CN101948767A - 一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法，属于生物技术领域。取经分离纯化的乳酸菌，接种于MRS培养基中，待菌体生长达到稳定期时，离心收集菌体，采用全细胞催化，以L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为唯一底物，以醋酸-醋酸钠为缓冲体系，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～24h，利用产GAD乳酸菌含有的谷氨酸脱羧酶使L-谷氨酸或L-谷氨酸钠发生脱羧作用生成γ-氨基丁酸，然后通过纸层析分析反应体系中是否含有γ-氨基丁酸来筛选产γ-氨基丁酸的乳酸菌，并通过形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析对所产γ-氨基丁酸的菌株进行鉴定。本发明的方法可以大大提高功能性益生菌的定向筛选效率。

Description

一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法

一、技术领域

本发明涉及一种微生物的筛选方法，特别涉及一种生物合成产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)，又叫氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能：如降血压作用；改善脑机能，延长记忆力；镇静神经，抗焦虑作用；改善肝功能；活化肾功能，降低胆固醇。GABA除具有上述的生理作用外，还有调节激素分泌，改善更年期综合症，促进酒精代谢、消臭、高效减肥、诱发人精子顶体、促进动物的抗病和生长等功能。另外，大量研究证明，GABA的缺乏将导致癫痫病的发生，因此在饮食中适当补充GABA对由于GABA的缺乏引起的癫痫病有一定预防作用。由于其特殊生理功能，GABA已经成为一种新型功能性因子，正被广泛用于食品保健、医药、化工和农业等行业，具有广阔的应用前景。

制备GABA的方法主要有化学合成法和生物合成法，其中生物合成法又包括植物富集法和微生物发酵法。生物合成法是利用生物体内的谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)作为催化剂，将L-谷氨酸或其钠盐α-脱羧生成GABA。相比而言，化学合成反应条件剧烈，采用的化学溶剂具有毒性和腐蚀性，副产物多，安全性差，主要应用于化工行业。生物合成法较化学合成法具有条件温和，环境污染相对较低、安全性高等优点。另外，由于微生物具有生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广泛等特点，是生物酶的重要来源。因此，利用微生物生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。

目前已在多种微生物中发现了GAD的存在。【文摘】用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌制成固定化细胞，与1％谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及柱式反应生产GABA。间歇反应5h转化率达到100％；连续搅拌式反应在三角瓶中进行，以6mL/h的流速输入底物溶液和输出反应液，转化率达85％；连续柱式反应器中进行，控制流速12mL/h，转化率达95％。赵景联等，《生物工程学报》，1989，5(2)：124-128。【文摘】用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA，获得了GABA含量达到了98.94％。章汝平等，长沙电力学院学报(自然科学版)，1998，13(4)：433～435。【文摘】Kono等对红曲beni-koji制作中的GABA含量变化进行了研究，GABA含量最高达到120μg/g。KonoI等，Biosci Biotechnol Biochem，2000，64(3)：617～619。【文摘】Wang等利用Monascus purpureus NTU 601进行固体发酵，GABA含量达到了5004mg/kg。Wang J等，J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30：669～676。【文摘】介绍了从生产奶酪的菌株中分离到一株Lactococcus lactis 01-7，用于奶酪的生产，奶酪中GABA的含量达到383mg/kg。Nomura M等，J dairy Sci.，1998，81：1486～1491。【文摘】从乳酸菌中筛选到了高产GABA的Lactococcus lactis菌株，25L罐发酵发酵72h，发酵液的GABA含量达到了2.50mg/mL。徐建军，博士学位论文，江南大学，2004年2月。【文摘】对高产GABA乳酸菌筛选和发酵条件进行了报道，发酵液中的GABA达到3.1g/L。刘清等，氨基酸和生物资源，2004，26(1)：40～43。【文摘】报道了利用Lactobacillus brevis IFO-12005对酒糟进行发酵，GABA的含量达到了10.18mM，通过离心、絮凝、脱色和脱臭处理获得了较好的GABA溶液，可用于食品强化GABA。Yokoyama S等，Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，93(1)：95～97。【文摘】采用Lactobacillus plantarum利用含有米糠抽提液的培养基发酵生产GABA，在干粉中含量达到了5％。爱宕世高等，食品と科学，2001，(8)：81～85。【文摘】从日本传统发酵鱼(funa sushi)中分离到了一株副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei NFRI 7415，经过对发酵条件优化，发酵液中GABA含量达到了302mM，Komatsuzaki等，Food Microbiol，2005，22：497～504。【文摘】用Streptococcus salivarius subsp.thermophilus Y-2细胞转化谷氨酸，在含有90g/L谷氨酸的反应体系中使转化液中的GABA浓度达到了87.16g/L。利用嗜热链球菌Y-发酵，建立二步发酵法，优化了发酵条件后，75L发酵罐的发酵醪中GABA浓度达到了6.27g/L。杨胜远，博士学位论文，南京农业大学，2006年6月。

乳酸菌是具保健作用的益生菌，是一种公认安全的微生物，在国内外长期广泛应用于酸奶、奶酪和泡菜等食品的生产。目前已经发现多种乳酸菌具有GAD活力。因此，可从乳酸菌中定向筛选高产GAD的菌株，建立优良功能特性的益生菌有效的筛选方法。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法，探索了优良功能特性的益生菌定向筛选的有效方法。

技术方案

本发明是这样实现的：通过常规方法分离纯化乳酸菌，将纯化后的菌种接种于MRS培养基中，待菌体生长达到稳定期时，离心收集菌体，采用全细胞催化，以L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为唯一底物，以醋酸-醋酸钠为缓冲体系，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～24h，利用乳酸菌含有的谷氨酸脱羧酶使L-谷氨酸或L-谷氨酸钠发生脱羧作用生成γ-氨基丁酸，然后通过纸层析分析反应体系中是否含有γ-氨基丁酸来筛选产γ-氨基丁酸的乳酸菌。

γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法具体步骤如下：

1.一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法，其特征为：

1)乳酸菌的富集培养

选择富含乳酸菌食品新鲜牛奶、发酵乳制品、发酵肉制品、发酵蔬菜制品或发酵谷物为富集样品，加入到脱脂牛乳或MRS液体培养基中进行富集培养，25～40℃静置培养24～48h，富集培养液；

2)乳酸菌的初步分离纯化

取上述富集培养液进行梯度稀释(即10倍梯度倍比稀释)成10^-4、10^-5、10^-6的稀释菌液，涂布于MRS平板上，于30℃培养48h，挑取肉眼可见、生长较快、单个有溶钙圈的菌落分离并纯化，根据菌落特征进行初步归类，将革兰氏染色阳性、无芽孢、接触酶阴性菌株作为进一步筛选的乳酸菌疑似菌株，并将其编号、保存；

3)产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选

将上述分离纯化后的菌种接种于MRS培养基中，待菌体生长达到稳定期时，离心收集菌体，加入0.5～3倍培养液体积的灭菌生理盐水洗涤菌体2～4次，取湿菌体0.1～1g，悬浮于5～50mL含有5～100mM的L-谷氨酸(L-Glu)或L-谷氨酸钠溶液的0.2mol·L^-1醋酸-醋酸钠缓冲体系中，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～24h，反应结束后，将混合液离心后，取上清进行纸层析分析，所述的纸层析分析方法为，展开剂组成：正丁醇∶冰乙酸∶水体积比＝4∶1∶3，内含质量浓度为0.4g/100mL的茚三酮，以GABA标准品做参比，待测样品点样5μL，采用新华一号层析纸展开后于90℃下烘干显色20min；

4)产γ-氨基丁酸乳酸菌的判断

如果纸层析分析反应体系中存在与GABA相对标准品R_f一致的茚三酮显色斑点，则含有γ-氨基丁酸，即为筛选得到产γ-氨基丁酸的乳酸菌。

5)产γ-氨基丁酸乳酸菌的鉴定

(1)形态学鉴定

培养特征、细胞形态及其染色特性、特殊的细胞结构、运动性等。

(2)生理生化鉴定

糖醇类发酵试验，耐盐试验，不同温度试验等。

(3)16S rDNA序列分析进行菌株的鉴定

采用细菌总DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物进行PCR扩增。PCR结束后，吸取PCR产物5μL与1μL loading buffer混合，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，电压为100V。电泳结束后用溴化乙锭EB染色20～30min，拍照。

PCR产物经纯化后测序。将16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析。

通过以上形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列测定并进行同源性比对分析，对产γ-氨基丁酸的乳酸菌进行鉴定。

有益效果

(1)本发明的优点是采用全细胞催化，以L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为唯一底物，以醋酸-醋酸钠为缓冲体系，转化液中无其他培养基成分，利用乳酸菌可能存在的谷氨酸脱羧酶，将底物L-谷氨酸或L-谷氨酸钠转化为γ-氨基丁酸，然后通过纸层析分析转化液中是否存在GABA，纸层析后表现为显色条带仅为一条或两条，很容易判断菌株是否为GABA产生菌株，大大提高筛选效率。

(2)本发明的另一个优点是反应条件温和、方法简单、易于操作。

四、附图说明

图1菌株转化液纸层析图。

1.5mmol/L L-Glu(5μL)；2.5mmol/L L-GABA(5μL)；3.5mmol/L L-Glu+5mmol/L L-GABA(各2.5μL)；4.fmbl12-4的细胞转化液(5μL)。

图2菌株fmbl12-4的16S rDNA扩增条带。

图3基于具有谷氨酸脱羧酶GAD活性细菌的16S rDNA序列为基础的系统发育树。

五、具体实施方式

(1)乳酸菌的富集培养

取10～20mL的发酵乳制品(上海光明乳业股份有限公司、南京卫岗乳业有限公司)、新鲜牛奶(取自安徽科技学院畜牧科技园)、发酵果蔬制品(扬州三和酱菜)等为原料，经灭菌蒸馏水稀释后，取10～20mL加入到100～20mL脱脂牛乳或MRS液体培养基中进行富集培养，37℃培养48h，得富集培养液。

所述的脱脂牛乳培养基：10g脱脂乳粉加入到100mL蒸馏水中，115℃灭菌10min。

所述的MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.58g，一水硫酸锰0.20g，TWEEN-801mL，蒸馏水1000mL，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

(2)乳酸菌的分离纯化

无菌操作，取1mL上述富集培养液至9mL灭菌生理盐水中，充分震荡混匀，制成菌悬液，然后用10倍梯度稀释成10^-4、10^-5、10^-6的稀释菌液，取上述的三个稀释度的样品各0.1mL涂布于含有CaCO₃的MRS平板上，37℃恒温培养24～48h；挑取肉眼可见、生长较快、菌落周围有溶钙圈、革兰氏染色阳性、接触酶试验阴性的菌株，继续进行反复划线分离、纯化，直至纯的单菌落为止，并将所获得的菌株编号、保存备用。

(3)产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选

菌株经琼脂斜面培养基活化后，转接于MRS液体培养基中，培养8～24h后，以0.5～5％的接种量转接于MRS培养基中，在25～45℃下静置培养12～36h，即得含菌体的培养物，取培养物在5000～10000r/min、2～40℃下离心5～20min收集菌体，加入0.5～3倍培养液体积的灭菌生理盐水洗涤菌体2～4次。取湿菌体0.1～1g，悬浮于5～50mL含有5～100mM的L-谷氨酸(L-Glu)或L-谷氨酸钠溶液的0.2mol·L^-1醋酸-醋酸钠缓冲体系中，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～24h。反应结束后，将混合液离心后，取上清进行纸层析分析体系中是否存在γ-氨基丁酸(GABA)。进而判断所筛选的菌株是否为产γ-氨基丁酸的菌株。

所述的纸层析分析方法如下：

展开剂组成：V(正丁醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)＝4∶1∶3，内含质量浓度为0.4g/100mL的茚三酮。以GABA标准品做参比，待测样品点样5μL。采用新华一号层析纸展开后于90℃下烘干显色20min。

利用上述方法，从新鲜牛奶中筛选到一株产GABA的乳酸菌株fmbl12-4。如图1所示，fmbl12-4全细胞催化反应液存在明显与GABA标准品R_f一致的茚三酮显色斑点，同时GAD是生物催化L-Glu及其盐类的α-羧基脱羧反应生成GABA的唯一酶，进而判断菌株fmbl12-4存在GAD，将底物L-Glu转化为GABA。

(4)产γ-氨基丁酸的乳酸菌的鉴定

1)形态学特征鉴定

菌株fmbl12-4在MRS固体培养基中培养48h，其菌落表面光滑、湿润、呈乳白色、边缘整齐，直径约1mm，经革兰氏染色镜检为阳性，符合乳酸菌特性。

2)生理生化鉴定

表1菌株fmbl12-4生理生化鉴定结果

3)16S rDNA序列测序进行菌株的鉴定

采用细菌总DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积50μL)：10×PCR缓冲液5μL；正、反向引物P1、P2(10mmol/L)各2.5μL；dNTP(2.5mmol/L)4μL；基因组DNA1.0μL；TaqDNA聚合酶0.5μL；ddH2O 34.5μL。PCR循环参数为：94℃预变性2min；94℃变性45s，55℃退火55s，72℃延伸2min，共进行34个循环；72℃延伸10min。PCR结束后，吸取PCR产物5μL与1μL loading buffer混合，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，电压为100V。电泳结束后用溴化乙锭EB染色20～30min，拍照。

本发明所述的细菌的16S rDNA通用引物序列如下：

正向引物P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

反向引物P2：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

通过上述方法，以fmbl12-4基因组DNA为模板进行16S rDNA的PCR扩增，可见约1500bp的条带即为目标条带，见图2。扩增产物经胶回收后送至南京金思特生物技术公司测序，核苷酸序列大小为1425bp。

该菌株fmbl12-4及其16S rDNA序列已经在GenBank上进行了登记(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/226295429？report＝genbank&log$＝nucltop&blast_rank＝1&RID＝6MK8F52Y011)，登记号为FJ824739.1。

测序结果在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行比对分析进行同源性分析，Blast结果显示，fmbl12-4菌株的16S rDNA与Lactococcus lactis subsp.lactis具有最高的相似性(99.9％)。利用MAG4.0软件对相似性较高的序列制作进化树，见图3。结果显示，fmbl12-4与Lactococcus lactis subsp.lactis具有最高的同源性，将fmbl12-4认定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)。

根据fmbl12-4的形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列比对分析和同源性分析，将fmbl12-4鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。

Claims (2)

1.一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法，其特征为：

1)乳酸菌的富集培养

选择富含乳酸菌食品新鲜牛奶、发酵乳制品、发酵肉制品、发酵蔬菜制品或发酵谷物为富集样品，加入到脱脂牛乳或MRS液体培养基中进行富集培养，25～40℃静置培养24～48h，富集培养液；

2)乳酸菌的初步分离纯化

取上述富集培养液进行10梯度倍比梯度稀释成10^-4、10^-5、10^-6的稀释菌液，涂布于MRS平板上，于30℃培养48h，挑取肉眼可见、生长较快、单个有溶钙圈的菌落分离并纯化，根据菌落特征进行初步归类，将革兰氏染色阳性、无芽孢、接触酶阴性菌株作为进一步筛选的乳酸菌疑似菌株，并将其编号、保存；

3)产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选

将上述分离纯化后的菌种接种于MRS培养基中，待菌体生长达到稳定期时，离心收集菌体，加入0.5～3倍培养液体积的灭菌生理盐水洗涤菌体2～4次，取湿菌体0.1～1g，悬浮于5～50mL含有5～100mM的L-谷氨酸或L-谷氨酸钠溶液的0.2mol·L^-1醋酸-醋酸钠缓冲体系中，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～24h，反应结束后，将混合液离心后，取上清进行纸层析分析，所述的纸层析分析方法为，展开剂组成：正丁醇∶冰乙酸∶水体积比＝4∶1∶3，内含质量浓度为0.4g/100mL的茚三酮，以GABA标准品做参比，待测样品点样5μL，采用新华一号层析纸展开后于90℃下烘干显色20min；

4)产γ-氨基丁酸乳酸菌的判断

如果纸层析分析反应体系中存在与GABA标准品相对迁移率R_f一致的茚三酮显色斑点，则含有γ-氨基丁酸，即为即为筛选得到产γ-氨基丁酸的乳酸菌。

2.根据权利要求1所述一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法，其筛选得到产γ-氨基丁酸的乳酸菌鉴定方法为：

(1)形态学鉴定

培养特征、细胞形态及其染色特性、特殊的细胞结构、运动性；

(2)生理生化鉴定

糖醇类发酵试验，耐盐试验，不同温度试验；

(3)16S rDNA序列分析进行菌株的鉴定

采用细菌总DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物进行PCR扩增，PCR结束后，吸取PCR产物5μL与1μL loading buffer混合，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，电压为100V，电泳结束后用溴化乙锭EB染色20～30min，拍照；

PCR产物经纯化后测序，将16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析；

通过以上形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列测定并进行同源性比对分析，对产γ-氨基丁酸的乳酸菌进行鉴定。

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