CN108864736A - 一种菜粕中提取黑色素的方法及其方法所获得的沉淀物的应用 - Google Patents

一种菜粕中提取黑色素的方法及其方法所获得的沉淀物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种菜粕中提取黑色素的方法及其方法所获得的沉淀物的应用，属于色素提取领域。该方法包括：向菜粕中加入白腐真菌或米曲霉进行发酵，得到发酵产物，将发酵产物进行烘干和粉碎，得到待提取产物；采用乙醇、盐酸和水的混合提取液对待提取产物进行浸提，待提取产物与混合提取液的料液比为1:(4～10)，盐酸的终浓度为0.5～1mol/L，乙醇的体积分数为60～80％，浸提后得到浸提产物，将浸提产物进行离心，得到上清液和沉淀物；将上清液提纯，得到黑色素。该方法使得黑色素能够与蛋白质和多糖等物质分离，从而使黑色素的提取率得到大大地提高。

Description

一种菜粕中提取黑色素的方法及其方法所获得的沉淀物的 应用
技术领域
本发明涉及色素提取领域，特别涉及一种菜粕中提取黑色素的方法及其方法所获得的沉淀物的应用。
背景技术
黑色素由吲哚类化合物或多酚类化合物组成。研究表明，黑色素具有生物农药的光保护作用、紫外吸收、清除自由基、抗病毒以及抗肿瘤等生物活性。黑色素依据产生途径可以分为天然黑色素和合成黑色素两类，相对于合成黑色素而言，天然黑色素副作用小及安全性高，被广泛应用于饮品、糖果、酒类等食品的着色和化妆品行业，有着广泛的应用前景和发展潜力。
植物黑色素作为天然黑色素的主要来源，主要存在于种子和果实的表皮组织中。菜粕是油菜籽经压榨和浸出等工艺制取分离出油脂后的残留物。菜粕来源广泛，价格低廉，且菜粕中含有大量的黑色素。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
现阶段，植物黑色素的提取方法主要包括醇溶法、碱溶酸沉法和酶解法。菜粕中的黑色素与蛋白质和多糖等物质紧密地结合在一起，使得黑色素的提取较为困难，导致提取率较低，不利于使用和商品化，大大限制了提取出的黑色素的应用范围。
发明内容
为了解决现有技术中在菜粕中提取的黑色素的提取率低的问题，本发明实施例提供了一种菜粕中提取黑色素的方法及其方法所获得的沉淀物的应用。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种菜粕中提取黑色素的方法，所述方法包括：
向菜粕中加入白腐真菌或米曲霉进行发酵，得到发酵产物，将所述发酵产物进行烘干和粉碎，得到待提取产物；
采用乙醇、盐酸和水的混合提取液对所述待提取产物进行浸提，所述待提取产物与所述混合提取液的料液比为1:(4～10)，所述盐酸在所述混合提取液中的终浓度为0.5～1mol/L，所述乙醇在所述混合提取液中的体积分数为60～80％，浸提后得到浸提产物，将所述浸提产物进行离心，得到上清液和沉淀物；
将所述上清液提纯，得到黑色素。
具体地，所述方法还包括：向所述菜粕中加入糖和水后，再加入所述白腐真菌或米曲霉进行发酵。
进一步地，所述糖为糖蜜、蔗糖或葡萄糖，所述糖的添加质量为所述菜粕质量的4～6％。
优选地，所述待提取产物与所述混合溶液的料液比为1:4。
优选地，盐酸的终浓度为0.5mol/L，乙醇的体积分数为70％。
具体地，所述白腐真菌为白腐真菌48424，所述米曲霉为米曲霉92011。
具体地，所述发酵的时间为60～84h，所述发酵的温度为25～30℃。
具体地，所述浸提的温度为40～70℃，所述浸提的时间为0.8～3h。
优选地，浸提的温度为40℃，所述浸提的时间为1h。
具体地，所述浸提时，将所述混合提取液和所述待提取产物混合后于摇床上震荡混匀，所述摇床的转速为150rpm。
具体地，按照106～107个孢子/g的接种量向所述菜粕中加入所述白腐真菌或所述米曲霉。
具体地，所述将所述上清液提纯的方法包括：将所述上清液通过旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液，将所述浓缩液利用大孔吸附树脂进行纯化，得到纯化产物，将所述纯化产物进行洗脱，得到洗脱液，将所述洗脱液再次浓缩，得到所述黑色素。
另一方面，本发明实施例提供了一种上述方法获得的沉淀物的应用，所述应用包括将所述沉淀物作为饲料。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种菜粕中提取黑色素的方法，该方法通过白腐真菌或米曲霉对菜粕进行发酵，在发酵过程中可以产生漆酶、纤维素酶和蛋白酶等胞外酶，这些胞外酶能够将发酵后的菜粕分子结构变的松散，使得黑色素能够与蛋白质和多糖等物质分离，从而使黑色素的提取率得到大大地提高，而且，黑色素与蛋白质和多糖等物质分离后，提高了提取黑色素的纯度；此外，沉淀物相比于待提取产物抗营养因子硫苷的含量降低了67.3％，且蛋白质的含量提高到了46.96％，使得提取黑色素后的沉淀物能够作为饲料使用，本发明实施例还提供了利用该方法所获得的沉淀物的应用，该沉淀物可作为饲料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提取的黑色素的紫外吸收光谱图，图中，1为黑色素标品，2为未经发酵的菜粕提取的黑色素，3为本发明实施例提取的黑色素；
图2是本发明实施例提取的黑色素的红外吸收光谱图，图中，1为黑色素标品，2为未经发酵的菜粕提取的黑色素，3为本发明实施例提取的黑色素。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明实施例提供了一种菜粕中提取黑色素的方法，该方法具体为：
称取500g菜粕，按照106～107个孢子/g的接种量向菜粕中加入白腐真菌或米曲霉于室温(25℃)下发酵72h后，得到发酵产物，将发酵产物进行烘干和粉碎，得到待提取产物。
采用乙醇、盐酸和水的混合提取液对待提取产物进行浸提，待提取产物与混合提取液的料液比为1:(4～10)，盐酸在混合提取液中的终浓度为0.5～1mol/L，乙醇在混合提取液中的体积分数为60～80％，浸提后得到浸提产物，将浸提产物进行离心，离心的转速为4000rpm，离心的时间为10min，得到上清液和沉淀物。
将该上清液进行浓缩和纯化，得到黑色素。
在本实施例中，乙醇在混合提取液中的体积分数可以为70％。乙醇在混合提取液中的体积分数对黑色素的提取率和蛋白浓度影响都较为显著。随着乙醇的体积分数的增大，两者均呈现先增后减的趋势。乙醇体积分数由40％增加至70％时，黑色素提取率逐渐上升，且在乙醇在混合提取液中的体积分数为70％时达到最大。当乙醇在混合提取液中的体积分数高于80％时，黑色素提取率减小。
在本实施例中，盐酸在混合提取液中的终浓度可以为0.5mol/L，随着盐酸在混合提取液中的终浓度的增大，黑色素的提取率和蛋白浓度均为先增后减的趋势。盐酸在混合提取液中的终浓度由0.01mol/L增加至0.5mol/L时，黑色素提取率逐渐上升，并在0.5mol/L时黑色素提取率达到峰值。当盐酸在混合提取液中的终浓度超过0.5mol/L时，黑色素提取率下降。盐酸在混合提取液中的终浓度在0.5mol/L时达到最大。
在本实施例中，待提取产物与混合提取液的料液比可以为1:(4～10)，在本实施例中，待提取产物与乙醇的料液比可以为1:4，料液比指固态的待提取产物的质量与作为浸提液的混合提取液的体积的比。随着菜粕质量的减小，黑色素的吸光值也减小，且两者呈线性关系。但是随着菜粕比例的增加，最后能得到的上清提取液的体积也逐渐减少，为了获得较高的黑色素提取率，在本实施例中选择1:4作为本实施待提取产物与混合提取液的料液比。
具体地，该方法还包括：向菜粕中加入糖和水后，再加入白腐真菌或米曲霉进行发酵。加入糖和水能够促进菜粕的发酵，利于黑色素的提取。
进一步地，糖可以为糖蜜、蔗糖或葡萄糖，糖的添加质量为菜粕质量的4～6％，水与菜粕的质量比可以为(4～6):4，在本实施例中，糖的添加质量为菜粕质量的5％，水与菜粕的质量比可以为6:4。本实施例中糖采用糖蜜，由于糖蜜溶液成本低，这样能够降低提取黑色素的成本。
在本实施例中，白腐真菌可以为白腐真菌48424(该白腐真菌48424来源于华中科技大学生命科学与技术学院)，该白腐真菌48424高产漆酶和纤维素酶等胞外酶；米曲霉可以为米曲霉92011(米曲霉92011来源于中国典型培养物保藏中心)，该米曲霉92011高产纤维素酶和蛋白酶等胞外酶。在发酵的过程中，白腐真菌48424和米曲霉92011产出的大量胞外酶能够促进发酵。
具体地，浸提的温度可以为40～70℃，浸提的时间可以为0.8～3h。在本实施例中，浸提的温度为40℃，浸提的时间为1h，该条件下能够使菜粕得到充分的浸提。当浸提的时间为0.5h时，黑色素的提取率和蛋白浓度都很低，浸提时间长于0.5h时，黑色素的提取率和蛋白浓度都升高，且在1h之后，波动不大，因此，选择浸提的时间为0.8～3h时，且黑色素的最佳浸提时间为1h，该浸提时间范围下，黑色素的提取率和蛋白浓度都较高。随着温度的上升，黑色素的提取率变化不大，但蛋白质的浓度显著上升，由8.0mg/mL增至9.6mg/mL，为了使得到的黑色素中蛋白质杂质尽可能的少，优选40℃作为浸提温度。
具体地，浸提时可以将混合提取液和待提取产物混合后于摇床上震荡混匀，摇床的转速为150rpm。这样能够使得待提取产物充分与混合提取液接触，进一步提高浸提效率。
具体地，采用60℃烘箱烘干发酵产物。采用60℃烘干能够避免烘干过程影响发酵产物的性能。
具体地，将上清液提纯的方法包括：将上清液通过旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液，将浓缩液利用DM130大孔吸附树脂进行纯化，得到纯化产物，将纯化产物进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液再次浓缩，得到黑色素。旋转蒸发可以采用旋转蒸发仪进行，旋转蒸发使得上清液受热均匀，从而减少浓缩对上清液中黑色素性能的影响。在纯化时，将浓缩液以2.5mL/min的流速通过DM130大孔吸附树脂的树脂层，再分别以浓度为95％和浓度为70％的乙醇溶液按照2.5mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液通过烘干的方式进行浓缩，即可得到黑色素。
测定本发明实施例所得的黑色素的紫外-可见光谱吸收，具体如下：
用浓度为2％的NaOH溶液分别配制浓度为1mg/mL的黑色素标品(该黑色素标品为合成黑色素)溶液、浓度为1mg/mL的未经发酵的菜粕提取的黑色素溶液和浓度为1mg/mL的本发明实施例提取的黑色素溶液，其中，未经发酵的菜粕提取的黑色素指的是菜粕未经白腐真菌或米曲霉发酵，而直接采用本发明提供的混合提取液进行浸提，且方法与本发明提供的方法相同。将黑色素标品溶液、未经发酵的菜粕提取的黑色素溶液和本发明实施例提取的黑色素溶液适当稀释并进行200～600nm波长扫描，结果如图1所示，由图1可知，三个样品均在220nm处有最大吸收峰值，即本发明实施例提取的黑色素与黑色素标品相似。由于各个样品纯度不同，所以各个样品在220nm处的吸光值存在较大差异，以黑色素标品溶液为对照，根据公式“提取黑色素纯度(％)＝提取黑色素溶液在220nm处的吸光值/黑色素标品溶液在220nm处的吸光值×100”计算提取黑色素的纯度，具体结果如表1所示：
表1提取黑色素的相对纯度
其中，黑色素标品为合成黑色素，其纯度为100％。由表1可知，本发明实施例提取的黑色素溶液的吸光值高于未经发酵的菜粕提取的黑色素溶液的吸光值。同时，以1mg/mL黑色素标品的NaOH溶液在220nm处的吸光值作为1换算其它样品的吸光值，而其它样品在220nm处的吸光值反映了该样品中黑色素的纯度，结合表1可推知，本发明实施例提取的黑色素的纯度相对于黑色素标品而言为42.13％，相比于未发酵的菜粕提高了6％。
此外，根据公式“提取黑色素提取率(％)＝提取黑色素的质量/菜粕的质量×100”计算黑色素的提取率，具体结果如表2所示。
表2黑色素提取率
由表2可知，本发明实施例提供的方法的提取率相比于未发酵的菜粕获得的黑色素的提取率增加了3.28倍，由此可见，本发明实施例提供的方法能够大大提高提取黑色素的提取率。
将本发明实施例所得的黑色素进行红外光谱扫描，具体如下：
采用KBr压片法测定黑色素，分别取约2mg黑色素标品(合成黑色素)、约2mg未经发酵的菜粕提取的黑色素和约2mg本发明实施例提取的黑色素进行研磨，然后分别与100～200mg干燥的KBr粉末充分混合，并进行压片，在400～4000cm-1范围内测其红外吸收光谱，该红外吸收光谱如图2所示，由图2可知，本发明实施例所得的黑色素具有2个特征性吸收带:(1)在3300cm-1附近都存在强而宽的共振吸收带，这是由于OH和NH2的伸缩振动产生的；(2)在1600～1700cm-1有两个强的吸收带，这是由于芳香C＝C和COO-的振动引起的。可见，本发明实施例提取的黑色素与黑色素标品相似。但本发明实施例所得的黑色素存在一些其他的峰，一方面，是因为本发明实施例所得的黑色素中的杂质引起了红外光的吸收，另一方面，本发明实施例所得的黑色素作为一种天然植物源黑色素，结构复杂多样，与黑色素标品在结构上存在一定的差异造成的。
收集浸提产物离心后所得的沉淀物，在60℃下烘干，利用凯氏定氮法和高效液相色谱法分别测得本发明实施例提供的方法提取黑色素前的待提取产物和提取黑色素后的沉淀物中的蛋白质和硫苷的含量，同时以未经发酵的菜粕和采用未经发酵的菜粕提取黑色素后的沉淀物中的蛋白质和硫苷的含量作为对比。具体结果如表3所示。
表3菜粕提取黑色素前后蛋白质和硫苷的含量变化
由表3可知，本发明实施例提供的菜粕提取黑色素后的沉淀物的蛋白质含量相比提取之前没有损耗，反而略微升高，且抗营养因子硫苷的含量大幅度降低，沉淀物相比于未发酵的菜粕其抗营养因子硫苷的含量降低了67.3％，且蛋白质的含量提高到了46.96％，这使得该沉淀物能够作为饲料使用。
本发明实施例提供了一种菜粕中提取黑色素的方法，该方法通过白腐真菌或米曲霉对菜粕进行发酵，在发酵过程中可以产生漆酶、纤维素酶和蛋白酶等胞外酶，这些胞外酶能够将发酵后的菜粕分子结构变的松散，使得黑色素能够与蛋白质和多糖等物质分离，从而使黑色素的提取率得到大大地提高，而且，黑色素与蛋白质和多糖等物质分离后，提高了提取黑色素的纯度；此外，沉淀物相比于待提取产物抗营养因子硫苷的含量降低了67.3％，且蛋白质的含量提高到了46.96％，使得提取黑色素后的沉淀物能够作为饲料使用，本发明实施例还提供了利用该方法所获得的沉淀物的应用，该沉淀物可作为饲料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种菜粕中提取黑色素的方法，其特征在于，所述方法包括：
向菜粕中加入白腐真菌或米曲霉进行发酵，得到发酵产物，将所述发酵产物进行烘干和粉碎，得到待提取产物；
采用乙醇、盐酸和水的混合提取液对所述待提取产物进行浸提，所述待提取产物与所述混合提取溶液的料液比为1:(4～10)，所述盐酸在所述混合提取液中的终浓度为0.5～1mol/L，所述乙醇在所述混合提取溶液中的体积分数为60～80％，浸提后得到浸提产物，将所述浸提产物进行离心，得到上清液和沉淀物；
将所述上清液提纯，得到黑色素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：向所述菜粕中加入糖和水后，再加入所述白腐真菌或米曲霉进行发酵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述糖为糖蜜、蔗糖或葡萄糖，所述糖的添加质量为所述菜粕质量的4～6％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白腐真菌为白腐真菌48424，所述米曲霉为米曲霉92011。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为60～84h，所述发酵的温度为25～30℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸提的温度为40～70℃，所述浸提的时间为0.8～3h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸提时，将所述混合提取液和所述待提取产物混合后于摇床上震荡混匀，所述摇床的转速为150rpm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照106～107个孢子/g的接种量向所述菜粕中加入所述白腐真菌或所述米曲霉。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述上清液提纯的方法包括：将所述上清液通过旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液，将所述浓缩液利用大孔吸附树脂进行纯化，得到纯化产物，将所述纯化产物进行洗脱，得到洗脱液，将所述洗脱液再次浓缩，得到所述黑色素。
10.一种根据权利要求1所述的方法获得的沉淀物的应用，其特征在于，所述应用包括将所述沉淀物作为饲料。
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