CN101701206B - 一种利用废弃生物有机质生产微生物培养基氮源的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用废弃生物有机质生产微生物培养基氮源的方法，属于废弃物资源化领域，制备氮源用于微生物培养。对废弃生物有机质进行预处理，与处理液反应后收集蛋白液，将蛋白液在一定条件下水解后，进行脱色，浓缩、干燥处理，即得本发明用于微生物培养的制备氮源。本发明所制备氮源在表观形态上与市售氮源存在一致性，经精确分析，含有各种必需和非必需氨基酸，可以为微生物生长提供充足的营养，保证微生物的正常生长，不存在对微生物生长存在影响的残留物质，可用于多种微生物的固态和液态培养，并且有较好的培养效果。

Description

一种利用废弃生物有机质生产微生物培养基氮源的方法

技术领域

本发明涉及一种可用作-微生物培养基的氮源的制备方法。核心材料为发酵工业产生的废弃生物有机质。该氮源可以用于多种微生物的液态和固态培养。

背景技术

用于细菌、真菌等微生物培养中的培养基主要由氮源、碳源、无机盐、生长因子和水等成分组成。在微生物培养过程中，氮源的添加具有关键性的作用，常用作氮源的物质有牛肉膏、蛋白胨和酵母粉等。牛肉膏是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。蛋白胨是由蛋白质经酶、酸、碱水解而获得的一种肽、氨基酸组成的水溶性混合物。酵母浸粉实际上是膏状的酵母抽提物，酵母抽提物是以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色(或精制浓缩、喷雾干燥)而成的含氨基酸、多肽及酵母细胞水溶性成分的产品。这些产品中氮含量较高，在微生物培养中发挥了重要的作用，但是同样存在着原材料价格高、生产成本高、产品价格较昂贵的缺点，并且由于蛋白胨和牛肉膏同为动物源蛋白，其生物相容性、安全性等问题受到了人们的特别关注；同时酵母浸粉也存在干扰性方面的问题。因此，对于能够提供一种在生物相容性、安全性、培养效果等方面更优于蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉的氮源，用于制备微生物或动植物组织、细胞等培养的培养基，是十分必要的。

近几年，我国发酵工业有了突飞猛进的发展，在产生了可观的社会效益和经济效益的同时，发酵过程中产生的废弃生物有机质的处理成为困扰行业发展的一大难题。生物有机质是发酵工业生产中的主要废弃料，其中含有大量的菌体蛋白(约占干重的40％以上)、丰富的维生素、生长因子及培养基残留物等营养物质，也并存着微生物的各种有毒代谢产物及下游处理添加物等，通常采用的处理方法是焚烧，用作饲料、肥料等，生物有机质存在热值较低的缺点，焚烧后并不会产生高品质的热量，而且生物有机质中含有N、S等元素，焚烧会产生大量的有毒物质，造成严重的环境污染，限制了它的应用前景；微量的抗生素成份的存在，在用于饲喂畜禽或施于农田后，必然会造成环境生物的抗生素积累，降低抗生素的治疗作用，产生严重后果。生物有机质含有异常丰富的有机质，如不及时处理，会形成二次发酵，产生恶臭味，造成环境污染。

国内有少数厂家利用直接干燥的方法生产饲料蛋白，这种简单的物理干燥方法事实上无法除去以上毒物。对利用菌丝体废菌渣生产有机肥料等的研究也取得了一定的进展，其中由华药集团环保所承担的“利用生物有机质生产有机肥料技术”近日通过技术鉴定，此研究项目达到了国内同类研究的领先水平。从废弃生物有机质中提取壳聚糖，生产麦角固醇，以及将废弃生物有机质用于重金属离子吸附树脂的制备，都有了很大程度上的研究进展。但是，对废弃生物有机质中含量最高的蛋白质的提取一直是研究中的空白，本发明重点介绍一种利用废弃生物有机质提取氮源类物质，并将其用于微生物培养的方法。在提取结束后，可以对剩余物质继续进行麦角固醇和多糖类物质的提取，从而完成对废弃生物有机质的综合利用的目的，取得良好的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的一种利用发酵工业废弃生物有机质生产微生物培养基氮源的方法是一种利用废弃生物有机质提取氮源类物质，并将其用于多种微生物培养的方法。

本发明的技术方案是将废弃生物有机质中的氮源物质提取分离，以用于多种微生物的培养，成本低廉，同市售氮源相比，有相似的培养效果。

1)本发明提供一种利用废弃生物有机质提取氮源类物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：对废弃生物有机质进行预处理，废弃生物有机质是天然生物材料，或者是废弃菌渣，将废弃生物有机质和处理液按固液比1∶1～1∶10g/ml在20～80℃下混合后，反应0.5～12小时，处理液浓度为0.01M～1M，上清液为蛋白富集相；

2)对蛋白富集相进行水解，蛋白富集相与水解液的体积比为1∶10～1∶1000，水解液浓度为0.01M～5M，添加缓冲液，缓冲液浓度为0.01M～5M，调节pH为4～10，达到最高的水解率，即经检测达到最高的吸光度，反应完全，之后将反应物在温度为20～80℃下水解0.5～12小时。

3)水解后进行脱色，浓缩工艺处理，在温度为40～90℃下干燥，即得本发明用于微生物培养的氮源物质。

本发明所使用的废弃生物有机质是天然生物材料，或者是废弃菌渣，天然生物材料为豆皮或玉米粉富含有机质的农副产品，废弃菌渣为有机酸发酵废菌渣、维生素发酵废菌渣、调味品发酵废菌渣、抗生素发酵废菌渣、食品发酵废菌渣、饲料发酵废菌渣或生物化工产品发酵废菌渣。

本发明中的处理液可以为各种酸液和碱液，其中酸液为无机酸和有机酸，无机酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸；有机酸为醋酸、乳酸、苯酚，碱液为：氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氨水或碳酸钠。

本发明中的水解液为酸液、碱液、生物酶液，酸液为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、醋酸、硼酸、乳酸、苯酚、偏铝酸或氢氧化铝，碱液为氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、三聚磷酸钠或碳酸钠，生物酶为蛋白酶，脂肪酶，纤维素酶，淀粉酶一种或多种的复合。

本发明中的缓冲液可以为各种酸液、碱液或各种盐类的溶液，其中酸液为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、醋酸、硼酸、乳酸、苯酚、偏铝酸或氢氧化铝，碱液为氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、三聚磷酸钠或碳酸钠，盐类为硫酸盐、碳酸盐、氯盐、各种金属盐类、磷酸盐、醋酸盐或硼酸盐。

本发明具有以下优点：

1、既解决了发酵工业废弃有机质无法处理或者处理不当导致二次污染的棘手问题，又实现了废弃物的综合再利用。

2、工艺路线简单，可操作性强，主要原料来源广泛，成本低廉。

3、用本发明制备的可用作微生物培养基的氮源，安全无污染，含有丰富的蛋白质、多肽、小肽和核酸类物质，含氮量较高，物化性质稳定，可长时间保存不变性。

4、本发明制备的可用作微生物培养基的氮源在表观形态上与市售氮源存在一致性，表观形态主要包括：味道、颜色、形态等。

5、本发明制备的可用作微生物培养基的氮源经过严格化学检测发现：粗蛋白含量较高，与市售氮源基本一致，经精确氨基酸成分分析发现：含有各种必需和非必需氨基酸，并且基础含量较高，可以为微生物生长提供充足的营养，保证微生物正常生长。

6、本发明制备的可用作微生物培养基的氮源经过严格生物检测发现，不存在对微生物生长存在影响的残留物质，如孢子、抗生素等，不影响微生物的正常生长等。

7、采用本发明制备的氮源替代培养基中的氮源可用于多种微生物培养的固态和液态培养，实验结果表明：本发明制备的氮源可以代替市售氮源而用于实验室中多种真菌、细菌等液态和固态培养，并且取得了较好的培养效果。

具体实施方式

本发明中微生物生长情况的表征方法为：采用血球计数板法测定微生物的生长情况，与普通培养基比较，比较制备氮源用作微生物培养后的微生物的生长情况。

实施例1

在50g湿柠檬酸废弃菌丝体中加入500ml的0.01MNaOH，在80℃加热反应0.5h，过滤后，去除沉淀，在蛋白富集相中添加0.1ml的1MH₂SO₄进行缓冲，调节pH为4，再添加0.5ml，0.01M纤维素酶，在温度为80℃下水解0.5小时，经检测达到最高的吸光度，即反应完全。将上述所得反应液水解后进行脱色、浓缩工艺处理，利用烘箱在90℃下烘干，烘干后粉碎成粉末状，即为产品。

将产品处理后用作微生物培养，培养结果如下：

将产品用于大肠杆菌的培养，采用细菌液态培养基(表1)，代替表1中牛肉膏作为氮源，在37℃培养24h，取得了良好的培养效果。

将产品用于大肠杆菌的培养，采用细菌固态培养基(表2)，代替表2中牛肉膏作为氮源，在37℃培养24h，取得了良好的培养效果。

将产品用于金黄色葡萄球菌的培养，采用细菌液态培养基(表1)，代替表1中蛋白胨作为氮源，在37℃培养24h，取得了良好的培养效果。

将产品用于金黄色葡萄球菌的培养，采用细菌固态培养基(表1)，代替表1中蛋白胨作为氮源，在37℃培养24h，取得了良好的培养效果。

将产品用于酵母菌的培养，采用酵母菌液态培养基(表3)，代替表3中酵母粉，在30℃培养30h，取得了良好的培养效果。

将产品用于酵母菌的培养，采用酵母菌固态培养基(表4)，代替表4中酵母粉，在30℃培养30h，取得了良好的培养效果。

实施例2、实施例3、实施例4的操作方法同实施例1，操作参数见表1。

实施例5

在50g废弃豆皮中加入50ml的1MKOH，在40℃加热反应12h，过滤后，去除沉淀，在蛋白富集相中添加一定量的0.01M醋酸进行缓冲，调节pH为10，再添加5ml，1M盐酸，在温度为20℃下水解12小时，经检测达到最高的吸光度，即反应完全。将上述所得反应液水解后进行脱色、浓缩工艺处理，利用烘箱在60℃下烘干，烘干后粉碎成粉末状，即为产品。

将产品处理后用作微生物培养，培养结果如下：

将产品用于大肠杆菌的培养，采用细菌液态培养基(表2)，代替表2中牛肉膏作为氮源，在37℃培养24h，取得了良好的培养效果。

将产品用于大肠杆菌的培养，采用细菌固态培养基(表3)，代替表3中牛肉膏作为氮源，在37℃培养24h，取得了良好的培养效果。

将产品用于金黄色葡萄球菌的培养，采用细菌液态培养基(表2)，代替表2中蛋白胨，在37℃培养24h，取得了良好的培养效果。

将产品用于金黄色葡萄球菌的培养，采用细菌固态培养基(表3)，代替表3中蛋白胨，在37℃培养24h，取得了良好的培养效果。

将产品用于酵母菌的培养，采用酵母菌液态培养基(表4)，代替表4中酵母粉，在30℃培养30h，取得了良好的培养效果。

将产品用于酵母菌的培养，采用酵母菌固态培养基(表5)，代替表5中酵母粉，在30℃培养30h，取得了良好的培养效果。

表1：

表2：细菌液态培养基

表3：细菌固态培养基

表4：酵母菌液态培养基

表5：酵母菌固态培养基

Claims (1)

1.一种利用废弃生物有机质生产微生物培养基氮源的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对废弃生物有机质进行预处理，废弃生物有机质是天然生物材料，或者是废弃菌渣，将废弃生物有机质和处理液按固液比1∶1～1∶10g/ml在20～80℃下混合后，反应0.5～12小时，处理液浓度为0.01M～1M，上清液为蛋白富集相；

2)对蛋白富集相进行水解，蛋白富集相与水解液的体积比为1∶10～1∶1000，水解液浓度为0.01M～5M，添加缓冲液，缓冲液浓度为0.01M～5M，调节pH为4～10，达到最高的水解率，之后将反应物在温度为20～80℃下水解0.5～12小时；

3)水解后进行脱色，浓缩工艺处理，在温度为40～90℃下干燥，即得本发明用于微生物培养的氮源物质；

步骤1)中所用的天然生物材料为豆皮，废弃菌渣为维生素发酵废菌渣、柠檬酸发酵废菌渣、青霉素发酵废菌渣或啤酒发酵废菌渣；

步骤1)中的处理液为硫酸、醋酸、氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钙；

步骤2)中的水解液为盐酸、醋酸、氢氧化钠、中性蛋白酶与醋酸的复合、或纤维素酶；

步骤2)中的缓冲液硫酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸钠或磷酸二氢钾。