CN104762333B

CN104762333B - 利用冬笋壳制备木糖醇的方法

Info

Publication number: CN104762333B
Application number: CN201510103334.6A
Authority: CN
Inventors: 杨胜利; 张慧; 羊悦; 祝燕燕
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2015-03-09
Filing date: 2015-03-09
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2035-03-09
Also published as: CN104762333A

Abstract

本发明公开了一种利用冬笋壳制备木糖醇的方法：原料冬笋壳先用硫酸水解，所得水解液再用CaCO₃乳液进行中和，得到糖液，所得糖液浓缩后用活性炭脱色，进一步通过离子交换净化糖液，最后利用热带假丝酵母进行生物转化获得木糖醇；本发明使用冬笋壳为原材料，生产工艺简单温和，经济高效。

Description

利用冬笋壳制备木糖醇的方法

(一)技术领域

本发明涉及木糖醇的制备方法，利用农业废弃物竹笋壳清洁生产木糖醇的方法。

(二)背景技术

木糖醇研究生产历史较早的国家主要是拥有丰富白桦树资源的芬兰、俄罗斯等欧洲国家，因此这些国家成为木糖醇生产大国。这些国家直至今日仍沿用传统的桦木蒸煮法来生产木糖醇——用白桦木片经水蒸气蒸煮后得到粗糖液，再经精制即可得到结晶木糖醇产品。该方法不仅要消耗大量森林资源，而且产品收率低，故直到上世纪80年代的全球木糖醇总产量始终徘徊在1万吨左右。

起初生产木糖醇都采用物理、化学的方法，存在诸多弊端。1966年Onishi和Suzuki首次报道了酵母菌能够利用D-木糖生产木糖醇后，国际上许多学者都对发酵法生产木糖醇的研究产生了很大的兴趣。目前的研究发现，一些细菌、酵母菌以及某些真菌能将木糖转化，生成木糖醇。其中，酵母菌是最有效的木糖醇生产菌。相较于传统的木糖醇生产方法，利用酵母还原木糖生成木糖醇是一条更为经济的工艺路线，因为发酵生产木糖醇无需化学法所必不可少的木糖纯化步骤，还可以简化木糖醇的分离步骤。此外，以酵母细胞作为木糖氢化的催化剂其过程耗能也较低。尽管某些天然利用木糖的微生物如树干毕赤氏酵母，在代谢过程中产生木糖醇，但将其直接用于工业生产则存在着许多局限性。首先，对这些酵母菌而言，木糖是碳源及能源物质，有相当部分的木糖要转变为生物量，影响木糖醇得率的提高；其次，这些微生物往往对木质纤维材料水解物中的毒性成分，如糠醛抗性很低，难以适应工业生产的要求；而且某些这类微生物的自身特性(如产生毒素等)不适用于食品及相关工业。酿酒酵母是公认的安全性微生物，应用于食品发酵已有上千年的历史，发酵工艺成熟，是理想的工业生产菌株，且自身不具有代谢木糖的能力。木糖还原酶转化木糖为木糖醇，是木糖代谢的第1步。在酿酒酵母工业菌株中稳定高效表达木糖还原酶基因，是构建酿酒酵母木糖醇生产菌株的基本策略。近年来国外学者进行了许多相关的研究，并取得了可喜的成果。有将木糖醇磷酸脱氢酶基因整合到枯草芽孢杆菌细胞中的(Mira Povelainen，2007年)；有以谷氨酸棒杆菌做为宿主的(So-Hyun Kim，2010年)；但是更多的是将毕赤酵母木糖还原酶基因整合到酿酒酵母细胞内(Xiaoran Zhang，2010年；Eun-Joong Oh，2012年；Soo Rin Kim，2012年)，并得到很好地表达。

本项目拟以竹笋壳为原料，采用生物转化法生产木糖醇，可省去多次提纯、精制步骤，提高木糖利用率和木糖醇转化率，实现木糖醇低成本的关键技术突破，增加农民收入，提高我国木糖醇国际占有量和竞争力。

(三)发明内容

为了得到质量高、成本低廉的木糖醇，本发明提供一种原材料新颖、反应条件温和、成本低、绿色生产、环境友好，易于实现工业化的木糖醇的制备方法。

竹笋壳分为春笋壳和冬笋壳等品种，春笋壳颜色深会加重木糖醇的颜色，增加脱色炭的消耗，加大成本，所以选用冬笋(Phyllostachys pubescens)壳作原料。

本发明采用如下技术方案：

一种利用冬笋壳制备木糖醇的方法，所述方法按如下步骤进行：

(1)水解：将原料冬笋壳洗净，烘干后破碎，置于水解釜中，加入原料冬笋壳质量3～4倍的水，煮沸90～120min，排水后再加入原料冬笋壳质量5～6倍的0.5wt％～1wt％硫酸，即0.5wt％～1wt％硫酸水溶液，在120～130℃，0.1～0.15MPa的条件下水解3～5h，得到水解液；

(2)中和：将步骤(1)所得水解液升温至75～80℃，边搅拌边加入CaCO₃乳液进行中和，中和至pH为3.5～4.0后，保温60～80min，过滤除渣，得到糖液；

(3)脱色：将步骤(2)所得糖液减压浓缩至所述糖液体积的1/5～1/7倍，滤除析出的固体，升温至75～80℃，pH调为2.5～3.5，边搅拌边加入活性炭A进行脱色，脱色后滤除活性炭，得到脱色后的糖液；

(4)离子交换：对步骤(3)所得脱色后的糖液进行离子交换，采用732型强酸性阳离子树脂和D201型强碱多孔阴离子树脂进行交叉处理，所述交叉处理的方法为：先用所述阳离子树脂对脱色后的糖液进行离子交换，再用所述阴离子树脂进行离子交换，以此为一个周期，重复进行1～3次，得到离子交换后的糖液；

(5)发酵：首先配制培养基：将步骤(4)所得离子交换后的糖液、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、水混合即得到培养基，接入以热带假丝酵母Candida tripicalis，保藏号：AS2.1776为出发菌株制得的酶源，在200～220r/min，28～32℃的条件下发酵48～52h，得到发酵液，然后将所得发酵液在8000～10000rpm下离心20～25分钟，取上清液，纯化得抽提液冷却后析出晶体，过滤收集晶体并干燥，得到产物木糖醇；所述培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为120～150g/L，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度分别为8～12g/L，溶剂为水，初始pH为5.0～6.0。

本发明所述的制备木糖醇的方法，步骤(1)中，推荐将所述冬笋壳烘干后破碎至粒度为3～5mm。

步骤(2)中，由于所述水解液仍含残余的硫酸，pH值为2.5左右，因此加入CaCO₃乳液进行中和，优选所述CaCO₃乳液波美度为15～17度。

步骤(3)中，由于浓缩后的糖液颜色较深，因此利用活性炭A进行脱色处理，优选所述活性炭A的质量用量为所述糖液质量的8％～12％，脱色后所述糖液的透明度(折光度)为30％～40％。

步骤(4)中，通过离子交换处理进一步净化所述糖液，可使所述糖液的透明度(折光度)达94％～97％，糖液呈无色透明状。

步骤(5)中，在配制培养基前，可以通过紫外可见分光光度法测得所述糖液中木糖的含量，从而在配制培养基时，可通过调节水量使木糖的终浓度满足本发明所述的浓度范围。

步骤(5)中所述的纯化方法为：所述上清液，加入活性炭B，调节pH至4.8～5.2，煮沸，冷却至室温，抽滤，取滤液在50～55℃下减压蒸干得到固体物质，并在50～55℃下用无水乙醇抽提得抽提液；所述活性炭B的质量用量以所述上清液的体积计为18～25g/L。

步骤(5)中，所述的出发菌株热带假丝酵母(Candida tripicalis，菌种保存号：AS2.1776)，购自中国普通微生物菌种保藏中心(北京)。

步骤(5)中，所述的酶源为所述的热带假丝酵母种子液，推荐所述热带假丝酵母种子液的接种体积量是所述培养基体积的5％～15％，所述的热带假丝酵母种子液按如下方法制得：

(1)斜面培养：将热带假丝酵母菌Candida tripicalis，保藏号：AS2.1776接种至斜面培养基，30℃培养3～4天，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～5g/L，蛋白胨2～5g/L，琼脂粉18～25g/L，木糖30～50g/L，pH 5～6，溶剂为水；优选斜面培养基终浓度组成为：酵母膏2g/L，蛋白胨3g/L，琼脂粉20g/L，木糖40g/L，溶剂为水，pH 5.5；

(2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5～15g/L，D-木糖5～15g/L，酵母膏1.5～5g/L，蛋白胨2～5g/L，麦芽汁2～5g/L，pH 5～6，溶剂为水；优选种子培养基浓度组成为：葡萄糖10g/L,D-木糖10g/L，酵母膏2.0g/L，蛋白胨3.0g/L，麦芽汁3.0g/L，pH 5.5，溶剂为水。

对步骤(5)中所得发酵液进行成分分析，其中，木糖醇浓度为75g/L～90g/L，残存木糖浓度为5g/L～10g/L，木糖醇转化率为60％～70％。

本发明中，“活性炭A”、“活性炭B”没有特殊的含义，均指一般意义上的活性炭，标记为“A”、“B”只是用于区分不同步骤中用到的活性炭。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)使用冬笋壳为原材料，在国内外未见相关的报道和应用；

(2)本发明的整体生产工艺过程反应温和，不需要使用化学催化剂，以热带假丝酵母Candida tripicalis，保藏号：AS2.1776为出发菌株制得酶源，对环境污染较小，由于微生物菌种的特性和微生物酶作用的专一性，反应终产物单一，使得提取和精制容易，生产成本低；

(3)发酵液离心后的剩余物主要成分是单细胞蛋白，可以进一步开发利用。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

(1)竹笋壳的选择

选用冬笋壳作原料；

(2)水解

将选好的冬笋壳用清洗机清洗干净，烘干后破碎，将破碎后的冬笋壳(粒度为3mm)100g放入水解釜，加入300g水，升温至100℃煮沸90min，排水后再加入500g 0.5wt％的硫酸，然后升温至120℃，在0.1MPa的压力条件下水解3h，得到水解液；

(3)中和

所得水解液仍含残余的硫酸，pH值为2.5左右，因此加入波美度15度CaCO₃乳液进行中和，具体步骤为：将所述水解液加到中和罐中，升温至75℃，边搅拌边加入所述的CaCO₃乳液，调控至pH为3.5，为充分沉淀，中和后保温60分钟，再过滤除渣，得到糖液；

(4)蒸发

将除渣后的糖液进行减压蒸发，浓缩至其原来体积的100mL，并将析出的CaSO₄滤除；

(5)脱色

浓缩后的糖液颜色较深，利用活性炭8g进行脱色处理：将所述糖液加热到75℃，调控pH为2.5，边搅拌边加入活性炭进行脱色，脱色后滤除活性炭，所得脱色后的糖液透明度(折光度)为34％；

(6)离子交换

为了进一步净化糖液，需进行离子交换，选用732型强酸性阳离子树脂和D201型强碱多孔阴离子树脂进行交叉离子交换处理，层析柱直径为4cm，柱床高度为42cm，木糖醇液流速控制为1.5ml/cm²·min。所述交叉离子交换处理的方法为：先用所述阳离子树脂进行离子交换，再用所述阴离子树脂进行离子交换，以此为一个周期，重复进行2次，可使糖液透明度(折光度)达95％左右，糖液呈无色透明状；

(7)发酵：首先配制培养基：将40mL离子交换后的糖液、0.8g酵母提取物、0.8g牛肉膏、0.8g蛋白胨、60mL水混合即得到培养基，所得培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为120g/L，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度均为8g/L，培养基配制好后，在超净台接入5mL热带假丝酵母种子液，接着置于摇床中，在200r/min，30℃的条件下发酵48h，得到发酵液，然后将所得发酵液在8000rpm下离心20分钟，取上清液，加入2.0g活性炭，调节pH至4.8，煮沸，冷却至室温，抽滤，取滤液在50℃下减压蒸干得到固体物质12.8g，并50℃下用60mL无水乙醇抽提所得的固体物质，抽提液冷却后析出晶体，过滤收集晶体并干燥，得到产物7.7g，采用紫外可见分光光度法测定为木糖醇；

上述发酵过程中，对所得的发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为77g/L，残存木糖浓度为5g/L，木糖醇转化率为68％。

其中，所述热带假丝酵母种子液是按如下方法制得的：

(1)斜面培养：将热带假丝酵母菌AS2.1776接种至斜面培养基，30℃培养3～4天，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏2g/L，蛋白胨3g/L，琼脂粉20g/L，木糖40g/L，溶剂为水，pH 5.5；

(2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10g/L,D-木糖10g/L，酵母膏2.0g/L，蛋白胨3.0g/L，麦芽汁3.0g/L，pH 5.5，溶剂为水。

实施例2

方法同实施例1，不同之处是培养基的配制和热带假丝酵母的接种量：将45mL离子交换后的糖液、1g酵母提取物、1g牛肉膏、1g蛋白胨、55mL水混合得到培养基，所得培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为135g/L，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度均为10g/L，培养基配制好后，在超净台接入10mL热带假丝酵母。

最终得到产物8.4g，采用紫外可见分光光度法测定为木糖醇，并且对发酵过程中所得的发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为84g/L，残存木糖浓度为7g/L，木糖醇转化率为67％。

实施例3

方法同实施例1，不同之处是培养基的配制和热带假丝酵母的接种量：将50mL离子交换后的糖液、1.2g酵母提取物、1.2g牛肉膏、1.2g蛋白胨、50mL水混合得到培养基，所得培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为150g/L，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度均为12g/L，培养基配制好后，在超净台接入15mL热带假丝酵母。

最终得到产物8.6g，采用紫外可见分光光度法测定为木糖醇，并且对发酵过程中所得的发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为86g/L，残存木糖浓度为8g/L，木糖醇转化率为62％。

Claims

1.一种利用冬笋壳制备木糖醇的方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行：

(1)水解：将原料冬笋壳洗净，烘干后破碎，置于水解釜中，加入原料冬笋壳质量3～4倍的水，煮沸90～120min，排水后再加入原料冬笋壳质量5～6倍的0.5wt％～1wt％硫酸水溶液，在120～130℃，0.1～0.15MPa的条件下水解3～5h，得到水解液；

(3)脱色：将步骤(2)所得糖液减压浓缩至所述糖液体积的1/5～1/7倍，滤除析出的固体，升温至75～80℃，pH调为2.5～3.5，边搅拌边加入活性炭进行脱色，脱色后滤除活性炭，得到脱色后的糖液；

2.如权利要求1所述的制备木糖醇的方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述冬笋壳烘干后破碎至粒度为3～5mm。

3.如权利要求1所述的制备木糖醇的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CaCO₃乳液波美度为15～17度。

4.如权利要求1所述的制备木糖醇的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述活性炭的质量用量为所述糖液质量的8％～12％。

5.如权利要求1所述的制备木糖醇的方法，其特征在于所述的步骤(5)纯化方法为：所述上清液，加入活性炭，调节pH至4.8～5.2，煮沸，冷却至室温，抽滤，取滤液在50～55℃下减压蒸干得到固体物质，并在50～55℃下用无水乙醇抽提得抽提液；所述活性炭的质量用量以所述上清液的体积计为18～25g/L。

6.如权利要求1所述的制备木糖醇的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的酶源为所述的热带假丝酵母种子液，所述热带假丝酵母种子液的接种体积量是所述培养基体积的5％～15％，所述的热带假丝酵母种子液按如下方法制得：

(1)斜面培养：将热带假丝酵母菌Candida tripicalis，保藏号：AS2.1776接种至斜面培养基，30℃培养3～4天，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～5g/L，蛋白胨2～5g/L，琼脂粉18～25g/L，木糖30～50g/L，pH 5～6，溶剂为水；

(2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5～15g/L，D-木糖5～15g/L，酵母膏1.5～5g/L，蛋白胨2～5g/L，麦芽汁2～5g/L，pH 5～6，溶剂为水。

7.如权利要求6所述的制备木糖醇的方法，其特征在于，所述的热带假丝酵母种子液按如下方法制得：