CN104611387A

CN104611387A - 一种链霉菌发酵生产l-多巴黑色素的方法

Info

Publication number: CN104611387A
Application number: CN201410460691.3A
Authority: CN
Inventors: 唐选明; 丁洋; 李淑英; 聂莹
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date: 2013-11-05
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2015-05-13
Also published as: CN103540617A

Abstract

本发明公开了一种链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，采用链霉菌T2-10菌株进行生产，包括如下步骤：取链霉菌T2-10菌株接种于液体培养基中，27-31℃，250-290rpm振荡培养24h制成种子液；按1％接种量将种子液接种于液体培养基中，27-31℃，250-290rpm振荡培养72-96h制成发酵液；将发酵液于4℃下，8000rpm离心15min去掉菌体等不溶物后，发酵清液采用大孔吸附树脂分离纯化，并用甲醇洗脱，烘干后即得L-多巴黑色素结晶。本发明提供的方法易于操作，生产的L-多巴黑色素水溶解性和热稳定性较好且其中L-多巴含量较高，在食品和医疗等方面具有重要的实用价值。

Description

一种链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法

技术领域

本发明涉及微生物及其应用领域，特别是涉及一种链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，本发明还涉及生产的L-多巴黑色素的理化性质。

背景技术

天然黑色素在动、植物及微生物中均可产生。而动、植物材料生长繁殖受季节、气候、产地等因素的影响，提取的色素价格昂贵，应用受到局限。微生物如放线菌、真菌和细菌均可产黑色素。微生物所产黑色素一般是由体内的酪氨酸酶催化酪氨酸形成L-多巴，再经一系列氧化过程而形成，属于氨基酸的衍生物，且无毒、无害。

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，Tyrosinase)，又被称为多酚氧化酶，是一种含铜的金属酶，主要参与L-多巴黑色素的合成过程：(1)催化L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴；(2)氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列反应后形成L-多巴黑色素。酪氨酸酶在生物体中具有重要的生理功能，是L-多巴黑色素生物合成途径中的关键酶。L-多巴是一种重要的生物活性物质，可以通过血脑屏障，在脑组织中脱羧形成一种重要的神经递质——多巴胺。因此L-多巴可研制成治疗老年常见病——帕金森氏病以及其它疾病如肝昏迷、一氧化碳中毒、心力衰竭等的良药。

放线菌是土壤中的优势菌群，除极少数致病菌外，大多数放线菌具有重要的生物学意义。链霉菌是一种重要的次生代谢物产生菌种，利用链霉菌发酵生产L-多巴黑色素，具有周期短、成本低廉、生产工艺简单，便于操作，适于工业化生产等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，本发明采用链霉菌(Streptomyces sp.)T2-10发酵生产L-多巴黑色素，还涉及所产L-多巴黑色素的理化性质。

本发明提供的技术方案为：

一种链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，采用链霉菌(Streptomyces sp.)T2-10(CGMCC NO.7449)菌株进行生产。

优选的是，所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法中，采用链霉菌(Streptomyces sp.)T2-10(CGMCC NO.7449)菌株进行生产还包括如下步骤：

(1)种子液制备：

取所述链霉菌T2-10菌株接种于液体培养基中，27-31℃，250-290rpm振荡培养24h制成种子液；

(2)发酵培养：

按1％接种量将所述种子液接种于所述液体培养基中，27-31℃，250-290rpm振荡培养72-96h制成发酵液；

(3)L-多巴黑色素的提取与纯化：

将所述发酵液于4℃下，8000rpm离心15min去掉菌体及其他不溶物后，发酵清液采用大孔吸附树脂分离纯化，并用甲醇洗脱，50-60℃烘干后即得L-多巴黑色素结晶。

优选的是，所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述液体培养基各组分的质量百分比为：燕麦粉1.0％，可溶性淀粉3.0％，豆粕粉0.3％，大米粉0.5％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.2％，酵母膏0.1％，KNO₃ 0.2％，K₂HPO₄0.1％，NaCl 0.1％，MgSO₄ 0.05％和CaCO₃ 0.3％。

优选的是，所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述种子液和发酵液的培养条件为29℃，260rpm振荡培养。

优选的是，所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述大孔吸附树脂型号为X-5，粒径范围0.3～1.25mm。

优选的是，所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述烘干条件为60℃烘4h。

优选的是，所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述L-多巴黑色素水溶解性和热稳定性较好且其中L-多巴含量较高。

本发明的有益效果：

本发明提供一种生产L-多巴黑色素的方法，本发明使用链霉菌T2-10产L-多巴黑色素，对该菌株的发酵条件进行优化，发酵生产的L-多巴黑色素水溶解性和热稳定性较好且其中L-多巴的含量较高；并且其生产工艺简单，操作方便；链霉菌T2-10发酵生产的L-多巴黑色素在食品、医疗和保健等方面具有重要的实用价值，并显示出广阔的应用前景。

附图说明

图1为发酵温度对产L-多巴黑色素的影响图；

图2为转速对产L-多巴黑色素的影响图；

图3为本发明所述生产L-多巴黑色素的流程图；

图4为本发明所述L-多巴黑色素OD_400nm值与质量浓度的关系；

图5为本发明所述L-多巴标准曲线图；

图6为本发明所述L-多巴黑色素的紫外-可见吸收光谱图；

图7为本发明所述L-多巴黑色素的红外光谱图；

图8为本发明所述链霉菌T2-10发酵液中酪氨酸酶活性变化；

图9为本发明所述链霉菌T2-10发酵液中OD_400nm值的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法和试剂如无特别说明均为常规方法，所述原材料和设备如无特别说明均能从公开商业途径而得。

本发明中用于生产L-多巴黑色素的链霉菌的分类命名为链霉菌(Streptomyces sp.)T2-10，该菌株属于放线菌株，已于2013年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7449。

本发明所述生产L-多巴黑色素的方法：

1 材料与方法

1.1 液体培养基：燕麦粉10g，可溶性淀粉30g，豆粕粉3g，大米粉5g，葡萄糖5g，酵母粉2g，酵母膏1g，KNO₃ 2g，K₂HPO₄ 1g，NaCl 1g，MgSO₄0.5g和CaCO₃ 3g，溶于蒸馏水中定容至1000mL后，，调节pH为7，112℃灭菌20min后备用。

1.2 发酵条件确定：

发酵的温度和转速会直接影响发酵产物的产量，因此需要寻找最适的产L-多巴黑色素的条件。

1.2.1 发酵温度筛选：

将链霉菌T2-10菌株接种于装有50mL液体培养基(pH 7.0)的250mL三角瓶中，于250rpm，分别放入27℃、28℃、29℃、30℃、31℃振荡培养培养96h后，离心取上清，测OD_400nm值。结果如图1所示，温度明显影响黑色素的产出，29℃时，黑色素产量最大。因此，29℃是本试验发酵产L-多巴黑色素的最适温度，并且从图1中也可以看出在27-31℃范围内，所述链霉菌T2-10都能发酵生产L-多巴黑色素。

1.2.2 发酵转速筛选：

将链霉菌T2-10菌株接种于装有50mL液体培养基(pH 7.0)的250mL三角瓶中，分别于250rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm，29℃振荡培养培养96h后，离心取上清，测OD_400nm值。结果如图2所示，转速为260rpm时，产黑色素的浓度最大。因此，260rpm是本试验发酵产L-多巴黑色素的最佳转速，并且从图2中也可以看出在250-290rpm范围内，所述链霉菌T2-10都能发酵生产L-多巴黑色素。

1.3 产L-多巴黑色素方法：

如图3所示，有如下步骤：

1.3.1 种子液制备：

取链霉菌T2-10菌株接种于装有50mL液体培养基(pH 7.0)的250mL三角瓶中，于260rpm，29℃振荡培养24h制成种子液；

1.3.2 发酵培养：

取7mL种子液，接种于装有200mL液体培养基(pH 7.0)的1000mL三角瓶中，于260rpm，29℃振荡培养96h得到发酵液。

1.3.3 L-多巴黑色素的提取与纯化：

所述发酵液于温度4℃，8000rpm离心15min，去掉菌体和其他不溶物；采用大孔吸附树脂(型号X-5，粒径范围0.3～1.25mm)分离纯化，并用甲醇洗脱；60℃烘干4h，即得纯化的L-多巴黑色素结晶。

1.4 L-多巴黑色素的理化性质研究

本发明所述链霉菌T2-10发酵液及不同L-多巴黑色素溶液中OD_400nm值的测定：

如图4所示，测定不同时期(0、24、48、72、96h)发酵液和不同L-多巴黑色素溶液中的OD_400nm值以反映L-多巴黑色素的质量浓度。

1.4.1 溶解性

取提纯的L-多巴黑色素晶体分别溶解到pH值3、5、7、9的水及普通有机溶剂中，均按质量浓度为0.1mg·mL^-1的量加入L-多巴黑色素，并充分振荡；以不加L-多巴黑色素的溶剂作为空白对照，测定所有溶液的OD_400nm值，结合溶液的颜色变化，比较L-多巴黑色素在不同溶液中的溶解性。

1.4.2 热稳定性

将质量浓度为0.1mg·mL^-1的L-多巴黑色素中性水溶液(pH值为7)置于60℃加热24h后，快速冷却至室温，测定加热前后OD_400nm值的变化。

1.4.3 抗氧化性

取0、0.5、1.0、1.5mL质量分数为10％的次氯酸钠溶液，分别加入到10mL质量浓度为0.1mg·mL^-1pH值为7的L-多巴黑色素中性水溶液中，反应10min后测定OD_400nm值。

1.4.4 紫外-可见吸收光谱

将所产L-多巴黑色素配成浓度为0.1mg·mL^-1的水溶液，以蒸馏水作空白对照，在190-600nm进行紫外-可见吸收光谱分析。

1.4.5 红外吸收光谱

将所产L-多巴黑色素按1∶100比例加入KBr，混匀并压片，在红外光谱仪4000-400cm^-1区间进行红外扫描分析。

1.5 链霉菌T2-10所产L-多巴黑色素中L-多巴含量的测定：

1.5.1 盐酸溶液配制：

取浓盐酸9mL，加水适量使成1000mL，摇匀得盐酸溶液。

1.5.2 L-多巴标准液的配制及标准曲线绘制：

用盐酸溶液配制成0.1mg·mL^-1的L-多巴标准液，然后用盐酸溶液稀释成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg·mL^-1，测定OD_280nm值，绘制L-多巴标准曲线，结果如图5所示。

1.5.3 L-多巴黑色素溶液配制：

取L-多巴黑色素样品，称取0.1g，研细，置于100mL容量瓶中，加盐酸溶液适量，充分振荡使溶解，用盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，即得L-多巴黑色素溶液，测定OD_280nm值，根据L-多巴标准曲线，计算L-多巴黑色素中L-多巴的含量。

1.6 链霉菌T2-10发酵液中酪氨酸酶活性测定

在5mL试管中加入1mL L-多巴标准液及1.9mL 0.1M的PBS缓冲液(pH值为6.8)，充分混匀，于30℃温育10min后，分别加入0.1mL不同时期0、24h、48h、72h、96h的发酵液，立即充分混匀；以高温灭活发酵液作为对照组，测定OD_475nm值，通过OD_475nm值随时间的增长直线斜率求得酪氨酸酶活性(ε＝3700cm^-1·mol^-1·L)。

2 结果与分析

2.1 L-多巴黑色素的理化性质

2.1.1 溶解性

如表1所示，本发明得到的所述L-多巴黑色素溶于中性(pH值为7)和弱碱性(pH值为9)水，其颜色为棕褐色，微溶于pH值小于5的酸性溶液；难溶于普通有机溶剂(如乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚)，但微溶于乙酸。本发明中所述L-多巴黑色素有较好的水溶解性和热稳定性，可以更好地应用于饮料、糕点等食品及药品行业。

表1所述L-多巴黑色素的溶解性

2.1.2 热稳定性

如表2所示，本发明所述L-多巴黑色素在60℃加热24h，OD_400nm值仅减少5.4％，具有较好的热稳定性。

表2所述L-多巴黑色素的热稳定性

2.1.3 抗氧化性

如表3所示，本发明所述L-多巴黑色素溶液随着次氯酸钠含量的增加，OD_400nm值逐渐降低，说明其对强氧化剂不稳定。

表3所述L-多巴黑色素的抗氧化性

2.1.4 紫外-可见吸收光谱

如图6所示，本发明所述L-多巴黑色素的紫外-可见吸收光谱图在196nm处有一个强吸收峰，在可见光区内没有特征吸收峰，吸收值随波长的增大而减少，与报道的标准黑色素的图谱一致。

2.1.5 红外吸收光谱

如图7所示，本发明所述L-多巴黑色素的红外光谱图在3400～3300cm^-1附近存在的吸收峰是由-OH、-NH2的伸展振动产生的；3000～2800cm^-1附近的吸收峰是由饱和C-H伸缩振动引起的；1700～1600cm^-1附近的吸收峰说明分子中存在C＝O结构；1500～1400cm^-1左右的吸收峰则是由于苯环骨架振动引起的。

2.2 链霉菌T2-10所产L-多巴黑色素中L-多巴含量

经分离纯化得到的L-多巴黑色素结晶中L-多巴的含量达731.56mg·g^-1，说明链霉菌T2-10发酵产的黑色素确实为L-多巴黑色素。

2.3 链霉菌T2-10发酵过程中酪氨酸酶活性的测定

如图8所示，链霉菌T2-10在液体发酵48h时，酪氨酸酶活性达到最高，经计算为5.38U·L^-1。

2.4 发酵时间对L-多巴黑色素产量的影响

在所述发酵培养开始时零点取样，以后每隔24h取一次样，离心取上清后，测OD_400nm值。结果如图9所示，链霉菌T2-10菌株在发酵中培养了24h后，L-多巴黑色素就开始迅速产生，到72h时，L-多巴黑色素的产量达到最大值，其后变化不明显，基本处于平台期。所以从经济的角度考虑72h为本发明所述方法中的最佳培养时间。

本发明公开了链霉菌T2-10发酵生产L-多巴黑色素的方法及其所产L-多巴黑色素的理化性质。本发明中所述链霉菌T2-10在液体发酵48h时，酪氨酸酶活性达到5.38U·L^-1，在72h时，发酵液中L-多巴黑色素的质量浓度达到最大；经分离纯化得到的L-多巴黑色素结晶中L-多巴的含量达731.56mg·g^-1。本发明所述L-多巴黑色素溶于中性(pH值为7)及弱碱性(pH值为9)的水中，难溶于普通有机溶剂，具有良好的热稳定性，但对强氧化剂不稳定。以上说明，依照本发明的链霉菌T2-10发酵生产的L-多巴黑色素具有广阔的工业化应用和市场前景。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，采用链霉菌(Streptomyces sp.)T2-10(CGMCC NO.7449)菌株进行生产。

2.如权利要求1所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，采用链霉菌(Streptomyces sp.)T2-10(CGMCC NO.7449)菌株进行生产还包括如下步骤：

(1)种子液制备：

取所述链霉菌T2-10菌株接种于液体培养基(pH 7.0)中，27-31℃，250-290rpm振荡培养24h制成种子液；

(2)发酵培养：

(3)L-多巴黑色素的提取与纯化：

3.如权利要求2所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述液体培养基各组分的质量百分比为：燕麦粉1.0％，可溶性淀粉3.0％，豆粕粉0.3％，大米粉0.5％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.2％，酵母膏0.1％，KNO₃0.2％，K₂HPO₄ 0.1％，NaCl 0.1％，MgSO₄ 0.05％和CaCO₃ 0.3％。

4.如权利要求2所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述种子液和发酵液的培养条件为29℃，260rpm振荡培养。

5.如权利要求2所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂型号为X-5，粒径范围0.3～1.25mm。

6.如权利要求2所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述烘干条件为60℃烘4h。

7.如权利要求2所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述L-多巴黑色素水溶解性和热稳定性较好且其中L-多巴含量较高。