CN101298622A

CN101298622A - 一种基因工程菌在制备泛酸中的应用

Info

Publication number: CN101298622A
Application number: CNA2007100684294A
Authority: CN
Inventors: 裘娟萍; 张潇潇; 高丽娟
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2007-04-30
Filing date: 2007-04-30
Publication date: 2008-11-05

Abstract

本发明提供了一种基因工程菌在制备泛酸中的应用，所述的基因工程菌通过如下方法制备得到：利用PCR扩增含有panD基因的供体菌的L－天冬氨酸α－脱羧酶基因panD，并将其克隆到能高效表达外源基因的质粒上，得到panD基因高表达载体，再将所得的panD基因高表达载体转化入受体菌，即得到所述的基因工程菌。本发明的有益效果主要体现在：(1)所得基因工程菌合成泛酸的能力强；初步研究发现转化液中泛酸浓度可达到1.34g/L，而出发菌株用相同方法检测不出泛酸；(2)运用基因工程技术对大肠杆菌进行改良，育种目标明确、效率高。

Description

一种基因工程菌在制备泛酸中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种基因工程菌在制备泛酸中的应用。

(二)背景技术

泛酸(Pantothenic acid)，又名遍多酸、本多生酸、鸡抗皮炎因子，属于水溶性B族维生素，广泛分布于生物界中，于1933年从酵母中首次分离。泛酸在体内主要以辅酶A(CoA)形式参与糖、脂、蛋白质代谢。泛酸缺乏时，过氧化物酶体脂肪酸β-氧化受到抑制，并可能诱导脑部伤害。

泛酸是人及许多动物、微生物必须的营养物质。泛酸或D-泛酸钙被广泛地用作食品或饲料的营养添加剂。泛酸在临床上一直用于维生素B缺乏症、周围神经炎、手术后便梗塞、链霉素中毒及类风湿等；还可用于治疗斑秃、慢性炎症、抗氧和解决食欲不振、以及作为治疗肝紊乱的营养食品。另外，在食品上作为添加剂可增加食品风味。

D-泛酸钙的合成方法分为化学法和生物法，现在工业上普遍采用化学法。化学法首先要得到DL-泛解酸内脂。根据其合成起始原料的差异可分为三类：(1)异丁醛、甲醛法(即stiller法)；(2)异丁醛、羟乙腈法；(3)异丁醛、乙醛酸法。其中stiller法应用范为最广，现在改进的stiller法已不再使用剧毒NaCN。DL-泛解酸内脂可以采用手性试剂进行拆分(前拆分)，得到D-泛解酸内脂后直接与β-丙氨酸缩合得到DL-泛酸钙后采用物理方法进行拆分(后拆分)，即加入D-泛酸钙晶种诱导溶液中D-泛酸钙结晶。化学法生产成本高，生产场地安全性要求高，其原料、中间体及副产物有毒，对环境污染比较严重。

生物法分为直接发酵法和酶法转化与拆分，目前多处于研究阶段。

泛酸在生物体内主要通过泛解酸内酯和β-丙氨酸缩合生成。β-丙氨酸在生物体内有多条合成途径。国外对L-天冬氨酸脱羧获得β-丙氨酸已经有所研究。在L-天冬氨酸α-脱羧酶的作用下，L-天冬氨酸的α位羧基能立体特异性地脱去生成β-丙氨酸和CO₂，随着CO₂的释放，该反应基本上是不可逆的。1971年，Nakano等首先表明来自大肠杆菌B株的粗提取物中有此酶活性。1979年，Williamson等进一步研究了把大肠杆菌中的该酶纯化到表观均一后的酶活性。1980年，Cronan等也研究了β-丙氨酸在大肠杆菌中的合成，接着，人们又对该酶的晶体结构和形成机制进行了研究。但由于该酶的活性非常低，直接从自然界中筛选产酶高活力菌株比较困难，到目前为止还未见相关报道。1996年，美国NSC技术有限公司通过基因重组的方法，构建含该酶的菌株(NS3291)，用于拆分DL-天冬氨酸。

(三)发明内容

为解决现有技术中直接从自然界中筛选产酶高活力菌株比较困难、泛酸化学法生产成本高、对环境污染比较严重的不足，本发明提供了一种育种目标明确、效率高、合成β-丙氨酸的能力强的基因工程菌在制备泛酸中的应用。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种基因工程菌在制备泛酸中的应用，所述的基因工程菌通过如下方法制备得到：利用PCR扩增含有panD基因的供体菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD，并将其克隆到能高效表达外源基因的质粒上，得到panD基因高表达载体，再将所得的panD基因高表达载体转化入受体菌，即得到所述的基因工程菌。

所述供体菌优选为含有panD基因的埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、分枝杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、变形菌属、固氮菌属、根瘤菌属、克雷伯氏菌属、螺杆菌属、李斯特菌属、蛭弧菌属、产碱杆菌属、弗朗西斯菌属、志贺氏菌属、嗜冷杆菌属或嗜肺军团菌属的细菌。

所述受体菌优选为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、结核分枝杆菌、枯草杆菌、天蓝色链霉菌或富养罗尔斯通氏菌。。

所述能高效表达外源基因的质粒优选为下列之一：①pET系列，②pUC系列，③pGEM系列，④pBluescript系列，⑤pEKEx2系列，⑥pCMVT^NT系列，⑦pGA1系列，⑧pJC1系列。

具体的，所述基因工程菌制备方法如下：

(1)PCR扩增供体菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD，PCR产物经凝胶回收后克隆至能高效表达外源基因的质粒上，得到panD基因高表达载体；

(2)步骤(1)所得的高表达载体转化宿主菌感受态细胞，获得含有panD基因高表达质粒的宿主菌细胞；

(3)步骤(2)所得的含有panD基因高表达质粒的宿主菌细胞，涂布到含卡那霉素的适宜于培养细菌的培养基如LB平板上，20～37℃培养6～24h，即得所述基因工程菌。

所述基因工程菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-panD(Escherchia.coli BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年10月27日，保藏编号CCTCC NO：M 206114。所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑，能发酵乳糖产酸产气，在伊红美蓝琼脂平板上呈现金龟子色。

所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-panD由如下方法制备得到：

(1)PCR扩增大肠杆菌DH5α的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD，PCR产物经凝胶回收后通过限制性内切酶BamH I/Hind III酶切后克隆至经BamH I/Hind III同样处理的质粒pET28b(+)载体上，得到重组质粒pET28b(+)-panD；

正向引物：AACGGATCCTATGATTCGCACGATGCTG，

反向引物：CCAAAGCTTAGCAACCTGTACCGGAATC，

PCR反应条件：

90～98℃变性1～10min；接着进行20～50个循环，参数为94～95℃，1～5min；50～70℃，1～3min；70～75℃，20～180s；最后72℃延伸2～30min；

(2)将大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等细菌感受态细胞，置于冰上，完全解冻后将细胞均匀悬浮，取步骤1)所得质粒pET28b(+)-panD，加入到感受态细胞中混匀，冰上放置5～30min，10～60℃水浴热激30～120s，再冰上放置5～30min；加入SOB(SOB培养基市购或自制，自制配方如下(终浓度计)：胰蛋白胨，20g/L；NaCl，0.5g/L；酵母膏，5g/L；MgSO₄·7H₂O，5g/L)或LB培养基(LB培养基可市购或自制，自制配方如下(终浓度计)：蛋白胨，10g/L；酵母膏，5g/L；NaCl，10g/L；pH7.0。)，20～37℃，50～250r/min振荡培养0.5～2h，室温下3000～5000r/min离心5～15min，吸去上清液，用培养液将细胞悬浮；

(3)将步骤2)的转化产物涂布于含10～100μg/mL卡那霉素的平板，20～37℃培养，长出菌种后重复传代两次，所得菌种提取质粒经酶切后琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定确认后保存菌种，即得所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD。

具体的，所述的应用为：将所述基因工程菌经斜面培养、种子培养、发酵培养，离心取菌体，加入底物泛解酸内酯至终浓度0.01～10mol/L，20～80℃、50～250r/min转化1～90h，反应液经分离纯化得到泛酸。所述的斜面培养基、种子培养基、发酵培养基均为培养大肠杆菌的适用培养基，可采用一切可用于培养大肠杆菌的常规培养基，如SOB或LB培养基等。

所述用于培养大肠杆菌的常规培养基，可市购，也可自制，SOB培养基自制配方如下(终浓度计)：胰蛋白胨，20g/L；NaCl，0.5g/L；酵母膏，5g/L；MgSO₄·7H₂O，5g/L；LB自制配方如下(终浓度计)：蛋白胨，10g/L；酵母膏，5g/L；NaCl，10g/L；pH7.0。斜面培养基为LB培养基再加入20g/L琼脂，在121℃下灭菌20min。

优选的，所述的应用为：将所述基因工程菌经斜面培养基20～37℃活化后接入种子培养基，在20～37℃、50～250r/min培养12～48h后，以0.1％～20％体积比接种量转入发酵培养基，20～37℃、50～250r/min培养1～24h后，加入诱导物D-半乳糖苷至终浓度0.01～1.5mmol/L或乳糖至终浓度0.1～50g/L，在20～37℃、50～250r/min培养12～48h后，离心取菌体，加入0.01～1mol/L的L-天门冬氨酸溶液，20～80℃、50～250r/min转化1～72h，加入底物泛解酸内酯至终浓度0.01～10mol/L，20～80℃、50～250r/min转化1～90h，反应液经分离纯化得到泛酸。

本发明的有益效果主要体现在：(1)所得基因工程菌合成泛酸的能力强；初步研究发现转化液中泛酸浓度可达到1.34g/L，而出发菌株用相同方法检测不出泛酸；(2)运用基因工程技术对大肠杆菌进行改良，育种目标明确、效率高。

(四)附图说明

图1为实施例1构建高表达载体pET28b(+)-panD图谱，kan为卡那霉素抗性基因；

图2为泛酸标准样品HPLC分析结果图，泛酸保留时间4.903min；

图3为实施例3所得基因工程菌合成的泛酸HPLC分析结果图，泛酸保留时间4.815min。

图4实施例3所得出发菌E.coli DH5α合成的泛酸HPLC分析结果图，未检测到泛酸。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

(所用LB培养基为自制，配方如下(终浓度计)：蛋白胨，10g/L；酵母膏，5g/L；NaCl，10g/L；pH7.0)

实施例1：高表达载体的构建

步骤：

(1)根据E.coli的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD(GenBank登录号：NC_000913)的序列设计引物(正向引物：AACGGATCCTATGATTCGCACGATGCTG，下划线的序列为限制酶BamH I切点；反向引物：CCAAAGCTTAGCAACCTGTACCGGAATC，下划线的序列为限制酶Hind III切点)，利用PCR技术扩增编码区序列；PCR反应条件：95℃变性3min；接着进行35个循环，参数是94℃，1min；60℃，1min和72℃，45s；最后在72℃延伸5min。

(2)PCR产物经凝胶回收后，用限制酶BamH I/Hind III克隆至pET28b(+)的相应位点，形成panD基因高表达载体pET28b(+)-panD，质粒构建图谱见图1。

(3)取100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮，取所得质粒pET28b(+)-panD 5μl，加入到感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min。42℃水浴热激90s，冰上放置15～20min。加入400μl LB培养基，37℃，200～250r/min振荡培养1h。室温下4000r/min离心5min，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮，获得大量载体pET28b(+)-panD。

实施例2：工程菌的获得

步骤：

(1)取100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。

(2)取实施例1所得质粒pET28b(+)-panD 5μl，加入到感受态细胞中轻轻混匀。冰上放置30min。

(3)42℃水浴热激90s，冰上放置15～20min。

(4)加入400μl LB培养基，37℃，200～250r/min振荡培养1h。

(5)室温下4000r/min离心5min，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。

(6)将转入载体的细菌涂布在LB(含卡那霉素30g/mL)平板上。

(7)平板在37℃下正向放置1h以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜，长出菌种后重复传代两次，所得菌种提取质粒经酶切及测序鉴定正确后保存菌种，即为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD。

实施例3：泛酸合成能力对比实验

将实施例2所得的基因工程菌在LB培养基上培养16～24h后，接入含卡那霉素30μg/mL的LB液体培养基中，37℃、200r/min摇床培养过夜。然后以1％的接种量转入相同的LB液体培养基中，250ml装30mlLB液体培养基，37℃、200r/min摇床培养至OD₆₀₀约为0.4～1.0时，加入诱导物(IPTG终浓度为0.4mmol/L或加入乳糖至终浓度为8g/L)，30℃、200r/min摇床培养12～20h，然后放于37℃、200r/min下摇床培养8h。4℃，4500r/min离心10min，收集菌体，用10mL无菌水离心洗涤两次，最后加入5mL 0.2mol/L L-asp(用NaOH调pH至7.0)，37℃、200r/min下转化1d。再加入0.5mL 0.8mol/L泛解酸内脂，继续37℃、200r/min下转化1d。转化液于4500r/min离心10min取上清，上清液用HPLC测定。

选取的对照为E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/pET28 b(+)，采用上述相同方法处理。

样品用反相高效液相色谱分析泛酸的含量。高效液相色谱仪为Agilent 1100 Series，色谱柱为Zorbax SB C18柱(4.6×250mm)。色谱条件如下：流速：1.0m l/min；检测波长：200nm；柱温：30℃；流动相：乙腈-20mmol/L KH₂PO₄溶液(体积比1∶9)，pH3.0。

泛酸标样也用相同方法分析。根据标准物色谱峰的保留时间定性，根据标准物的标准曲线对样品中泛酸进行定量。进样量为20μL。

泛酸标准样品HPLC分析结果图谱见图2；实施例2所得的基因工程菌合成的泛酸的HPLC分析结果图谱见图3。实施例2所得的出发菌E.coliDH5α合成的泛酸的HPLC分析结果图谱见图4。

对照样E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/pET28 b(+)用相同方法没有检测出泛酸，所以基因工程菌泛酸的合成能力比出发菌株有显著提高。

实施例4：泛酸合成

将实施例2所得的基因工程菌在LB培养基上培养20h后，接入含卡那霉素30μg/mL的LB液体培养基中，37℃、200r/min摇床培养17h。然后以1％的接种量转入相同的LB液体培养基中，250ml装30mlLB液体培养基，37℃、200r/min摇床培养2h，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，28℃、200r/min摇床培养19h，然后放于37℃、200r/min下摇床培养6h。4℃，4500r/min离心10min，收集菌体，用10mL无菌水离心洗涤两次，最后加入5mL 0.2mol/L L-asp(用NaOH调pH至7.0)，37℃、200r/min下转化1d。再加入0.5mL 0.8mol/L泛解酸内脂，继续37℃、200r/min下转化1d。

结果显示工程菌转化液中泛酸含量达到1.34g/L。

Claims

1.一种基因工程菌在制备泛酸中的应用，所述的基因工程菌通过如下方法制备得到：利用PCR扩增含有panD基因的供体菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD，并将其克隆到能高效表达外源基因的质粒上，得到panD基因高表达载体，再将所得的panD基因高表达载体转化入受体菌，即得到所述的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述供体菌为含有panD基因的埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、分枝杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、变形菌属、固氮菌属、根瘤菌属、克雷伯氏菌属、螺杆菌属、李斯特菌属、蛭弧菌属、产碱杆菌属、弗朗西斯菌属、志贺氏菌属、嗜冷杆菌属或嗜肺军团菌属的细菌。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于其特征在于所述受体菌为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、结核分枝杆菌、枯草杆菌、天蓝色链霉菌或富养罗尔斯通氏菌。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述能高效表达外源基因的质粒为下列之一：①pET系列，②pUC系列，③pGEM系列，④pBluescript系列，⑤pEKEx2系列，⑥pCMVT^NT系列，⑦pGA1系列，⑧pJC1系列。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-panD(Escherchia.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-panD)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年10月27日，保藏编号CCTCC NO：M 206114。

6.如权利要求1～5之一所述的应用，其特征在于所述的应用为：将所述基因工程菌经斜面培养、种子培养、发酵培养，离心取菌体，加入底物泛解酸内酯至终浓度0.01～10mol/L，20～80℃、50～250r/min转化1～90h，反应液经分离纯化得到泛酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：将所述基因工程菌经斜面培养基20～37℃活化后接入种子培养基，在20～37℃、50～250r/min培养12～48h后，以0.1％～20％体积比接种量转入发酵培养基，20～37℃、50～250r/min培养1～24h后，加入诱导物D-半乳糖苷至终浓度0.01～1.5mmol/L或乳糖至终浓度0.1～50g/L，在20～37℃、50～250r/min培养12～48h后，离心取菌体，加入0.01～1mol/L的L-天门冬氨酸溶液，20～80℃、50～250r/min转化1～72h，加入底物泛解酸内酯至终浓度0.01～10mol/L，20～80℃、50～250r/min转化1～90h，反应液经分离纯化得到泛酸。