CN108828106A - 一种检测草菇中氨基酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测草菇中氨基酸含量的方法，涉及氨基酸检测技术领域。该检测方法包括：往装有草菇样品的水解管中加入盐酸，涡旋震荡，进行第一次提取，然后再加入盐酸，涡旋震荡，进行第二次提取，然后再补加盐酸至预设体积；预设体积与草菇样品的体积质量比为10‑15:1。在测定氨基酸含量时，通过将盐酸分阶段地加入到样品中进行水解时，可以使样品中的氨基酸更充分地溶出，减少检测的氨基酸含量与真实的氨基酸含量之间的差异，提高检测结果的可靠性。

Description

一种检测草菇中氨基酸含量的方法

技术领域

本发明涉及氨基酸检测技术领域，具体而言，涉及一种检测草菇中氨基酸含量的方法。

背景技术

草菇(Volvariella volvacea(Bull.:Fr.)Sing.)又名兰花菇、苞脚菇起源于广东韶关的南华寺中，300年前我国已开始人工栽培，在20世纪约30年代由华侨传入世界各国，是一种重要的热带亚热带菇类，是世界上第三大栽培食用菌，我国草菇产量居世界之首，主要分布于华南地区。

草菇因其风味独特，营养成分高、药用效果好而具有很高的营养和食用价值。

草菇是一种优质的食用菌。蛋白质含量的高低通常作为评价食品营养价值高低的重要依据，草菇具有高蛋白低脂肪的特点。鲜草菇中蛋白质含量占干重的2.66％-5.05％，与日常食用的常见蔬菜相比较，其蛋白含量是土豆和芦笋的2倍，番茄和胡萝卜的4倍，柑橘的6倍。此外，草菇子实体内含有18种氨基酸，其中含有8种人类不能合成或者转化的必需氨基酸，并且这8种必需氨基酸的含量较高，占其氨基酸总量的38.2％。

经常食用草菇对人体具有保健作用。众所周知，食用维生素含量高的食物，可以促进人体新陈代谢的正常进行，增强机体对传染病的抵抗能力，加速伤口的愈合，并能防止坏血病的发生。草菇子实体中含有一种称为异种蛋白质的物质，具有抗癌作用，其含有的氮浸出物和嘌呤碱也能抑制癌细胞的生长。另外，夏天食用草菇具有防暑清热的作用。

草菇生长喜好高温高湿环境，适合在热带、亚热带地区栽培，温度的突然波动极不利于草菇的生长发育，极大地影响草菇的品质和产量。另外，草菇的生长还需要较高的湿度，由于我国长江以北地区，大部分时间温度较低，气候干燥，适应草菇种植的时间极短，不利于大规模栽培，这极大地制约了草菇的栽培范围，因此草菇目前的产量还远远达不到市场的要求，尤其草菇中优质蛋白质的供应还不能满足消费者日益增长的需求。但是目前关于提高草菇的蛋白质含量的研究很少。目前已有的提高蛋白质含量的方法有通过添加三十烷醇、维生素B1、磷酸二氢钾现有培养草菇培养技术存在草菇氨基酸含量相对低、菌丝短小。密度低、生长速度慢等缺点。此外，现有的检测草菇中的氨基酸含量的方法的准确性较低，不能反映出草菇中氨基酸实际含量。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种草菇培养基，采用该草菇培养基培养草菇可以提高草菇的氨基酸含量。

本发明的目的在于提供上述草菇培养基的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种培养草菇的方法，该培养方法可以提高草菇的氨基酸含量。

另一方面，本发明还提供了一种草菇，其有上述的培养方法培养得到。

本发明的另一目的在于提供一种检测草菇中氨基酸含量的方法，该检测方法能够更准确地检测出草菇样品中的氨基酸含量，提高检测结果的可信度。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种草菇培养基，其含有：土豆水提物、葡萄糖、蛋白胨以及豆粕水提物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，按重量份计，所述草菇培养基含有：

葡萄糖18-22份、蛋白胨4-8份以及豆粕水提物20-30份，土豆水提物与葡萄糖的体积质量比为14-16:1。

相较于现有的普通培养基，本发明提供的培养基通过加入蛋白胨和豆粕水提取物可以使草菇呈现良好的羊肚菌生长态势，表现出菌丝粗壮、密度大和生长速度快的特点。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述草菇培养基还含有添加剂，所述添加剂选自硫酸钙、硫酸镁、水杨酸和茉莉酮酸甲酯中的一种或多种的组合。

在本发明的进一步研究中，发明人发现，在培养基中添加硫酸钙、硫酸镁、水杨酸和茉莉酮酸甲酯中的任一种物质也可以提高草菇的氨基酸含量。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，硫酸钙在草菇培养基中的浓度为0.5％-5％。

例如，在本发明的一些实施方案中，硫酸钙在草菇培养基中的浓度可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％和5％中的任意一者或两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，硫酸镁在草菇培养基中的浓度为1％-7.5％。

例如，硫酸镁在草菇培养基中的浓度可以是1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％和7.5％中的任意一者或两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，水杨酸在草菇培养基中的浓度为0.00001％-0.01％。

例如，水杨酸在草菇培养基中的浓度可以是0.00001％、0.0001％、0.0001％、0.001％和0.01％中的任意一者或两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，茉莉酮酸甲酯在草菇培养基中的浓度为0.000001％-0.0001％。

例如，茉莉酮酸甲酯在草菇培养基中的浓度可以是0.000001％、0.00001％和0.0001％中的任意一者或两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述豆粕水提物按如下方法制得：

用水煎煮豆粕，过滤，取滤液即得所述豆粕水提物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，煎煮时，所用豆粕与所用水的质量体积比为1:22-30。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述豆粕水提物按如下方法制得：25g豆粕用500mL水煮沸15-20min，过滤，取滤液，即得豆粕水提物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述土豆水提物通过如下方法制备：将土豆与水混合，煮沸，过滤，取滤液，作为上述土豆水提物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述土豆水提物通过如下方法制备：称取200g土豆，切成长约3cm的小块，加入500ml水，煮沸15-20min；然后使用纱布进行过滤，取滤液，作为上述土豆水提物。

另一方面，本发明还提供了上述的草菇培养基的制备方法，其包括：将土豆与水混合，煮沸，过滤，取滤液，作为土豆水提物；

将葡萄糖、蛋白胨以及豆粕水提物与土豆水提物混合，灭菌，得所述草菇培养基。

需要说明的是，在实际的情况中，可以根据情况添加琼脂，制备成固体培养基。

另一方面，本发明提供了一种培养草菇的方法，其包括如下步骤：将草菇菌种接种至草菇培养基上，所述草菇培养基含有：土豆水提物、葡萄糖、蛋白胨、琼脂以及豆粕水提物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，按重量份计，所述草菇培养基含有：

葡萄糖18-22份、蛋白胨4-8份、琼脂15-20份以及豆粕水提物20-30份，土豆水提物与葡萄糖的体积质量比为14-16:1。

相较于现有的普通培养基，本发明提供的培培养方法通过加入蛋白胨和豆粕提取物到培养基中可以使草菇呈现良好的羊肚菌生长态势，表现出菌丝粗壮、密度大和生长速度快的特点。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述草菇培养基还含有添加剂，所述添加剂选自硫酸钙、硫酸镁、水杨酸和茉莉酮酸甲酯中的一种或多种的组合。

在本发明的进一步研究中，发明人发现，在培养基中添加硫酸钙、硫酸镁、水杨酸和茉莉酮酸甲酯中的任一种物质也可以提高草菇的氨基酸含量。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，硫酸钙在草菇培养基中的浓度为0.5％-5％。

例如，在本发明的一些实施方案中，硫酸钙在草菇培养基中的浓度可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％和5％中的任意一者或两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，硫酸镁在草菇培养基中的浓度为1％-7.5％。

例如，硫酸镁在草菇培养基中的浓度可以是1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％和7.5％中的任意一者或两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，水杨酸在草菇培养基中的浓度为0.00001％-0.01％。

例如，水杨酸在草菇培养基中的浓度可以是0.00001％、0.0001％、0.0001％、0.001％和0.01％中的任意一者或两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，茉莉酮酸甲酯在草菇培养基中的浓度为0.000001％-0.0001％。

例如，茉莉酮酸甲酯在草菇培养基中的浓度可以是0.000001％、0.00001％和0.0001％中的任意一者或两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述豆粕水提物按如下方法制得：

用水煎煮豆粕，过滤，取滤液即得所述豆粕水提物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，煎煮时，所用豆粕与所用水的质量体积(g:ml)比为1:22-30。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述豆粕水提物按如下方法制得：25g豆粕用500mL水煮沸15-20min，过滤，取滤液，即得豆粕水提物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述土豆水提物通过如下方法制备：将土豆与水混合，煮沸，过滤，取滤液，作为土豆水提物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述土豆水提物通过如下方法制备：称取200g土豆，切成长约3cm的小块，加入500ml水，煮沸15-20min；然后使用纱布进行过滤，取滤液，作为土豆水提物。

另一方面，本发明还提供了一种草菇，其由上述的方法培养得到。

该草菇营养丰富，含有丰富的氨基酸。

另一方面，本发明还提供了一种检测草菇中氨基酸含量的方法，其包括制备出样品测定液的试样水解步骤和检测步骤：

所述试样水解步骤包括：

步骤(a)：往装有草菇样品的水解管中加入盐酸，涡旋震荡，进行第一次水解，然后再加入盐酸，涡旋震荡，进行第二次水解，然后再补加盐酸至预设体积；

所述预设体积与草菇样品的体积质量比(mL:g)为10-15:1。

本发明的发明人发现，在测定氨基酸含量时，通过将盐酸分阶段地加入到样品中进行水解时，可以使样品中的氨基酸更充分地溶出，减少检测的氨基酸含量与真实的氨基酸含量之间的差异，提高检测结果的可靠性，提高检测结果的可靠性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第一次水解时，所用盐酸的浓度为7.8-8.2mol/L。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第一次水解时，所用盐酸的体积为预设体积的8％-12％。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第二次水解时，所用盐酸的浓度为6.8-7.2mol/L。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第二次水解时，所用盐酸的体积为预设体积的8％-12％。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在第二次水解后，补加的盐酸浓度为5.8-6.2mol/L。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述草菇样品的蛋白质含量为10mg-20mg。

需要说明的是，上述预设体积为待测样品重量的9-11倍(mL:g)，例如10倍，即1g样品，对应的预设体积为10ml。

氨基酸含量分析过程中加入盐酸的作用是酸水解蛋白质，通过酸的作用破坏蛋白质中间的肽键，由于本样品为草菇的菌丝体，该样品与其他干品或者食品相比较，具有水分含量较高，蛋白质含量相对较低的特点。为了能够增加氨基酸的提取效率，本发明特选择梯度加酸水解法。该方法的优点是针对草菇菌丝的细胞壁中几丁质以及纤维素等成分含量较高且样品中水分含量高，故先利用高浓度酸水解细胞壁成分，释放蛋白质，同时保持有效水解肽键的酸浓度，提高氨基酸的提取效率。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试样水解步骤还包括如下步骤：

步骤(b)：往水解管内加入苯酚，将水解管置于冷冻剂中，冷冻3min～5min，然后重复抽真空-充入氮气，重复3-4次；

步骤(c)：将水解管置于100-120℃条件进行水解，水解时间20-22h，得到水解液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试样水解步骤还包括如下步骤：

步骤(d)：过滤所述水解液，将滤液转入容量瓶，用水定容至刻度，吸取1.0mL滤液移入到试管内，用试管浓缩仪或平行蒸发仪在40℃～50℃加热环境下减压干燥，干燥后残留物用1mL～2mL水溶解，再减压干燥，蒸干；

步骤(e)：用1.0mL～2.0mL pH 2.0-2.2柠檬酸钠缓冲溶液加入到干燥后的试管内溶解，振荡混匀后，吸取溶液，通过滤膜后，转移至仪器进样瓶，作为样品测定液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述检测步骤包括：将混合氨基酸标准工作液和所述样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪中，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。

本发明的发明人发现，在测定氨基酸含量时，通过将盐酸分阶段地加入到样品中进行水解时，可以使样品中的蛋白质更充分地溶出，避免检测结果低于实际结果的现象，有利于提高检测结果的准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实验例1中的采用实施例2-5的草菇培养基所培养出的草菇菌丝体中的氨基酸含量检测结果；

图中：纵坐标表示氨基酸的含量(mg/kg)，横坐标V1-1,V1-2,V1-3,V1-4,V1-5分别表示培养基中硫酸钙的浓度分别为：0％，0.5％，1％，2％，5％。

图2为实验例1中的采用实施例6-9的草菇培养基所培养出的草菇菌丝体中的氨基酸含量检测结果；

图中：纵坐标表示氨基酸的含量(mg/kg)，横坐标V2-1,V2-2,V2-3,V2-4,V2-5分别表示培养基中硫酸镁的配制浓度分别为：0％，1％，2.5％，5％，7.5％。

图3为实验例1中的采用实施例10-13的草菇培养基所培养出的草菇菌丝体中的氨基酸含量检测结果；

图中：纵坐标表示氨基酸的含量(mg/kg)，横坐标V3-1,V3-2,V3-3,V3-4,V3-5分别表示培养基中水杨酸的浓度分别为：0％、0.00001％、0.0001％、0.001％，0.01％。

图4为实验例1中的采用实施例14-16的草菇培养基所培养出的草菇菌丝体中的氨基酸含量检测结果；

图中：纵坐标表示氨基酸的含量(mg/kg)，横坐标V4-1,V4-2,V4-3,V4-4分别表示培养基中茉莉酮酸甲酯的浓度分别为：0％、0.000001％、0.00001％、0.0001％。

图5为实验例2中的采用不同的氨基酸含量分析方法针对同一样品得到的氨基酸含量检测结果。

图6为氨基酸标准液的色谱图；图中：A为各种氨基酸的标准图谱；B为标准图谱的相关参数。

图7为草菇菌种分别接种中普通PDA培养基和本发明实施例1的培养基上的菌丝生长图；图中：A为普通PDA培养基，B为实施例1的培养基。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、以及豆粕水提物25份。

其中，豆粕水提物溶液通过如下方法制备：

25g豆粕用500mL水煮沸20min，过滤，取滤液即得豆粕水提物溶液，约300mL，备用。

以制备1000ml的草菇培养基为例，对草菇培养基的制备方法进行说明，如下：

称取200g土豆，切成长约3cm的小块，加入500ml水，煮沸15-20min；然后使用纱布进行过滤，取滤液，即为土豆水提物溶液。取土豆水提物溶液300ml，再取20g葡萄糖、5g蛋白胨、25g豆粕水提物溶液和10g琼脂加入到滤液中，加水补齐至1000mL，pH自然，高压灭菌，121℃，20min。

采用本实施例的草菇培养基培养基接种草菇菌种，以普通PDA培养基作为对照，观察草菇的生长态势，结果见图7，可以看出相对普通PDA培养基(图7A)，采用实施例1的培养基可以使草菇呈现良好的羊肚菌生长态势，表现出菌丝粗壮、密度大和生长速度快的特点(图7B)。

实施例2

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、豆粕水提物25份，以及质量体积比(g:ml)为0.5％的硫酸钙。

其中，以制备1000ml的草菇培养基为例，对草菇培养基的制备方法进行说明，如下：

取土豆水提物溶液(其制备方法同实施例1)300ml，20g葡萄糖、5g蛋白胨、25g豆粕水提物、适量的二水硫酸钙和10g琼脂加入到滤液中，加水补齐至1000mL，pH自然，高压灭菌，121℃，20min。其中，二水硫酸钙的添加量使其保证硫酸钙在1000ml的草菇培养基中的终浓度为0.5％即可。

实施例3

本实施例提供的草菇培养基成分和制备方法与实施例2相同，不同的是硫酸钙的浓度为1％。

实施例4

本实施例提供的草菇培养基成分和制备方法与实施例2相同，不同的是硫酸钙的浓度为2％。

实施例5

本实施例提供的草菇培养基成分和制备方法与实施例2相同，不同的是硫酸钙的浓度为5％。

实施例6

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、豆粕水提物25份，以及质量浓度为1％的硫酸镁。

该草菇培养基的制备方法同实施例2，用七水硫酸镁代替二水硫酸钙，控制硫酸镁的在草菇培养基中的终浓度为1％即可。

实施例7-9

实施例7-9提供的草菇培养基与实施例7基本相同，不同的是硫酸镁的浓度不同，实施例7提供的草菇培养基的硫酸镁浓度为2.5、实施例8提供的草菇培养基的硫酸镁浓度为5％、实施例9提供的草菇培养基的硫酸镁浓度为7.5％。

实施例10

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、豆粕水提物25份，以及浓度为0.00001％(质量体积比(g:ml))的水杨酸。

以制备1000ml的草菇培养基为例，对本实施例的草菇培养基的制备方法进行说明，如下：

称取200g土豆，加入适量的水，煮沸15-20min；然后使用纱布进行过滤，取滤液；取20g葡萄糖、5g蛋白胨、25g豆粕水提物、0.0001g水杨酸(此处水杨酸需要先溶于有机溶剂，然后加入到培养基中)和10g琼脂加入到滤液中，加水补齐至1000mL，pH自然，高压灭菌，121℃，20min。

其中，溶解水杨酸的方法如下：

准确称取1.0000g水杨酸，加入无水乙醇溶解至终体积为10mL。用移液枪吸取1mL上述溶解液10倍稀释于加热的蒸馏水和乙醇混合溶液(V：V＝5:4)中，充分溶解(此时，水杨酸浓度为0.01g/mL)。根据水杨酸的添加量，以10倍梯度稀释于蒸馏水中。得到不同水杨酸含量的稀释液。根据水杨酸的添加量，选取合适稀释倍数的稀释将其加入到培养基中即可。

例如，取10mL浓度为0.0001g/10mL的水杨酸稀释液，然后加入到终体积控制为1000mL的培养基中，得到含0.00001％水杨酸的培养基。

实施例11

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、豆粕水提物25份，以及浓度为0.0001％的水杨酸。

实施例12

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、豆粕水提物25份，以及浓度为0.001％的水杨酸。

实施例13

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、豆粕水提物25份，以及浓度为0.01％的水杨酸。

实施例14

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、豆粕水提物25份，以及浓度为0.000001％的茉莉酮酸甲酯。

以制备1000ml的草菇培养基为例，对本实施例的草菇培养基的制备方法进行说明，如下：

称取200g土豆，加入适量的水，煮沸15-20min；然后使用纱布进行过滤，取滤液；取20g葡萄糖、5g蛋白胨、25g豆粕水提物、0.00001g茉莉酮酸甲酯(需要先溶解于有机溶剂，然后加到培养基中)和10g琼脂加入到滤液中，加水补齐至1000mL，pH自然，高压灭菌，121℃，20min。

溶解茉莉酮酸甲酯的方法如下：

使用移液枪吸取1mL茉莉酮酸甲酯溶解于9mL无水乙醇中，然后10倍稀释到蒸馏水中，得到浓度为0.00001g/10mL的茉莉酮酸甲酯稀释液。其中，稀释倍数根据添加到培养基中的茉莉酮酸甲用量确定。

例如，取10mL浓度为0.00001g/10mL的茉莉酮酸甲酯稀释液全部加入到终体积控制为1000mL的培养基中，这样既得到含0.000001％的茉莉酮酸甲酯的培养基。

实施例15

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、豆粕水提物25份，以及浓度为0.00001％的茉莉酮酸甲酯。

实施例16

本实施例提供的草菇培养基，按重量份计，其含有土豆200份、葡萄糖20份、蛋白胨5份、琼脂10份、豆粕水提物25份，以及浓度为0.0001％的茉莉酮酸甲酯。

实施例17

本实施例提供了一种培养草菇的方法，其包括：

将草菇V23的菌种接种至实施例2-16中任意一种草菇培养基上，然后置于37℃培养，即可得到草菇菌丝体。

相对普通培养基，采用实施例2-16的培养基可以使草菇呈现良好的羊肚菌生长态势，表现出菌丝粗壮、密度大和生长速度快的特点。

实验例1

检测采用实施例2-16的草菇培养基所培养得到的草菇菌丝体中的氨基酸含量。

1草菇菌丝体样品收集，方法如下：

无菌环境下将灭好菌的实施例2-16的草菇培养基倒入灭过菌且干燥的培养皿，待其凝固；

将凝固后的培养基表明贴上一层裁剪好且灭过菌的玻璃纸(注意：玻璃纸大小以略小于培养皿为宜，过大或过小都不宜)；

接种草菇V23，每种培养基接5个培养皿以保证之后收集到足够的菌丝，于37℃培养箱中培养3天；待其完全长满培养皿时取出，刮取菌丝，并收集于5mL离心管中，存放于-70℃冷冻以备用。

氨基酸含量分析：

2试剂的配制

盐酸溶液(6mol/L):取500mL盐酸加水稀释至1000mL，混匀。

冷冻剂:市售食盐与冰块按质量1∶3混合。

氢氧化钠溶液(500g/L):称取50g氢氧化钠，溶于50mL水中，冷却至室温后，用水稀释至100mL，混匀。

柠檬酸钠缓冲溶液[c(Na⁺)＝0.2mol/L]:称取19.6g柠檬酸钠加入500mL水溶解，加入16.5mL盐酸，用水稀释至1000mL，混匀，用6mol/L盐酸溶液或500g/L氢氧化钠溶液调节pH至2.2。

不同pH和离子强度的洗脱用缓冲溶液:参照仪器说明书配制或购买。

3标准溶液配制

1)混合氨基酸标准储备液(1μmol/mL):分别准确称取单个氨基酸标准品(精确至0.00001g)于同一50mL烧杯中，用8.3mL 6mol/L盐酸溶液溶解，精确转移至250mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀，各氨基酸标准品称量质量参考值见表1。

表1配制混合氨基酸标准储备液时氨基酸标准品的称量质量参考值

2)混合氨基酸标准工作液(100nmol/mL):准确吸取混合氨基酸标准储备液1.0mL于10mL容量瓶中，加pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液定容至刻度，混匀，为标准上机液。

4分析

1)样品制备

将步骤收集的草菇菌丝体使用组织粉碎机或研磨机粉碎，液体试样用匀浆机打成匀浆密封冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。

2)样品称量

均匀性好的样品，用万分天平准确称取1g样品(精确至0.0001g)，使试样中蛋白质含量在10mg～20mg范围内。对于蛋白质含量未知的样品，可先测定样品中蛋白质含量。将称量好的样品置于水解管中。

3)试样水解

(a)在水解管内入1mL的8mol/L盐酸，涡旋3min，加入1mL体积的7mol/L盐酸，涡旋2min再用6mol/L盐酸溶液补充至大约10mL(样品与终体积的质量体积比为1:10(g/mL))。

氨基酸含量分析过程中加入盐酸的作用是酸水解蛋白质，通过酸的作用破坏蛋白质中间的肽键，由于本样品为草菇的菌丝体，该样品与其他干品或者食品相比较，具有水分含量较高，蛋白质含量相对较低的特点，为了能够增加氨基酸的提取效率，本发明特选择梯度加酸水解法，该方法的优点是针对草菇菌丝的细胞壁中几丁质以及纤维素等成分含量较高且样品中水分含量高，故先利用高浓度酸水解细胞壁成分，释放蛋白质，同时保持有效水解肽键的酸浓度，提高氨基酸的提取效率。

(b)向水解管内加入苯酚3滴～4滴。将水解管放入冷冻剂中，冷冻3min～5min，接到真空泵的抽气管上，抽真空(接近0Pa)，然后充入氮气，重复抽真空-充入氮气3次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。

(c)将已封口的水解管放在110℃±1℃的电热鼓风恒温箱或水解炉内，水解22h后，取出，冷却至室温。

(d)打开水解管，将水解液过滤至50mL容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一50mL容量瓶内，最后用水定容至刻度，振荡混匀。

准确吸取1.0mL滤液移入到15mL或25mL试管内，用试管浓缩仪或平行蒸发仪在45℃加热环境下减压干燥，干燥后残留物用1mL～2mL水溶解，再减压干燥，最后蒸干。

(e)用1.5mL pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液加入到干燥后试管内溶解，振荡混匀后，吸取溶液，通过0.22μm滤膜后，转移至仪器进样瓶，为样品测定液，供仪器测定用。

4)检测

混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，(Hitachi L-8900Amino Acid Analyzer(Tokyo,Japan))以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。

色谱参考条件：

色谱柱：磺酸型阳离子树脂；

检测波长：570nm和440nm；

标准溶液：

Amino Acids Mixture Standard Solution,Type H(lot TWK6209Wako PureChemical Industries,Ltd.)；

标准溶液配制：取0.400mL氨基酸混合标准溶液用水定容至10.00mL。

氨基酸分析仪分离柱：

4.6mmI.D.×60mm L packed with Hitachi custom ion exchange resin(Partical size:3μm)，钠型(产品型号#2622)；

脱氨柱：4.6mm I.D.×40mm L(产品型号#2650L)；

反应柱：4.6mm I.D.x40mm L，内置惰性金刚砂小颗粒；

进样量：20μL；

流速：0.4ml/min；柱温：57℃；反应液流速：0.35ml/min；反应温度：135℃。

5)结果

结果见表2-表5和图1-图4，图6。

表2采用实施例2-5的草菇培养基所培养出的草菇菌丝体中的氨基酸含量检测结果(单位：mg/kg)

表3采用实施例6-9的草菇培养基所培养出的草菇菌丝体中的氨基酸含量检测结果(单位：mg/kg)

表4采用实施例10-13的草菇培养基所培养出的草菇菌丝体中的氨基酸含量检测结果(单位：mg/kg)

表5采用实施例14-16的草菇培养基所培养出的草菇菌丝体中的氨基酸含量检测结果(单位：mg/kg)

从表2-表5，和图1-图4结果可以看出，添加硫酸钙、硫酸镁、水杨酸或茉莉酸甲酯均能提高草菇菌丝体中的氨基酸含量，尤其是添加0.0001％浓度的茉莉酸甲酯，其氨基酸总量达33801mg/kg，即每kg草菇菌丝体含有33801mg总氨基酸，较其他实施例都高，这一结果是本发明的发明人不曾预料的。

实验例2

实验组：采用实施例1得到的草菇菌丝体，分析其氨基酸含量，实验组的分析方法与实验例1中的步骤2-步骤4基本相同；

对照组：与实验组相同，不同的是以在试样水解步骤中的(a)步骤中按如下处理：在水解管内一次性加10mL 6mol/L盐酸溶液进行水解。

结果见图5，可以看出，实验组的氨基酸含量高于对照组，由此表明实验例1中的氨基酸含量分析方法能够使样品中的蛋白质更充分地溶出到样品测定溶液中，提高检测结果的准确性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，其包括制备样品测定液的试样水解步骤和检测步骤：

所述试样水解步骤包括：

步骤(a)：往装有草菇样品的水解管中加入盐酸，涡旋震荡，进行第一次提取，然后再加入盐酸，涡旋震荡，进行第二次提取，然后再补加盐酸至预设体积；

所述预设体积与草菇样品的体积质量比为10-15:1。

2.根据权利要求1所述的检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，第一次水解时，所用盐酸的浓度为7.8-8.2mol/L。

3.根据权利要求2所述的检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，第一次水解时，所用盐酸的体积为预设体积的8％-12％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，第二次水解时，所用盐酸的浓度为6.8-7.2mol/L。

5.根据权利要求4所述的检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，第二次水解时，所用盐酸的体积为预设体积的8％-12％。

6.根据权利要求1-3任一项所述的检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，在第二次水解后，补加的盐酸浓度为5.8-6.2mol/L。

7.根据权利要求1-3任一项所述的检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，所述草菇样品的蛋白质含量为10mg-20mg。

8.根据权利要求1-3任一项所述的检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，所述试样水解步骤还包括如下步骤：

步骤(b)：往水解管内加入苯酚，将水解管置于冷冻剂中，冷冻3min～5min，然后重复抽真空-充入氮气，重复3-4次；

步骤(c)：将水解管置于100-120℃条件进行水解，水解时间20-22h，得到水解液。

9.根据权利要求8所述的检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，

所述试样水解步骤还包括如下步骤：

步骤(d)：过滤所述水解液，将滤液转入容量瓶，用水定容至刻度，吸取1.0mL滤液移入到试管内，用试管浓缩仪或平行蒸发仪在40℃～50℃加热环境下减压干燥，干燥后残留物用1mL～2mL水溶解，再减压干燥，蒸干；

步骤(e)：用1.0mL～2.0mL pH 2.0-2.2柠檬酸钠缓冲溶液加入到干燥后的试管内溶解，振荡混匀后，吸取溶液，通过滤膜后，转移至仪器进样瓶，作为样品测定液。

10.根据权利要求9所述的检测草菇中氨基酸含量的方法，其特征在于，所述检测步骤包括：将混合氨基酸标准工作液和所述样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪中，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。