CN1259576A - 用肠杆菌科菌株制备d－泛酸的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过产D－泛酸的肠杆菌科微生物的发酵制备D－泛酸的方法,其特征在于:(a)使用含有pFV31和/或pFV202的菌株,(b)在所述微生物中扩增并具体地过量表达panD基因和选择性地其它编码天冬氨酸－1－脱羧酶的核苷酸序列,(c)泛酸在培养基或微生物细胞中富集,并且(d)分离合成的泛酸。

Description

用肠杆菌科菌株制备D-泛酸的发酵方法
泛酸是应用于化妆品、医药、人类和动物营养的商业上重要的维生素。
泛酸可以通过化学合成来制备或通过生物技术在适当营养溶液中适当微生物的发酵来制备。化学合成中，DL-泛内酯(pantolactone)是重要的中间产物。它是在多步骤过程中从甲醛、异丁醛和氰化物制备的。在随后的步骤中，拆分此消旋混合物并用β-丙氨酸缩合D-泛内酯以得到D-泛酸。
通过微生物发酵制备的优势是直接形成所需的D-泛酸而无L-泛酸。
正如EP-A 0 493 060中所示，不同种的细菌如大肠杆菌、产尿节杆菌、产红棒杆菌和产氨短杆菌以及酵母如Debaromyces castellii。可以在含有葡萄糖、DL-泛解酸和β-丙氨酸的营养溶液中合成D-泛酸。EP-A 0493 060也表明，以大肠杆菌为例，在含有葡萄糖、DL-泛解酸和β-丙氨酸的营养溶液中D-泛酸的合成通过扩增质粒pFV3和pFV5中所含的泛酸生物合成基因得到增强。
EP-A 0 590 857和US 5,518,906涉及从大肠杆菌菌株IF003547衍生的突变体如FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069，它们具有对各种抗代谢物如水杨酸、α-丁泛解酸、β-羟基天冬氨酸、O-甲基苏氨酸和α-酮异戊酸的耐受性，并且在含有葡萄糖的营养溶液中合成泛解酸，在含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养溶液中合成D-泛酸。
EP-A 0 590 857也表明，在上述菌株中，质粒pFV31中所含的不确切特定泛酸生物合成基因得到扩增后，在含有葡萄糖的营养溶液中D-泛解酸的产量以及含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养溶液中D-泛酸的产量均有提高。
另外，WO97/10340表明，通过利用质粒pFV202扩增ilvGM基因而提高缬氨酸生物合成酶—乙酰羟基羧酸合酶II的活性之后，含有葡萄糖的营养溶液中泛解酸的产量以及含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养溶液中D-泛酸的产量均有提高。
所述专利文件没有说明所述菌株在只含有葡萄糖或蔗糖作为底物的营养溶液中合成泛酸的含量。发明目的
本发明人的目的是进一步改善合成泛酸的肠杆菌科、尤其是埃希氏菌属菌株。发明详述
维生素泛酸是应用于化妆品、医药、人类和动物营养的商业上重要的产品。所以，对提供制备泛酸的改良方法有广泛兴趣。
当在下文中提到D-泛酸、泛酸和泛酸盐时，它们应理解为不仅指游离酸也指D-泛酸盐类如钙盐、钠盐、氨盐或钾盐。
本发明提供通过产D-泛酸的肠杆菌科微生物的发酵制备D-泛酸的方法，其特征在于：
a)所述微生物含有质粒pFV31和/或pFV202，优选pFV31，并且
b)在所述微生物中扩增并优选地过量表达panD基因和选择性地其它编码天冬氨酸-1-脱羧酶(E.C.4.1.1.11)的核苷酸序列。
优选的是使用带有其核苷酸序列编码源于大肠杆菌、尤其是棒杆菌的panD的DNA的微生物。所述DNA优选地是能复制的DNA，其特征在于：
(i)SEQ ID No.1中所示的编码panD的核苷酸序列，或者
(ii)它在遗传密码简并性区域内对应于序列(i)，或者
(iii)它与互补于序列(i)或(ii)的序列杂交，并且选择性地
(iv)它携带(i)的中性意义突变。
发酵优选在只含有葡萄糖或蔗糖作为底物而无β-丙氨酸和泛解酸的营养溶液中进行。
这就是怎样按照本发明提高泛酸产量。加入天冬氨酸、β-丙氨酸、酮异戊酸、酮泛解酸或泛解酸和/或它们的盐类也是选择性有利的。
本文中术语“扩增”是指微生物中由适当DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性例如通过增加基因拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的适当酶的基因以及选择性地结合这些方法而得到提高。
本发明所提供的微生物可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉或纤维素或利用甘油和乙醇合成泛酸。优选的是使用葡萄糖或蔗糖。所述微生物尤其是革兰氏阴性细菌如肠杆菌科的细菌。在此可特别提出的是埃希氏菌属和大肠杆菌种。大肠杆菌品种中所谓的K-12菌株如菌株MG1655或W3110[Neidhard等：大肠杆菌和沙门氏菌。细胞和分子生物学(ASM Press，Washington DC)]或大肠杆菌野生型菌株IFO3547(发酵研究所，Osaka，Japan)及由其衍生的能合成泛酸的突变体都是适合的。这些菌株中尤其应提及的是以下几种：3547/pFV31、5714/pFV31、525/pFV31、814/pFV31、521/pFV31、FV221/pFV31、FV6051/pFV31、FV5069/pFV31、FV5069/pFV202以及那些通过传统突变、选择例如抗代谢物耐受性如叠氮胸腺嘧啶耐受性或硫代异亮氨酸耐受性以及筛选从其衍生而来的菌株。特别适合的菌株是FV5069/pFV31和FV5069/pFV202，它们依照布达佩斯条约的条款以FERM BP 4395和FERM BP5227保藏(参见EP-A 0 590 857和WO 97/10340)。
扩增，尤其是过量表达是通过增加适当基因的拷贝数或突变位于结构基因上游的启动子和调控区域来实现的。在结构基因上游掺入的表达盒以相同方式起作用。另外，可诱导的启动子可以通过发酵增加D-泛酸合成过程中的表达。延长mRNA寿命的方法也可提高表达。而且，酶活性也通过防止酶蛋白的降解而得到提高。基因或基因构建体可以位于可变拷贝数的质粒中或在染色体整合并扩增。选择性地，也可以通过改变培养基的成分和培养技术实现目的基因的过量表达。
本领域技术人员将尤其在Chang和Cohen(细菌学杂志，134，1141-1156(1978))、Hartley和Gregori(基因13，347-353，(1981))、Amann和Brosius(基因40，183-190(1985))，de Broer等(美国国家科学院院报80，21-25(1983))、LaVallie等(生物/技术11，187-193(1993))、PCT/US97/13359、Llosa等(质粒26，222-224(1991))、Quandt和Klipp(基因80，161-169(1989))、Hamiton(细菌学杂志171，4617-4622(1989))、Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58，191-195(1998))以及众所周知的遗传学和分子生物学书本中发现相关说明。
来自大肠杆菌的panD基因是已知的。Merkels和Nichols已经发表其核苷酸序列(FEMS Microbiology Letters 143，247-252(1996))。panD基因可以使用众所周知的PCR(聚合酶链反应)方法或下述方法之一从大肠杆菌分离或制备。
从谷氨酸棒杆菌分离panD基因的第一个步骤是在大肠杆菌中构建此微生物的基因文库。基因文库的构建一般在众所周知的书本和手册中均有记录。可提及的例子是Winnacker的题为“从基因到克隆，基因技术介绍”(Verlag Chemie，Weinheim，Germany，1990)的书本或Sambrook等题为“分子克隆，实验手册”(冷泉港实验室出版社，1989)的手册。众所周知的基因文库是由Kohara等在λ载体中构建的大肠杆菌K-12菌株W3110的基因文库(细胞50，495-508(1987))。Bathe等(分子和普通遗传学252，255-265(1996))描述了使用粘粒载体SuperCos I(Watl等，美国国家科学院院报84，2160-2164(1987))在大肠杆菌K-12菌株NM554(Raleigh等，核酸研究16，1563-1575(1988))中构建的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。大肠杆菌中谷氨酸棒杆菌的基因文库也可以使用诸如PBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或PUC9(Vieira等，基因19，259-268(1982))的质粒得到构建。限制和重组缺陷性大肠杆菌是尤为适合的宿主，菌株DH5αmcr是由Grant等描述的例子(美国国家科学院院报87，4645-4649(1990))。
然后将基因文库通过转化(Hanahan，分子生物学杂志166，557-580(1983))或电穿孔(Tauch等，FEMS Microbiological Letter123，343-347(1994))转入指示菌株。指示菌株的鉴定性特征是其在目的基因中有突变导致可检测的表型，例如营养缺陷型。带有panD基因中突变的大肠杆菌突变体DV9(Vallari和Rock，细菌学杂志164，136-142(1985))，在本发明的框架中尤其有利。用携带目的基因如panD基因的重组质粒转化指示菌株如panD突变体DV9并表达目的基因，在适当特征如需要泛酸方面，指示菌株变成原养型。
用此方法分离的基因或DNA片段可以通过如Sanger等所述的序列测定(美国国家科学院院报，74，5463-5467(1977))得到鉴定。
来自谷氨酸棒杆菌编码panD基因的新DNA序列以此方法获得，为SEQID No1，它构成本发明的一部分。相应酶的氨基酸序列通过上述方法从所述DNA序列推导出来。panD基因产物即L-天冬氨酸-1-脱羧酶的氨基酸序列在SEQ ID No.2中表示。
由于遗传密码的简并性而从SEQ ID No.1得到的编码DNA序列也构成本发明的一部分。相似地，与SEQ ID No.1杂交的DNA序列构成本发明的一部分。而且，本领域技术人员已知保守氨基酸互换如蛋白质中甘氨酸换成丙氨酸或天冬氨酸换成谷氨酸为有义突变，这种突变不引起蛋白活性的基本改变，即它们是中性的。也已知蛋白N和/或C末端的改变基本上不破坏其功能，甚至可以稳定蛋白。
本领域技术人员将尤其在Ben-Bassat等(细菌学杂志169，751-757(1987))、O’Regan等(基因77，237-251(1989))、Sahin-Toth等(蛋白质科学3，240-247(1994))、Hochuli等(生物/技术6，1321-1325(1988))以及众所周知的遗传学和分子生物学书本中发现这方面的信息。
然后用此方法分离和鉴定的基因可以单独或选择性地与其它基因结合在适当大肠杆菌菌株中表达。表达或过量表达基因的已知方法在于借助另外提供表达信号的质粒载体扩增基因。可能的质粒载体是那些能在适当微生物中复制的质粒载体。以大肠杆菌为例，用于本发明的可能载体的例子是pSC101(Vocke和Bastia美国国家科学院院报80(21)，6557-6561(1983))或pKK223-3(Brosius和Holy，美国国家科学院院报81，6929(1984))或谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭载体pZ8-1(EP 0 375889)。这样的大肠杆菌菌株是包含质粒pND-D1和pND-D2的FV5069/pFV31/pND-D1知FV5069/pFV31/pND-D2。质粒pND-D1是以质粒pZ8-1为基础携带来自大肠杆菌的panD基因的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体。质粒pND-D2是以质粒pZ8-1为基础携带来自谷氨酸棒杆菌的panD基因的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体。
对于本领域技术人员很明显，赋予对代谢物和抗代谢物耐受性或防止泛酸前体流失的染色体突变可以单独或一起与本发明所提供的方法有利地结合。
按照本发明制备的微生物可以通过分批方法、补料分批方法和重复补料分批方法连续或不连续培养用于泛酸生产。Chmiel的书(生物加工技术1.生物工程介绍，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的书(生物反应器和外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中提供了已知培养方法的总结。
欲使用的培养基必须适当地符合特定微生物的要求。不同微生物的培养基的描述可见于美国细菌学会的手册“普通细菌学方法手册”(Washington DC，USA，1981)。可以使用的碳源是糖类和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪如大豆油、葵花子油、花生油和椰子脂肪，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸，酒精如甘油和乙醇以及有机酸如乙酸。这些物质可以单独或作为混合物使用。可以使用的氮源是有机含氮化合物如蛋白胨、酵母提取物、肉类抽提物、麦芽抽提物、玉米浆、大豆粉和尿素或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独或作为混合物使用。可以使用的磷源是磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐。培养基还必须含有金属盐如对于生长必需的硫酸镁或硫酸铁。最后，除了以上所述的物质，可以使用必要的促生长物质如氨基酸和维生素。如果需要，可以向培养基加入泛酸前体如天冬氨酸、β-丙氨酸、酮异戊酸、酮泛解酸或泛解酸和/或选择性地它们的盐类。上述添加物可以一次全部加入培养物，也可在培养期间适当地加入。
培养基的PH值可以通过适当使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾或氨或者酸性化合物如磷酸或硫酸来控制。泡沫形成可以使用消泡剂多聚脂肪酸甘油酯来控制。质粒的稳定性可以通过加入适当选择性作用物质如抗生素来维持。需氧条件通过向培养基输入氧气或含氧气体混合物如空气来保持。培养基的温度正常在25℃-45℃，优选30℃-37℃。持续培养直至泛酸合成达到最大值。此目标一般在10到160小时达到。
对于本领域技术人员很明显，具有高度L-天冬氨酸-1-脱羧酶活性的菌株也可用于从L-天冬氨酸制备β-丙氨酸。已知的发酵方法、酶转化反应或二者的结合都可用于此目的。
合成的泛酸浓度可用已知方法确定(Velisek，色谱科学60，515-560(1992))。
下列微生物依照布达佩斯条约条款保藏于德意志微生物和细胞保藏中心(DSMZ)，Brunswick，Germany：
谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pND-D2为DSM12438实施例
本发明借助以下实施例得到更详细的说明。实施例1来自谷氨酸棒杆菌的panD基因的克隆和测序1.panD基因的克隆
按Tauch等所述的(质粒33，168-179(1995))从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离染色体DNA，并用限制性酶Sau3A(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，产品描述Sau3A，编号27-0913-02)部分切割。用Nucleotrap抽提试剂盒(Macherey和Nagel，Düren，Germany；目录号740584)分离大小范围7-9kb的DNA片段，并将其连接入从MBI Fermentas(Vilnius，Lithuania)得到的载体pUC19(Norrander等，基因26，101-106(1982))的磷酸化BamH I酶切位点。按Sambrook等所述的(1989，分子克隆：实验手册，冷泉港)进行连接，DNA混合物与T4连接酶(PharmaciaBiotech，Freiburg，Germany)一起温育过夜。然后，通过电穿孔(Tauch，FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))将此连接混合物转入大肠杆菌DH5αmcr(Grant，美国国家科学院院报87，4645-4649(1990))中，并将其涂在LB琼脂(Lennox，病毒学1，190(1995))+100μg/ml青霉素上。37℃培养24小时后，通过用Birnboim和Doly的碱裂解方法再分离质粒DNA(核酸研究7，1513-1523(1997))，可以从转化子获得谷氨酸棒杆菌基因文库。通过电穿孔将此基因文库转入带有panD基因突变的大肠杆菌菌株DV9(Vallari和Rock，细菌学杂志164，136-142(1985))中。再生期后(Tauch等，FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))，用培养基E(Vogel和Bonner，生物化学杂志218，97-106(1956))将此电穿孔混合物洗两次。介质E的组成见表1。用这些细胞接种250ml锥形瓶中的50ml培养基E+100μg/ml青霉素并于39℃在250rpm的通气摇床中培养。培养两天后，将细菌悬浮物稀释并在补加100μg/ml青霉素的LB琼脂(Lennox，病毒学1，190(1995))上划线接种。表1
       物质     每升含量         备注
       K2HPO4       10g
    NaNH4HPO4*4H2O       3.5g
       柠檬酸        2g
    MgSO4*7H2O       0.2g
       葡萄糖        4g       分开灭菌
      维生素B1      0.2μg     无菌条件下过滤
分离称为pNIC-1.3的DV9转化子的质粒DNA并通过琼脂糖凝胶电泳(Sambrook等，分子克隆：实验手册(1989)，冷泉港实验室出版社)并与已知长度的标准DNA片段比较进行鉴定。质粒pNIC-1.3含有7kbp插入片段。pNIC-1.3的互补能力通过panD突变体DV9的重新转化来检测。继而所得的转化子能在上述条件下于无β-丙氨酸的培养基E中生长。
通过用限制性BamH I(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，产品描述BamH I，编号27-0868-03)、EcoR I(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，产品描述EcoR I，编号27-0884-03)和Bgl II(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，产品描述Bgl II，编号27-0946-02)切割质粒pNIC1.3，接着与用适当限制性酶(Schǎfer，基因145，69-73(1994))消化的载体pK18mob连接对7Kb插入片段进行亚克隆。通过电穿孔将得到的连接混合物转入大肠杆菌panD突变体DV9；按上述进行互补转化子的筛选，此例中的琼脂平板含50μg/ml卡那霉素。分离互补单克隆的质粒并通过限制性分析进行鉴定选择此后称为pNIC-10的含有约3kb DNA插入序列的EcoR I亚克隆进行下列序列分析。2.panD基因的序列测定
为进行双链测序，用各种限制性酶切割pNIC-10的3kb片段，并将片段亚克隆入质粒pUC19或pK18mob。按制造商的说明用QIAGEN质粒Mini试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，Ca.，USA)分离用于测序的质粒DNA，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳确定质粒的大小。
测序按Sanger等的双脱氧链终止法(美国国家科学院院报74，5463-5467(1977))进行，并经Zimmermann等改良(核酸研究18，1067(1990))。使用来自Pharmacia的Cy5自动测序试剂盒(产品号27-2690-02，Freiburg，Germany)。凝胶电泳分离和测序反应的分析用来自Amersham Pharmacia Biotech(Uppsla，Sweden)的自动激光荧光(A.L.F)显示DNA测序仪，在长范围凝胶溶液聚丙烯凝胶(FMCBioproducts，Rockland，Me.，USA)上进行。然后对获得的原始序列资料用97-0版Staden软件包进行处理(核酸研究14，217-231(1986))。所有pNIC-10亚克隆的各个序列都被整理到称为重叠群13的衍接的3060bp重叠群中。用XNIP软件(Staden，核酸研究14，217-231(1986))对整个DNA片段进行计算机辅助的编码区分析，鉴定到5个开放读码框(ORF)。图1表示重叠群13的限制性图谱和表示为orf1-orf5的ORF的位置。用可通过国家医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的NCBI服务器的网上服务得到BLAST搜索程序[Gish和States，Nature of Genetics 3，266-272(1993))；Altschul等，分子生物学杂志215，403-410(1990)]进行同源性分析。重叠群13分析表明orf-3是panD基因。orf-3以后称为panD基因。含有panD基因的DNA片段的核苷酸序列表示为SEQ IDNo.1。从上述步骤得到的panD基因产物即L-天冬氨酸-1-脱羧酶的氨基酸顺序表示为SEQ ID No.2。实施例2  构建表达panD基因的载体
使用聚合酶链反应(PCR)和合成的寡聚核苷酸扩增来自谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的panD泛酸生物合成基因。用来自Gibco-BRL(Eggestein，Germany)的Taq DNA聚合酶在PCT-100热循环仪(MJ ResearchInc.，Watertown，Mass.，USA)中进行PCR实验。于94℃2分钟的一次变性步骤后，接着是于94℃ 90秒的变性步骤、于引物依赖温度T＝(2AT+4GC)-5℃(Suggs等，1981，683-693页，于：D.D.Brown和C.F.Fox(编)，使用纯化基因的发育生物学。Acedemic Press，New York，USA)90秒的退火步骤，于72℃ 90秒的延伸反应。最后三个步骤循环重复35次，反应以72℃ 10分钟的延伸反应结束。通过琼脂糖凝胶电泳对它们进行检测后，按厂商说明将以此方法扩增的产物与载体pCR2.1[原始TA克隆试剂盒，Invitrogen(Leek，The Netherlsnds)，产品描述原始TA克隆试剂盒，目录号KNM2030-01]连接，然后转化入大肠杆菌菌种TOP10F’。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂板上培养进行转化子的筛选。
从来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032(图2)和大肠杆菌K12(W.K.Merkel和B.P.Nichols，1993，基因库：L17086)的panD泛酸生物合成基因合成PCR引物。选择这些引物以使扩增的片段含有这些基因及其固有的核糖体结合位点，但不含有可能的启动子区。另外，插入适当限制性酶切位点以便克隆入目的载体。下面表2中列出了PCR引物、插入的切割位点(序列下划线)和扩增的基因(以bp表示的片段长度在括号中给出)的序列。表2
    引物       具有限制性酶切位点的序列     产物     质粒
panD-Ec1  5′-GAATTCGACAGGGTAGAAAGGTAGA-3′EcoRI panDE.c. pND-D1
panD-Ec2  5′-AGATCTGGGATAACAATCAAGCAACC-3′BglII
panD-Cg1  5′-CATCTCACGCTATGAATTCT-3′EcoRI panDC.g. pND-D2
panD-Cg2  5′-ACGAGGCCTGCAGCAATA-3′PstI
图2中所示的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pZ8-1(EP 0 375889)用作在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中表达的基本载体。以前克隆入载体pCR2.1的panDC.g.扩增的产物通过引物插入的限制性酶切位点与相似处理的表达载体pZ8-1连接，并由此在该质粒中的tac启动子的控制之下。将panDE.C.扩增的产物作为EcoR I-Bgl II片段克隆入载体pZ8-1的相容EcoR I-BamH I限制性末端。按这种方法构建的表达质粒的相应名称在表2中表示。panDE.C.和panDC.g.的克隆策略在图2中表示。表达载体的正确克隆通过相应插入片段的测序来检测。
将质粒pND-1和pND-2转化入大肠杆菌FV5069/pFV31，并在LB琼脂糖(Lennox，病毒学1，190(1955))+50μg/ml卡那霉素上选择转化子。获得的菌株称为FV5069/pFV31/pND-D1和FV5069/pFV31/pND-D2。实施例3  从大肠杆菌FV5069/pFV31衍生的不同菌株的泛酸合成
通过植物乳杆菌泛酸分析对D-泛酸进行定量(测试菌株：植物乳杆菌ATCC8014，目录号3211-30-3；培养基：Bacto泛酸分析培养基(DIFCOLaboratories，Michgan，USA，目录号0604-15-3)。这种指示性菌株只能在含有泛酸的指示培养基中生长，并表现可用分光计测量的细菌生长与培养基泛酸浓度之间的线性依赖关系。用泛酸的高钙盐(hemicalcium)(Sigma，产品号P 2250)进行校准。于580nm测量波长在LKB Biochrom光度计(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)上测定光密度(OD580)。
大肠杆菌菌株FV5069/pFV31、FV5069/pFV31/pND-D1和FV5069/pFV31/pND-D2的泛酸合成用葡萄糖或蔗糖作为底物来测定。所用的测试培养基是含有作为底物的4g/l葡萄糖或4g/l蔗糖的培养基E，对于菌株FV5069/pFV31/pND-D1和FV5069/pFV31/pND-D2，补加50μg/ml卡那霉素。用相同培养基中OD580为0.1的16小时培养物接种500ml锥形瓶中的50ml测试培养基。于37℃和250rpm培养这些培养物72小时后，通过于5000×g离心10分钟沉淀细胞，将获得的无细胞上清过滤除菌并于4℃保存直到对泛酸进行定量。
按DIFCO手册(第10版，1100-1102页；Michigan，USA)中说明的方法，用植物乳杆菌ATCC8014对培养物上清中的D-泛酸进行定量。这些测量结果在表3和表4中表示。表3  用葡萄糖作为底物积累泛酸
菌株   基因     泛酸(μg/ml)
FV5069/pFV31      -           2
FV5069/pFV31/pND-D1  panDE.c.           24
FV5069/pFV31/pND-D2  panDC.g.           58
表4  用蔗糖作为底物积累泛酸
菌株   基因     泛酸(μg/ml)
FV5069/pFV31     -         2
FV5069/pFV31/pND-D1  panDE.c.         47
FV5069/pFV31/pND-D2  panDC.g.         69
附图附加下列附图：图1：含有orf-1到orf-5的重叠群13的图谱图2：质粒pZ8-1的图谱以及质粒pND-D1和pND-D2的克隆策略附图中所用的缩写如下定义：T1T2：     rrnB基因的转录终止子Ptac：     tac启动子panD：     panD基因的编码区rep-C.g.： 在谷氨酸棒杆菌中复制的DNA区域oriV-E.c.：用于向大肠杆菌无性转移的起始点kan：      卡那霉抗性基因EcoRI：    限制性酶EcoRI的酶切位点E：        限制性酶EcoRI的酶切位点BamHI：    限制性酶BamHI的酶切位点B：        限制性酶BamHI的酶切位点BglII：    限制性酶BglII的酶切位点ClaI：     限制性酶ClaI的酶切位点H：        限制性酶HindIII的酶切位点P：        限制性酶PstI的酶切位点PstI：     限制性酶PstI的酶切位点SalI：     限制性酶SalI的酶切位点ScaI：     限制性酶ScaI的酶切位点SphI：     限制性酶SphI的酶切位点X：        限制性酶XhoI的酶切位点XhoI：     限制性酶XhoI的酶切位点
                           序列表(1)基本信息(i)申请人：
(A)名称：Degussa Aktiengesellschaft
(B)街道：Weissfrauenstr.9
(C)城市：Frankfurt am Main
(D)地区：Hessen
(E)国家：德国
(F)邮政编号：D-60311(ii)发明名称：用肠杆菌科菌株制备D-泛酸的发酵方法(iii)序列数：2(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPA)(2)关于SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征
(A)长度：540个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：基因组DNA(iii)假设：否(iii)反义：否(vi)来源：
(A)生物：谷氨酸棒杆菌
(B)菌株：ATCC13032(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：77..484
(C)其它信息：/密码_起始＝77
             /EC号＝4.1.1.11
             /产品＝“L-天冬氨酸-1-脱羧酶”
             /基因＝“panD”(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：AATATTCCTT TCCTTGTCAT CTCACGCTAT GATTTCTAAA ACTTGCAGGA CAACCCCCAT      60AAGGACACCA CAGGAC ATG CTG CGC ACC ATC CTC GGA AGT AAG ATT CAC         109
              Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His
                1               5                  10CGA GCC ACT GTC ACT CAA GCT GAT CTA GAT TAT GTT GGC TCT GTA ACC       157Arg Ala Thr Val Thr Gln Ala Asp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Thr
         15                  20                  25ATC GAC GCC GAC CTG GTT CAC GCC GCC GGA TTG ATC GAA GGC GAA AAA       205Ile Asp Ala Asp Leu Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys
     30                  35                  40GTT GCC ATC GTA GAC ATC ACC AAC GGC GCT CGT CTG GAA ACT TAT GTC       253Val Ala Ile Val Asp Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val
 45                  50                  55ATT GTG GGC GAC GCC GGA ACG GGC AAT ATT TGC ATC AAT GGT GCC GCT       301Ile Val Gly Asp Ala Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala60                  65                  70                  75GCA CAC CTT ATT AAT CCT GGC GAT CTT GTG ATC ATC ATG AGC TAC CTT       349Ala His Leu Ile Asn Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu
             80                  85                  90CAG GCA ACT GAT GCG GAA GCC AAG GCG TAT GAG CCA AAG ATT GTG CAC       397Gln Ala Thr Asp Ala Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His
         95                 100                 105GTG GAC GCC GAC AAC CGC ATC GTT GCG CTC GGC AAC GAT CTT GCG GAA       445Val Asp Ala Asp Asn Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu
    110                 115                 120GCA CTA CCT GGA TCC GGG CTT TTG ACG TCG AGA AGC ATT TAGCGTTTTA        494Ala Leu Pro Gly Ser Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile
125                 130                135GCTCGCCAAT ATTGCTGCCG GCCTCGTTGA AAATGGTCAT GGTGGC                    540(2)关于SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征
(A)长度：136个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His Arg Ala Thr Val Thr1               5                  10                  15Gln Ala Asp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Thr Ile Asp Ala Asp Leu
         20                  25                  30Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys Val Ala Ile Val Asp
     35                  40                  45Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val Ile Val Gly Asp Ala
 50                  55                  60Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala Ala His Leu Ile Asn65                  70                  75                  80Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu Gln Ala Thr Asp Ala
             85                  90                  95Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His Val Asp Ala Asp Asn
        100                 105                 110Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu Ala Leu Pro Gly Ser
    115                 120                 125Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile
130                 135

Claims (19)

1.通过产D-泛酸的肠杆菌科微生物的发酵制备D-泛酸的方法，其特征在于：
a)使用含有pFV31和/或pFV202的菌株，
b)在所述微生物中扩增并具体地过量表达panD基因和选择性地其它编码天冬氨酸-1-脱羧酶的核苷酸序列，
c)泛酸在培养基或微生物细胞中富集，并且
d)分离合成的泛酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用含有可复制DNA的微生物，其核苷酸序列编码来自棒杆菌的panD。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于可复制DNA的特征是：
(i)SEQ ID No.1中所示的编码panD的核苷酸序列，或者
(ii)在遗传密码简并性区域内对应于序列(i)的序列，或者
(iii)与互补于序列(i)或(ii)的序列杂交的序列，以及选择性地
(iv)(i)中的中性意义突变。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用微生物，其中通过借助带有这些基因或核苷酸序列的质粒载体增加拷贝数来实现基因或核苷酸序列的扩增(过量表达)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用微生物，其中通过突变位于结构基因上游的启动子和调控区域来实现过量表达。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用微生物，其中通过在结构基因上游掺入表达盒来实现过量表达。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过延长以上述序列作为模板转录的mRNA的寿命和/或防止相应酶蛋白的降解来影响扩增。
8.根据权利要求1-7所述的方法，其特征在于使用分别或一起带有其它代谢物或抗代谢物抗性基因突变的微生物。
9.根据权利要求1-8所述的方法，其特征在于通过在改良的适当培养基中发酵微生物或改变发酵技术来实现过量表达。
10.根据权利要求1-9所述的方法，其特征在于使用其中减弱泛酸盐(泛酸)形成的代谢途径至少部分被关闭的微生物。
11.根据权利要求1-10所述的方法，其特征在于使用微生物，其中除了panD基因，泛酸合成代谢途径的其它基因，尤其是源于棒杆菌的那些基因单独或全部过量表达。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于使用微生物，其中除了panD基因，编码酮泛解酸羟甲基转移酶(E.C.4.1.2.12)和泛酸合成酶(E.C.6.3.2.1)的一种或多种基因、尤其是源于棒杆菌的基因过量表达。
13.根据权利要求11和12所述的方法，其特征在于使用以单独含有上述基因的各种相容性质粒载体转化的微生物。
14.根据权利要求11和12所述的方法，其特征在于使用以质粒载体转化的大肠杆菌微生物，而且质粒载体含有一种或多种上述基因包括panD基因，其中所述基因连续排列并在共同启动子的控制之下或彼此分开在不同启动子的控制之下。
15.根据一个或多个前述权利要求所述的方法，其特征在于使用的微生物含有质粒载体pND-D2，其特征见图2中所示的限制性图谱，它作为谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pND-D2以DSM12438的号码保存。
16.根据一个或多个前述权利要求所述的制备泛酸的方法，其特征在于进行下列步骤：
a)大肠杆菌微生物的发酵，其中至少panD基因得到扩增(过量表达)，选择性地与panB和/或panC基因结合。
b)泛酸在培养基或微生物细胞中的富集，和
c)泛酸的分离
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于过量表达的基因来自棒杆菌属微生物。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于在步骤a)中加入从包括天冬氨酸、β-丙氨酸、酮泛解酸、酮异戊酸和泛解酸的群体中选出的泛酸前体。
19.包含质粒pFV31和/或pFV202并通过导入可复制DNA转化的大肠杆菌(sic)微生物，可复制DNA的特征是：
(i)SEQ ID No.1中所示的编码panD的核苷酸序列，或者
(ii)在遗传密码简并性区域内对应于序列(i)的序列，或者
(iii)与互补于序列(i)或(ii)的序列杂交的序列，以及选择性地
(iv)(i)中的中性意义突变。
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