CN113439840A - 一种仙草黑色素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉食品加工技术领域，具体涉及一种仙草黑色素及其制备方法。其包括以下依次进行的步骤：将新鲜仙草加入米曲霉和黑曲霉的混合菌堆垛发酵3～5天；经过碱水浸提、醇成除胶制得仙草黑色素。其通过黑曲霉和米曲霉的复合菌发酵和碱水浸提的方法，使所得到的仙草黑色素的热稳定性和色阶更高，并且所得到的仙草黑色素为水溶性黑色素。
Description
技术领域
本发明涉食品加工技术领域，具体涉及一种仙草黑色素及其制备方法。
背景技术
仙草，又名仙人草或凉粉草，为唇形科一年生草本植物，是一种重要的药食两用植物资源，主要分布于我国福建、广东、台湾等地。仙草是植物中的天然绿色食品，具有很高的营养与医药价值，具有降温解暑、清心除火的功效。仙草为唇形科仙草属一年生草本植物，是一种重要的药食两用的植物资源。仙草全草干样含有约70％仙草碳水化合物，少量蛋白质、脂肪、色素等，还含有较多的矿物质元素。药用广泛，具有清暑，解热利水的功能。主治中暑、热毒、消渴、高血压、肾脏病、糖尿病、关节肌肉疼痛、淋病等。仙人草所含成分中，黄酮类物质具有抑制癌症细胞生长、降低血压的作用；多糖具有增强和提高机体免疫机能作用；香精素有镇静、清凉解毒利水的功效；微量元素具有抑制自由基形成、抗衰老、抗癌的作用；维生素能调节和增强生理机能等。
其中，黑色素是干仙草中大量存在的一种活性物质，因此开展仙草黑色素的研究对仙草的高附加值综合利用和深加工开发具有十分重要的实用价值和理论意义。
目前，国内外对仙草黑色素提取制备研究鲜有报道。曹崇江等人将仙草切断、粉碎后经室温水浴(pH＝14)提取90min，色素得率为12.44％，采用微波或超声波提取，仅缩短提取时间，对仙草色素提取率并未增加(曹崇江,刘晓庚,王项俊.仙草色素的提取研究[J].食品研究与开发,2007,128:64-67)。仙草中含有大量胶质(主要成分为酸性多糖)，若不将其去除，既降低仙草黑色素产品的纯度又影响产品的透光性；此外，新鲜仙草需经自然晾干成干仙草才能用于提取制备黑色素，有时还需将干仙草打包贮存半年以上等方式处理，否则将会影响黑色素的色价。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种新的仙草黑色素的制备方法，其通过黑曲霉和米曲霉的复合菌发酵、碱水浸提，使所得到的仙草黑色素的色阶更高，透光性更好，热更稳定，并且所得到的仙草黑色素为水溶性黑色素。
相应地，本发明还提供一种仙草黑色素。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种仙草黑色素的制备方法，其包括以下依次进行的步骤：
S1将新鲜仙草加入米曲霉和黑曲霉的混合菌堆垛发酵3～5天，之后自然晾干，制得干仙草；
S2经过碱水浸提制得仙草黑色素。
本发明方案中，将新鲜仙草通过米曲霉和黑曲霉的混合菌堆垛发酵有利于提高水溶性仙草黑色素的色阶；米曲霉和黑曲霉对于高水溶性仙草黑色素的色阶具有明显地协同效应。优选地，黑曲霉为黑曲霉AS3.324，米曲霉为米曲霉AS3.042。本发明创造性的采用堆垛发酵的方式，可提高水溶性仙草黑色素的色阶和产量。自然晾干，应该避免日光暴晒。
本发明仙草黑色素的制备方法可选地方案中，混合菌中，黑曲霉和米曲霉有效菌种数的比例为2:1，所述混合菌的浓度为108～109cfu/mL。
新鲜仙草与所喷洒的混合菌按重量体积比为3～5‰。
本发明仙草黑色素的制备方法可选地方案中，步骤S1还包括以下子步骤：新鲜仙草在加入所述混合菌后，在28～30℃下培养16～20h，再进行堆垛发酵。
本发明仙草黑色素的制备方法可选地方案中，所述堆垛发酵的温度为30～33℃，湿度为30～35％。
本发明仙草黑色素的制备方法可选地方案中，所述碱水为质量浓度0.12～0.15％的NaOH水溶液，碱水的加入量为干仙草质量的45～50倍，碱水浸提的温度为90～98℃，浸提时间为1.5～2.5h；其中，NaOH水溶液的pH值在12以上，本发明采用较高pH值的碱水浸提的方式，使水溶性黑色素的产量更高，色阶更高。
本发明优选地，碱水浸提在夹层锅中进行，采用夹层锅使受热更均匀，使浸提过程中的温度稳定的保持在90～98℃，利于产业化。
本发明仙草黑色素的制备方法可选地方案中，碱水浸提后采用板框过滤得到浸提液。
本发明仙草黑色素的制备方法可选地方案中，其还包括以下步骤：S3将碱水浸提后的浸提液加入无水乙醇进行醇沉，收集滤液制得仙草黑色素。本发明醇沉可以进一步除胶，提高水溶性色素的纯度。浸提液加入无水乙醇至浓度为48％～53％，并采用管式离心分离的方法收集滤液。
本发明仙草黑色素的制备方法可选地方案中，步骤S3中，将所述浸提液添加HCl调节溶液pH至6.8～7.2，再进行醇沉，收集滤液；将所述滤液经电渗析除盐处理后制得仙草黑色素。本发明通过HCl调节溶液pH至6.8～7.2，再进行醇沉的方式，并经管式离心分离去杂，所得水溶性仙草黑色素浊度最低。
本发明仙草黑色素的制备方法可选地方案中，其还包括步骤S4：将所得到的滤液进行纳滤浓缩，或者所得到的滤液经电渗析除盐处理后进行纳滤浓缩，设置膜的孔径为100Da，浓缩后制得所述仙草黑色素相比于真空蒸发浓缩或者其它浓缩方式显得更为高效，较低消耗。
第二方面，本发明还提供上述任一方案所述仙草黑色素的制备方法提取得到的仙草黑色素。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：本发明的仙草黑色素的制备方法，由于采用黑曲霉和米曲霉混合菌对新鲜仙草堆垛发酵处理，使所得水溶性仙草黑色素色价更高；水溶性仙草黑色素产品，具有良好的热稳定性，并在pH5～12范围内稳定性良好。
其中，本发明进一步采用碱水浸提和醇沉除胶的组合方法，降低仙草黑色素的浊度，进一步提高透光性。
附图说明
图1是本发明实施例1水溶性仙草黑色素水溶液的紫外-可见波段扫描图；
图2是本发明实施例1水溶性仙草黑色素的吸光度随pH值变化的变化示意图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明实施例提出的仙草黑色素的制备方法，创造性的在色素提取领域，采用黑曲霉和米曲霉混合菌的堆垛发酵处理，以提高水溶性黑色素的提取率，发酵后，采用高碱水浸提。水溶性仙草黑色素产品，具有良好的热稳定性，并在pH5-12范围内稳定性良好。
为了更好的理解上述技术方案，下面将更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然以下显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
S1堆垛发酵
新鲜仙草由田间采摘后自然摊放，向其喷洒有效菌种数比为2:1的黑曲霉AS3.324和米曲霉AS3.042混合菌悬液，混合菌悬液浓度为4.6×108cfu/mL，新鲜仙草与所喷洒的混合菌悬液按重量体积比为3‰；30℃下培养18h，之后转至密封的空间中进行堆垛发酵3天，温度控制在33℃，湿度控制在33％，堆垛发酵后，自然晾干，避免日光爆晒得到干仙草；
S2碱水浸提
经步骤S1堆垛发酵后的仙草置于夹层锅中，加入干仙草质量45倍的质量浓度为0.12％的NaOH水溶液，在95℃下浸提2h，后经板框压滤，得到碱水浸提液；
S3醇沉除胶
将所得碱水浸提液温度降至室温后通过HCl调节溶液pH至7，并添加无水乙醇至浓度50.8％，后经管式离心分离，收集滤液；
S4电渗析除盐
将所得滤液，经电渗析除盐，操作参数为：操作压力1.5kg/cm2，操作电压220V，操作电流2.5A；
S5纳滤浓缩
将除盐后的滤液进行纳滤浓缩，操作参数为：磺化聚砜膜孔径100Da，进料温度＜50℃，工作压力0.5MPa，进料流量为250L/h，浓缩后得到浓缩液；
S6真空干燥
将所得到的素浓缩液进行真空干燥，制得水溶性仙草黑色素。
本实施例所得水溶性仙草黑色素的色价E1％＝8.8。
实施例2
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
S1堆垛发酵
新鲜仙草由田间采摘后自然摊放，向其喷洒有效菌种数比为2:1的黑曲霉AS3.324和米曲霉AS3.042混合菌悬液，混合菌悬液浓度为6.2×108cfu/mL，新鲜仙草与所喷洒的混合菌悬液按重量体积比为5‰；28℃下培养16h，之后转至密封的空间中进行堆垛发酵5天，温度控制在35℃，湿度控制在30％，堆垛发酵后，自然晾干，避免日光爆晒，得到干仙草；
S2碱水浸提
经步骤S1堆垛发酵后的仙草置于夹层锅中，加入干仙草质量45倍的质量浓度为0.12％的NaOH水溶液，在95℃下浸提2h，后经板框压滤，得到碱水浸提液；
S3醇沉除胶
所得碱水浸提液温度降至室温后添加HCl调节溶液pH至7，随后向其添加无水乙醇至浓度50.5％，后经管式离心分离，收集滤液；
S4电渗析除盐
所得滤液，经电渗析除盐，操作参数为：操作压力2.0kg/cm2，操作电压220V，操作电流2.5A；
S5纳滤浓缩
除盐后的滤液进行纳滤浓缩，操作参数为：磺化聚砜膜孔径100Da，进料温度＜50℃，工作压力0.7MPa，进料流量为280L/h；
S6真空干燥
将所得到的素浓缩液进行真空干燥，制得水溶性仙草黑色素。
本实施例所得水溶性仙草黑色素的色价E1％＝8.6。
实施例3
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
S1堆垛发酵
新鲜仙草由田间采摘后自然摊放，向其喷洒有效菌种数比为2:1的黑曲霉AS3.324和米曲霉AS3.042混合菌悬液，混合菌悬液浓度为8.1×108cfu/mL，新鲜仙草与所喷洒的混合菌悬液按重量体积比为4‰；30℃下培养20h，之后转至密封的空间中进行堆垛发酵4天，温度控制在32℃，湿度控制在35％，之后自然晾干，避免日光爆晒，得到干仙草；
S2碱水浸提
步骤S1堆垛发酵后的仙草置于夹层锅中，加入干仙草质量48倍的浓度为0.13％的NaOH水溶液，在97℃下浸提1.8h，后经板框压滤，得到碱水浸提液；
S3醇沉除胶
所得碱水浸提液温度降至室温后添加HCl调节溶液pH至7，随后向其添加无水乙醇至浓度50.2％，后经管式离心分离，收集滤液；
S4电渗析除盐
所得滤液，经电渗析除盐，操作参数为：操作压力1.8kg/cm2，操作电压220V，操作电流2.5A；
S5纳滤浓缩
除盐后的滤液进行纳滤浓缩，操作参数为：磺化聚砜膜孔径100Da，进料温度＜50℃，工作压力0.7MPa，进料流量为280L/h；
S6真空干燥
将所得到的素浓缩液进行真空干燥，制得水溶性仙草黑色素。
本实施例所得水溶性仙草黑色素的E1％＝8.7。
对比例1
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
其它同实施例1，不同点在于步骤S1中，新鲜仙草经传统工艺干制处理。具体为：新鲜仙草收割，直接在田间放置4d左右，其后放置水泥地坪露天自然晾晒，期间避免日光暴晒，后打包贮存库房半年以上，得到干仙草。
对比例2
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
其它同实施例1，不同点在于步骤S1的堆垛发酵，未喷洒混合菌，具体的：新鲜仙草由田间采摘后自然摊放，转至密封的空间中进行堆垛发酵3天，温度控制在33℃，湿度控制在33％，堆垛发酵后，自然晾干，避免日光爆晒，得到干仙草。
对比例3
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
其它同实施例1，不同点在于步骤S1的堆垛发酵，只喷洒米曲霉，具体的：新鲜仙草由田间采摘后自然摊放，向其喷洒米曲霉AS3.042悬液，菌悬液浓度为5.3×108cfu/mL，新鲜仙草与所喷洒的混合菌悬液按重量体积比为3‰，30℃下培养18h，之后转至密封的空间中进行堆垛发酵3天，温度控制在33℃，湿度控制在33％，堆垛发酵后，自然晾干，避免日光爆晒，得到干仙草。
对比例4
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
其它同实施例1，不同点在于步骤S1的堆垛发酵，只喷洒黑曲霉，具体的：将新鲜仙草由田间采摘后自然摊放，向其喷洒黑曲霉AS3.324菌悬液，菌悬液浓度为4.8×108cfu/mL，新鲜仙草与所喷洒的菌悬液按重量体积比为3‰，30℃下培养18h，之后转至密封的空间中进行堆垛发酵3天，温度控制在33℃，湿度控制在33％，堆垛发酵后，自然晾干，避免日光爆晒，得到干仙草。
对比例5
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
其它同实施例1，不同点在于步骤S1的堆垛发酵，喷洒有效菌种数比为1:1的黑曲霉和米曲霉混合菌悬液，具体的：将新鲜仙草由田间采摘后自然摊放，向其喷洒有效菌种数比为1:1的黑曲霉AS3.324和米曲霉AS3.042混合菌悬液，混合菌悬液浓度为4.9×108cfu/mL，新鲜仙草与所喷洒的混合菌悬液按重量体积比为3‰，30℃下培养18h，之后转至密封的空间中进行堆垛发酵3天，温度控制在33℃，湿度控制在33％，堆垛发酵后，自然晾干，避免日光爆晒，得到干仙草。
对比例6
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
其它同实施例1，不同点在于步骤S1的堆垛发酵，喷洒有效菌种数比为1:2的黑曲霉和米曲霉混合菌悬液，具体的：新鲜仙草由田间采摘后自然摊放，向其喷洒有效菌种数比为1:2的黑曲霉AS3.324和米曲霉AS3.042混合菌悬液，混合菌悬液浓度为5.4×108cfu/mL，新鲜仙草与所喷洒的混合菌悬液按重量体积比为3‰，30℃下培养18h，之后转至密封的空间中进行堆垛发酵3天，温度控制在33℃，湿度控制在33％，堆垛发酵后，自然晾干，避免日光爆晒，得到干仙草。
对比例7
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
其它同实施例1，不同点在于步骤S3的醇沉除胶，不调pH，具体的：将所得碱水浸提液温度降至室温后向其添加无水乙醇至浓度50％，后经管式离心分离，收集滤液；
对比例8
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
其它同实施例1，不同点在于步骤S3的醇沉除胶，具体的：将所得碱水浸提液温度降至室温后通过HCl调节溶液pH至7，并添加无水乙醇至浓度45％，后经管式离心分离，收集滤液；
对比例9
仙草黑色素的制备方法，其步骤为：
其它同实施例1，不同点在于步骤S3的醇沉除胶，具体的：将所得碱水浸提液温度降至室温后通过HCl调节溶液pH至7，并添加无水乙醇至浓度55％，后经管式离心分离，收集滤液；
为验证本发明仙草黑色素的特性，进行以下试验：
试验一：
测定实施例1，对比例1-5所得到的水溶性仙草黑色素的色阶，色价测定方法：参照GB 1886.64-2015《食品安全国家标准食品添加剂》焦糖色色价方法，色价＝E1％249nm＝A×100/w。
测定得到如表1所示的数据：
表1：实施例1，对比例1-6所得仙草黑色素色价
由表1可知，新鲜仙草在堆垛发酵添加米曲霉或黑曲霉，都有利于提高水溶性仙草黑色素的色价，当实施例1同时添加米曲霉和黑曲霉时水溶性仙草黑色素的色价最高，并且显著高于对比例1-6，说明米曲霉与黑曲霉在新鲜仙草堆垛发酵过程中对提高水溶性仙草黑色素色价有明显的协同效应，且得率更高。与对比例1对比可知，对比例1采用传统方式对新鲜仙草进行处理，虽然能够提高产物的色价，但是其效果小于堆垛发酵处理，显著小于实施例1中采用米曲霉和黑曲霉协同堆垛发酵处理。
图1为本发明实施例1所得水溶性仙草黑色素的万分之一浓度水溶液紫外-可见波段扫描图，由图1可见，水溶性仙草黑色素溶液的最大吸收峰为249nm。
试验二：
将实施例1，对比例7-9所得到的水溶性仙草黑色素分别配置成1‰浓度的水溶液，进行浊度测定。测定方法参照GB/T5750.4-2006《生活饮用水标准检验方法感官性状和物理指标》中的方法，利用浊度分析仪测定样品浊度。测定结果如表2所示：
表2不同醇沉除胶工艺制得的产品浊度
从表2可知，醇沉除胶工艺调节体现pH值至中性，有利于仙草胶的醇沉，从而提高水溶性仙草黑色素溶液的透光性。此外，醇沉除胶工艺中无水乙醇最佳浓度在50％，少于50％仙草胶的醇沉不彻底，显著高于50％时对提高水溶性仙草黑色素溶液的透光性作用不大，但会显著增加生产成本。
试验三：
实施例1中除盐后的滤液进行纳滤浓缩，操作参数为：磺化聚砜膜孔径100Da，进料温度＜50℃，工作压力0.7MPa，进料流量为280L/h；
对比实验：实施例1中除盐后的滤液在50℃下真空蒸发浓缩，真空度为0.10MPa，与本发明纳滤浓缩做对比。比较两种浓缩工艺浓缩至不同浓缩倍数所需的时间，结果如表3所示。
表3纳滤浓缩与真空蒸发浓缩所需时间的比较
由表3可知，水溶性仙草黑色素溶液浓缩达到相同的浓缩倍数，真空蒸发浓缩所需的时间是纳滤浓缩的2.5倍以上。因此，纳滤浓缩比真空蒸发浓缩更高效。
试验四：
将本发明实施例1-3所得到的水溶性仙草黑色素进行热稳定性评价和酸碱稳定性评价。
1.热稳定性评价
将实施例1-3所得到的水溶性仙草黑色素分别烘干处理，分别称取0.1g水溶性仙草黑色素样品精确到0.0001g，10倍梯度稀释至1000倍，取稀释后的水溶性仙草黑色素溶液10mL，分别置于25℃、50℃、80℃、100℃水浴中，分别水浴0h、1h、2h、3h，水浴结束后，快速冷却至室温，在最大吸收波长249nm处测定吸光度，结果如表4所示。
表4黑色素热稳定性的评价
由表4可知，本发明实施例1-3制备的水溶性仙草黑色素的吸光度在100℃以下基本不变化，表明本发明制备的水溶性仙草黑色素在25-100℃的范围内具有良好的热稳定性。
2、黑色素酸、碱稳定性的评价
将实施例1所得到的水溶性仙草黑色素烘干处理，称取0.1g黑色素样品精确到0.0001g，10倍梯度稀释至1000倍(用HCI、NaOH溶液调节上述制备的1000倍稀释黑色素溶液的pH值分别至3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，取稀释后的水溶性仙草黑色素溶液10mL，分别置于40℃水浴锅中下静置2h后，在最大吸收波长249nm处测定吸光度，结果如图2所示。
由图2可知，本发明实施例1制备的水溶性仙草黑色素的吸光度在pH值5-12的范围内基本不变化，在pH值3-5范围内随溶液酸性增加而出现下降趋势，表明本发明制备的水溶性仙草黑色素在pH为中性与碱性时具有良好的稳定性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种仙草黑色素的制备方法，其特征在于，其包括以下依次进行的步骤：
S1将新鲜仙草加入米曲霉和黑曲霉的混合菌堆垛发酵3～5天，之后自然晾干，制得干仙草；
S2干仙草经过碱水浸提制得所述仙草黑色素。
2.如权利要求1所述的仙草黑色素的制备方法，其特征在于：所述混合菌中，黑曲霉和米曲霉有效菌种数的比例为2:1，所述混合菌的浓度为108～109cfu/mL，新鲜仙草与所喷洒的混合菌按重量体积比为3～5‰。
3.如权利要求1所述的仙草黑色素的制备方法，其特征在于，步骤S1还包括以下子步骤：新鲜仙草在加入所述混合菌后，在28～30℃下培养16～20h，再进行堆垛发酵。
4.如权利要求1所述的仙草黑色素的制备方法，其特征在于：所述堆垛发酵的温度为30～33℃，湿度为30～35％。
5.如权利要求1所述的仙草黑色素的制备方法，其特征在于：所述碱水为质量浓度0.10～0.15的NaOH水溶液，碱水的加入量为所述干仙草质量的45～50倍，碱水浸提的温度为90～98℃，浸提时间为1.5～2.5h；
优选地，碱水浸提在夹层锅中进行。
6.如权利要求1或5所述的仙草黑色素的制备方法，其特征在于：碱水浸提后采用板框过滤得到浸提液。
7.如权利要求1所述的仙草黑色素的制备方法，其特征在于，其还包括步骤：S3将碱水浸提后的浸提液加入无水乙醇进行醇沉，收集滤液制得所述仙草黑色素。
8.如权利要求7所述的仙草黑色素的制备方法，其特征在于：步骤S3中，将所述浸提液添加HCl调节溶液pH至6.8～7.2，再进行醇沉，收集滤液；将所述滤液经电渗析除盐处理后制得所述仙草黑色素。
9.如权利要求7或8所述的仙草黑色素的制备方法，其特征在于，其还包括步骤S4：将所得到的滤液进行纳滤浓缩，或者所得到的滤液经电渗析除盐处理后进行纳滤浓缩，设置膜的孔径为100Da，浓缩后制得所述仙草黑色素。
10.一种如权利要求1-5，7或8任一项所述的仙草黑色素的制备方法提取得到的仙草黑色素。
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