CN109913398B - 无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用 - Google Patents
无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种无需β‑丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过(1)强化大肠杆菌D‑泛酸合成途径的最后一步，增强大肠杆菌对胞外β‑丙氨酸的利用能力，(2)强化泛解酸合成途径，(3)修复ilvG基因，减弱副产物对泛解酸合成途径的反馈抑制作用，(4)根据细胞表型变化，削弱缬氨酸合成途径的通量，(5)利用CRISPRi技术系统筛选TCA循环、PPP途径、副产物代谢途径的代谢改造位点，根据结果对异亮氨酸合成途径进行阻断，减少2‑丁酮酸对由乙酰乳酸合酶催化的丙酮酸合成乙酰乳酸反应的竞争，(6)异源表达来自其他菌株的天冬氨酸脱羧酶，得到无需β‑丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌株。本发明结合来源于谷氨酸棒杆菌的panB、panC和来源于枯草芽孢杆菌的panD共同在pTrc99A质粒上的组合表达能在不添加β‑丙氨酸的情况下得到1.3g/L的D‑泛酸。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
(二)背景技术
泛酸通常以稳定的钙盐形式储藏、运输和商品交易，泛酸钙属于B族维生素的一种，是生物正常生长必需的营养物质之一，D-泛酸钙属维生素类药物，是人体和动物体内辅酶A的成分之一，存在于活细胞中，其主要作用是参与蛋白质、脂肪、糖在体内的新陈代谢，治疗维生素B缺乏症、周围神经炎以及手术后的肠绞痛，与维生素C 合用可治疗播散性红斑狼疮。另外，D-泛酸钙还能与羟酸形成高能硫酯化合物，激活活性较弱的酸，参与血色素卟啉架的合成，对皮肤和粘膜功能的正常化、对毛发的着色和抗感染也是不可缺少的，在预防链霉素和卡那霉素副作用方面也有积极的作用。 D-泛酸钙较高的生物活性使其在饲料行业中得以广泛应用，缺乏泛酸钙将使畜禽类出现生长发育迟缓、贫血及其代谢、神经、肠胃紊乱等症状。
D-泛酸钙的的化学制备方法较复杂，首先要制备两个重要的中间体，分别为β- 丙氨酸和DL-泛解酸内酯。由上述中间体制备D-泛酸钙有两种方法：一种是先化学合成DL-泛酸钙，通过拆分DL-泛酸钙而制得D-泛酸钙。另一种是通过化学法或生物法拆分关键中间体DL-泛解酸内酯得到D-泛解酸内酯，再由D-泛解酸内酯与β-丙氨酸反应合成D-泛酸钙。但在DL-泛解酸内酯生产过程中容易造成工业污染，环保与压力大。
随着对微生物代谢过程的不断了解和代谢工程技术的发展，利用葡萄糖等廉价可回收材料生产D泛酸等多种有机物具有广阔的生产前景。然而，由于野生型大肠杆菌菌株的细胞经济性和局限性，细胞内D-泛酸生物合成途径受到竞争途径和辅助因子供给的限制，因此生物法生产D-泛酸最重要的因素是获得合适的高产D-泛酸微生物。通过常规诱变、筛选和代谢工程技术可获得高产微生物。在代谢工程转化过程中，由于不同代谢途径之间的非线性关系，以及辅助因子与主要代谢途径之间的竞争与协作，代谢工程改造往往从多个角度进行。
微生物中D-泛酸复杂生物合成的最后一步是由泛酸合成酶(PanC)催化：泛解酸和β-丙氨酸消耗ATP分子形成D-泛酸。其中天冬氨酸在天冬氨酸脱羧酶(PanD) 催化下得到β-丙氨酸，泛解酸由缬氨酸合成途径的中间体α-酮异戊酸在羟甲基转移酶(PanB)、酮泛解酸还原酶(PanE)或者酮酸还原异构酶(IlvC)的两步催化反应得到。两分子丙酮酸通过丙酮酸合成酶(IvGM、IlvBN、IvHI)、酮酸还原酶(IlvC)和二羟基酸脱水酶(IlvD)三步反应得到α-酮异戊酸。除了主要的合成途径(天冬氨酸到β-丙氨酸，丙酮酸到泛解酸)，D-泛酸生物合成还有与NADPH和亚甲基四氢叶酸的供应相关。同时，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成D-泛酸的生物合成有较大的影响，选择分支削弱竞争是一种好的菌株的优化策略。但这种优化与细胞通常为了获得最大生长速率而进行的自我调节相矛盾。由于上述原因，D-泛酸发酵的研究一直没有深入。然而，近年来随着技术理念的发展，环保和成本的限制，D-泛酸发酵生产变得越来越可行。
由于微生物发酵产泛酸含量极低，最成功的的案例是日本的Miki Hiroshi等人经过重组DNA技术处理的微生物新菌株，不仅增强了泛酸生物合成途径，而且增强了位于其上游的缬氨酸生物合成途径。在含有糖类碳源的培养基中，通过微生物菌体与β-丙氨酸接触，可以大量产生D-泛酸。出发菌株为Escherichia coli IFO 3547，由其获得的突变株Escherichia coli FV 5069具有多重抗性，它具有抗水杨酸、抗D-酮基异戊酸、抗α-酮基丁酸、抗β-羟基天冬氨酸和抗O-甲基苏氨酸特性。用于生产的工程菌株Escherichia coli FV5069/pFV202(FERM BP-5227)，是用含有泛酸生物合成基因和支链氨基酸生物合成基因的质粒pFV202转化大肠杆菌Escherichia coli FV 5069而得到的。工程菌FV 5069/pFV202，38℃摇瓶发酵72h，产泛酸达到66.0g/L。
(三)发明内容
本发明的目的在于利用代谢工程和基因编辑技术，提供无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌，由如下方法构建而成：
(1)将底盘菌E.coli W3110基因组中的panC、panB、panE和ilvC基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)；
(2)在E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)基因组中修复ilvG基因，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(3)将E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中avtA基因敲除，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(4)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中上ilvE基因的起始密码子ATG替换为GTG，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)；
(5)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)中coaA编码的酶第106位氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)；
(6)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)中ilvA基因敲除，得到E.coli W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*coaA*)；
(7)将pTrc99A质粒与片段panB(C.g)、panC(C.g)和panD(B.s)进行连接，构建质粒pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)；
(8)将质粒pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)转化到E.coli W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)，得到E.coli W3110△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*/pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)，即所述无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌。
优选的，所述菌株为Escherichia coli ZJB18004，保存于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2018年12月21 日，保藏编号：CCTCC NO：M 2018915。该菌株能在不添加β-丙氨酸的情况下得到 1.3g/L的D-泛酸。
本发明通过(1)强化大肠杆菌D-泛酸合成途径的最后一步，增强大肠杆菌对胞外β-丙氨酸的利用能力，(2)强化泛解酸合成途径，(3)修复ilvG基因，减弱副产物对泛解酸合成途径的反馈抑制作用，(4)根据细胞表型变化，削弱缬氨酸合成途径的通量，(5)利用CRISPRi技术系统筛选TCA循环、PPP途径、副产物代谢途径的代谢改造位点，根据结果对异亮氨酸合成途径进行阻断，减少2-丁酮酸对由乙酰乳酸合酶催化的丙酮酸合成乙酰乳酸反应的竞争，(6)异源表达来自其他菌株的天冬氨酸脱羧酶，得到无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌株。
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)应用CRISPR-Cas9基因编辑将底盘菌E.coli W3110基因组中的panC、panB、panE和ilvC基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110 (Trc-panCpanEpanBilvC)；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑在E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)基因组中修复ilvG基因，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑将E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中avtA基因敲除，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvCilvG*)中上ilvE基因的起始密码子ATG替换为GTG，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)；
(5)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)中coaA基因编码的酶第106位氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)；
(6)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)中ilvA基因敲除，得到E.coli W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*coaA*)；
(7)将pTrc99A质粒与片段panB(C.g)、panC(C.g)和panD(B.s)进行连接，构建质粒pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)；
(8)将质粒pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)转化到E.coli W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)，即所述无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌。
具体的，所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ilvG基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ilvE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述coaA 基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述panB(C.g)核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示，所述panC(C.g)核苷酸序列如SEQ ID NO.6，所述panD(B.s)核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有Amp的发酵培养基中， 25～30℃、100～200rpm条件下进行发酵培养OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM 的IPTG，继续培养至24～48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 0.8g/L、 MgSO40.5g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/LCuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
通常，所述基因工程菌发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200 rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明改造了大肠杆菌的D-泛酸合成网络和竞争支路，通过用来源于pTrc99A 的Trc启动子和RBS序列置换panC、panE、panB和ilvE的原有启动子，增强胞内泛解酸合成以及D-泛酸合成途径。通过对大肠杆菌由于移码突变而不能正常表达的ilvG 进行修复，得到能正常表达的ilvG*，而其所编码的乙酰乳酸合酶II是对缬氨酸不敏感的，功能性ilvG使缬氨酸和泛酸都有较大积累，运用CRISPR-Cas9将基因组上ilvE 基因的起始密码子ATG置换为GTG使其表达量下降，减少亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸合成途径对碳流的争夺，通过敲除avtA减少缬氨酸合成途径对D-泛酸合成途径的竞争。通过对coaA(编码泛酸激酶)进行点突变，从而削弱CoA合成途径，使其对相应的代谢终产物AcCoA敏感，减少D-泛酸往AcCoA合成途径的通量。通过对ilvA 进行敲除，阻断了异亮氨酸代谢支路，从而削弱L-异亮氨酸合成途径。
本发明用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列在基因组中同时置换了panC (编码泛酸合成酶)，panB(编码羟甲基转移酶)，panE(编码酮泛解酸还原酶)和ilvC (编码酮酸还原异构酶)原有的启动子和RBS序列，强化了泛解酸合成路径和利用β- 丙氨酸的能力，构建W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)。
本发明克隆了来源于E.coli W3110，Corynebacterium glutamicum ATCC 13032(CGSCb)和Bacillus subtilis subsp.subtilis 168(CGSCb)的基因panD(编码天冬氨酸脱羧酶)，并用一步连接试剂盒连接到pTrc99A上，构建pTrc99A-panD(E.c)、 pTrc99A-panD(B.s)和pTrc99A-panD(C.g)，并转化到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvCilvG*ilvE*)筛选得到来源于枯草芽孢杆菌的panD(编码天冬氨酸脱羧酶)最适于D-泛酸合成。
本发明本发明克隆了来源于B.subtilis的基因panD(编码天冬氨酸脱羧酶)，并用一步连接试剂盒连接到pTrc99A-panBpanC(C.g)上，构建了pTrc99A-panBpanC (C.g)panD(B.s)，并转化到E.coli W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*coaA*)，得到一株不需β-丙氨酸添加的D-泛酸生产菌株。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
与以往的发明不同，本发明通过敲降coaA和敲除ilvA对竞争支路进行削弱，使 D-泛酸效价提升近20％。进一步对不同来源的panD基因进行单独表达，结果显示来源于枯草芽孢杆菌的panD有利于D-泛酸合成的，结合来源于谷氨酸棒杆菌的panB、panC和来源于枯草芽孢杆菌的panD共同在pTrc99A质粒上的组合表达能在不添加β- 丙氨酸的情况下得到1.3g/L的D-泛酸。
(四)附图说明
图1为CRISPRi基因敲降的OD600和D-泛酸效价变化；
图2为coaA点突变后的OD600和D-泛酸效价变化；
图3为ilvA敲除后的OD600和D-泛酸效价变化；
图4为panD的筛选及组合表达的OD600和D-泛酸效价变化；
图5为W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*) /pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)发酵过程残糖、OD600和D-泛酸效价变化。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述氨苄霉素在培养基中终浓度为0.10mg/L。
本发明所述亲本菌株E.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli GeneticStock Center)，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135A1，US 2010/0248311 A1中公开。
实施例1-8中使用的引物序列信息如表2所示，
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
表2：引物序列
下划线为pT-X-1(2)携带基因组上基因X所含PAM位点(NGG)前20bp序列。
实施例1：D-泛酸含量的HPLC测定
检测方法如下：
色谱条件：C18柱(250×4.6mm,particle size 5μm,Agilent Technologies Co.,Santa Clara,CA,USA)、检测波长：200nm、柱温：30℃；
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持D-泛酸含量在0.05g/L到0.40g/L之间；
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
数据采集时间：18min。
实施例2：有效利用胞外β-丙氨酸菌株W3110(Trc-panC)的构建及摇瓶发酵
以Escherichia coli W3110为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via theCRISPR-Cas9System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，用来源于pTrc99A的trc启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，在基因组替换panC (GeneID：12932172)的原有启动子，以增强panC的表达强度。
(1)构建pTarget-panC质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-panC-1/pTarget-panC-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-panC质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-panC质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-panC-1与 pTD-panC-2为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，pTD-panC-3和pTD-panC-4 为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)，胶回收纯化PCR片段得到F1和F2； pTarget-panC质粒经过XbaI和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照
(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-panC质粒、片段F1和F2连接在一起，通过测序验证得到pTD-panC质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入E.coli W3110中，转接单克隆到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mLLB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖， 150rpm、30℃培养至OD6000.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(MolecularCloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102) 的描述。
(4)取200ng pTD-panC质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm 电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2-3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，37℃倒置培养12-16h，以T-panC-up和Trc-down为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段600bp左右的片段，则证明是W3110(Trc-panC)阳性菌落。
(5)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的 LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L 壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-panC质粒成功消除，挑取pTarget-panC质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养 12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒W3110(Trc-panC)。
(6)将W3110(Trc-panC)，以E.coli W3110为对照组，分别接种到10mL的 LB培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1mL预培养物到装有20mL的MS培养基的500mL摇瓶中，然后在30℃、150rpm培养发酵到 OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养48h；发酵结束后取1mL 发酵液测定OD600，取1mL发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释10 倍，根据实施例1进行HPLC检测OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量，结果显示，基因组替换panC基因启动子，会对细胞生长有有一定抑制作用，细胞OD600从36降低到24，而D-泛酸效价从4mg/L增加到25mg/L，这说明panC表达的增强可有效增加胞内对胞外β-丙氨酸的利用，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水， pH值自然。
MS培养基：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L、β-丙氨酸2.5g/L、CaCO3 10g/L(单独灭菌)、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/LCuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
实施例3：高表达酮泛解酸还原酶菌株W3110(Trc-panCpanE)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-panE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-panE-1/pTarget-panE-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-panE质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-panE质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-panE-1、 pTD-panE-2、pTD-panE-3和pTD-panE-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到 pTD-panE质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的W3110 (Trc-panC)感受态中，W3110(Trc-panC)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(Trc-panCpanE)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110(Trc-panCpanE)。
(6)将构建的W3110(Trc-panCpanE)生产菌株以实施例2构建的W3110 (Trc-panC)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。结果显示，基因组替换panE(GeneID：12933987)基因启动子对细胞生长有轻微抑制作用，但D- 泛酸效价从25mg/L增加到84mg/L，这说明panE表达的强化可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例4：高表达羟甲基转移酶菌株W3110(Trc-panCpanEpanB)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-panB质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-panB-1/pTarget-panB-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-panB质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-panB质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-panB-1、 pTD-panB-2、pTD-panB-3和pTD-panB-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到 pTD-panB质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的W3110 (Trc-panCpanE)感受态中，W3110(Trc-panCpanE)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(Trc-panCpanEpanB)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110 (Trc-panCpanEpanB)。
(6)将构建的W3110(Trc-panCpanEpanB)生产菌株以实施例3构建的W3110 (Trc-panCpanE)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。结果显示，基因组替换panB(GeneID：12932389)基因启动子对细胞生长有轻微抑制作用，但D- 泛酸效价从84mg/L增加到300mg/L，这说明panB基因在泛酸合成中扮演关键角色，其强化其表达可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例5：高表达酮酸异构还原酶菌株W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-ilvC质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ilvC-1/pTarget-ilvC-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-ilvC质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ilvC质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ilvC-1、 pTD-ilvC-2、pTD-ilvC-3和pTD-ilvC-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ilvC 质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例4获得的W3110 (Trc-panCpanEpanB)感受态中，W3110(Trc-panCpanEpanB)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)阳性菌落，构建方法同实施例2 (4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110 (Trc-panCpanEpanBilvC)。
(6)将构建的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)生产菌株以实施例4构建的 W3110(Trc-panCpanEpanB)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。结果显示，基因组替换ilvC(GeneID：12934337)基因启动子对细胞生长有轻微抑制作用，但D-泛酸效价从300mg/L增加到414mg/L，这说明ilvC表达的强化可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例6：缺陷基因ilvG的修复菌株W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)的构建及摇瓶发酵
以W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichia coli Genome viathe CRISPR-Cas9System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，通过在移码突变位点(979和980)附近找寻NGG得到在pTarget设计20bp序列与移码突变位点周围碱基相互匹配，在donorDNA上插入缺失的AT并用同义密码子替换包括 NGG及前20bp碱基序列(替换后ilvG核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)，修复ilvG。
(1)构建pTarget-ilvG质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ilvG-1/pTarget-ilvG-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-ilvG质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ilvG质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ilvG-1、pTD-ilvG-2、pTD-ilvG-3和pTD-ilvG-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ilvG 质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例5获得的W3110 (Trc-panCpanEpanBilvC)感受态中，W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110 (Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)。
(6)将构建的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)生产菌株以实施例5构建的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。
结果显示，在基因组修复缺陷基因ilvG(GeneID：12933612)对细胞生长有一定促进作用，ilvG的正常表达可以减轻一部分代谢压力，可有效增强胞内α-酮异戊酸的合成且受较小的反馈抑制作用，增加D-泛酸合成中间体α-酮异戊酸的合成从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成，D-泛酸最终效价由0.41g/L增加到0.49g/L。
实施例7：缬氨酸合成弱化菌株W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-avtA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-avtA-1/pTarget-avtA-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-avtA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-avtA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-avtA-1、 pTD-avtA-2、pTD-avtA-3和pTD-avtA-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-avtA 质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例6获得的W3110 (Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)感受态中，W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)。
(6)将构建的W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)生产菌株以实施例 6构建的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。
结果显示，基因组敲除avtA(GeneID：12930377)基因对细胞生长有轻微抑制作用，实施例6对ilvG基因进行修复导致α-酮异戊酸合成旺盛，而avtA的敲除将减少α-酮异戊酸往竞争支路缬氨酸合成途径的通量，从而增加泛解酸通路的碳流，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成，D-泛酸最终效价由0.49g/L增加到0.91g/L。
实施例8：支链氨基酸合成弱化菌株W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)的制备
以W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，通过在起始密码子ATG附近找寻NGG得到在pTarget设计20bp序列与移码突变位点周围碱基相互匹配，在donorDNA上将ATG替换换为GTG并用同义密码子替换包括NGG及前20bp碱基序列(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)，降低ilvE 的表达。
(1)构建pTarget-ilvE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ilvE-1/pTarget-ilvE-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-ilvE质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ilvE质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ilvE-1、pTD-ilvE-2、pTD-ilvE-3和pTD-ilvE-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ilvE质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例7获得的W3110(△avtATrc-panCpanEpanBilvC ilvG*)感受态中，W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)。
(6)将构建的W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)生产菌株以实施例7构建的W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)为对照组，按照实施例2 方法进行摇瓶测试及检测。
结果显示，基因组敲降ilvE(GeneID：12932278)基因对细胞生长有轻微抑制作用，可有效弱化泛解酸合成途径的竞争支路(缬氨酸合成途径、亮氨酸合成途径和异亮氨酸合成途径)，增加泛解酸通路的碳流，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成，D- 泛酸最终效价由0.91g/L增加到1.54g/L。
实施例9：辅酶A合成削弱菌株W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*coaA*)的构建及摇瓶发酵
以实施例8构建的W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing inthe Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System.Applied EnvironmentalMicrobiology.81:2506-2514)，在基因组coaA(GeneID：12934389)所编码的酶106 位氨基酸发生突变(丙氨酸变为精氨酸)，突变后coaA核苷酸序列如SEQ ID No.4)，使CoaA合成途径受阻，降低辅酶A通量，引物序列如表6。
表6：引物序列
(1)构建pTarget-coaA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-coaA-1/pTarget-coaA-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-coaA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-coaA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ilvA-1与 pTD-ilvA-2为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，pTD-ilvA-3和pTD-ilvA-4 为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)，胶回收纯化PCR片段得到F1和F2； pTarget-coaA质粒经过XbaI和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照
(One stepclone kit,Vazyme Biotech,Nanjing,China)说明书将 pTarget-coaA质粒、片段F1和F2连接在一起，通过测序验证得到pTD-coaA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)中，单克隆接种到LB试管中，30℃过夜培养，再以体积浓度1％的接种量接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm，30℃培养至OD600 0.4～0.6，4000rpm，4℃离心10 min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取200ng pTD-coaA质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm 电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2-3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，37℃倒置培养12-16h，进行测序徐验证，得到W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*coaA*)阳性菌落。
(5)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的 LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L 壮观霉素的LB平板的单菌落其pTD-coaA质粒成功消除，挑取pTD-coaA质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的 LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)。
(6)将构建的W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)生产菌株以W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图1所示。
实施例10：异亮氨酸合成途径阻断菌株W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)的制备及摇瓶发酵
以W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System.Applied EnvironmentalMicrobiology.81:2506-2514)，在基因组实现ilvA(GeneID：12930592)的敲除，引物序列如表7。
表7：引物序列
(7)构建pTarget-ilvA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ilvA-1/pTarget-ilvA-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-ilvA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(8)构建pTD-ilvA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ilvA-1、pTD-ilvA-2、pTD-ilvA-3和pTD-ilvA-4为引物，构建步骤同实施例10(2)，得到pTD-ilvA质粒。
(9)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的W3110(△avtATrc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)感受态中，W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)感受态制备方法同实施例10(3)。
(10)构建得到W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)阳性菌落，构建方法同实施例10(4)。
(11)质粒消除：实施方法同实施例10(5)，获得无质粒W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)。
(12)将根据的菌株按照按照实施例2方法进行摇瓶测试，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图2所示。
由图可见，ilvA、leuA、pdhR和thrB的干扰能提高最终D-泛酸产量，而cycA、 lrp和tdcE的干扰则会使产量有较大幅度下降，除ilvA的干扰对细胞生长有抑制作用，其他靶点基因对细胞生长有一定促进作用。
实施例11：高效天冬氨酸脱羧酶的筛选及组合表达
涉及到的引物序列如表5。
表5：引物序列
12.1pTrc99A-panD(E.c)的构建
质粒构建流程：
(1)以W3110基因组为模板，99A-panD(E.c)-1/99A-panD(E.c)-2为引物， PCR扩增得到片段panD(E.c)。
(2)pTrc99A质粒经过Nco I和EcoR I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照
(One step clone kit,Vazyme Biotech,Nanjing,China)说明书分别将pTrc99A质粒与片段panD(E.c)进行连接，通过pTrc99A-up/99A-panD (E.c)-2进行PCR验证，得到质粒pTrc99A-panD(E.c)。
12.2pTrc99A-panD(B.s)的构建
(1)以B.subtilis基因组为模板，99A-panD(B.s)-1/99A-panD(B.s)-2为引物，PCR扩增得到片段panD(B.s)。
(2)pTrc99A质粒经过Nco I和EcoR I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收 DNA片段；按照
(One step clone kit,Vazyme Biotech,Nanjing,China)说明书分别将pTrc99A质粒与片段panD(B.s)进行连接，通过pTrc99A-up/99A-panD (B.s)-2进行PCR验证，得到质粒pTrc99A-panD(B.s)。
12.3pTrc99A-panD(C.g)的构建
(1)以C.glutamicum基因组为模板，99A-panD(C.g)1/99A-panD(C.g)-2 为引物，PCR扩增得到片段panD(C.g)。
(2)pTrc99A质粒经过Nco I和EcoR I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收 DNA片段；按照
(One step clone kit,Vazyme Biotech,Nanjing,China)说明书分别将pTrc99A质粒与片段panD(C.g)进行连接，通过pTrc99A-up/99A-panD (C.g)-2进行PCR验证，得到质粒pTrc99A-panD(C.g)。
12.4pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)的构建
(1)以C.glutamicum基因组为模板，99A-panB(C.g)-4/99A-panB(C.g)-3 为引物，99A-panC(C.g)-3/99A-panC(C.g)-2为引物，分别PCR扩增得到片段panB (C.g)3和panC(C.g)2；以B.subtilis基因组为模板，99A-panD(B.s)-1/99A-panD (B.s)-3为引物，PCR扩增得到片段panD(B.s)2。
(2)pTrc99A质粒经过Nco I和EcoR I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收 DNA片段；按照
(One step clone kit,Vazyme Biotech,Nanjing,China)说明书分别将pTrc99A质粒与片段panB(C.g)3、panC(C.g)2和panD(B.s)2进行连接，通过pTrc99A-up/99A-panC(C.g)-2进行PCR验证，得到质粒pTrc99A-panBpanC (C.g)panD(B.s)。
12.5高效天冬氨酸脱羧酶的摇瓶发酵筛选
将W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)根据实施例3制备电转感受态，将制备好的pTrc99A-panD(C.g)、pTrc99A-panD(E.c)和pTrc99A-panD(B.s) 进行转化涂布含0.05mg/L氨苄霉素的LB平板，37℃倒置培养12-16h得到E.coli W3110△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*/pTrc99A-panD(C.g)、E.coli W3110 △avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*/pTrc99A-panD(E.c)和E.coli W3110△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*/pTrc99A-panD(B.s)。
将根据的菌株按照按照实施例9方法进行摇瓶测试(不添加β-丙氨酸)，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图4所示，结果显示来源于枯草芽孢杆菌的panD 最适于D-泛酸生产。
12.6高效天冬氨酸脱羧酶与羟甲基转移酶和泛酸合成酶的组合表达
将W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)根据实施例3制备电转感受态，将制备好的pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)进行转化涂布含0.05mg/L 氨苄霉素的LB平板，37℃倒置培养12-16h得到E.coli W3110△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*/pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)。
将根据的菌株按照实施例2方法进行摇瓶测试(不添加β-丙氨酸)，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图4所示。
由图可见，天冬氨酸脱羧酶与羟甲基转移酶和泛酸合成酶的组合表达跟天冬氨酸脱羧酶的单独表达相比，细胞生长更加旺盛，而D-泛酸产量有较大幅度提高，说明羟甲基转移酶和泛酸合成酶的组合表达在天冬氨酸脱羧酶过表达的基础上能有效增加D-泛酸产量。
实施例13：E.coli W3110△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*/pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)的构建及5L发酵罐分批补料发酵
(1)将W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)根据实施例3制备电转感受态，将制备好的pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)进行转化涂布含0.05mg/L氨苄霉素的LB平板，37℃倒置培养12-16h得到E.coli W3110 △ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*/pTrc99A-panBpanC(C.g)panD (B.s)(即CCTCC NO：M2018915)。
(2)挑取单菌落接种于含0.05mg/L氨苄霉素的5mL LB培养基中，37℃培养 12h，以10％接种量接种于100mL LB液体培养基培养12h中，共准备2瓶培养基， 200mL种子液用于接种5L发酵罐中。5L发酵罐中装液量为2L，培养基配方为：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L、 CaCO3 10g/L(单独灭菌)，1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/LZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
(3)发酵温度控制在30℃，通过40％氨水控制pH在7.0左右，通过补料培养基控制葡萄糖浓度在5g/L以下，发酵15h时添加0.4g异亮氨酸。补料培养基配方如下：500g/L葡萄糖，10g/L硫酸铵，2g/L酵母粉，14g/L KH2PO4，1mL/L微量元素溶液，8g/L MgSO4，溶剂为去离子水。
(4)测定葡萄糖浓度、OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量，如图5所示。
由图可见，E.coli W3110△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*/pTrc99A-panBpanC(C.g)利用简单培养基在分批补料发酵过程中保持低糖浓度使D-泛酸积累到12.4g/L，细胞OD600维持在56左右。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 2
<211> 1647
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgaatggcg cacagtgggt ggtacatgcg ttgcgggcac agggtgtgaa caccgttttc 60
ggttatccgg gtggcgcaat tatgccggtt tacgatgcat tgtatgacgg cggcgtggag 120
cacttgctat gccgacatga gcagggtgcg gcaatggcgg ctatcggtta tgctcgtgct 180
accggcaaaa ctggcgtatg tatcgccacg tctggtccgg gcgcaaccaa cctgataacc 240
gggcttgcgg acgcactgtt agattccatc cctgttgttg ccatcaccgg tcaagtgtcc 300
gcaccgttta tcggcactga cgcatttcag gaagtggatg tcctgggatt gtcgttagcc 360
tgtaccaagc acagctttct ggtgcagtcg ctggaagagt tgccgcgcat catggctgaa 420
gcattcgacg ttgcctgctc aggtcgtcct ggtccggttc tggtcgatat cccaaaagat 480
atccagttag ccagcggtga cctggaaccg tggttcacca ccgttgaaaa cgaagtgact 540
ttcccacatg ccgaagttga gcaagcgcgc cagatgctgg caaaagcgca aaaaccgatg 600
ctgtacgttg gcggtggcgt gggtatggcg caggcagttc cggctttgcg tgaatttctc 660
gctgccacaa aaatgcctgc cacctgtacg ctgaaagggc tgggcgcagt agaagcagat 720
tatccgtact atctgggcat gctggggatg cacggcacca aagcggcaaa cttcgcggtg 780
caggagtgtg acctgctgat cgccgtgggc gcacgttttg atgaccgggt gaccggcaaa 840
ctgaacacct tcgcgccaca cgccagtgtt atccatatgg atatcgaccc ggcagaaatg 900
aacaagctgc gtcaggcaca tgtggcatta caaggtgatt taaatgctct gttaccagca 960
ttacagcagc cgctgaacat taacgattgg cagcaacact gcgcgcagct gcgtgatgaa 1020
cattcctggc gttacgacca tcccggtgac gctatctacg cgccgttgtt gttaaaacaa 1080
ctgtcggatc gtaaacctgc ggattgcgtc gtgaccacag atgtggggca gcaccagatg 1140
tgggctgcgc agcacatcgc ccacactcgc ccggaaaatt tcatcacctc cagcggttta 1200
ggtaccatgg gttttggttt accggcggcg gttggcgcac aagtcgcgcg accgaacgat 1260
accgttgtct gtatctccgg tgacggctct ttcatgatga atgtgcaaga gctgggcacc 1320
gtaaaacgca agcagttacc gttgaaaatc gtcttactcg ataaccaacg gttagggatg 1380
gttcgacaat ggcagcaact gttttttcag gaacgataca gcgaaaccac ccttactgat 1440
aaccccgatt tcctcatgtt agccagcgcc ttcggcatcc atggccaaca catcacccgg 1500
aaagaccagg ttgaagcggc actcgacacc atgctgaaca gtgatgggcc atacctgctt 1560
catgtctcaa tcgacgaact tgagaacgtc tggccgctgg tgccgcctgg cgccagtaat 1620
tcagaaatgt tggagaaatt atcatga 1647
<210> 3
<211> 930
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
gtgaccacca aaaaggcaga ctatatctgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60
gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120
cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180
ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240
gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat ccgtccgctg 300
atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360
attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420
gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480
gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540
caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600
tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660
attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720
gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatgtccgg tacggcggca 780
gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840
gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900
tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930
<210> 4
<211> 951
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
atgagtataa aagagcaaac gttaatgacg ccttacctac agtttgaccg caaccagtgg 60
gcagctctgc gtgattccgt acctatgacg ttatcggaag atgagatcgc ccgtctcaaa 120
ggtattaatg aagatctctc gttagaagaa gttgccgaga tctatttacc tttgtcacgt 180
ttgctgaact tctatataag ctcgaatctg cgccgtcagg cagttctgga acagtttctt 240
ggtaccaacg ggcaacgcat tccttacatt atcagtattg ctggcagtgt cgcggtgggg 300
aaaagtacca cggctgcggt gttacaagcg ctattaagcc gttggccgga acatcgtcgt 360
gttgaactga tcactacaga tggcttcctt caccctaatc aggttctgaa agaacgtggt 420
ctgatgaaga agaaaggctt cccggaatcg tatgatatgc atcgcctggt gaagtttgtt 480
tccgatctca aatccggcgt gccaaacgtt acagcacctg tttactcaca tcttatttat 540
gatgtgatcc cggatggaga taaaacggtt gttcagcctg atattttaat tcttgaaggg 600
ttaaatgtct tacagagcgg gatggattat ccacacgatc cacatcatgt atttgtttct 660
gattttgtcg atttttcgat atatgttgat gcaccggaag acttacttca gacatggtat 720
atcaaccgtt ttctgaaatt ccgcgaaggg gcttttaccg acccggattc ctattttcat 780
aactacgcga aattaactaa agaagaagcg attaagactg ccatgacatt gtggaaagag 840
atcaactggc tgaacttaaa gcaaaatatt ctacctactc gtgagcgcgc cagtttaatc 900
ctgacgaaaa gtgctaatca tgcggtagaa gaggtcagac tacgcaaata a 951
<210> 5
<211> 816
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 5
atgcccatgt caggcattga tgcaaagaaa atccgcaccc gtcatttccg cgaagctaaa 60
gtaaacggcc agaaagtttc ggttctcacc agctatgatg cgctttcggc gcgcattttt 120
gatgaggctg gcgtcgatat gctccttgtt ggtgattccg ctgccaacgt tgtgctgggt 180
cgcgatacca ccttgtcgat caccttggat gagatgattg tgctggccaa ggcggtgacg 240
atcgctacga agcgtgcgct tgtggtggtt gatctgccgt ttggtaccta tgaggtgagc 300
ccaaatcagg cggtggagtc cgcgatccgg gtcatgcgtg aaacgggtgc ggctgcggtg 360
aagatcgagg gtggcgtgga gatcgcgcag acgattcgac gcattgttga tgctggaatt 420
ccggttgtcg gccacatcgg gtacaccccg cagtccgagc attccttggg cggccacgtg 480
gttcagggtc gtggcgcgag ttctggaaag ctcatcgccg atgcccgcgc gttggagcag 540
gcgggtgcgt ttgcggttgt gttggagatg gttccagcag aggcagcgcg cgaggttacc 600
gaggatcttt ccatcaccac tatcggaatc ggtgccggca atggcacaga tgggcaggtt 660
ttggtgtggc aggatgcctt cggcctcaac cgcggcaaga agccacgctt cgtccgcgag 720
tacgccacct tgggcgattc cttgcacgac gccgcgcagg cctacatcgc cgatatccac 780
gcgggtacct tcccaggcga agcggagtcc ttttaa 816
<210> 6
<211> 840
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
atgcaggtag caaccacaaa gcaggcgctt atcgacgccc tcctccacca caaatccgtc 60
gggctcgtcc ccaccatggg tgcgctacac agcggacacg cctcgttggt taaagcagca 120
cgcgctgaaa acgacactgt tgtagccagt atttttgtca atcccctgca gtttgaagca 180
ctcggtgatt gcgatgatta ccgcaactat ccccgccaac tcgacgccga tttagcactg 240
cttgaagagg caggtgtgga tattgtgttc gcacccgatg tggaggaaat gtaccccggt 300
ggcttgccac tagtgtgggc gcgcaccggt tccatcggaa caaaattgga gggtgccagc 360
aggcctggcc atttcgatgg tgtggctacc gtggtggcga agctgttcaa tttggtgcgc 420
cctgatcgtg catattttgg acaaaaagat gctcagcagg ttgcggtgat tcggcgattg 480
gttgccgatc tagacattcc cgtggagatt cgtcccgttc cgattattcg tggcgccgat 540
ggcttagccg aatccagccg caatcaacgt ctttctgcgg atcagcgagc gcaagctctg 600
gtgctgccgc aggtgttgag tgggttgcag cgtcgaaaag cagctggtga agcgctagat 660
atccaaggtg cgcgcgacac cttggccagc gccgacggcg tgcgcttgga tcacctggaa 720
attgtcgatc cagccaccct cgaaccatta gaaatcgacg gcctgctcac ccaaccagcg 780
ttggtggtcg gcgcgatttt cgtggggccg gtgcggttga tcgacaatat cgagctctag 840
<210> 7
<211> 384
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis subsp. subtilis
<400> 7
atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60
aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120
aatgaaaaag tacaaattgt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180
cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240
gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300
catgagccga aagtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360
gaaccagccc gtacaatttt gtag 384
Claims (7)
1.一种无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌，由如下方法构建而成：
(1)将底盘菌E.coli W3110基因组中的panC、panB、panE和ilvC基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)；所述trc启动子核苷酸序列如SEQID NO.1所示；
(2)在E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)基因组中修复ilvG基因，得到E.coliW3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；所述ilvG基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)将E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中avtA基因敲除，得到E.coliW3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(4)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中上ilvE基因的起始密码子ATG替换为GTG，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)；所述ilvE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(5)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)中coaA编码的酶第106位氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvCilvG*ilvE*coaA*)；所述coaA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(6)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)中ilvA基因敲除，得到E.coli W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)；
(7)将pTrc99A质粒与片段panB(C.g)、panC(C.g)和panD(B.s)进行连接，构建质粒pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)；所述panB(C.g)核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述panC(C.g)核苷酸序列如SEQ ID NO.6，所述panD(B.s)核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(8)将质粒pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)转化到E.coli W3110(△ilvA △avtATrc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)，得到E.coli W3110 △ilvA △avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE* coaA*/pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)，即所述无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的高产泛酸的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为Escherichia coli ZJB18004，保藏编号：CCTCC NO：M 2018915。
3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)应用CRISPR-Cas9基因编辑将底盘菌E.coli W3110基因组中的panC、panB、panE和ilvC基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)；所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑在E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)基因组中修复ilvG基因，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；所述ilvG基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑将E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中avtA基因敲除，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvCilvG*)中上ilvE基因的起始密码子ATG替换为GTG，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*)；所述ilvE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(5)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*)中coaA基因编码的酶第106位氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*coaA*)；所述coaA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(6)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*coaA*)中ilvA基因敲除，得到E.coli W3110(△ilvA△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*coaA*)；
(7)将pTrc99A质粒与片段panB(C.g)、panC(C.g)和panD(B.s)进行连接，构建质粒pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)；所述panB(C.g)核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述panC(C.g)核苷酸序列如SEQ ID NO.6，所述panD(B.s)核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(8)将质粒pTrc99A-panBpanC(C.g)panD(B.s)转化到E.coli W3110(△ilvA △avtATrc-panCpanEpanBilvC ilvG* ilvE*coaA*)，即所述无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌。
4.权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有Amp的发酵培养基中，25～30℃、100～200rpm条件下进行发酵培养OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至24～48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述基因工程菌发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
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