CZ428199A3 - Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech - Google Patents

Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech Download PDF

Info

Publication number
CZ428199A3
CZ428199A3 CZ19994281A CZ428199A CZ428199A3 CZ 428199 A3 CZ428199 A3 CZ 428199A3 CZ 19994281 A CZ19994281 A CZ 19994281A CZ 428199 A CZ428199 A CZ 428199A CZ 428199 A3 CZ428199 A3 CZ 428199A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ala
gene
leu
wall
gly
Prior art date
Application number
CZ19994281A
Other languages
English (en)
Inventor
Nicole Dr. Dusch
Jörn Dr. Kalinowski
Alfred Prof. Dr. Pühler
Original Assignee
Degussa-Hüls Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa-Hüls Aktiengesellschaft filed Critical Degussa-Hüls Aktiengesellschaft
Priority to CZ19994281A priority Critical patent/CZ428199A3/cs
Publication of CZ428199A3 publication Critical patent/CZ428199A3/cs

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Popisuje se způsob výroby pantothenové kyseliny fermentací mikroorganismů, ve kterýchje zesílen (zvýšenajeho exprese) alespoň gen panD, popřípadě v kombinaci s genem panB a/nebo genempanC a zvýší se koncentrace kyseliny pantothenové v médiu nebo buňkách mikroorganismu.

Description

Oblast techniky
Kyselina pantothenové představuje komerčně významný vitamín, který nalézá uplatnění v kosmetice, lékařství a ve výživě lidí i zvířat.
Kyselina pantothenové může být vyrobena pomocí chemické syntézy nebo biotechnologicky pomocí fermentace vhodného mikroorganizmu ve vhodném živném roztoku. Při chemické syntéze je důležitým meziproduktem DL-pantolakton. DL-pantolakton se vyrábí vícestupňovou syntézou z formaldehydu, isobutylaldehydu a kyanidu. V dalších krocích syntézy se pak dělí vzniklá racemická směs a kondenzací D-pantolaktonu s β-alaninem se získá kyselina D-pantothenová.
Výhodou fermentativního způsobu výroby za pomoci mikroorganizmů je, že vzniká požadovaný stereoizomer a to D-forma kyseliny pantothenové, která je zcela prostá L-formy.
Dosavadní stav techniky
Různé druhy bakterií, jako jsou například Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes nebo také kvasinek, jako jsou například Debaromyces castellii, mohou v živném roztoku obsahujícím glukózu, DL-pantoinovou kyselinu a β-alanin, produkovat kyselinu D-pantothenovou, jak je to popsáno v EP-A 0 493 060.
Ve spise EP-A O 493 060 se dále uvádí, že u bakterií Escherichia coli lze zesílením genů pro biosyntézu kyseliny pantothenové, které se nacházejí v plazmidech pFV3 a pFVS, zvýšit tvorbu této kyseliny v kultivačním médiu obsahujícím glukózu, DL-pantoinovou kyselinu a β-alanin.
EP-A 0 590 857 a patent USA č. :5,518, 906 popisují mutantní kmeny bakterií odvozené od Escherichia coli IFO03547, označené jako FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221,
FV6051 a FV5069, které nesou rezistenci k různým antimetabolitům, jako například ke kyselině salicylové, α-ketomáselné kyselině, β-hydroxyasparagové kyselině, O-methylthreoninu a α-ketoisovalerové kyselině, roztoku obsahujícím glukózu a β-alanin D-pantothenovou kyselinu. V dokumentu EPA-0 a v živném produkuj i 590 857 a v patentu USA 5,518,906 se dále uvádí, že zesílením genů pro biosyntézu kyseliny pantothenové, které se nacházejí v plazmidu pFV31, lze ve výše uvedených kmenech E.coli zvýšit produkci D-pantoinové kyseliny v kultivačním médiu obsahujícím glukózu a produkci D-pantothenové kyseliny v kultivačním médiu obsahujícím glukózu a β-alanin.
Dokument WO 97/10340 mimo to popisuje, že ve kmenech bakterií Escherichia coli, které vytvářejí kyselinu pantothenovou, lze dále zvýšit produkci kyseliny pantothenové zvýšením aktivity syntázy hydroxyoctové kyseliny II - enzymu, který se podílí na biosyntéze valinu,.
Podstata vynálezu
Vynález se snaží popsat nové základy pro zlepšené způsoby fermentativní výroby kyseliny D-pantothenové.
Vitamín pantothenové kyselina představuje komerčně významný produkt s využitím v kosmetice, lékařství a
• · · · * · · «
-3v lidské i zvířecí výživě. Z toho vyplývá všeobecný zájem o vylepšený způsob výroby pantothenové kyseliny.
V následujícím textu se výrazy D-pantothenová kyselina nebo pantothenové kyselina nebo pantothenát rozumí nejen volná kyselina, ale také její soli, jako například vápenatá, sodná, amonná nebo draselná sůl.
Předmětem vynálezu je mimo jiné způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantothenové za použití mikroorganismů, a to zejména takových, které již produkují D-pantothenovou kyselinu, a ve kterých je samostatně nebo v kombinaci s geny panB a/nebo panC zesílen gen panD kódující L-aspartát-1dekarboxylázu (E.C. 4.1.1.11), přičemž zesílením je zejména zvýšení exprese genu. Vynález dále popisuje příslušné rekombinantní DNA sekvence, které jsou dále popsány v nárocích. Předmětem vynálezu jsou rovněž způsoby fermentativní výroby kyseliny D-pantothenové využívající zlepšených, kyselinu D-pantothenovou produkujících mikroorganismů, které byly vytvořeny podle nároků 8 až 17.
Výrazem zesílení se v tomto případě rozumí zvýšení intracelulární aktivity jednoho nebo několika enzymů, které jsou v mikroorganizmu kódovány příslušnými DNA, například tím, že se zvýší počet kopií genu (genů) na buňku, použije se silný promotor, nebo se použije gen kódující enzym se zvýšenou aktivitou, popřípadě kombinace těchto účinků.
Předmětem vynálezu jsou dále mikroorganismy, které jsou schopné vytvářet kyselinu pantothenovou z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy nebo z glycerinu a ethanolu. Může jít houby, kvasinky nebo o Gram-pozitivní bakterie například rodu Corynebacterium nebo Gram-negativní bakterie jako jsou například Enterobacteriaceae. Z enterobakterií je třeba jmenovat zejména rod Esherichia a druh Esherichia coli. Z bakterií patřících k druhu Esherichia coli je třeba dále
-4jmenovat takzvané kmeny K-12 jako jsou například kmeny MG1655 nebo W3110 (Neidhard a další: Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology, ASM Press, Washington D.C.) či přirozeně se vyskytující kmen (wild type) Escherichia coli IF03547 (Institut fermentace, Osaka, Japonsko) a od nich odvozené mutanty. Z bakterií rodu Corynebacterium je třeba uvést zejména druh Corynebacterium glutamicum, které jsou odborníkům známy díky svojí schopnosti produkovat aminokyseliny. K tomuto druhu bakterií náleží přirozeně se vyskytující kmeny jako například Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Corynebacterium melassecola ATCC17965 a od nich odvozené kmeny.
Vynález dále popisuje skutečnost, že ke zvýšené produkci kyseliny D-pantothenové dochází po zesílení exprese nově izolovaného genu panD, který kóduje L-aspartát-1dekarboxylázu (E. C. 4.1.1.11). Ve výhodném provedení tento gen pochází z bakterií Corynebacterium glutamicum.
Vynález dále popisuje skutečnost, že zvýšená exprese genu panD má výhodné účinky v takových kmenech bakterií, ve kterých je současně zvýšená exprese genů panB a panC, které kódují ketopantoát hydroxymethyl-transferázu respektive pantothenát synthetázu. Výhodné účinky těchto genů se projevují je-li zvýšena exprese každého zvlášť nebo obou dohromady.
Zvýšení exprese genu lze docílit například zvýšením počtu kopií příslušného genu na buňku nebo mutací v oblasti promotoru a/nebo v regulační oblasti proti směru transkripce od strukturního genu. Stejným způsobem mohou účinkovat expresní kazety zabudované proti směru transkripce od strukturního genu. Pomocí indukovatelných promotorů lze dále zesílit expresi v průběhu fermentativní produkce D-pantothenátu. Expresi lze dále zlepšit prodloužením • · • « · * • « · ·
-5životnosti m-RNA v buňce nebo inhibici rozkladu enzymatických proteinů. Geny nebo rekombinantní genové konstrukty podle vynálezu se přitom nacházejí na plazmidovém vektoru s různým počtem kopií na buňku nebo jsou integrovány v chromozómu a amplifikovány. Alternativně může být exprese příslušného genu dále zvýšena změnou složení média a způsobu kultivace.
Návody k tomu mohou odborníci nalézt mimo jiné v publikacích Martin a další (Bio/Technology 5, strana 137 až 146 (1987)), Guerrero a další (Gene 138, strana 35 až 41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, strana 428 až 430 (1988)), Eikmanns a další (Gene 102, strana 93 až 98 (1991)), v Evropském patentovém spise EPS 0 472 869, v patentu USA č.: 4,601,893, v publikacích Schwarzer a Píihler (Bio/Technology 9, strana 84 až 87 (1991), Reinscheid a další (Applied and Environmental Microbiology 60, strana 126 až 132 (1994)), LaBarre a další (Journal of Bacteriology 175, strana 1001 až 1007 (1993)), v patentové přihlášce WO 96/15246, Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, strana 191 až 195 (1998)) nebo v příručce Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pro obecnou bakteriologii) vydané Americkou bakteriologickou společností (American Society for Bacteriology), Washington
D.C., USA v roce 1981.
Kromě toho může odborník nalézt řadu návodů v článcích Chang a Cohen (Journal of Bacteriology 134: strana 1141 až 1156 (1978)), Hartley a Gregori (Gene 13: strana 347 až 353 (1981)), Amann a Brosius (Gene 40: strana 183 až 190 (1985)), de Broer a další, (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: strana 21 až 25 (1983), při LaVallie a další. (Bio/Technology 11, strana 187 až 193 (1993)), v přihlášce PCT/US 97/13359, a v článcích Llosa a další, (Plasmid 26: strana 222 až 224 (1991)), Quandt a Klipp (Gene 80: strana 161 až 169 (1989)), Hamilton
(Journal of Bacteriology 171: strana 4617 až 4622 (1989)),
Makrides (Microbiological Reviews 60: strana 512 až 538 (1996) a dále ve známých učebnicích zaměřených na výuku genetiky a molekulární biologie.
Před vlastní izolací genu panD nebo jiných genů, například genů panB a panC z bakterie C. glutamicum je nejprve nutno vytvořit DNA knihovnu tohoto mikrorganismu v bakteriích E. coli. Způsob vytvoření takovéto DNA knihovny je popsán ve všeobecně známých učebnicích a příručkách jako je například učebnice Winnacker: Gene und Klone: Eine Einfílhrung in die Gentechnologie (Geny a Klony: Úvod do genového inženýrství, nakladatelství Chemie, Weinheim, SRN, 1990) či příručka Sambrook a další: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Laboratorní manuál molekulárního klonování, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Jednou takovou známou knihovnou je knihovna E. coli K-12 kmene W3110 v λ-vektorech vytvořená a popsaná Koharou a dalšími (viz Cell 50, strana 495 až 508 (1987)). Bathe a další popisují (viz Molecular and General Genetics, 252: strana 255 až 265, 1996) DNA knihovnu bakterie C. glutamicum ATCC13032, vytvořenou pomocí kosmidu SuperCos I (Wahl a další 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: strana 2160 až 2164) v bakteriích E.coli K-12 kmene NM554 (viz Raleigh a další 1988, Nucleic Acids Research 16: strana 1563 až 1575). K přípravě DNA knihovny bakterie C. glutamicum v E. coli mohou být použity také plazmidy jako například pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, strana 807 až 818 (1979)) nebo pUC9 (Norrander a další 1983, Gene 26:
strana 101 až 106). Jako hostitelské jsou vhodné zvláště takové kmeny E. coli, které jsou restrikčně a a rekombinačně deficientní. Příkladem takového kmene jsou buňky kmene DH5aMCR, viz Grant a další, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) strana 4645 až 4649.
I • · « « *« · • · « · · « » • · flfl* • · · · · · • · • · • · způsobů vytvořená DNA ••fl ·· ·· «··
-7Některým z výše uvedených knihovna se poté přenese do indikátorového kmene ať již pomocí transformace (viz Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, strana 557 až 580, 1983) nebo elektroporace (Tauch a další, 1994, FEMS Microbiologícal Letters, 123: strana 343 až 347). Vhodný indikátorový kmen se vyznačuje tím, že obsahuje mutaci ve vhodném genu a to takovou, která vyvolává viditelnou změnu fenotypu, například závislost na přídavku metabolitu do kultivačního média (auxotrofii). Indikátorové kmeny či mutanty lze získat z publikovaných zdrojů a nebo ze sbírek kmenů a kultur, nebo je lze popřípadě i přímo vytvořit. Pro tento vynález mají velký význam bakterie E. coli DV9 (viz Vallari a Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164: strana 136 až 142), které mají mutaci v genu panD. Jiným příkladem E. coli s defektem ve tvorbě pantothenové kyseliny je kmen SJ2, který má mutaci v genu panB a lze jej získat z genové banky Univerzity v Yale, New Haven, Connecticut, USA.
Po transformaci indikátorového kmene, například panDmutantních buněk DV9, rekombínantním plazmidem, který obsahuje hledaný gen, například gen panD, a po expresi příslušného genu, dojde ke změně fenotypu indikátorového kmene, například tento kmen ztratí závislost na přídavku pantothenové kyseliny v kultivačním médiu.
Takto isolovaný gen či DNA fragment může být dále popsán a charakterizován určením jeho sekvence, tak jak je to popsáno například Sangerem a dalšími (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America, 74: strana 5463 až 5467, 1977). Sekvenci genu lze poté porovnat se známými sekvencemi ve veřejných databázích například v databázi GenBank (Benson a další., 1998, Nuleic Acids Research, 26: strana 1 až 7) a publikovanými způsoby ji analyzovat, viz Altschul a další, 1990, Journal of Molecular Biology 215: strana 403 až 410.
• ·
-8Tímto způsobem byla získána a zpracována i nová DNA sekvence z bakterie C. glutamicum, která je součástí vynálezu a je uvedena jako Sekvence id.č.:l. Dále byly z uvedené DNA sekvence výše popsanými metodami odvozeny aminokyselinové sekvence příslušného enzymu. Sekvence id.č.: 2 udává pořadí aminokyselin v produktu genu panD, jmenovitě L-aspartát-l-dekarboxylázy.
Dále byly uvedeným způsobem získány i nové sekvence genů kódujících enzymy panB a panC z bakterie C. glutamicum, které jsou rovněž součástí vynálezu jako Sekvence id.č.:3. Sekvence id.č.: 4 udává pořadí aminokyselin v produktu genu panB, jmenovitě ketopantoát hydroxymethyl transferázy a Sekvence id č.:5 udává pořadí aminokyselin v produktu genu panC tedy pantothenát syntetázy.
Vynález dále popisuje všechny další kódující DNA sekvence, které odpovídají Sekvenci id.č.:l a/nebo 3 v důsledku degenerace genetického kódu. Vynález rovněž popisuje všechny sekvence DNA, které hybridizují se Sekvencí id.č.:l a/nebo 3. Odborníkům jsou dále známy konzervativní záměny aminokyselin jako je například záměna glycinu za alanin nebo záměna kyseliny asparagové za kyselinu glutamovou. Tyto záměny aminokyselin se nazývají sense mutations a vzhledem k tomu, že nevedou k zásadní změně aktivity proteinu nazývají se rovněž funkčně neutrální. Dále je známo, že změny v N- a/nebo C-konci proteinu nemívají zásadní negativní vliv na funkci proteinu, ba v některých případech může dojít i k její stabilizaci. Odborník může najít údaje, které to potvrzují mimo jiné v práci BenBassata a dalších v časopise Journal of Bacteriology 169: strana 751 až 757 (1987), 0'Regana a dalších v časopise Gene 77: strana 237 až 251 (1989), Sahin-Totha a dalších v časopise Protein Sciences 3: strana 240 až 247 (1994), Hochuliho a dalších v Bio/Technology 6: strana 1321 až 1325 (1988) a ve známých učebnicích genetiky a molekulární • · · 4«·· ·«·« • * ··♦ » <· « « • · · · · ·····« • · · · « · ···· * · · · · · · «·» · · · »
-9biologie. Aminokyselinové sekvence, které jsou v tomto smyslu analogické Sekvencím id. č.:2, id. č.:4 a/nebo Sekvenci id. č.: 5 jsou tedy rovněž předmětem vynálezu.
Takto charakterizovaný gen může být následně samostatně nebo v kombinaci s dalšími geny exprimován ve vhodném mikroorganizmu. Jeden způsob exprese, respektive zvýšené exprese (over-expression) genů spočívá v tom, že se gen amplifikuje pomocí plazmidového vektoru, který navíc obsahuje regulační sekvence fungující jako signály pro expresi. Při výběru vhodného plazmidu přicházejí do úvahy takové, které jsou schopny se v příslušných mikroorganismech replikovat. Pro bakterie E.coli je možno brát v úvahu například vektory pSCIOl (Vocke a Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21),strana 6557 až 6561 (1983)) nebo plazmid pKK223-3 (Brosius a Holý, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81, 6929 (1984), pro bakterie Corynebacterium glutamicum pak jsou to například vektory pEKExl (viz Eikmanns a další, Gene 102: strana 93 až 98 (1991)), pZ8-l (Evropský patentový spis 0 375 889).
Příkladem mikroorganismů podle vynálezu jsou kmeny bakterie C. glutamicum ATCC13032/pND-D2 a ATCC13032/pND-DBC2 a kmen bakterie E.coli MG1655/PND-D2, které obsahují plazmidy pND-D2 a pND-DBC2. Plazmid pND-D2 je kyvadlový vektor pro E.coli-C. glutamicum založený na plazmidu pZ8-l a obsahující gen panD z C. glutamicum. Plazmid pND-DBC2 je kyvadlový vektor pro E.coli a C. glutamicum založený na plazmidu pZ8-l a obsahující geny panD, panB a panC z C. glutamicum.
Odborníkům je zřejmé, že je výhodně možno zkombinovat způsoby podle vynálezu s chromozomálními mutacemi, které způsobují rezistenci k metabolitům a antimetabolitům, popřípadě brání vylučování meziproduktů syntézy pantothenové kyseliny.
-10• * ·
Mikroorganismy zkonstruované podle vynálezu mohou být za účelem produkce kyseliny D-pantothenové kultivovány kontinuálním způsobem, nebo způsoby dískontinuálními, ať již vsádkovou kultivací nebo přítokovou kultivací. Přehled známých způsobů kultivace je uveden v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Úvod do biotechnik, nakladatelství Gustav Fischer, Stuttgart, 1991) nebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periferní zařízeni, nakladatelství Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Použité kultivační médium musí patřičným způsobem vyhovovat nárokům příslušného mikroorganismu. Popisy různých známých kultivačních médií pro mikroorganismy jsou uvedeny příručce Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pro obecnou bakteriologii) vydaný Americkou bakteriologickou společností (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roce 1981. Jako zdroje uhlíku mohou být použity cukry a uhlohydráty jako například glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky jako například sójový olej, slunečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk; mastné kyseliny jako například kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy jak například glycerin a ethanol a organické kyseliny jako například kyselina octová. Tyto látky mohou být použity buď jednotlivě nebo ve směsi. Jako zdroje dusíku mohou být použity sloučeniny obsahující organický dusík jako například pepton, kvasničný extrakt, extrakt z masa, extrakt ze sladu, kukuřičný extrakt, sójová mouka a močovina nebo anorganické sloučeniny jako například síran amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný, uhličitan amonný a dusičnan amonný. Tyto zdroje dusíku mohou být použity buď jednotlivě nebo ve směsi. Jako zdroje fosforu lze použít hydrogenfosforečnan nebo dihydrogenfosforečnan draselný či odpovídající sodné • » < · • · » ·
-11soli. Kultivační médium musí dále obsahovat soli kovů které jsou nezbytné pro růst, jako například síran hořečnatý nebo síran železnatý. A konečně může být kultivační médium kromě výše uvedených látek obohaceno o esenciální růstové látky jako například aminokyseliny a vitamíny. Pro zvýšení tvorby kyseliny pantothenové lze kultivační médium ještě obohatit o její prekurzory jako jsou například aspartát, β-alanin; ketoisovalerát, ketopantoát, pantoát a popřípadě příslušné soli. Uvedené složky mohou být přidány do média jednorázově na počátku, nebo vhodným způsobem v průběhu kultivace.
Pro kontrolu pH v průběhu kultivace jsou vhodné zásadité sloučeniny jako například hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak nebo kyselé sloučeniny jako například kyselina fosforečná nebo kyselina sírová. Pěnění kultivační směsi lze kontrolovat přídavkem činidel potlačujících tvorbu pěny jako jsou například polyglykolestery mastných kyselin. Stabilitu plazmidů lze udržet prostřednictvím vhodného selekčního činidla například antibiotika. Vhodné aerobní podmínky lze udržovat přiváděním kyslíku nebo kyslíkobsahující směsi plynů, například vzduchu, do kultivačního média. Vhodná teplota pro pěstování bakterii se normálně pohybuje od 20°C do 50 °C a výhodně od 25 °C do 45° C. Doba kultivace by měla být taková, aby bylo dosaženo maxima tvorby pantothenové kyseliny. Tohoto maxima je obvykle dosaženo během 10 až 160 hodin.
Kmeny, vykazující vysokou aktivitu enzymu L-aspartát 1-dekarboxylázy, mohou být rovněž použity pro výrobu β-alaninu z L-aspartátu. K tomu mohou být použity fermentativní způsoby, nebo přímá enzymatická přeměna nebo kombinace obou způsobů.
Koncentraci produkované pantothenové kyseliny lze stanovit známými způsoby (viz Velisek; Chromatographic Science 60, strana 515 až 560 (1992).
i
-12Následující mikroorganismy byly uloženy v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur (DSMZ, Braunschweig, SRN) podle ustanovení Budapešťské smlouvy:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2 jako DSM12438
- Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-DBC2 jako DSM12437
Popis obrázků
Obrázek 1: na obrázku je schematicky znázorněna mapa kontigu 13 s otevřenými čtecími rámci orfl až orf-5.
Obrázek 2: schematická mapa plazmidů pZ8-l, pND-Dl a pND-D2.
Obrázek 3: schematická mapa fragmentu DNA klonovaného do plazmidu pURl a poloha sekvenovaných úseků. Zkratky: Ss cílové místo SspI, Sc - cílové místo Seal, Ps - cílové místo Pstl, Pv - cílové místo PvuII, Sa - cílové místo Sáli, Sp cílové místo Sphl a Ec - cílové místo EcoRI.
Obrázek 4: schematická mapa plazmidů pND-DBCl a pND-DBC2 Na obrázcích použité zkratky a symboly mají následující významy:
rrnBTlT2 - terminátor transkripce genu rrnB
Ptač - promotor tac panB - kódující oblast genu panB panC - kódující oblast genu panC panD - kódující oblast genu panD rep-C.g. - oblast nezbytná pro replikaci v bakteriích C. glutamicum oriV-E.c. - oblast nezbytná pro replikaci v bakteriích Ecoli
-13kan - gen pro rezistenci ke kanamycinu
EcoRI - cílové místo restrikčního enzymu EcoRI E - cílové místo restrikčního enzymu EcoRI BamHI - cílové místo restrikčního enzymu BamHI B - cílové místo restrikčního enzymu BamHI BglII - cílové místo restrikčního enzymu BglII Clal - cílové místo restrikčního enzymu Clal H - cílové místo restrikčního enzymu HindlII mcs - klonovací polylinker (multiple cloning sítě) Ncol - cílové místo restrikčního enzymu Ncol Nrul - cílové místo restrikčního enzymu Nrul Nsil - cílové místo restrikčního enzymu Nsil P - cílové místo restrikčního enzymu Pstl Pvul - cílové místo restrikčního enzymu Pvul
Sací - cílové místo restrikčního enzymu Sací
Sáli - cílové místo restrikčního enzymu Sáli
Seal - cílové místo restrikčního enzymu Seal
Sphl - cílové místo restrikčního enzymu Sphl
X - cílové místo restrikčního enzymu Xbal Xhol - cílové místo restrikčního enzymu Xhol
Příklady provedení vynálezu
Vynález bude blíže popsán v následujících příkladech
-14«·« «· «· ·«· ·· *·
Příklad 1: Klonování a sekvenování genu panD z bakterie C.
glutamicum
1. Klonování genu panD
Chromozomální DNA z bakterie C. glutamicum ATCC13032 byla izolována způsobem podle Taucha a dalších, 1995, Plazmid, 33: strana 168 až 179, a částečně naštepena restrikční endonukleázou Sau3A (Pharmacia Bio-Tech, Freiburg, Německo), katalogové číslo 27-0913-02) . DNA-fragmenty o velikostech 7 až 9 kb byly izolovány pomocí soupravy Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids (Macherey a Nagel, Duřen, Německo; kat. čís. 740584) a naligovány do defosforylovaného cílového místa BamHI vektoru pUC19 (Narrander a další 1982, Gene, 26: strana 101 až 106), dodaného firmou MBI Fermentas (Vilnius, Litva).
Ligace byla provedena v podstatě tak, jak je to popsáno v příručce Sambrook a další. (1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor) , přičemž byla směs DNA s T4-ligázou (Pharmacia Bio-Tech, Freiburg, Německo) inkubována přes noc. Touto ligační směsí byly poté elektroporovány (viz Tauch, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347) bakterie E. coli kmene DH5amcr (viz Grant a další, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87 (1990) strana 4645 až 4649) a poté byly vysety na LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s přídavkem
100 pg/ml ampicilinu. Po 24 hodinové inkubaci při 37°C a opětovné izolaci plazmidové DNA metodou alkalické lýzy (viz Birnboim a Doly (Nucleic Acids Research, 7: strana 1513 až 1523, 1997) byla získána genomová knihovna bakterie C.
glutamicum.
Touto knihovnou byly elektroporovány kompetentní buňky
E. coli kmene DV9 (Vallari a Rock, 1985, Journal of
-15Bacteriology, 164: strana 136 až 142), které nesou mutaci v genu panD. Elektroporační směs byla nejprve ponechána regenerovat (Tauch a další, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347) a poté dvakrát promyta médiem E (Vogel a Bonner, 1956, Journal of Biological Chemistry, 218: strana 97 až 106) . Složení média E udává tabulka 1. Těmito buňkami bylo poté inokulováno 50 ml média E s přídavkem 100 pg/ml ampicilinu ve 250 ml Erlenmeyerových baňkách a tyto baňky byly inkubovány ve třepačce při 250 otáčkách/min a teplotě 39°C. Po dvoudenní inkubaci byla bakteriální suspenze naředěna přeočkována na LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190), s přídavkem 100 pg/mililitr ampicilinu.
Tabulka 1: složení média E
Sloučenina Množství na 11 Poznámka
K2HPO4 10 g
NaNH4HPO4* 4H2O 3, 5 g
Kyselina citrónová 2 g
MgSO4*7H2O 0,2 g
Glukóza 4 g Sterilizována separátně
Thiamin 0,2 pg Sterilně filtrován
Poté byla vyizolována plazmidová DNA z jedné kolonie transformovaných DV9 buněk. Velikost tohoto plazmidu, označeného jako pNIC-1.3, byla stanovena porovnáním se standardy v elektroforéze na agarózovém gelu (Sambrook a další, Molecular cloning: A laboratory manual (1989) Cold
-16• · • · · · · ·
Spring Harbour Laboratory Press). Plazmid pNIC-1.3 obsahuje inzert o velikosti 7 komplementovat mutaci potvrzena opětovnou kbp. Schopnost plazmidu pNIC-1.3 v panD genu v buňkách DV9 byla transformací. Takto transformanti byli opět schopni růst v médiu neobsahuje β-alanin za výše uvedených podmínek.
získání E, které naštěpeného strana 69
Tento 7 kb inzert byl dále subklonován naštěpením plazmidu pNIC-1.3 restrikčními enzymy BamHI (Pharmacia BioTech (Freiburg, Německo, kat.č. 27-0868-03), EcoRI (Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, Německo, kat.č. 27-0884-03) a BglII (Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, Německo, kat.č. 270946-02) a poté byl zaligován do odpovídajícími enzymy vektoru pK18mob (Scháfer, 1994, Gene, 145: až 73). Získanou ligační směsí byly elektroporovány buňky E. coli DV9 (s mutací v genu panD) a byla provedena selekce na transformanty s kompíementujícím fenotypem za výše uvedených podmínek, přičemž plotny s agarózou v tomto případě obsahovaly 50 pg/ml kanamycinu. Byly izolovány plazmidy z jednotlivých kolonií s kompíementujícím fenotypem a ty byly charakterizovány pomocí restrikční analýzy. Jeden EcoRI-subklon, dále označovaný jako pNIC-10, který obsahoval asi 3 kb velký DNAinzert byl vybrán pro další sekvenční analýzu.
2.Sekvenování genu panD
Během dvouvláknového sekvenování 3 kb fragmentu z plazmidu pNIC-10 byl tento plazmid nejprve naštěpen s různými restrikčními enzymy a vzniklé fragmenty byly překlonovány do plazmidů pUC19 nebo pK18mob. Plazmidová DNA použitá k sekvenování byla izolována podle instrukcí výrobce křtem QIAGEN Plasmid Mini kit (Qiagen, lne., Chatsworth, • ·
-17CA, USA) a její velikost byla určena pomocí elektroforézy na agarózovém gelu.
Vlastní sekvenování bylo provedeno pomocí Sangerovy metody terminace DNA řetězce dideoxynukleotidy, viz Sanger a další, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: strana 5463 až 5467, s modifikacemi podle Zimmermanna (Nucleic Acids Research, 18: strana 1067, 1990). Byl k tomu použit Cy5-AutoRead Sequencing kit Pharmacia (kat. čís. 27-2690-02, Freiburg, SRN) . Elektroforetická analýza sekvenační směsi byla provedena v polyakrylamidovém gelu Long Ranger Gel Solution od firmy FMC BioProducts (Rockland, Me., USA) na automatickém sekvenátoru využívajícím laserem excitované fluorescence (A.L.F.) od firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech (Uppsala, Švédsko). Získaná hrubá nukleotidová sekvence byla poté analyzována programovým balíkem Staden (Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231, 1986, verze 97-0). Jednotlivé sekvence subklonů plazmidu pNIC-10 byly sestaveny do souvislého 3060 bp dlouhého kontigu, který byl poté označen jako kontig 13. Počítačová analýza celého DNA fragmentu programem XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231) pomohla identifikovat pět otevřených čtecích rámců (ORF). Na obrázku 1 je znázorněna restrikční mapa kontigu 13 jakož i poloha jednotlivých čtecích rámců orf-1 až orf-5. Pomocí programu BLAST (viz Gish and States, 1993, Nátuře of Genetics, 3: strana 266 až 272; Altschul a další, 1990, Journal of Molecular Biology, 215: strana 403 až 410) byla studována homologie těchto čtecích rámců, tak jak to umožňuje on-line služba na serveru NCBI Národní lékařské knihovny (National Library of Medicine, Bethesda, MD, USA) . Z analýzy Kontigu 3 vyplývá, že orf-3 odpovídá genu panD. V dalším textu se tedy orf-3 označuje jako panD. Nukleotidová sekvence DNA fragmentu nesoucího gen panD je uvedena jako Sekvence id.č.:l.
• · · ···· ····
-18•·· ·· ·· ··· ·· ··
Aminokyselinová sekvence produktu genu panD, neboli rovněž L-aspartát 1-dekarboxylázy je uvedena jako Sekvence id.č.:2.
Příklad 2: Klonování a sekvenování genů panB a panC z bakterie C. glutamicum
1. Klonování genů panB a panC
Chromozomální DNA z bakterie C. glutamicum ATCC13032 byla izolována způsobem podle Schwarzera a Puhlera (Bio/Technology 9 (1990) strana 84 až 87) a naštěpena restrikční endonukleázou Sau3A. Po elektroforetickém rozdělení byly extrahovány fragmenty DNA o velikostech 3 až 7 kb respektive 9 až 20 kb a ty byly následně naligovány do jedinečného cílového místa BamHI ve vektoru pBR322.
Ligační směsí byly poté transformovány bakterie E. coli kmene DH5ctmcr (viz Grant a další, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87 (1990) strana 4645 až 4649; Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) strana 557 až 580) . Kolonie nesoucí inzert byly identifikovány na základě jejich citlivosti k tetracyklinu po přeočkování na plotny s LB-agarózou a přídavkem 10 pg/ml tetracyklinu. Po vyizolovaní plazmidů (viz Sambrook a další, Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) byly klony rozděleny do 8 skupin po 400 plazmidech s inzertem o velikosti 9 až 20 kb a do 9 skupin po 500 plazmidech s inzertem o velikosti 3 až 7kb. Bakterie E. coli panB s mutací SJ2 (viz Cronan a další 1982, Journal of Bacteriology 149: strana 916 až 922) byly elektroporací transformovány touto knihovnou, viz Wehrmann a další, 1994, Microbiology 140: strana 3349 až 3356. Transformační směsi byly vysety přímo na médium CGXII s přídavkem 15 g/1 agaru (viz Keilhauer a další, Journal of Bacteriology (1993) 175:
strana 5595 až 5603) . Z klonů, které byly schopny růst bez přídavku pantothenátu, byla vyizolována plazmidová DNA (viz Sambrook a další, Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). U 8 plazmidů byla pomocí opětovné transformace potvrzena schopnost heterologně komplementovat defekt v genu panB u bakterií E. coli s mutací SJ2.
U těchto 8 plazmidů byla vypracována restrikční mapa. Jeden z takto studovaných plazmidů, následně pojmenovaný jako pURl, obsahoval inzert o velikostí 9,3 kb (viz obrázek 2). Transformací bakterií E. coli s mutací DV39 v genu panC (viz Vallari a Rock, 1985, Journal of Bacteriology 164: strana 136 až 142) bylo potvrzeno, že vektor pURl je rovněž schopen komplementovat defekt v genu panC v tomto mutantu.
2. Sekvenování genů panB a panC
Fragment inzertu o velikosti 2,2 kb (viz obrázek 3) z plazmidu pURl byl sekvenován pomocí Sangerovy metody terminace DNA řetězce dideoxynukleotidy, viz Sanger a další, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: strana 5463 až 5467. K tomu byli nejprve zhotoveny pomocí exonukleázy III menší fragmenty a ty byly sekvenovány pomocí standardních primerů (univerzálního a reverzního primerů firmy Boehringer Mannheim, SRN) . Elektroforetická analýza sekvenační směsi byla provedena automatickým sekvenátorem využívajícím laserem excitované fluorescence (A.L.F.) od firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech (Uppsala, Švédsko). Získaná nukleotidová sekvence byla analyzována programovým balíkem HUSAR (verze 4.0, EMBL, Cambridge, Velká Británie). Tato nukleotidová sekvence je uvedena jako Sekvence id.č.: 3. Analýzou byly identifikovány dva otevřené čtecí rámce. Jeden otevřený
-20čtecí rámec o délce 813 bp, byl identifikován jako gen panB, kódující polypeptid o délce 271 aminokyselin a je uveden jako Sekvence íd.č.:4. Druhý otevřený čtecí rámec obsahující 837 párů baží byl identifikován jako gen panC, kódující polypeptid 279 aminokyselin dlouhý je uveden jako Sekvence id.č.: 5.
Příklad 3: Konstrukce vektorů vhodných pro expresi genů panD, panBC a panDBC
Geny pro biosyntézu pantothenátu z bakterií C. glutamicum a E. coli byly amplifikovány pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a syntetických oligonukleotidových primerů. Tyto PCR reakce byly prováděny s Taq DNA polymerázou od firmy Gibco-BRL (Eggestein, SRN) v termálním cykleru PCT-100 (MJ Research lne., Watertown, Mass., USA). Po počáteční 2 minutové denaturaci při 94 °C následovalo 35 cyklů sestávajících z 90 sekundové denaturace při 94°C, 90 sekundového annealingu při teplotě odvozené od sekvence primerů a vzorce Ta= [ (2AT+4GC)-5 ] °C (viz Suggs, a další 1981, strana 683 až 593, v knize: D. D. Brown, a C. F. Fox (editoři), Developmental biology using purified genes, Academie Press, New York, USA) a konečně z 90 sekundové polymerace při 72°C. Po 35 cyklech byla reakce zakončena 10 minutovou polymerací při 72°C. Takto amplifikované produkty byly poté elektroforeticky otestovány na agarózovém gelu a přímo ligovány podle instrukcí výrobce do vektoru pCR®2.1 (TA Cloning Kit, Invitrogene, Leek, Nizozemí, kat. č.. KNM2030-01). Ligační směs byla použita k transformaci bakterií E. coli kmene TOP10F'. Selekce transformantů byla provedena 24 hodinovou inkubací při teplotě 37°C na plotnách • ·
s LB-agarózou s přídavkem 100 pg/ml ampicilinu a 40 pg/ml X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-ů-D-Galaktosid).
Na základě nukleotidové sekvence genů pro biosyntézu pantothenátu panD (Sekvence id.č.:l) a panBC (Sekvence id.č.: 3) z bakterií C. glutamicum ATCC 13032 a E. coli K12 (W. K. Merkel and B.P. Nichols, 1993, GenBank: L17086) byly nasyntetizovány PCR primery (MWG Bio-Tech, Eberberg, SRN) . Tyto primery byly vybrány tak, aby amplifikované fragmenty obsahovaly vlastní geny, jakož i původní vazebná místa pro ribozómy, avšak nikoliv možné promotorové oblasti. Dodatečně bylo vloženo rovněž vhodné restrikční místo, které usnadnilo klonování do cílového vektoru. Sekvence těchto PCR-primerů včetně vložených cílových míst (podtržené sekvence) jakož i popis jimi amplifikováných genů (velikost fragmentů v bp je uvedena v závorkách) udává následující tabulka.
Tabulka 2: primery použité k amplifikaci genů panD, panBC
Primer Sekvence s restrikčními místy Produkt Plazmid
panD-Ecl 5'-GAATTCGACAGGGTAGAAAGGTAGA-3' EcoRI panDE.c. (462bp). pND-Dl
panD-Ec2 5'-AGATCTGGGATAACAATCAAGCAACC-3' BglII
panD-Cgl 5'-CATCTCACGCTATGAATTCT-3' EcoRI panDc.g. (405bp) pND-D2
panD-Cg2 5'-ACGAGGCCTGCAGCAATA-3' Pstl
panBC-El 5'- GGATCCCACAACATCAATTTATCAGG-3' BamHI panBCE.c. (1700 bp) pND-BCl
panBC-E2 5'-GGATCCTTAAGTATTACGCCAGCTC-3’ BamHI
panBC-Cl 51-GTCGACTCTGAGCTGGTCATCACATC-3' Sall panBCc.g. (1700bp) pND-BC2
panBC-C2 5'-GTCGACACGCAGGGTTGGTACTAGAG-3' Sall
-22Jako základní vektor pro expresi jak v bakteriích C. glutamicum tak i v E. coli byl použit kyvadlový expresní vektor pZ8-l pro E. coli-C. glutamicum (Evropský patentový spis 0 375 889, viz obrázek 2) . PCR produkty naklonováné v předchozím kroku do vektoru pCR®2.1 byly pomocí restrikčních míst obsažených v primerech naligovány do stejných míst expresního vektoru pZ8-l a tím vloženy pod kontrolu tac-promotoru, který je obsažen na tomto plazmidu. Jedinou výjimkou byl PCR produkt genu panDE.c. (EcoRI-BglIIfragment), který byl vložen do kompatibilních restrikčních míst EcoRI-BamHI vektoru pZ8-l. Označení příslušných nově zkonstruovaných expresních plazmidů jsou uvedena v tabulce 2 .
Expresní vektor pZ8-l s genem panDEE.c. z bakterie E. coli byl označen jako pND-Dl a pZ8-l s genem panDc.g. z bakterie C. glutamicum byl označen jako pND-D2. Odpovídajícím způsobem byly označeny expresní plazmidy obsahující geny panBE.c. a panBc.g. jako pND-BCl respektive pND-BC2. Na obrázku 2 je znázorněna strategie klonování genů panD£.c a panDc.g. do vektoru pZ8-l. Správný výsledek klonování všech genů do expresních plazmidů byl ověřen sekvenováním příslušných inzertů.
Dále byly zkonstruovány umělé panDBC-operony obsahující geny panD jak z bakterie E. coli tak i z C. glutamicum. Při konstrukci operonu s genem panD z bakterie E. coli byl nejprve enzymem EcoRI naštěpen vektor pCR2.1 obsahující gen panDE.c., plazmidová DNA byla rozdělena na agarózovém gelu a fragment panD byl vyizolován z gelu způsobem, který byl popsán v příkladu 1.1, tj . pomocí kitu Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids (Macherey a Nagel, Duřen, SRN). V dalším kroku byl tento fragment nakloňován do plazmidu pND-BCL naštěpeného enzymem EcoRI. Plazmidy se správnou orientací genu panD byly získány tak, že ligační směsí byly transformovány buňky E. coli kmene
I
• · w 9 ·
-23DV9, které jsou auxotrofní v genu panD pak byla provedena selekce (viz příklad 1) na komplementaci auxotrofního fenotypu. Poté byla vyizolována plazmidová DNA komplementujících mutantů a správné uspořádání genů bylo ověřeno sekvenováním inzertu. Výsledný plazmid byl označen pND-DBCl a je znázorněn na obrázku 4.
Při konstrukci operonu panDBC z bakterie C. glutamicum bylo postupováno obdobně. Vektor pCR2.1 obsahující gen panDc.g. byl nejprve naštěpen enzymem EcoRI, přičemž gen panDc.g. byl štěpen jednak v místě, které bylo vloženo do primerů a jednak v dalším místě EcoRI, které pocházelo ze sekvence vektoru. Vzniklý fragment genu byl po izolaci nakloňován do vektoru pZ8-l naštěpeného rovněž enzymem EcoRI. Plazmid se správnou orientací genu panD nazvaný pNDD4 byl získán a otestován výše popsaným způsobem. V dalším kroku byl plazmid pND-D4 štěpen restrikčním enzymem Sáli a spojen s přečištěným fragmentem panBC, který vznikl štěpením plazmidu pND-BC2 enzymem Sall (Pharmacia Bio-Tech, Freiburg, SRN, kat.č.: 27-0882-01). Tato směs byla elektroporována do bakterií E. coli kmene DH5<xMCR. 10 vzniklých plazmidů bylo podrobeno restrikční analýze, čímž bylo zjištěno správné uspořádání genů panDBC. Správné uspořádání genů jednoho z těchto plazmidů, dále označeného jako pND-DBC2 (viz obrázek 4), bylo ověřeno sekvenováním.
Expresním vektorem pZ8-l, jakož i na tomto plazmidu založenými konstrukty pND-Dl, pND-D2 a pND-DBCl, byly transformovány bakterie E. coli kmene MG1655 a vzniklí transformanti byli selektováni na LB-agaru (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s přídavkem 50 pg/ml kanamycinu. Takto získané kmeny byly pojmenovány MGL655/PZ8-1, MG1655/PND-D1, MG1655/PND-D2 a MG1655/PND-DBC1.
Elektroporací plazmidů pZ8-l, pND-Dl, pND-D2 a pNDDBC2 do bakterií C. glutamicum kmene ATCC13032 a následnou
selekcí na LB-agaru (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s přídavkem 50 pg/ml kanamycinu byly získány kmeny ATCC13032/pZ8-l, ATCCl3032/pND-Dl, ATCC13032/pND-D2 a ATCC13032/pND-DBC2.
Příklad 4: Produkce pantothenátu v různých klonech bakterií E. coli kmene K12
Kvantitativní stanovení D-pantothenátu bylo provedeno pomocí bakterií Lactobacillus plantarum (zkušební kmen: Lactobacillus plantarum ATCC 8014, kat.č.: No.3211-30-3; zkušební kultivační médium: Bacto Pantothenat Assay Medium (DIFCO Laboratories, Michigan, USA), kat.č.: 0604-15-3).
Tento indikátorový kmen může růst jen v přítomnosti pantothenátu v uvedeném kultivačním médiu. Růst bakterií lze určit z fotometrického měření a z lineární závislosti růstu na koncentraci pantothenátu v médiu. Pro kalibraci byla to použita vápenatá sůl pantothenátu (Sigma, kat.č.:P-2250). Optická hustota byla měřena na spektrofotometru LKB Biochrom od firmy Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, SRN) při vlnové délce 580 nm (dále O.D •58θ) ·
V tomto testu produkce pantothenátu byly bakterie E. coli klonů MG1655/PZ8-1, MG1655/PND-D1, MG1655/PND-D2 a MG1655/PND-DBC1 po 16 hodinové kultivaci ve zkušebním kultivačním médiu (médium E s přídavkem 50 pg/ml kanamycinu) při O.D. 58o =0,1 přeočkovány do 50 ml téhož média. Po 5 hodinové a 72 hodinové kultivaci při 37°C a třepání při 250 otáčkách v minutě byly bakterie zpeletovány 10 minutovou centrifugací při 5000 x g. Získaný bezbuněčný supernatant byl sterilně přefiltrován a poté uskladněn při teplotě 4°C až do doby vlastního stanovení pantothenátu.
• ·
Stanovení D-pantothenátu v supernatantu kultivačního média bylo provedeno pomocí bakterií L. plantarum kmene ATCC 8014 podle instrukcí firmy DIFCO (DIFCO manual, 10. vydání, strana 1100 až 1102; Michigan, USA). Výsledky měření udává tabulka 3.
Tabulka 3
Kmen Gen O.D. 580 a akumulace panthotanátu
(pg/ml) po 5 hodinách po 5 hodinách
O.D. 580 Pan. O.D. 580 Pan.
MG1655/pZ8-l - 2,0 0, 3 2,3 1,47
MG1655/pND-Dl panDE.c. 2, 3 0,9 2,5 6, 95
MG1655/pND-DBCl panDBCE.c. 2,0 0, 96 2,0 6, 96
MG1655/pND-D2 PanDc.g. 2,2 4, 07 2,3 9, 66
Příklad 5: Produkce pantothenátu v různých klonech bakterií C. glutamicum
Tvorba pantothenátu bakteriemi C. glutamicum kmenů ATCC13032/pZ8-l, ATCC13032/pND-Dl, ATCC13032/pND-D2 a C. glutamicum ATCC13032/pND-DBC2 byla testována v médiu CGXII (viz Keilhauer a další 1993, Journal of Bacteriology, 175: strana 5595 až 5603; Tabulka 4), s přídavkem 25 pg/mililitr kanamycinu. Toto médium je dále popisováno jako zkušební médium pro C. glutamicum.
-26Po 16 hodinové kultivaci ve zkušebním médiu pro C. glutamicum dosáhly kmeny bakterií O.D.580 =0, 1 a byly přeočkovány do 50 ml téhož média. Po 48 hodinové kultivaci při 30°C a třepání při 150 otáčkách v minutě byly bakterie zpeletovány 10 minutovou centrifugací při 5000 x g. Získaný bezbuněčný supernatant byl sterilně přefiltrován a poté byl stanoven pantothenát způsobem popsaným v příkladu 4. Výsledky produkce pantothenátu různými klony C. glutamicum jsou shrnuty v tabulce 5.
• ·
Tabulka 4: Složení média CGXII
Složka Množství na 1 1 Poznámka
(NH4)2SO4 20 g
močovina 5 g
KH2PO4 i g
k2hpo4 i g
Mg204*7 H20 0,25 g
MOPS (kyselina 3-morfolino propansulfonová) 42 g
CaCl2 10 mg
FeS04*7 H20 10 mg
MnS04* H20 10 mg
ZnS04*7 H20 1 mg
CuS04 0,2 mg
NiCl2*6 H20 0,02 mg
biotin 0,2 mg
glukóza 40 g autoklávována separátně
Kyselina protokatechuová (3,4- dihydroxy benzoová) 0,03 mg sterilně filtrována
-28Tabulka 5
Kmen Gen Akumulace panthotanátu (pg/ml) ·<,
0.D.580 Obsah pantothenátu
ATCC13032/pZ8-l - 21 0,19
ATCC13032/pND-Dl panDE.c. 20 0, 32
ATCC13032/pND-D2 panDc.g. 19 1,78
ATCC13032/pND-DBC2 panDBCc.g. 20 2, 6
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 540 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTISENSE: ne (vi) PŮVOD:
(A) ORGANISMUS: Corynobacterium glutamicum (B) KMEN: ATCC13032 (C) ANTISENSE: ne (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA:77 až 484 (D) DALŠÍ INFORMACE: start kodón= 77; produkt= L-aspartát -1dekarboxyláza; EC= 4.1.1.11; gen=panD (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 1:
AATATTCCTT TCCTTGTCAT CTCACGCTAT GATTTCTAAA ACTTGCAGGA CAACCCCCAT 60
AAGGACACCA CAGGAC ATG CTG CGC ACC ATC CTC GGA AGT AAG ATT CAC 109
Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His
10
CGA GCC ACT GTC ACT CAA GCT GAT CTA GAT TAT GTT GGC TCT GTA ACC 157
Arg Ala Thr Val 15 Thr Gin Ala Asp Leu 20 Asp Tyr Val Gly Ser 25 Val Thr
ATC GAC GCC GAC CTG GTT CAC GCC GCC GGA TTG ATC GAA GGC GAA AAA 205
Ile Asp Ala Asp Leu Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys
30 35 40
GTT GCC ATC GTA GAC ATC ACC AAC GGC GCT CGT CTG GAA ACT TAT GTC 253
Val Ala Ile Val Asp Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val
45 50 55
ATT GTG GGC GAC GCC GGA ACG GGC AAT ATT TGC ATC AAT GGT GCC GCT 301
Ile Val Gly Asp Ala Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala
60 65 70 75
GCA CAC CTT ATT AAT CCT GGC GAT CTT GTG ATC ATC ATG AGC TAC CTT 349
Ala His Leu Ile Asn Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu
80 85 90
CAG GCA ACT GAT GCG GAA GCC AAG GCG TAT GAG CCA AAG ATT GTG CAC 397
Gin Ala Thr Asp Ala Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His
95 100 105
GTG GAC GCC GAC AAC CGC ATC GTT GCG CTC GGC AAC GAT CTT GCG GAA 445
Val Asp Ala Asp Asn Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu
110 115 120
GCA CTA CCT GGA TCC GGG CTT TTG ACG TCG AGA AGC ATT TAGCGTTTTA 494
Ala Leu Pro Gly Ser Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile
125 130 135
GCTCGCCAAT ATTGCTGCCG GCCTCGTTGA AAATGGTCAT GGTGGC 540
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 136 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 2:
Met 1 Leu Arg Thr Ile Leu 5 Gly Ser Lys Ile 10 His Arg Ala Thr Val 15 Thr
Gin Ala Asp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Thr Ile Asp Ala Asp Leu
20 25 30
Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys Val Ala Ile Val Asp
35 40 45
Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val Ile Val Gly Asp Ala
50 55 60
Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala Ala His Leu Ile Asn
65 70 75 80
Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu Gin Ala Thr Asp Ala
85 90 95
Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His Val Asp Ala Asp Asn
100 105 110
Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu Ala Leu Pro Gly Ser
115 120 125
Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile
130 135
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 3
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2164 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTISENSE: ne (vi) PŮVOD:
(A) ORGANISMUS: Corynobacterium glutamicum (B) KMEN: ATCC13032 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA:351 až 1163 (C) DALŠÍ INFORMACE: start kodón= 351; produkt= ketopantoáthydroxy-methyltransferáza; EC=4.1.2.12; gen=panB (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA:1166 až 2002 (C) DALŠÍ INFORMACE: start kodón= 1166; produkt= pantothenátsyntáza; gen=panC (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 3:
GCTTCGGGGT ACCAATTCCT TTAAGAACCA TCAGATCAAT CTGTTGTACA TTCTCGGCCA 60
GATTCAGCTT TTCGGTAAGG ACGAAACACT TTCACTTGAA TCGGCAGCAA AGTTTCTTAA 120
AGTTTCTAAG GCAACTGCAA CGAGGTATTT TAGAACTCTC CGAGAAATGG AATTAGTTCA 180
CGAGGTCAGC AAACGCCCTT TGCGGTTTGC GCTCACGGAT AAAGGTCGTG AGATAGTAGG 240
TCTTGAGGTA AAAATTTGAC TCCATAACGA GAACTTAATC GAGCAACACC CCTGAACAGT 300
GAATCAAATC GGAATTTATT TATTCTGAGC TGGTCATCAC ATCTATACTC ATG CCC Met Pro 356
• · · ·
ATG Met TCA Ser 140 GGC ATT GAT GCA AAG AAA ATC CGC ACC CGT CAT TTC CGC GAA 404
Gly Ile Asp Ala Lys 145 Lys Ile Arg Thr Arg 150 His Phe Arg Glu
GCT AAA GTA AAC GGC CAG AAA GTT TCG GTT CTC ACC AGC TAT GAT GCG 452
Ala Lys Val Asn Gly Gin Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr Asp Ala
155 160 165 170
CTT TCG GCG CGC ATT TTT GAT GAG GCT GGC GTC GAT ATG CTC CTT GTT 500
Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu Leu Val
175 180 185
GGT GAT TCC GCT GCC AAC GTT GTG CTG GGT CGC GAT ACC ACC TTG TCG 548
Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr Leu Ser
190 195 200
ATC ACC TTG GAT GAG ATG ATT GTG CTG GCC AAG GCG GTG ACG ATC GCT 596
Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr Ile Ala
205 210 215
ACG AAG CGT GCG CTT GTG GTG GTT GAT CTG CCG TTT GGT ACC TAT GAG 644
Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr Tyr Glu
220 225 230
GTG AGC CCA AAT CAG GCG GTG GAG TCC GCG ATC CGG GTC ATG CGT GAA 692
Val Ser Pro Asn Gin Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met Arg Glu
235 240 245 250
ACG GGT GCG GCT GCG GTG AAG ATC GAG GGT GGC GTG GAG ATC GCG CAG 740
Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile Ala Gin
255 260 265
ACG ATT CGA CGC ATT GTT GAT GCT GGA ATT CCG GTT GTC GGC CAC ATC 788
Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly His Ile
270 275 280
GGG TAC ACC CCG CAG TCC GAG CAT TCC TTG GGC GGC CAC GTG GTT CAG 836
Gly Tyr Thr Pro Gin Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val Val Gin
285 290 295
GGT CGT GGC GCG AGT TCT GGA AAG CTC ATC GCC GAT GCC CGC GCG TTG 884
Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg Ala Leu
300 305 310
GAG CAG GCG GGT GCG TTT GCG GTT GTG TTG GAG ATG GTT CCA GCA GAG 932
Glu Gin Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro Ala Glu
315 320 325 330
GCA GCG CGC GAG GTT ACC GAG GAT CTT TCC ATC ACC ACT ATC GGA ATC 980
Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile Gly Ile
335 340 345
GGT GCC GGC AAT GGC ACA GAT GGG CAG GTT TTG GTG TGG CAG GAT GCC 1028
Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gin Val Leu Val Trp Gin Asp Ala
350 355 360
TTC GGC CTC AAC CGC GGC AAG AAG CCA CGC TTC GTC CGC GAG TAC GCC 1076
Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu Tyr Ala
365 370 375
ACC TTG GGC GAT TCC TTG CAC GAC GCC GCG CAG GCC TAC ATC GCC GAT 1124
Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gin Ala Tyr Ile Ala Asp
380 385 390
- Λ • • · • « • « · 1 • · · « • • • • 4 r · • · • · • * • · · • · • » • t» · • · • · · • * • · ·
ATC CAC GCG GGT ACC TTC CCA GGC GAA GCG GAG TCC TTT TA ATG CAG 1171
Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe Met Gin
395 400 405 1
GTA GCA ACC ACA AAG CAG GCG CTT ATC GAC GCC CTC CTC CAC CAC AAA 1219
Val Ala Thr Thr Lys Gin Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His His Lys
5 10 15
TCC GTC GGG CTC GTC CCC ACC ATG GGT GCG CTA CAC AGC GGA CAC GCC 1267
Ser val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly His Ala
20 25 30
TCG TTG GTT AAA GCA GCA CGC GCT GAA AAC GAC ACT GTT GTA GCC AGT 1315
Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val Ala Ser
35 40 45 50
ATT TTT GTC AAT CCC CTG CAG TTT GAA GCA CTC GGT GAT TGC GAT GAT 1363
Ile Phe Val Asn Pro Leu Gin Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys Asp Asp
55 60 65
TAC CGC AAC TAT CCC CGC CAA CTC GAC GCC GAT TTA GCA CTG CTT GAA 1411
Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gin Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu Leu Glu
70 75 80
GAG GCA GGT GTG GAT ATT GTG TTC GCA CCC GAT GTG GAG GAA ATG TAC 1459
Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu Met Tyr
85 90 95
CCC GGT GGC TTG CCA CTA GTG TGG GCG CGC ACC GGT TCC ATC GGA ACA 1507
Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile Gly Thr
100 105 110
AAA TTG GAG GGT GCC AGC AGG CCT GGC CAT TTC GAT GGT GTG GCT ACC 1555
Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val Ala Thr
115 120 125 130
GTG GTG GCG AAG CTG TTC AAT TTG GTG CGC CCT GAT CGT GCA TAT TTT 1603
Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala Tyr Phe
135 140 145
GGA CAA AAA GAT GCT CAG CAG GTT GCG GTG ATT CGG CGA TTG GTT GCC 1651
Gly Gin Lys Asp Ala Gin Gin Val Ala Val Ile Arg Arg Leu Val Ala
150 155 160
GAT CTA GAC ATT CCC GTG GAG ATT CGT CCC GTT CCG ATT ATT CGT GGC 1699
Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile Arg Gly
165 170 175
GCC GAT GGC TTA GCC GAA TCC AGC CGC AAT CAA CGT CTT TCT GCG GAT 1747
Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gin Arg Leu Ser Ala Asp
180 185 190
CAG CGA GCG CAA GCT CTG GTG CTG CCG CAG GTG TTG AGT GGG TTG CAG 1795
Gin Arg Ala Gin Ala Leu Val Leu Pro Gin Val Leu Ser Gly Leu Gin
195 200 205 210
CGT CGA AAA GCA GCT GGT GAA GCG CTA GAT ATC CAA GGT GCG CGC GAC 1843
Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gin Gly Ala Arg Asp
215 220 225
ACC TTG GCC AGC GCC GAC GGC GTG CGC TTG GAT CAC CTG GAA ATT GTC 1891
Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu Ile Val
230 235 240
GAT CCA GCC ACC CTC GAA CCA TTA GAA ATC GAC GGC CTG CTC ACC CAA 1939
Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu Thr Gin
245 250 255
1¼ • · · ·
CCA GCG TTG Pro Ala Leu 260 GTG GTC GGC GCG ATT TTC GTG GGG CCG GTG CGG TTG ATC 1987
Val Val Gly Ala 265 Ile Phe Val Gly Pro 270 Val Arg Leu Ile
GAC AAT ATC GAG CTC TAGTACCAAC CCTGCGTTGC AGCACGCAGC TTCGCATAAC 2042
Asp Asn Ile Glu Leu
275
GCGTGCTCAG CTCAGTGTTT TTAGGTGCGC GGTGCGGATC GGAACCGGGA GTTGGCCACT 2102
GCGGTGGCGT GGCCTCACCC GACAGCGCCC ATGCCGCCTG ACGAGCTGCA CCCAACGCCA 2162
CA 2164
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 271 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
(xi) POPIS SEKVENCÍ 2 ID. ,Č. 4:
Met Pro Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe
1 5 10 15
Arg Glu Ala Lys Val Asn Gly Gin Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ala Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu
35 40 45
Leu Val Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr
50 55 60
Leu Ser Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr
65 70 75 80
Ile Ala Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr
85 90 95
Tyr Glu Val Ser Pro Asn Gin Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg val Met
100 105 110
Arg Glu Thr Gly Ala Ala Ala Val Lye Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile
115 120 125
Ala Gin Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly
130 135 140
His Ile Gly Tyr Thr Pro Gin Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val
145 150 155 160
Val Gin Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg
165 170 175
Ala Leu Glu Gin Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro
180 185 190
Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val Thr GlU Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile
195 200 205
Gly Ile Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gin Val Leu Val Trp Gin
210 215 220
• ·
Asp Ala 225 Phe Gly Leu Asn 230 Arg Gly Lys Lys Pro 235 Arg Phe Val Arg Glu 240
Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gin Ala Tyr Ile
245 250 255
Ala ASp Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe
260 265 270
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 279 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xii) POPIS SEKVENCE ID.Č. 5:
Met 1 Gin Val Ala Thr 5 Thr Lys Gin Ala Leu 10 Ile Asp Ala Leu Leu 15 His
His Lys Ser Val 20 Gly Leu Val Pro Thr 25 Met Gly Ala Leu His 30 Ser Gly
His Ala Ser Leu 35 Val Lys Ala Ala Arg Ala 40 Glu Asn Asp Thr Val Val 45
Ala Ser 50 Ile Phe Val Asn Pro 55 Leu Gin Phe Glu Ala 60 Leu Gly Asp Cys
Asp 65 Asp Tyr Arg Asn Tyr 70 Pro Arg Gin Leu Asp 75 Ala Asp Leu Ala Leu 80
Leu Glu Glu Ala Gly 85 Val Asp Ile Val Phe 90 Ala Pro Asp Val Glu 95 Glu
Met Tyr Pro Gly 100 Gly Leu Pro Leu Val 105 Trp Ala Arg Thr Gly 110 Ser Ile
Gly Thr Lys 115 Leu Glu Gly Ala Ser 120 Arg Pro Gly His Phe 125 Asp Gly Val
Ala Thr 130 Val Val Ala Lys Leu 135 Phe Asn Leu Val Arg 140 Pro Asp Arg Ala
Tyr 145 Phe Gly Gin Lys Asp 150 Ala Gin Gin Val Ala 155 Val Ile Arg Arg Leu 160
Val Ala Asp Leu Asp 165 Ile Pro Val Glu Ile 170 Arg Pro Val Pro Ile 175 Ile
Arg Gly Ala Asp 180 Gly Leu Ala Glu Ser 185 Ser Arg Asn Gin Arg 190 Leu Ser
Ala Asp Gin 195 Arg Ala Gin Ala Leu 200 Val Leu Pro Gin Val 205 Leu Ser Gly
Leu Gin 210 Arg Arg Lys Ala Ala 215 Gly Glu Ala Leu Asp 220 Ile Gin Gly Ala
Arg 225 Asp Thr Leu Ala Ser 230 Ala Asp Gly Val Arg 235 Leu Asp His Leu Glu 240
Ile Val Asp Pro Ala 245 Thr Leu Glu Pro Leu .250 Glu Ile Asp Gly Leu 255 Leu
Thr Gin Pro Ala 260 Leu Val Val Gly Ala 265 Ile Phe Val Gly Pro 270 Val Arg
Leu Ile Asp 275 Asn Ile Glu Leu
·· · ·· .

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. V mikroorganismech rodu Corynebacterium a Escherichia replikovatelná, popřípadě rekombinantní DNA, která obsahuje sekvenci kódující aspartát-l-dekarboxylázu.
  2. 2. Replikovatelná DNA podle nároku 1, která kóduje panD původem z bakterií Corynebacterium a jejíž uspořádání je znázorněno na obrázku 1.
  3. 3. Replikovatelná DNA podle nároku 2, která:
    i) má sekvenci nukleotidů podle Sekvence id.č.:l, která kóduje panD ii) obsahuje alespoň jednu takovou sekvenci, která sekvenci uvedené v bodě (i) degeneraci genetického kódu iii) obsahuje alespoň jednu takovou hybridizuje se sekvencemi k sekvencím uvedeným v bodě (i) popřípadě iv) sekvence s funkčně neutrální sense-mutací vzhledem k sekvenci podle bodu (i).
    odpovídá díky sekvenci, která komplementárními nebo (ii) a
  4. 4. Mikroorganismy, zvláště pak z rodů Corynebacterium nebo Escherichia, které jsou transformovány vložením replikovatelné DNA podle libovolného z nároků 1 až 3.
  5. 5. Plazmidový obrázku 2, glutamicum DSM 12438.
    vektor pND-D2, který je znázorněn na a který byl v bakteriích Corynebacterium
    ATCC13032/pND-D2 uložen pod číslem » ·
    -37vektor pND-DBC2, který je znázorněn na a který byl v bakteriích Corynebacterium
    ATCC13032/pND-DBC2 uložen pod číslem
  6. 6.
    Plazmidový obrázku 4, glutamicum
    DSM 12437.
  7. 7. Způsob výroby kyseliny D-pantothenové vyznačující se tím, že se v mikroorganismech zesílí (zvýší se jejich exprese) gen panD a popřípadě další nukleotidové sekvence, kódující aspartát-l-dekarboxylázu a tyto mikroorganismy se použijí k fermentaci.
  8. 8. Způsob výroby podle nároku 7 vyznačující setím, že se zesílení dosáhne zvýšením počtu kopií genu, popřípadě nukleotidových sekvencí v mikroorganismu transformací plazmidem, který tento gen respektive nukleotidovou sekvenci nese, nebo se zesílí chromozomální geny.
  9. 9. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že se zesílení dosáhne mutací promotorové nebo
    regulační transkripce oblasti nacházející od strukturního genu. se proti proudu 10. Způsob podle nároku 7 v y z n a č u j i c i se tím, že se zesílení dosáhne vložením expresní
    kazety proti proudu transkripce od strukturního genu.
  10. 11. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že se zesílení dosáhne prodloužením životnosti
    -38odbourávání příslušné mRNA a/nebo zpomalením odpovídajícího enzymatického proteinu.
  11. 12. Způsob podle libovolného z nároků 8 až 11 vyznačuj ící se tím, že se zvýší exprese genu panD v mikroorganismech, které obsahují další mutace pro rezistenci k metabolitům popřípadě antimetabolitům.
  12. 13. Způsob podle libovolného z nároků 8 až 12 vyznačující se tím , že se zesílení dosáhne změnou kultivačního média a/nebo průběhu fermentace.
  13. 14. Způsob podle libovolného z nároků 8 až 13 vyznačující se tím , že se použijí mikroorganismy, v nichž je alespoň částečně inhibovány metabolické dráhy, která snižují tvorbu pantothenátu (pantothenové kyseliny).
  14. 15. Způsob podle vyznačuj ící mikroorganismy, ve dodatečně zesílena libovolného z nároků se tím , že kterých je kromě exprese jednoho zbývajících genů metabolické dráhy syntézy kyseliny pantothenové.
    8 až 14 se použijí genu panD více nebo
  15. 16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že se použijí mikroorganismy, ve kterých je, kromě genu panD zesílen (zvýšena jeho exprese) jeden nebo více genů, které kódují enzym ketopanthoát• ·
    -39hydroxymethyl transferázu (EC 4.1.2.12) a pantothenát syntázu (EC6.3.2.1.), výhodně původem z bakterií
    Corynobacterium.
  16. 17. Způsob podle nároků 15 a 16 vyznačující se tím, že se použijí mikroorganismy transformované různými kompatibilními plazmidovými vektory, které obsahují jmenované geny.
  17. 18. Způsob podle nároků 15 a 16 vyznačující se tím, že se použije kmen transformovaný plazmidovým vektorem a tento plazmidový vektor nese jeden nebo více uvedených genů včetně genu panD, ve kterém jsou geny uspořádány za sebou pod kontrolou společného promotoru nebo jsou od sebe odděleny a jsou kontrolovány různými promotory.
  18. 19. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že se použijí mikroorganismy transformované plazmidovým vektorem pND-D2.
  19. 20. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že se použijí mikroorganismy transformované plazmidovým vektorem pND-DBC2.
  20. 21. Způsob výroby pantothenové kyseliny vyznačující se tím , že se provedou následující kroky:
    a) nechají se fermentovat mikroorganismy podle jednoho nebo více z předchozích nároků, ve kterých je zesílen (zvýšena jeho exprese) alespoň gen • *
    -40panD, popřípadě v kombinaci s genem panB a/nebo genem panC
    b) zvýší se koncentrace kyseliny pantothenové v médiu nebo v buňkách mikroorganismu a
    c) izoluje se kyselina pantothenová.
  21. 22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že geny se zvýšenou expresí pochází z bakterií rodu Corynebacterium.
  22. 23. Způsob podle nároku 21 nebo 22 vyznačující setím, že se v kroku a) přidá prekurzor kyseliny pantothenové vybraný ze skupiny obsahující aspartát, β-alanin, ketoisovalerát, ketopantoát a pantoát.
  23. 24. Způsob podle jednoho nebo vyznačující se mikroorganismy z rodu
    Corynebacterium.
CZ19994281A 1999-11-30 1999-11-30 Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech CZ428199A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19994281A CZ428199A3 (cs) 1999-11-30 1999-11-30 Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19994281A CZ428199A3 (cs) 1999-11-30 1999-11-30 Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ428199A3 true CZ428199A3 (cs) 2000-06-14

Family

ID=5467903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19994281A CZ428199A3 (cs) 1999-11-30 1999-11-30 Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ428199A3 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6184007B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid by enhancement of the panD gene in microorganisms
US6177264B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using Coryneform bacteria
US7632663B1 (en) Method for microbially producing L-valine
US6171845B1 (en) Mutant E. coli kiz strains for production of pantothenic acid
US6184006B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using strains of the family enterobacteriaceae
EP1320586B1 (en) Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria
US6911329B2 (en) Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
HUP0003550A2 (en) Process for production of d-pantotenic acid using coryneform bacteria
US6787334B1 (en) Process for the preparation of pantothenic acid by amplification of nucleotide sequences which code for the ketopantoate reductase
US6667166B2 (en) Processes for preparing D-pantothenic acid using coryneform bacteria
CZ428199A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech
US20020042104A1 (en) Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
CZ427799A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající kmenů bakterií z čeledi Enterobacteriacae
US20020076770A1 (en) Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using Coryneform bacteria
CZ428299A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií
MXPA99010876A (en) Fermentation process for the preparation of d-pantothenic acid using strains of the family enterobacteriaceae
MXPA99010768A (en) Procedure for the preparation by fermentation of d-pantothenic acid using corinefor bacteria
CZ20003156A3 (cs) Způsob fermentativní výroby kyseliny Dpantotenové za použití koryneformních bakterií
CZ352399A3 (cs) Způsob výroby kyseliny pantotenové

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic