CN109938243A - 一种复合菌种降低酱油中氮代谢危害物含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合菌种降低酱油中氮代谢危害物含量的方法，属于微生物技术领域。利用木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌联合发酵，使其分别从降低生物胺和氨基甲酸乙酯的积累两个方面共同控制酱油中氮代谢危害物。在酱油发酵过程中，以1：1的数量比例于成曲与盐水混合时同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌进行发酵时，可将酱油成品中总生物胺含量降低64.2％，氨基甲酸乙酯含量降低77.2％，同时氨基态氮提升61.1％。

Description

一种复合菌种降低酱油中氮代谢危害物含量的方法

技术领域

本发明涉及一种复合菌种降低酱油中氮代谢危害物含量的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

酱油是一种美味的调味剂，2500年前中国就掌握了酱油的酿造方法。酱油如今很受欢迎，是餐桌上不可或缺的调味品。酱油按生产方法不同可分为天然发酵酱油、人工发酵酱油和化学酱油三类。人工发酵酱油又分为低盐固态发酵和高盐稀态发酵，其中高盐稀态酱油是大豆和小麦粉为原料，经蒸煮、曲霉菌制曲后与盐水混合成稀酵，再经发酵制成的酱油。影响我国传统发酵食品安全最为重要的因素是各种由于发酵过程中含氮化合物的不完全代谢生成的胺(氨)类物质，而酱油中主要的氮代谢危害物主要是生物胺和氨基甲酸乙酯。

生物胺是通过前体氨基酸的微生物脱羧作用而合成的具有生物活性、含氨基的小分子有机化合物。食品中常见的生物胺包括组胺、酪胺、色胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺等。生物胺是在发酵食品储存和加工过程中通过微生物生长代谢形成的，当人体过量摄入时，可能会产生毒性作用，引发头痛、呼吸紊乱、心悸、呕吐、低血压和消化问题，从而导致消费者的健康问题。目前我国食品领域还没有明确的生物胺限值，但部分国家已经尝试根据不同食品的特性制定生物胺的限量标准。美国FAD规定水产品中的组胺含量不得超过50mg/kg，并建议酪胺含量不要超过100mg/kg，生物胺总量不要超过1000mg/kg，欧盟则限定组胺为100mg/kg。对于发酵食品如鱼露、发酵香肠等，传统去除生物胺的方法是通过冷冻、辐射、添加食品添加剂和防腐剂等方法来抑制微生物的生长，从而减少食品中生物胺的积累。

氨基甲酸乙酯一般由乙醇与氨甲酰化合物发生自发化学反应产生，能够反应生成氨基甲酸乙酯的氨甲酰化合物主要有：尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氰酸及焦碳酸二乙酯。EC主要是通过皮肤及肠道上皮组织，快速并几乎完全的被吸收进入体内。进入体内的EC的去路主要有2条：(1)约5％的EC未经代谢直接以粪便或尿液的形式排出体外。(2)通过体内的代谢转化为其他物质，代谢途径主要有三条，分别是：①水解作用；②羟基化作用；③侧链氧化作用。其中羟基化作用引起会DNA损伤进而诱发癌变。2007年，IARC将EC的致癌等级列为2A级。加拿大首先提出EC的限量标准，此限量标准在不同酒中从30μg/L到400μg/L不等。随后，美国和欧洲各国(捷克、法国、德国)也相继提出了EC在不同酒类中的限量标准从15μg/L到1000μg/L不等。但是，中国到目前为止还没有提出相关的限量标准。食品中氨基甲酸乙酯的消除策略主要有酸性脲酶法，氨基甲酸乙酯水解法，代谢工程改造生产菌株和工艺优化等。

酱油的原料中含有大量蛋白质，由于传统加工工艺粗放等原因，伴随发酵食品生产过程中氮代谢产生的危害物质，对食品安全和生物体健康产生潜在的安全风险。因此，基于我国酱油工业发展需求和发酵食品安全控制，提供一种能大规模应用的同时降低生物胺和氨基甲酸乙酯含量的方法对发酵食品领域具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种降低酱油中氮代谢危害物含量的方法，利用木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌联合发酵，将成曲与盐水混合时，以1:3-3:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌。

进一步地，是以1:2-2:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌。

进一步地，是以1:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌。

在本发明的一种实施方式中，包括以下步骤：(1)两种发酵菌株的制备；(2)制曲；(3)发酵。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)包括：将木糖葡萄球菌接种于MSA固体培养基，30-40℃恒温培养24-48h以初步活化菌种，挑取单菌落接种到MSA液体培养基，30-40℃恒温培养24-48h，收集菌体后用0.7％-0.9％的生理盐水洗涤。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)包括：将嗜盐四联球菌接种于MRS固体培养基，30-40℃恒温培养24-48h以初步活化菌种，挑取单菌落接种到MRS液体培养基，30-40℃恒温培养24-48h，收集菌体后用0.7％-0.9％的生理盐水洗涤。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)包括：烘干面粉，并将冷却后的大豆和面粉按质量比为100:(15-25)的比例均匀混合，拌入种曲，种曲接种量为大豆和面粉总质量的0.3‰-0.6‰，28-32℃制曲40-60h。

在本发明的一种实施方式中，所述冷却后的大豆是将挑选的大豆原料清洗、浸泡后沥水，在高压、110-125℃条件下蒸煮15-30min，取出后冷却至室温得到的。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)具体为：向步骤(2)制备得到的曲中加入2-3倍质量的盐水，盐水质量分数为18-20％的氯化钠溶液，将成曲与盐水混合均匀，以1:3-3:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌，于20-30℃继续发酵60-90d。

在本发明的一种实施方式中，接种的木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌菌浓度为10⁶-10⁸CFU/L。

本发明的第二个目的是提供上述方法在制备酱油中的应用

本发明的第三个目的是提供上述方法在食品发酵领域中的应用。

与传统高盐稀态酱油发酵相比，本发明的积极效果为：

本发明通过在酱油的发酵阶段添加木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌的复合菌，使其分别从脱羧作用及转胺作用两个方向调控生物按积累，从而降低酱油成品中生物胺的含量。当将成曲与盐水混合时，以1:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌进行发酵时，可将酱油成品中总生物胺含量降低64.2％，氨基甲酸乙酯含量降低77.2％，同时氨基态氮含量提升61.1％。

具体实施方式

(一)测生物胺含量的方法

1.样品预处理

量取5mL酱油放入洁净的50mL离心管中，量取40mL浓度为0.367mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液加入管内，置于30℃振荡水浴锅中，200r/min振荡30min后，在4℃，1200×g下离心10min，过滤后，取上清液进行衍生反应。

2.标准溶液和样品的衍生

精确吸取1mL生物胺混合标准使用溶液和样品预处理液，分别加入0.10mL内标标准使用溶液，加入0.20mL的2mol/L的NaOH溶液使反应液呈碱性，用0.30mL的饱和NaHCO₃缓冲液保护反应体系，再加入1mL丹磺酰氯(10g/L丙酮)溶液于45℃黑暗处理50min，加入0.10mL氨水终止反应，30min后用乙腈定容至5mL，4℃、8000rpm离心5min，取上清液用0.45μm针孔滤膜过滤，供液相色谱测定。

3.色谱条件

色谱柱为Agilent Extend-C18柱(250mm×4.6mm,2.5μm)，乙腈作为流动相A，超纯水作为流动相B，柱温选择30℃，采用混合流动相进行洗脱，洗脱程序如表1所示，流速为1.5mL/min，进样量为20μL，紫外检测波长为254nm。

表1 梯度洗脱生物胺

(二)测氨基甲酸乙酯的方法

1.样品前处理：取5mL酱油样品，加入10mL乙酸乙酯，剧烈震荡40s混匀，取乙酸乙酯相至试管，再加入10mL乙酸乙酯，重复以上萃取操作一次。合并萃取液，共20mL。过无水硫酸钠干燥，取上清液于旋转蒸发仪上浓缩(30℃，真空度800MPa)，用甲醇定容至1mL，待测定。

2.色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18(4.6×250mm)；流动相：20mmol/L醋酸钠和乙腈，梯度洗脱条件如表2所示。柱温：35℃。进样量：20μL。激发光波长：233nm，发射光波长：600nm。

表2 酱油中氨基甲酸乙酯检测的流动相梯度条件

(三)测氨基酸的方法

按GB5009.124—2016中执行。

(四)测氨基态氮含量的方法

按GB/T5009.235-2016中执行。

(五)测总酸含量的方法

按GB/T5009.40-2003中执行。

(六)测还原糖含量的方法

按GB5009.7-2016中执行。

(七)培养基

MSA培养基：牛肉浸膏1g，蛋白胨10g，甘露醇10g，NaCl75g，蒸馏水1000mL，调节pH7.2-7.6。

MRS培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵[(NH₄)₂HC₆H₅O₇]2.0g、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠(CH₃COONa·3H2O)5.0g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.58g、硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.25g、(琼脂18.0g)、蒸馏水1000mL，调节pH6.2-6.6。

实施例1

(1)发酵剂菌株制备

将木糖葡萄球菌接种于MSA固体培养基，30-40℃恒温培养24-48h以初步活化菌种，挑取单菌落接种到MSA液体培养基，30-40℃恒温培养24-48h，然后，收集菌体，用0.7-0.9％生理盐水洗涤备用。将嗜盐四联球菌接种于MRS固体培养基，30-40℃恒温培养24-48h以初步活化菌种，挑取单菌落接种到MRS液体培养基，30-40℃恒温培养24-48h，然后，收集菌体，用0.7-0.9％生理盐水洗涤备用。

(2)制曲

挑选大豆并清洗，浸泡后沥水，在高压、110-125℃条件下蒸煮15-30min，取出冷却至室温；烘干面粉，并将冷却后的大豆按照m(大豆)：m(面粉)＝100：(15-25)的比例均匀混合，拌入种曲，接种量为大豆和面粉总量的0.3‰-0.6‰，28-32℃制曲40-60h。

(3)发酵

向制备得到的曲中加入2-3倍质量的盐水，盐水质量分数为18-20％的氯化钠溶液，混合均匀后于20-30℃继续发酵60-90d，得酱油成品。测定其生物胺含量、氨基甲酸乙酯含量、氨基酸含量、氨基态氮含量、总酸含量及还原糖含量。

实施例2

步骤(3)中，于成曲与盐水混合时接种木糖葡萄球菌，菌浓度为10⁶-10⁸ CFU/L，其余同实施例1。

实施例3

步骤(3)中，于成曲与盐水混合时接种嗜盐四联球菌，菌浓度为10⁶-10⁸ CFU/L，其余同实施例1。

实施例4

步骤(3)中，于成曲与盐水混合时，以1:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌，菌浓度为10⁶-10⁸ CFU/L，其余同实施例1。

实施例5

步骤(3)中，于成曲与盐水混合时，以1:2的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌，菌浓度为10⁶-10⁸ CFU/L，其余同实施例1。

实施例6

步骤(3)中，于成曲与盐水混合时，以2:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌，菌浓度为10⁶-10⁸ CFU/L，其余同实施例1。

实施例7

步骤(3)中，于成曲与盐水混合时，以1:3的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌，菌浓度为10⁶-10⁸ CFU/L，其余同实施例1。

实施例8

步骤(3)中，于成曲与盐水混合时，以3:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌，菌浓度为10⁶-10⁸ CFU/L，其余同实施例1。

制得的酱油生物胺含量、氨基甲酸乙酯含量等指标如表3所示，可以看出，当成曲与盐水混合时，以1：1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌进行发酵时(见实施例4)，可将酱油成品中总生物胺含量降低64.2％，氨基甲酸乙酯含量降低77.2％，同时氨基态氮含量提高61.1％，总游离氨基酸含量也略有提升。

表3 酱油生物胺含量、氨基甲酸乙酯含量及理化指标

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种降低酱油中氮代谢危害物含量的方法，其特征在于，利用木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌联合发酵，将成曲与盐水混合时，以1:3-3:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接种的木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌菌浓度为10⁶-10⁸CFU/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)两种发酵菌株的制备；(2)制曲；(3)发酵。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：烘干面粉，并将冷却后的大豆和面粉按质量比为100:(15-25)的比例均匀混合，拌入种曲，种曲接种量为大豆和面粉总质量的0.3‰-0.6‰，28-32℃制曲40-60h。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：将木糖葡萄球菌接种于MSA固体培养基，30-40℃恒温培养24-48h以初步活化菌种，挑取单菌落接种到MSA液体培养基，30-40℃恒温培养24-48h，收集菌体。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：将嗜盐四联球菌接种于MRS固体培养基，30-40℃恒温培养24-48h以初步活化菌种，挑取单菌落接种到MRS液体培养基，30-40℃恒温培养24-48h，收集菌体。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：向步骤(2)制备得到的曲中加入2-3倍质量的盐水，盐水质量分数为18-20％的氯化钠溶液，将成曲与盐水混合均匀，以1:3-3:1的数量比例同时接种木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌，于20-30℃继续发酵60-90d。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述冷却后的大豆是将挑选的大豆原料清洗、浸泡后沥水，在高压、110-125℃条件下蒸煮15-30min，取出后冷却至室温得到的。

9.权利要求1-8任一所述的方法在制备酱油中的应用。

10.权利要求1-8任一所述的方法在食品发酵领域中的应用。