至85℃，持续10～15 min进行灭酶处理；
S6、离心浓缩：将灭酶处理后的酶解液过滤，再在4000 rpm/min条件下离心10～15min，取上清液减压浓缩至膏状，然后真空冷冻干燥得到酶解结合态多酚样品。
2.根据权利要求1所述的连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法，其特征在于：所述S2的具体方法：在15～20℃温度条件下，将杂粮粉与预冷的体积比75%的乙醇水溶液按照质量比1:60～100混合，浸泡2～3 h，期间每隔0.5 h摇匀一次，得到杂粮提取液。
3.根据权利要求2所述的连续复合酶法提取杂粮中结合态多酚的方法，其特征在于：所述S3的具体方法：将杂粮提取液在温度4℃，转速4000 rpm/min条件下离心10～15 min，上清液为杂粮中的游离态多酚提取液，弃去不用，将剩余残渣用超纯水反复清洗至无乙醇残留，甩干水分得到杂粮渣。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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