RU2683208C1 - Мутант пируватдегидрогеназы, микроорганизм, содержащий мутант, и способ получения L-аминокислоты с использованием микроорганизма - Google Patents
Мутант пируватдегидрогеназы, микроорганизм, содержащий мутант, и способ получения L-аминокислоты с использованием микроорганизма Download PDFInfo
- Publication number
- RU2683208C1 RU2683208C1 RU2017134331A RU2017134331A RU2683208C1 RU 2683208 C1 RU2683208 C1 RU 2683208C1 RU 2017134331 A RU2017134331 A RU 2017134331A RU 2017134331 A RU2017134331 A RU 2017134331A RU 2683208 C1 RU2683208 C1 RU 2683208C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- microorganism
- seq
- pyruvate dehydrogenase
- strains
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 66
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 title claims abstract description 54
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 16
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 40
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 55
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 48
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 46
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 32
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 15
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 100
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 13
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 10
- 102000012751 Pyruvate Dehydrogenase Complex Human genes 0.000 description 9
- 108010090051 Pyruvate Dehydrogenase Complex Proteins 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 7
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 5
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 4
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 3
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 4-thiaisoleucine Chemical compound 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000002568 Multienzyme Complexes Human genes 0.000 description 2
- 108010093369 Multienzyme Complexes Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMKATDLSKRGLMZ-WHFBIAKZSA-N (2s,3s)-2-amino-n-hydroxy-3-methylpentanamide Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NO GMKATDLSKRGLMZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDHYTCIGBOOCDX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-n,3-dihydroxybutanamide Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NO GDHYTCIGBOOCDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxynorvaline Chemical compound CCC(O)C(N)C(O)=O LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108700016171 Aspartate ammonia-lyases Proteins 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014468 Dihydrodipicolinate Reductase Proteins 0.000 description 1
- 101100134740 Drosophila melanogaster Oct-TyrR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101100337176 Escherichia coli (strain K12) gltB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100505027 Escherichia coli (strain K12) gltD gene Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GGLZPLKKBSSKCX-YFKPBYRVSA-N L-ethionine Chemical compound CCSCC[C@H](N)C(O)=O GGLZPLKKBSSKCX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 150000008543 L-isoleucines Chemical class 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- 150000008545 L-lysines Chemical class 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N L-thialysine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101100194625 Rattus norvegicus Rgs19 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 101100057034 Talaromyces wortmannii astB gene Proteins 0.000 description 1
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 1
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 101150015189 aceE gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- ZYVMPHJZWXIFDQ-LURJTMIESA-N alpha-methylmethionine Chemical compound CSCC[C@](C)(N)C(O)=O ZYVMPHJZWXIFDQ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 101150070145 aspB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N calcium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound [Ca].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 1
- 108010082690 diaminopimelic acid decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 1
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003587 threonine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/01051—Pyruvate dehydrogenase (NADP+) (1.2.1.51)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/04—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a disulfide as acceptor (1.2.4)
- C12Y102/04001—Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring) (1.2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен вариант пируватдегидрогеназы, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную замену в области аминокислот в положениях 190-205 или в области аминокислот в положениях 415-440 SEQ ID NO: 1. Предложен полинуклеотид, кодирующий указанный вариант пируватдегидрогеназы. Предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-аминокислоту, содержащий указанный вариант пируватдегидрогеназы. Предложен способ получения L-аминокислоты с использованием указанного микроорганизма рода Corynebacterium. Группа изобретений позволяет повысить способность продуцировать L-аминокислоту в модифицированном штамме по сравнению с контрольным штаммом. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 11 табл., 14 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новому варианту пируватдегидрогеназы, полинуклеотиду, кодирующему указанный вариант пируватдегидрогеназы, микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему способностью продуцировать L-аминокислоту, содержащему указанный вариант, и способу получения L-аминокислоты с использованием указанного микроорганизма.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Пируватдегидрогеназный мультиферментный комплекс (PDHC) представляет собой фермент, превращающий пируват, образованный при гликолизе, в ацетил-КоА, и является важным ферментом, определяющим включение углерода в цикл трикарбоновых кислот.PDHC состоит из пируватдегидрогеназы (Е1р), дигидролипоамидацетилтрансферазы (Е2р) и дигидролипоамиддегидрогеназы (Е3р). Среди них фермент Е1р кодирован геном асеЕ. Несмотря на известные изменения в продукции L-лизина штаммом-продуцентом L-лизина, вызванные делецией и ослаблением гена асеЕ (Blombach et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 76: 615, 2007; Buchholz J et al., Appl Environ Microbiol., 79 (18): 5566 - 75, 2013), сообщений о варианте E1p, который мог бы улучшать способности к продукции L-аминокислот, не было.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
Авторы настоящего изобретения приложили значительные усилия для разработки варианта Е1р, который может быть использован в получении L-аминокислоты в высокой концентрации, и микроорганизма, в котором использован указанный вариант, и в результате разработали вариант Е1р и обнаружили, что L-аминокислота может быть получена с высоким выходом из микроорганизма, содержащего указанный вариант Е1р, завершив посредством этого настоящее изобретение.
Техническое решение
Задачей настоящего изобретения является обеспечение нового варианта пируватдегидрогеназы.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотида, кодирующего указанный вариант пируватдегидрогеназы.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего L-аминокислоту, содержащего указанный вариант пируватдегидрогеназы.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения L-аминокислоты, включающего: (а) культивирование микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего L-аминокислоту, содержащего указанный вариант пируватдегидрогеназы, в среде для получения L-аминокислоты; и (б) выделение L-аминокислоты из культивированного микроорганизма или среды.
Полезные эффекты настоящего изобретения
С использованием варианта пируватдегидрогеназы по настоящему изобретению может быт получен фермент с ослабленной активностью. Как таковой, микроорганизм, содержащий указанный вариант пируватдегидрогеназы с ослабленной активностью, позволяет получать L-аминокислоту более эффективным образом, чем микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоту, содержащий белок пируватдегидрогеназу дикого типа. Кроме того, микроорганизм по настоящему изобретению позволяет эффективно получать L-аминокислоту, ингибируя при этом рост микроорганизма лишь в редких случаях, в отличие от микроорганизмов с делецией пируватдегидрогеназы. Например, лизин, незаменимую аминокислоту для кормов для животных, необходимо получать в больших, с точки зрения производства, масштабах. Таким образом, получение L-лизина с высокой эффективностью, как в настоящем изобретении, может снизить стоимость изготовления кормов для животных.
НАИЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен вариант пируватдегидрогеназы, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную замену в области аминокислот в положениях 190-205 или в области аминокислот в положениях 415-440 SEQ ID NO:1.
При использовании здесь термин «пируватдегидрогеназа» относится к одному из ферментов, составляющих пируватдегидрогеназный мультиферментный комплекс (PDHC), вовлеченный в превращение пирувата в ацетил-КоА. При использовании здесь пируватдегидрогеназа не ограничена каким-либо конкретным ферментом, при условии, что она обладает соответствующей активностью, и может представлять собой, без ограничения, пируватдегидрогеназу, имеющую происхождение из микроорганизма рода Corynebacterium, конкретно Corynebacterium glutamicum. Например, пируватдегидрогеназа может представлять собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или аминокислотную последовательность, имеющую гомологию по меньшей мере 75%, конкретно по меньшей мере 80%, конкретнее 85%, и еще конкретнее 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Белок Е1р, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, может быть кодирован геном асеЕ, имеющим, без ограничения, полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2. Кроме того, если аминокислотная последовательность гомологична указанной выше последовательности и обладает по существу такой же биологической активностью, как белок SEQ ID NO:1, или биологической активностью, соответствующей белку SEQ ID NO:1, то очевидно, что такую аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или присоединением/вставкой следует также включать в объем настоящего изобретения. В настоящем изобретении любая полинуклеотидная последовательность, кодирующая пируватдегидрогеназу, может быть включена в объем настоящего изобретения. Например, полинуклеотидная последовательность может представлять собой полинуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 75%, конкретно, по меньшей мере 80%, конкретнее, 85%, и, еще конкретнее 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. Кроме того, ввиду вырожденности кодонов или с учетом предпочтительности кодонов для организмов, экспрессирующих белок, полинуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может иметь различные варианты кодирующей области, без выхода за рамки объема изобретения и без изменения аминокислотной последовательности белка, экспрессируемого с кодирующей области.
Вариант пируватдегидрогеназы по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере 10 аминокислотных замен в области аминокислот в положениях 190-205 или 415-440 SEQ ID NO:1.
В частности, вариант пируватдегидрогеназы по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре аминокислотные замены в области аминокислот в положениях 190-205 SEQ ID NO:1. Конкретно, аминокислотная замена в области аминокислот в положениях 190-205 SEQ ID NO:1 может быть выбрана, без ограничения, из группы аминокислот в положениях 190, 195, 199 и 201.
Замена в области аминокислот в положениях 190-205 SEQ ID NO:1 может представлять собой, без ограничения, замену по меньшей мере одной аминокислоты в области аминокислот в положениях 190-205 аминокислотой другого типа, конкретнее, замену по меньшей мере одной аминокислоты в положениях 190, 195, 199 и 201 аминокислотой другого типа, и еще конкретнее, по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из замены глутаминовой кислоты в положении 190 на валин (E190V), замены глутамина в положении 195 на гистидин (Q195H), замены пролина в положении 199 на серии (P199S) и замены тирозина в положении 201 на аланин (Y201A).
Кроме того, вариант пируватдегидрогеназы по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть аминокислотных замен в области аминокислот в положениях 415-440 SEQ ID NO:1. Конкретно, аминокислотная замена в области аминокислот в положениях 415-440 SEQ ID NO:1 может быть выбрана из группы, состоящей из аминокислот в положениях 418, 428, 432, 435 и 438.
Замена в области аминокислот в положениях 415-440 SEQ ID NO:1 может представлять собой, без ограничения, замену по меньшей мере одной аминокислоты в области аминокислот в положениях 415-440 аминокислотой другого типа, конкретнее, замену по меньшей мере одной аминокислоты в положениях 418, 428, 432, 435 и 438 аминокислотой другого типа, и еще конкретнее, по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из замены тирозина в положении 418 на гистидин (Y418H), замены аспарагина в положении 428 на аланин (N428A), замены глутамина в положении 432 на глутаминовую кислоту (Q432E), замены глутамина в положении 432 на аланин (Q432A), замены лизина в положении 435 на аланин (K435A) и замены лейцина на пролин (L438P).
Конкретнее, вариант пируватдегидрогеназы может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:14-33.
Вариант пируватдегидрогеназы может включать не только белки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:14-33, но также варианты пируватдегидрогеназы, имеющие гомологию по меньшей мере 75% или более, конкретно, 80% или более, конкретнее 85% или более, и еще конкретнее 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:14-33, без ограничения, при условии, что их пируватдегидрогеназная активность существенно ослаблена по сравнению с пируватдегидрогеназной активностью дикого типа. Очевидно, что аминокислотные последовательности, обладающие по существу такой же биологической активностью, как белки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:14-33, или биологической активностью, соответствующей белкам, имеющим аминокислотные последовательности SEQ ID NO:14-33, следует также включать в объем настоящего изобретения, несмотря на то, что часть их аминокислотных последовательностей может иметь делецию, модификацию, замену или присоединение/вставку.
При использовании здесь термин «гомология» относится к проценту идентичности двух полинуклеотидных или полипептидных группировок. Гомология последовательностей одной группировки другой группировке может быть определена технологией, известной в данной области. Например, гомология может быть определена непосредственным сравнением информации о последовательностях двух полинуклеотидных молекул или двух полипептидных молекул с использованием легкодоступных компьютерных программ. Примеры компьютерных программ включают BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc.) и так далее. Кроме того, гомология полинуклеотидов может быть определена гибридизацией полинуклеотидов в условиях, в которых между гомологичными областями образуются стабильные двойные цепи, разъединением нуклеазой, специфичной в отношении одиночных цепей, с последующим определением размера разъединенных фрагментов.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариант пируватдегидрогеназы.
Вариант пируватдегидрогеназы представляет собой такой же вариант, как объяснено выше. Конкретно, полинуклеотид, кодирующий вариант пируватдегидрогеназы, может быть включен в объем настоящего изобретения при условии, что полинуклеотид кодирует белки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:14-33. Кроме того, полинуклеотид может представлять собой любой полинуклеотид, имеющий гомологию по меньшей мере 75% или более конкретно 80%, или конкретнее 85% или более, и еще конкретнее 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, с указанной выше полинуклеотидной последовательностью.
При использовании здесь термин «полинуклеотид» относится к полимеру нуклеотидов, расположенных продольной цепью с ковалентными связями между нуклеотидными единицами, обычно к цепи ДНК или РНК определенной длины, и в настоящем изобретении он относится к полинуклеотиду, кодирующему вариант пируватдегидрогеназы. Ввиду вырожденности кодонов полинуклеотид может иметь различные нуклеотидные последовательности, кодирующие одну и ту же аминокислоту. Кроме того, кодоны в последовательности полинуклеотида могут быть оптимизированы для оптимизации экспрессии в соответствии с типом клеток-хозяев.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-аминокислоту, содержащий указанный вариант пируватдегидрогеназы.
Конкретно, присутствие варианта пируватдегидрогеназы в микроорганизме может быть результатом мутации, или микроорганизм может быть трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант пируватдегидрогеназы.
При использовании здесь термин «вектор» относится к любому носителю для клонирования и/или переноса оснований в клетку-хозяина. Вектор может представлять собой репликон, позволяющий проводить репликацию другого фрагмента (фрагментов) ДНК, соединенного с вектором. «Репликон» относится к любой генетической единице, действующей как единица репликации ДНК in vivo, то есть, к генетическим единицам (например, плазмидам, фагам, космидам, хромосомам и вирусам), способным к репликации посредством саморегуляции. При использовании здесь термин «вектор» не ограничен каким-либо конкретным вектором, при условии, что он может быть реплицирован у хозяина, и может быть использован любой вектор, известный в данной области. Вектор, используемый в конструировании рекомбинантного вектора, может быть в естественном состоянии или представлять собой плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги в рекомбинантном состоянии. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора могут быть использованы pWE15, М13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, Charon21A и так далее, и в качестве плазмидного вектора могут быть использованы векторы на основе вектора pDZ, векторы pBR, pUC, pBluescriptll, pGEM, pTZ, pCL, pET и так далее. Векторы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничены какими-либо конкретными векторами, и может быть использован любой известный вектор экспрессии. Конкретно, но без ограничения, может быть использован вектор pDZ (патент Кореи №10-0924065 полностью включен в настоящее описание посредством ссылки).
При использовании здесь термин «трансформация» относится к процессу введения гена в клетку-хозяина, что позволяет экспрессировать ген в клетке-хозяине. Ген, вводимый при трансформации, может включать, без ограничения, любой ген, независимо от того, введен ли он в хромосому клетки-хозяина, будучи расположен в ней, или расположен вне хромосомы, при условии, что он может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой полинуклеотидную конструкцию, содержащую все обязательные элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета может содержать промотор, функционально связанный с геном, сигнал терминации транскрипции, домен связывания рибосом и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть представлена в форме вектора экспрессии, способного к самостоятельной репликации. Кроме того, полинуклеотид может, без ограничения, быть введен в клетку-хозяина сам по себе или в форме полинуклеотидной конструкции и функционально связан с последовательностью, необходимой для его экспрессии в клетке-хозяине.
Микроорганизм может представлять собой любой прокариотический или эукариотический микроорганизм, при условии, что указанный микроорганизм обладает активностью соответствующего варианта пируватдегидрогеназы или трансформирован для экспрессии соответствующего белка. Примеры микроорганизмов могут включать, без ограничения, микробные штаммы рода Escherichia, рода Erwinia, рода Serratia, рода Providencia, рода Enterobacteria, рода Salmonella, рода Streptomyces, рода Pseudomonas, рода Brevibacterium, рода Corynebacterium и так далее, конкретно, микроорганизм рода Corynebacterium, и, конкретнее, Corynebacterium glutamicum.
Кроме того, при введении варианта пируватдегидрогеназы по настоящему изобретению в микроорганизм, способный продуцировать L-аминокислоту, его способность продуцировать L-аминокислоту может быть значительно улучшена без существенного ингибирования роста клеток, по сравнению с микроорганизмом, содержащим пируватдегидрогеназу дикого типа.
При использовании здесь термин «L-аминокислота» относится ко всем L-аминокислотам, которые могут быть получены из различных источников углерода через пируват, и в частности может относиться к L-аминокислоте, путь биосинтеза которой не включает процесс превращения пирувата в ацетил-КоА. Конкретнее, L-аминокислота может включать L-лизин, L-треонин, L-метионин, L-изолейцин, L-валин, L-лейцин или L-аланин, и, еще конкретнее, L-лизин или L-валин.
Микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоту, может включать как эукариотические, так и прокариотические микроорганизмы, способные продуцировать L-аминокислоту in vivo, и примеры таких микроорганизмов описаны выше. Микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоту, может представлять собой любой микроорганизм, без ограничения, при условии, что микроорганизм обладает способностью продуцировать L-аминокислоту, включая как штаммы дикого типа, так и рекомбинантные штаммы.
Например, микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-лизин, может быть модифицирован для придания резистентности к аналогу L-лизина или усиления активности белка, связанного с биосинтезом L-лизина, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом. Конкретно, экспрессию по меньшей мере одного типа генов, связанных с биосинтезом L-лизина, улучшают, без ограничения, амплификацией генов, заменой или модификацией таких последовательностей, как промотор или старт-кодон, введением модификации для улучшения экспрессии и так далее.
Кроме того, примеры генов, связанных с биосинтезом L-лизина, могут включать гены, входящие в путь биосинтеза L-лизина, и в частности, без ограничения, ген синтазы дигидродипиколиновой кислоты (dapA), ген аспартокиназы (lysC), ген редуктазы дигидродипиколиновой кислоты (dapB), ген декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты (lysA), ген дегидрогеназы диаминопимелиновой кислоты (ddh), ген фосфоенолпируваткарбоксикиназы (ррс), ген аспартатполуальдегиддегидрогеназы (asd), ген аспартазы (aspB) и ген пируваткарбоксилазы (Рус). Кроме того, примеры генов, связанных с биосинтезом L-лизина, могут включать, без ограничения, транскетолазу (tkt) и тому подобное, входящие в пентозофосфатный путь.
В частности, без ограничения, микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-лизин, может демонстрировать способность продуцировать L-лизин включением модификации, связанной с продукцией L-лизина, раскрытой в данной области.
Микроорганизм, продуцирующий L-треонин, может представлять собой, без ограничения, микроорганизм, которому необходим метионин, обладающий резистентностью к аналогам треоиниа, резистентностью к аналогам лизина, резистентностью к аналогам изолейцина и/или резистентностью к аналогам метионина. Аналоги метионина могут представлять собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из D.L-этионина, норлейцина, α-метилметионина и L-метионин-D,L-сульфоксимина; аналоги треонина могут представлять собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из α-амино-β-гидроксивалериановой кислоты и гидроксамата D,L-треонина; и аналоги лизина могут представлять собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из S-(2-аминоэтил)-L-цистеина и δ-метил-L-лизина.
Кроме того, продуцирующий L-треонин, может включать, без ограничения, микроорганизм, у которого активность РскА, вовлеченного в превращение оксалоацетата (ОАА), являющегося промежуточным продуктом биосинтеза L-треонина, в фосфоенолпируват (PEP), ослаблена или устранена; или микроорганизм, у которого активность TyrR, ингибирующего ген lysC, вовлеченный в превращение оксалоацетата в аспартат, ослаблена или устранена; или микроорганизм, у которого активность GaIR, ингибирующего экспрессию гена gaIP, вовлеченного в транспорт глюкозы, ослаблена или устранена.
Микроорганизм, продуцирующий L-изолейцин, может представлять собой микроорганизм, обладающий резистентностью к L-изолейцину или его производным, или микроорганизм, генетически модифицированный для устранения ингибирования L-изолейцином или его производными по механизму обратной связи. Примеры производных L-изолейцина могут включать, без ограничения, 4-тиаизолейцин (тиаил (thiaile)) и гидроксамат изолейцина (ileHx).
Микроорганизм, продуцирующий L-валин, может представлять собой микроорганизм, обладающий резистентностью к L-валину или его производным, или микроорганизм, у которого генетически модифицирован фермент пути биосинтеза L-валина для устранения ингибирования L-валином или его производными по механизму обратной связи. Примеры такого микроорганизма могут включать, без ограничения, микроорганизм, содержащий вариант синтазы ацетогидроксикислоты, у которого устранено ингибирование L-валином по механизму обратной связи. Кроме того, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессия оперона L-валина у которого модифицирована для ее усиления, и, например, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессия оперона L-валина у которого усилена частичной или полной делецией полинуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид, в регуляторной области оперона L-валина (заявка на патент Кореи №10-2014-0111421, все описание которой может, без ограничения, быть включено посредством ссылки).
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения L-аминокислоты, включающий: (а) культивирование микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего L-аминокислоту, содержащего указанный вариант пируватдегидрогеназы, в среде для получения L-аминокислоты; и (б) выделение L-аминокислоты из культивированного микроорганизма или среды.
Микроорганизмы рода Corynebacterium, продуцирующие L-аминокислоту и тому подобное, являются такими же, как описано выше.
При использовании здесь термин «культивирование» относится к выращиванию микроорганизма в подходящих и искусственно контролируемых условиях окружающей среды. Способ культивирования по настоящему изобретению может быть осуществлен на основе подходящих культуральных сред и условий культивирования, известных в данной области. Конкретные условия, такие как температура культивирования, время культивирования, значение рН культуральной среды и так далее, могут быть определены на основе информации, хорошо известной специалисту в данной области, или обычным способом, известным в данной области, и могут быть надлежащим образом скорректированы в зависимости от обстоятельств. В частности, эти известные способы культивирования подробно описаны в литературе [Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), и Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]. Кроме того, способы культивирования могут включать периодическое культивирование, непрерывное культивирование, культивирование с подпиткой, и конкретно без ограничения, культивирование можно проводить непрерывно методикой культивирования с подпиткой или повторяющегося культивирования с подпиткой. Среда, используемая для культивирования, должна подходящим образом соответствовать требованиям для определенных штаммов. Примеры источников углерода для использования в указанной среде могут включать, без ограничения, сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода могут быть использованы, без ограничения, по отдельности или в комбинации. Примеры источников азота для использования в указанной среде могут включать пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку; и мочевину или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота могут также быть использованы, без ограничения, по отдельности или в комбинации. Примеры источников фосфора для использования в указанной среде могут включать, без ограничения, дигидрофосфат, гидрофосфат калия, соответствующие натрийсодержащие соли и так далее. Кроме того, среда может содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, необходимые для роста. В завершение, помимо веществ, описанных выше, среда может также содержать вещества, обязательные для роста, такие как аминокислоты и витамины. Кроме того, могут быть использованы предшественники, подходящие для культуральной среды. Эти источники могут, без ограничения, быть подходящим образом добавлены в культуру во время культивирования по методике периодического культивирования или непрерывного культивирования.
Кроме того, во время культивирования показатель рН культуры можно корректировать, подходящим образом добавляя в культуру такое соединение, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. В периоде культивирования может быть добавлен пеногаситель, такой как полигликолевый эфир жирной кислоты, для предотвращения пенообразования. Кроме того, в культуру могут быть введены кислород или кислородсодержащий газ для поддержания аэробного состояния культуры, или могут быть введены азот, водород или диоксид углерода без введения газа для поддержания анаэробного или микроаэробного состояния культуры. Температура культуры может обычно входить в диапазон от 27°С до 37°С и, конкретно, от 30°С до 35°С. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества полезных веществ и, конкретно, от 10 часов до 100 часов. L-аминокислоты могут высвобождаться в культуральную среду, используемую для культивирования, или могут присутствовать в микроорганизмах.
Кроме того, что касается способа получения L-аминокислоты по настоящему изобретению, способ выделения L-аминокислоты из культивированного микроорганизма или культуры широко известен в данной области. Способы выделения L-аминокислот могут включать, без ограничения, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и так далее.
ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Тем не менее, эти Примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и изобретение не следует ограничивать этими Примерами.
Пример 1: Конструирование библиотеки вариантов Е1р посредством
искусственного мутагенеза
В данном Примере конструировали векторную библиотеку для первичной перекрестной вставки в хромосому с целью получения вариантов Е1р способом, описанным ниже. Проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) пониженной точности (error-prone PCR), амплифицируя ген асеЕ, имеющий происхождение от Corynebacterium glutamicum АТСС13032 (SEQ ID NO:2), кодирующий E1p (SEQ ID NO:1) и получая модифицированный ген асеЕ (2852 пары оснований (п.о.)) со случайными заменами оснований. ПЦР пониженной точности проводили с использованием набора для мутагенеза Genemorph II Random Mutagenesis Kit (Stratagene) и геномной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы с парймером 1 (SEQ ID NO:3) и праймером 2 (SEQ ID NO:4).
Праймер 1 (SEQ ID NO:3): 5'-TGGGA CCGGG АААСС GGG-3'.
Праймер 2 (SEQ ID NO:4): 5'-GATTT ATCTG TCCCT TGA-3'.
В амплифицированных фрагментах гена заменяли основания в количестве от 0 до 3,5 на 1 тысячу пар оснований (т.п.о.) и ПЦР проводили на протяжении в общей сложности 30 циклов при следующих условиях: денатурация при 96°С в течение 30 с, отжиг при 53°С в течение 30 с и полимеризация при 72°С в течение 2 мин.
Амплифицированные фрагменты соединяли с вектором pCR2.1-TOPO (далее - «pCR2.1») с использованием набора для клонирования pCR2.1-TOPO ТА Cloning Kit (Invitrogen), трансформировали им Е. coli DH5α и высевали их на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Отбирали 20 различных типов трансформированных колоний, после чего выделяли из них плазмиды. При анализе полинуклеотидных последовательностей плазмид было подтверждено, что модификации присутствовали в разных положениях с частотой 1,4 мутации на 1 т.п.о. Было получено приблизительно 20000 колоний трансформированных Е. coli, и их плазмиды были выделены и названы библиотекой «pCR2.1-aceE (mt)».
Кроме того, конструировали плазмиду, имеющую ген асеЕ дикого типа, для использования в качестве контрольного штамма. ПЦР проводили таким же образом, как описано выше, с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы с парймером 1 (SEQ ID NO:3) и праймером 2 (SEQ ID NO:4). В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase (Stratagene), и сконструированная таким образом плазмида была названа «pCR2.1-aceE (WT)».
Пример 2: Конструирование штамма с делецией асеЕ
Штамм с делецией асеЕ конструировали для введения библиотеки pCR2.1-aceE (mt), используя штамм KCCM11016P (указанный выше микроорганизм был впервые опубликован как KFCC10881 и депонирован повторно признанным международным органом по депонированию согласно Будапештскому соглашению с присвоением регистрационного номера KCCM11016P; патент Кореи №10 0159812) в качестве исходного штамма.
Для конструирования вектора с делецией асеЕ проводили ПЦР с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum АТСС13032 дикого типа в качестве матрицы с праймером 3 (SEQ ID NO:5), праймером 4 (SEQ ID NO:6), праймером 5 (SEQ ID NO:7) и праймером 6 (SEQ ID NO:8).
Праймер 3 (SEQ ID NO:5): 5'-GCAGG TCGAC TCTAG ATGCG ATTCG CGTCA AACGT G-3'.
Праймер 4 (SEQ ID NO:6): 5'-GTCCC TTGAG GTGAT GTGAA TCCAT CCACT-3'.
Праймер 5 (SEQ ID NO:7): 5'-AGTGG ATGGA TTCAC ATCAC CTCAA GGGAC-3'.
Праймер 6 (SEQ ID NO:8): 5'-CCGGG GATCC TCTAG ACGAA GCGCC GTGAG CAATT C-3'.
ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 30 с и полимеризации при 72°С в течение 30 с; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин.
В результате, были получены SEQ ID NO:9 (521 п. о.) и SEQ ID NO:10 (538 п. о.), содержащие 5'-конец и 3'-конец, соответственно.
ПЦР проводили с использованием амплифицированных последовательностей SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 в качестве матриц с парймером 3 (SEQ ID NO:5) и праймером 6 (SEQ ID NO:8).
ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 30 с и полимеризации при 72°С в течение 60 с; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин.
В результате, была амплифицирована SEQ ID NO:11 размером 1029 п. о. (далее - ΔасеЕ), в которой были соединены 5'-конец и 3'-конец гена асеЕ.
Вектор pDZ (патент Кореи №10-0924065), неспособный к репликации в Corynebacterium glutamicum, и фрагмент ΔасеЕ обрабатывали рестриктазой Xbal, лигировали с использованием ДНК-лигазы и клонировали с получением плазмиды. Полученная плазмида была названа pDZ-ΔасеЕ.
Плазмидой pDZ-ΔасеЕ трансформировали Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, являющийся штаммом, продуцирующим L-лизин, посредством электрического импульса (Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999) 52: 541-545), и трансформированный штамм выделяли из селективной среды, содержащей канамицин (25 мг/л). Был получен штамм, в котором ген асеЕ был инактивирован посредством ΔасеЕ, фрагмента ДНК, введенного в геном вторичной рекомбинацией, и полученный штамм был назван KCCM11016PΔасеЕ.
Пример 3: Конструирование библиотеки искусственных вариантов Е1р и скрининг штаммов с усиленной способностью к продукции L-лизина
Конструированной библиотекой pCR2.1-aceE (mt) трансформировали штамм KCCM11016PΔасеЕ, который использовали в качестве исходного штамма, посредством гомологичной рекомбинации и проводили высев на сложную твердую среду, содержащую канамицин (25 мг/л), с получением приблизительно 10000 колоний, каждой из которых было присвоено название от «KCCM11016PΔасеЕ/pCR2.1-aceE (mt)-1» до «KCCM11016PΔасеЕ/pCR2.1-асеЕ (mt)-10000», соответственно.
Кроме того, штамм KCCM11016PΔасеЕ трансформировали конструированным вектором pCR2.1-aceE (WT) с получением контрольного штамма, названного «KССМ11016PΔасеЕ/pCR2.1-aceE (WT)».
Сложная твердая среда (рН 7,0)
Глюкоза, 10 г; пептон, 10 г; мясной экстракт, 5 г; дрожжевой экстракт, 5 г; сердечно-мозговой экстракт, 18,5 г; NaCl, 2,5 г; мочевина, 2 г; сорбит, 91 г; и агар, 20 г (на 1 л дистиллированной воды).
Полученные таким образом 10000 колоний высевали соответственно в селективную среду (300 мкл) и культивировали в глубоких 96-луночных планшетах при 32°С и 1000 об/мин в течение приблизительно 24 часов. Количество L-лизина, продуцируемого в культуре, анализировали нингидриновым методом (J. Вiоl. Сhem. 1948. 176: 367-388). По завершении культивирования 10 мкл культурального супернатанта и 190 мкл нингидринового реакционного раствора подвергали взаимодействию при 65°С в течение 30 минут. Оптическую плотность при 570 нм измеряли спектрофотометром, сравнивали с соответствующим показателем контрольного штамма KCCM11016PΔасеЕ/pCR2.1-aceE (WT) и отбирали 256 модифицированных штаммов с повышением оптической плотности по меньшей мере на 10%. Другие колонии продемонстрировали сходную или сниженную оптическую плотность по сравнению с контрольным штаммом.
Селективная среда (рН 8,0)
Глюкоза, 10 г; (NH4)2SO4, 5,5 г; MgSO4⋅7H2O, 1,2 г; KН2РO4, 0,8 г; K2НРO4, 16,4 г; биотин, 100 мкг; тиамин-HCl, 1000 мкг; кальций-пантотеновая кислота, 2000 мкг; и никотинамид, 2000 мкг (на 1 л дистиллированной воды).
Отобранные 256 штаммов анализировали нингидриновым методом так же, как описано выше, и отбирали 53 штамма с повышенной способностью к продукции L-лизина по сравнению со штаммом
KCCM11016PΔасеЕ/pCR2.1-aceE (WT).
Пример 4: Подтверждение способности штаммов, отобранных из
библиотеки искусственных вариантов Е1р, к продукции L-лизина
Для сравнения способности 53 различных штаммов, отобранных в Примере 3, продуцировать L-лизин, штаммы культивировали методом, описанным ниже, и анализировали компоненты полученных культур.
Каждый из штаммов высевали в колбы с угловыми перегородками (corner-baffle flasks) объемом 250 мл, содержащие 25 мл среды для получения посевной культуры, соответственно, и культивировали в шейкер-инкубаторе (200 об/мин) при 30°С в течение 20 часов. В каждую колбу с угловыми перегородками, содержащую 24 мл среды для получения L-лизина, вносили по 1 мл жидкой посевной культуры и культивировали в шейкер-инкубаторе (200 об/мин) при 30°С в течение 72 часов. Концентрацию L-лизина в каждой культуре анализировали посредством ВЭЖХ.
Среда для получения посевной культуры (рН 7,0)
Глюкоза (20 г), пептон (Юг), дрожжевой экстракт (5 г), мочевина (1,5 г), KН2РO4 (4 г), K2НРO4 (8 г), MgSO4⋅7H2O (0,5 г), биотин (100 мкг), тиамин-HCl (1000 мкг), кальций-пантотеновая кислота (2000 мкг), никотинамид (2000 мкг) (на 1 л дистиллированной воды).
Среда для получения L-лизина (рН 7,0)
Глюкоза (100 г), (NH4)2SO4 (40 г), соевый белок (2,5 г), сухой кукурузный экстракт (5 г), мочевина (3 г), КН2РO4 (1 г), MgSO4⋅7H20 (0,5 г), биотин (100 мкг), тиамин-HCl (1000 мкг), кальций-пантотеновая кислота (2000 мкг), никотинамид (3000 мкг) и СаСO3 (30 г) (на 1 л дистиллированной воды).
Из 53 различных штаммов отбирали 10 штаммов с наибольшими концентрациями L-лизина, и повторяли культивирование и анализ, описанные выше. Концентрации L-лизина, полученные при анализе, показаны в Таблице 1 ниже.
В результате анализа концентрации L-лизина было подтверждено, что выход L-лизина при использовании 10 отобранных штаммов продемонстрировал максимальное повышение на 22% по сравнению с контрольным штаммом KCCM11016PΔасеЕ/pCR2.1-aceE (WT).
Пример 5: Подтверждение модификации гена асеЕ в штаммах, отобранных из библиотеки искусственных вариантов Е1р
Для подтверждения замен, введенных в Е1р 10 штаммов, отобранных в Примере 4, анализировали полинуклеотидные последовательности модифицированного асеЕ. Для определения полинуклеотидных последовательностей проводили ПЦР с использованием праймера 1 (SEQ ID NO:3) и праймера 2 (SEQ ID NO:4).
Праймер 1 (SEQ ID NO:3): 5'-TGGGA CCGGG АААСС GGG-3'.
Праймер 2 (SEQ ID NO:4): 5'-GATTT ATCTG TCCCT TGA-3'.
Полученные полинуклеотидные последовательности каждого модифицированного фрагмента гена асеЕ подтверждали анализом, сравнивали с полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2 и таким образом подтверждали аминокислотные последовательности вариантов Е1р. Информация о заменах в аминокислотных последовательностях Е1р отобранных штаммов показана в Таблице 2 ниже.
Пример 6: Конструирование вектора для введения варианта Е1р в хромосому
С целью подтверждения эффекта применения варианта Е1р, подтвержденного в Примере 5, конструировали вектор для введения указанного варианта в хромосому.
На основе указанных полинуклеотидных последовательностей, синтезировали праймер 9 (SEQ ID NO:12) с сайтом рестрикции Xbal на 5'-конце и праймер 10 (SEQ ID NO:13) с сайтом рестрикции Хbаl на 3'-конце. Фрагменты генов асеЕ (mt) 10 различных модифицированных штаммов амплифицировали посредством ПЦР с использованием хромосом 10 различных отобранных штаммов в качестве матриц, соответственно.
ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и полимеризации при 72°С в течение 2 мин; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин.
Праймер 9 (SEQ ID NO:12): 5'-ААТСТ AGATG GGACC GGGAA ACCGG G-3'.
Праймер 10 (SEQ ID NO:13): б'-ААТСТ AGAGA ТТТАТ CTGTC CCTTG А-3'.
Фрагменты генов 10 различных штаммов, амплифицированные посредством ПЦР, обрабатывали Xbal с получением соответствующих фрагментов ДНК, фрагменты соединяли с вектором pDZ для введения в хромосомы, содержащие сайт рестрикции Хbаl, трансформировали им Е. coli DH5α и высевали их на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л).
Колонии, трансформированные вектором, в который был введен целевой ген, отбирали посредством ПЦР и получали плазмиды общеизвестными методами выделения плазмид. В соответствии с модификацией, введенной в Е1р каждой плазмиды, плазмиды были названы pDZ-E1p (Q432E), pDZ-E1p (E190V), pDZ-E1p(L438P), pDZ-E1p (Q195H), pDZ-E1p (P199S), pDZ-E1p (K435A), pDZ-E1p(Q432A), pDZ-E1p (Y418H), pDZ-E1p (N428A) и pDZ-E1p (Y201A), соответственно.
Пример 7: Конструирование штаммов, имеющих происхождение из KCCM11016P, с введением вариантов Е1р и сравнение их способности
продуцировать L-лизин
Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, штамм, продуцирующий L-лизин, трансформировали 2-стадийной рекомбинацией гомологичных хромосом с использованием 10 векторов для введения новых вариантов Е1р, полученных в Примере 6. Затем, анализируя полинуклеотидные последовательности, отбирали штаммы, в хромосомы которых были введены варианты Е1р, и они были названы KCCM11016P::Е1р (Q432E), KCCM11016P::E1р (E190V), KCCM11016P::E1р (L438P), KCCM11016P::Е1р (Q195H), KCCM11016P::E1р (P199S), KCCM11016P::Е1р (K435A), KCCM11016P::E1p (Q432A), KCCM11016P::Е1р (Y418H), KCCM11016P::E1р (N428A) и KССM11016Р::Е1р (Y201A) в соответствии с введенным вариантом Е1р.
Штаммы культивировали так же, как в Примере 4, и анализировали концентрации L-лизина в культурах. Для оценки скорости роста конструированных штаммов измеряли остаточную концентрацию глюкозы в культурах через 18 часов после начала культивирования (Таблица 3).
Новые 10 различных штаммов (то есть KCCM11016P::Е1р (Q432E), KCCM11016P::E1р (E190V), KCCM11016P::Е1р (L438P), KCCM11016P::E1р (Q195H), KCCM11016P::Е1р (P199S), KCCM11016P::E1р (K435A), KCCM11016P::Е1р (Q432A), KCCM11016P::Е1р (Y418H), KССМ11016Р::Е1р (Y201A) и KCCM11016P::Е1р (N428A)) продемонстрировали незначительное снижение скорости потребления глюкозы и в то же время максимальное повышение продукции лизина на 10% по сравнению с исходным штаммом.
В связи с этим авторы настоящего изобретения дали штамму KCCM11016P::E1р (N428A), репрезентативному штамму среди штаммов с улучшенной способностью к продукции L-лизина, название Corynebacterium glutamicum «СА01-2289», и депонировали этот штамм в Корейском центре культур микроорганизмов, являющемся признанным международным органом по депонированию согласно Будапештскому соглашению, 23 октября 2014 г. с присвоением ему регистрационного номера KССМ11590Р.
При исследовании было подтверждено, что варианты Е1р 10 различных штаммов (то есть E1p(Q432E) (SEQ ID NO:14), E1p(E190V) (SEQ ID NO:15), E1p(L438P) (SEQ ID NO:16), E1p(Q195H) (SEQ ID NO:17), E1p (P199S) (SEQ ID NO:18), E1p(K435A) (SEQ ID NO:19), E1p (Q432A) (SEQ ID NO:20), E1p(Y418H) (SEQ ID NO:21), E1p(Y201A) (SEQ ID NO:22) и E1p (N428A) (SEQ ID NO:23)) можно было распределить главным образом по двум группам (аминокислотные остатки в положениях 190-201 и аминокислоты в положениях 418-438).
Были синтезированы десять различных штаммов с комбинациями замен, принадлежащих к каждой группе (то есть (KCCM11016P::Е1р (E190V, Q195H), KCCM11016P::Е1р (E190V, P199S), KCCM11016P::Е1р (Q195H, P199S), KCCM11016P::Е1р (E190V, Y201A), KCCM11016P::Е1р (Q195H, Y201A), KCCM11016P::Е1р (P199S, Y201A), KCCM11016P::Е1р (N428A, Q432E), KCCM11016P::Е1р (N428A, K435A), KCCM11016P::Е1р (Y418H, K435A), KCCM11016P::Е1р (Y418H, Q432A)), и их способность продуцировать L-лизин измеряли так же, как описано выше (Таблица 4).
Как показано в Таблице выше, все 10 новых штаммов с комбинациями замен продемонстрировали незначительное снижение скорости потребления глюкозы и в то же время максимальное повышение способности продуцировать L-лизин на 15,6%. Эти результаты подтверждают, что штамм с комбинацией замен может демонстрировать лучшую способность продуцировать L-лизин, чем штамм с одной новой заменой.
Полученные результаты подтверждают, что 10 штаммов с новыми вариантами белка Е1р являются эффективными штаммами, которые могут существенно повысить способность продуцировать L-лизин без существенного снижения скорости потребления глюкозы по сравнению с исходным штаммом, и также подтверждают, что аминокислотные остатки в положениях 190-205 или 415-440 являются основными областями, которые могут демонстрировать описанные выше эффекты.
Пример 8: Измерение активности пируватдегидрогеназного комплекса (PDHC) у штаммов с вариантами Е1р
Активность PDHC у отобранных штаммов измеряли методом, описанным в литературе (Schreiner et al., J. Bacteriol. 187:6005, 2005). Контрольные штаммы KCCM11016P и KCCM11016PΔасеЕ и 10 отобранных штаммов (KCCM11016P::Е1р (Q432E), KCCM11016P::Е1р (E190V), KCCM11016P::Е1р (L438P), KCCM11016P::Е1р (Q195H), KCCM11016P::Е1р (P199S), KCCM11016P::Е1р (K435A), KCCM11016P::Е1р (Q432A), KCCM11016P::Е1р (Y418H), KCCM11016P::Е1р (Y201A) и KCCM11016P::Е1р (N428A)), высевали в 25 мл среды для получения посевной культуры, описанной в Примере 4, и культивировали до поздней логарифмической фазы.
Клетки собирали центрифугированием и отмывали два раза с использованием буферного раствора со 100 мМ трис-HCl (рН 7,2, 3 мМ L-цистеина, 10 мМ МgCl2), после чего суспендировали в 2 мл того же буферного раствора. Суспензию клеток подвергали физическому разрушению обычным методом, интенсивно перемешивая со стеклянными шариками в течение 10 минут, два раза отбирали супернатант после центрифугирования (13000 об/мин, 4°С, 30 мин) и использовали его в качестве неочищенного экстракта для измерения ферментативной активности PDHC. Для измерения ферментативной активности PDHC 0,05 мл неочищенного экстракта добавляли к 0,95 мл реакционного раствора для измерения ферментативной активности (10 мМ MgCl2, 3 мМ цистеин, 2 мМ NAD, 0.9 мМ дифосфата тиамина, 0,25 мМ хлорпромазина, 6 мМ пирувата, 0,2 мМ КоА в буфере с трис-HCl (рН 7,2)) и подвергали взаимодействию при 30°С.Единицу активности PDHC определяли как потребление 1 мкмоль NADH в минуту, и результаты измерения ферментативной активности показаны в Таблице 5 ниже.
Активность PDHC у штаммов с новыми вариантами составляла от 35% до 56% активности исходного штамма.
Пример 9: Сравнение способности продуцировать L-лизин со штаммом с делецией асеЕ
Для сравнительной оценки KCCM11016PΔасеЕ, штамма с делецией асеЕ, конструированного в Примере 2, и 10 отобранных штаммов (KCCM11016P::Е1р (Q432E), KCCM11016P::Е1р (E190V), KCCM11016P::Е1р (L438P), KCCM11016P::Е1р (Q195H), KCCM11016P::Е1р (P199S), KCCM11016P::Е1р (K435A), KCCM11016P::Е1р (Q432A), KCCM11016P::Е1р (Y418H), KCCM11016P::Е1р (Y201A) и KCCM11016P::Е1р (N428A)) штаммы культивировали так же, как в Примере 4, используя среды, содержащие ацетат аммония. Концентрацию L-лизина в полученных культурах анализировали посредством ВЭЖХ и для оценки скорости роста конструированных штаммов измеряли остаточную концентрацию глюкозы через 18 часов после начала культивирования (Таблица 6).
Среда для получения лизина, содержащая ацетат аммония (рН 7,0)
Глюкоза (100 г), CH3COONH3 (5 г), (NH4)2SO4 (40 г), соевый белок (2,5 г), сухой кукурузный экстракт (5 г), мочевина (3 г), КН2Р04 (1 г), MgSO4⋅7H2O (0,5 г), биотин (100 мкг), тиамин-HCl (1000 мкг), кальций-пантотеновая кислота (2000 мкг), никотинамид (3000 мкг) и СаСО3 (30 г) (на 1 л дистиллированной воды).
Штамм KCCM11016PΔасеЕ продемонстрировал повышение способности продуцировать L-лизин на 9,6%, но с существенным снижением скорости роста по сравнению с исходным штаммом. В отличие от этого, штаммы с заменами продемонстрировали повышение выхода лизина при скорости потребления глюкозы, сходной с культивированием без ацетата аммония.
Результаты показывают, что штаммы с вариантами асеЕ позволяют получать лизин с высоким выходом без заметного эффекта на скорость роста, в отличие от штамма с делецией асеЕ, который позволяет повысить выход лизина, но со значимым снижением скорости роста.
Пример 10: Конструирование штаммов, имеющих происхождение из KFCC10750, с введением вариантов Е1р и сравнение их способности продуцировать L-лизин
Для подтверждения эффектов введения 10 новых вариантов в другие штаммы Corynebacterium glutamicum, конструировали штаммы, вводя каждый из соответствующих 10 разных вариантов Е1р в Corynebacterium glutamicum KFCC10750 (указанный микроорганизм был впервые опубликован как KFCC10750 и депонирован повторно признанным международным органом по депонированию согласно Будапештскому соглашению с присвоением регистрационного номера KССМ11347Р; патент Кореи №10-0073610), штамм, продуцирующий L-лизин, таким же образом, как в Примере 7, и полученные штаммы были названы KFCC10750::E1p (Q432E), KFCC10750::E1p (E190V), KFCC10750::E1p (L438P), KFCC10750::E1p (Q195H), KFCC10750::E1p (P199S), KFCC10750::E1p (K435A), KFCC10750::E1p (Q432A), KFCC10750::E1p (Y418H), KFCC10750::E1p (Y201A) и KFCC10750::E1p (N428A). Эти одиннадцать штаммов, включая штамм KFCC10750 в качестве контрольного штамма, культивировали так же, как в Примере 4, и анализировали концентрацию L-лизина в культурах (Таблица 7).
В результате, было подтверждено, что у 10 различных штаммов с новыми вариантами способность продуцировать L-лизин была максимально повышена на 17% по сравнению с исходным штаммом.
Пример 11: Конструирование штаммов, имеющих происхождение из KССМ10770Р, с введением вариантов Е1р и сравнение их способности продуцировать L-лизин
Для подтверждения эффектов введения 10 новых вариантов в другие штаммы Corynebacterium glutamicum, конструировали штаммы, вводя каждый вариант Е1р в Corynebacterium glutamicum KССМ10770Р (патент Кореи №10-0924065), штамм, продуцирующий L-лизин, таким же образом, как в Примере 7, и полученные штаммы были названы KССМ10770Р::Е1р (Q432E), KССМ10770Р::Е1р (E190V), KССМ10770Р::Е1р (L438P), KССМ10770Р::Е1р (Q195H), KССМ10770Р::Е1р (P199S), KССМ10770Р::Е1р (K435A), KССМ10770Р::Е1р (Q432A), KССМ10770Р::Е1р (Y418H), KССМ10770Р::Е1р (Y201A) и KССМ10770Р::Е1р (N428A). Эти штаммы, включая штамм KFCC10750 в качестве контрольного штамма, культивировали так же, как в Примере 4, и анализировали концентрацию L-лизина в культурах (Таблица 8).
В результате, было подтверждено, что у 10 штаммов с новыми вариантами способность продуцировать L-лизин была максимально повышена на 17% по сравнению с исходным штаммом.
Пример 12: Конструирование штаммов, имеющих происхождение из CJ3P, с введением вариантов Е1р и сравнение их способности продуцировать L-лизин
Для подтверждения эффектов введения вариантов Е1р в другие штаммы Corynebacterium glutamicum, конструировали штаммы, вводя каждый вариант Е1р в Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al., Genome Biology 2012, 13: R40), штамм, продуцирующий L-лизин, таким же образом, как в Примере 7, и полученные штаммы были названы CJ3P::E1p (Q432E), CJ3P::E1p (E190V), CJ3P::E1p (L438P), CJ3P::E1p (Q195H), CJ3P::E1p (P199S), CJ3P::E1p (K435A), CJ3P::E1p (Q432A), CJ3P::E1p (Y418H), CJ3P::E1p (Y201A) и CJ3P::E1p (N428A). Эти штаммы культивировали так же, как в Примере 4, и анализировали концентрацию L-лизина в культурах (Таблица 9).
В результате, было подтверждено, что у 10 различных штаммов с новыми вариантами способность продуцировать L-лизин была максимально повышена на 19,5% по сравнению с исходным штаммом.
Результаты показывают, что каждый из полученных новых 10 различных штаммов с вариантами Е1р (E1p (Q432E), E1p (E190V), E1p (L438P), Е1р (Q195H), Е1р (P199S), Е1р (K435A), Е1р (Q432A), Е1р (Y418H), Е1р (Y201A) и E1p (N428A)) демонстрирует отличный эффект с соответствующим повышением способности продуцировать L-лизин.
Пример 13: Конструирование штаммов, имеющих происхождение из KССМ11201Р, с введением вариантов Е1р и сравнение их способности продуцировать L-валин
Для подтверждения эффектов введения 10 отобранных вариантов Е1р в штаммы Corynebacterium glutamicum, продуцирующие другие аминокислоты, конструировали штаммы, вводя каждый вариант Е1р в Corynebacterium glutamicum KFCC11201P (патент Кореи №10-1117022), штамм, продуцирующий L-валин, таким же образом, как в Примере 7, и полученные штаммы были названы KССМ11201Р::Е1р (Q432E), KССМ11201Р::Е1р (E190V), KССМ11201Р::Е1р (L438P), KССМ11201Р::Е1р (Q195H), KССМ11201Р::Е1р (P199S), KССМ11201Р::Е1р (K435A), KССМ11201Р::Е1р (Q432A), KССМ11201Р::Е1р (Y418H), KССМ11201Р::Е1р (Y201A) и KССМ11201Р::Е1р (N428A).
Для оценки этих штаммов каждый из них высевали в колбы с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержащие 25 мл среды для получения L-валина, описанной ниже, соответственно, и культивировали в шейкер-инкубаторе (200 об/мин) при 30°С в течение 20 часов. Концентрацию L-валина в каждой культуре анализировали посредством ВЭЖХ (Таблица 10).
Среда для получения валина (рН 7,2)
Глюкоза (50 г), (NH4)2S04 (20 г), кукурузный экстракт (20 г), КН2РO4 (1 г), MgSO4⋅7H2O (0,5 г), биотин (200 мкг) и СаСО3 (30 г) (на 1 л дистиллированной воды).
В результате, было подтверждено, что у 10 различных штаммов с новыми вариантами способность продуцировать L-валин была максимально повышена на 21% по сравнению с исходным штаммом.
Пример 14: Конструирование штаммов, имеющих происхождение из дикого типа, с вариантами Е1р и сравнение их способности продуцировать L-валин
Для повторного подтверждения способности четырех различных штаммов из 10 отобранных вариантов Е1р, продемонстрировавших эффект сильного повышения выхода L-валина, продуцировать L-валин конструировали штаммы, вводя каждый вариант Е1р в Corynebacterium glutamicum АТСС13032, таким же образом, как в Примере 7, и полученные штаммы были названы АТСС13032::Е1р (E190V), АТСС13032::Е1р (L438P), АТСС13032::Е1р (Y418H) и АТСС13032::Е1р (N428A).
Для подтверждения способности указанных выше штаммов продуцировать L-валин каждый из штаммов трансформировали pECCG117-DvaIS (заявка на патент Кореи №10-2014-0111421), являющимся вектором сверхэкспрессии для биосинтеза L-валина, электропорацией. Трансформированные штаммы получали из селективной среды, содержащей канамицин (25 мг/л), и они были названы АТСС13032::Е1р (E190V)_DvaIS, АТСС13032::Е1р (L438P)_DvaIS, АТСС13032::Е1р (Y418H)_DvaIS АТСС13032::Е1р (N428A)_DvaIS.
Эти штаммы культивировали так же, как в Примере 13, и анализировали концентрацию валина в каждой культуре (Таблица 11).
В результате, было подтверждено, что у четырех различных штаммов с новыми вариантами способность продуцировать L-валин была максимально повышена на 38% по сравнению с контрольным штаммом.
Исходя из изложенного выше, специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение, будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения технической концепции или существенных характеристик настоящего изобретения. В этом отношении, типичные воплощения раскрыты здесь исключительно в иллюстративных целях, и их не следует толковать как ограничение объема настоящего изобретения. Наоборот, подразумевают, что настоящее изобретение охватывает не только типичные воплощения, но также различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в сущность и объем настоящего изобретения, как определено приложенной формулой изобретения.
Claims (12)
1. Вариант пируватдегидрогеназы, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную замену в области аминокислот в положениях 190-205 или в области аминокислот в положениях 415-440 SEQ ID NO: 1.
2. Вариант пируватдегидрогеназы по п. 1, где аминокислотная замена в области аминокислот в положениях 190-205 SEQ ID NO: 1 выбрана из группы, состоящей из аминокислот в положениях 190, 195, 199 и 201.
3. Вариант пируватдегидрогеназы по п. 1, где аминокислотная замена в области аминокислот в положениях 190-205 SEQ ID NO: 1 выбрана из группы, состоящей из замены глутаминовой кислоты в положении 190 на валин (E190V), замены глутамина в положении 195 на гистидин (Q195H), замены пролина в положении 199 на серин (P199S) и замены тирозина в положении 201 на аланин (Y201A).
4. Вариант пируватдегидрогеназы по п. 1, где аминокислотная замена в области аминокислот в положениях 415-440 SEQ ID NO: 1 выбрана из группы, состоящей из аминокислот в положениях 418, 428, 432, 435 и 438.
5. Вариант пируватдегидрогеназы по п. 1, где аминокислотная замена в области аминокислот в положениях 415-440 SEQ ID NO: 1 выбрана из группы, состоящей из замены тирозина в положении 418 на гистидин (Y418H), замены аспарагина в положении 428 на аланин (N428A), замены глутамина в положении 432 на глутаминовую кислоту (Q432E), замены глутамина в положении 432 на аланин (Q432A), замены лизина в положении 435 на аланин (K435А) и замены лейцина в положении 438 на пролин (L438P).
6. Вариант пируватдегидрогеназы по п. 1, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14-33.
7. Полинуклеотид, кодирующий вариант пируватдегидрогеназы по любому из пп. 1-6.
8. Микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-аминокислоту, содержащий вариант пируватдегидрогеназы по любому из пп. 1-6.
9. Микроорганизм по п. 8, представляющий собой Corynebacterium glutamicum.
10. Способ получения L-аминокислоты, включающий:
(а) культивирование микроорганизма рода Corynebacterium по п. 8 в среде для получения L-аминокислоты; и
(б) выделение L-аминокислоты из культивированного микроорганизма или среды.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150037654A KR101776375B1 (ko) | 2015-03-18 | 2015-03-18 | 피루브산 디하이드로게나아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 |
| KR10-2015-0037654 | 2015-03-18 | ||
| PCT/KR2016/002594 WO2016148490A1 (ko) | 2015-03-18 | 2016-03-15 | 피루브산 디하이드로게나아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2683208C1 true RU2683208C1 (ru) | 2019-03-26 |
Family
ID=56919058
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017134331A RU2683208C1 (ru) | 2015-03-18 | 2016-03-15 | Мутант пируватдегидрогеназы, микроорганизм, содержащий мутант, и способ получения L-аминокислоты с использованием микроорганизма |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10526586B2 (ru) |
| EP (1) | EP3272860B1 (ru) |
| JP (2) | JP6625133B2 (ru) |
| KR (1) | KR101776375B1 (ru) |
| CN (1) | CN106715687B (ru) |
| BR (1) | BR112017019057B1 (ru) |
| DK (1) | DK3272860T5 (ru) |
| ES (1) | ES2959213T3 (ru) |
| HU (1) | HUE064139T2 (ru) |
| MY (1) | MY187636A (ru) |
| PL (1) | PL3272860T3 (ru) |
| RU (1) | RU2683208C1 (ru) |
| WO (1) | WO2016148490A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2822660C1 (ru) * | 2020-09-01 | 2024-07-11 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Микроорганизмы, продуцирующие L-валин, и способ получения L-валина с их использованием |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101947945B1 (ko) * | 2018-01-25 | 2019-02-13 | 씨제이제일제당 (주) | L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법 |
| KR101947959B1 (ko) * | 2018-05-28 | 2019-02-13 | 씨제이제일제당 (주) | 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법 |
| KR102311391B1 (ko) | 2020-05-21 | 2021-10-12 | 씨제이제일제당 주식회사 | L- 분지쇄 아미노산 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용하여 l-분지쇄 아미노산을 생산하는 방법 |
| KR102344689B1 (ko) * | 2020-09-01 | 2021-12-29 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 |
| US20220372451A1 (en) * | 2021-04-28 | 2022-11-24 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Production of pyruvate or products derived from pyruvate using modified escherichia coli |
| CN113249347B (zh) * | 2021-07-14 | 2021-11-12 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产l-氨基酸的方法 |
| CN113430151B (zh) * | 2021-08-13 | 2022-06-07 | 江苏澳创生物科技有限公司 | 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-缬氨酸中的应用 |
| CN113683667B (zh) * | 2021-08-25 | 2024-06-25 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | Yh66-rs10865基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用 |
| KR102703218B1 (ko) * | 2022-01-11 | 2024-09-06 | 대상 주식회사 | L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 l-히스티딘의 생산 방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496867C2 (ru) * | 2011-04-25 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии |
| CN104004678A (zh) * | 2014-05-05 | 2014-08-27 | 江南大学 | 一株高产l-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建及其发酵产l-缬氨酸的方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR940001307B1 (ko) | 1991-12-27 | 1994-02-19 | 제일제당 주식회사 | L-라이신을 생산하는 신규 미생물 |
| PE20001375A1 (es) * | 1998-12-18 | 2000-12-14 | Ajinomoto Kk | Metodo para producir acido l-glutamico por fermentacion |
| TW200734459A (en) * | 1999-10-04 | 2007-09-16 | Ajinomoto Kk | Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria |
| DE102005045301A1 (de) * | 2005-09-22 | 2007-04-05 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| DE102006032634A1 (de) | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren |
| EP2066782A4 (en) | 2006-09-15 | 2010-02-03 | Cj Cheiljedang Corp | CORYNEBACTERIA WITH IMPROVED L-LYSINE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR THE PREPARATION OF L-LYSINE THEREWITH |
| ES2699747T3 (es) * | 2011-04-29 | 2019-02-12 | Danisco Us Inc | Microorganismos recombinantes para la producción potenciada de mevalonato, isopreno e isoprenoides |
| KR101117022B1 (ko) | 2011-08-16 | 2012-03-16 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법 |
| KR101721722B1 (ko) | 2013-03-11 | 2017-04-10 | 씨제이제일제당 (주) | L-발린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 l-발린 생산방법 |
-
2015
- 2015-03-18 KR KR1020150037654A patent/KR101776375B1/ko active IP Right Review Request
-
2016
- 2016-03-15 JP JP2017548259A patent/JP6625133B2/ja active Active
- 2016-03-15 CN CN201680002649.4A patent/CN106715687B/zh active Active
- 2016-03-15 PL PL16765246.0T patent/PL3272860T3/pl unknown
- 2016-03-15 MY MYPI2017703025A patent/MY187636A/en unknown
- 2016-03-15 DK DK16765246.0T patent/DK3272860T5/da active
- 2016-03-15 RU RU2017134331A patent/RU2683208C1/ru active
- 2016-03-15 EP EP16765246.0A patent/EP3272860B1/en active Active
- 2016-03-15 HU HUE16765246A patent/HUE064139T2/hu unknown
- 2016-03-15 US US15/557,013 patent/US10526586B2/en active Active
- 2016-03-15 BR BR112017019057-5A patent/BR112017019057B1/pt active IP Right Grant
- 2016-03-15 WO PCT/KR2016/002594 patent/WO2016148490A1/ko active Application Filing
- 2016-03-15 ES ES16765246T patent/ES2959213T3/es active Active
-
2019
- 2019-05-30 US US16/426,453 patent/US20190292526A1/en not_active Abandoned
- 2019-09-06 JP JP2019163451A patent/JP2020000250A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496867C2 (ru) * | 2011-04-25 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии |
| CN104004678A (zh) * | 2014-05-05 | 2014-08-27 | 江南大学 | 一株高产l-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建及其发酵产l-缬氨酸的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BLOMBACH B. et al. L-Valine Production with Pyruvate Dehydrogenase Complex-Deficient Corynebacterium glutamicum, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 73, No. 7, pp. 2079-2084, 2007. * |
| BLOMBACH B. et al. L-Valine Production with Pyruvate Dehydrogenase Complex-Deficient Corynebacterium glutamicum, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 73, No. 7, pp. 2079-2084, 2007. BUCHHOLZ J. et al. Platform Engineering of Corynebacterium glutamicum with Reduced Pyruvate Dehydrogenase Complex Activity for Improved Production of L-Lysine, L-Valine, and 2-Ketoisovalerate, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 79, No. 18, pp. 5566 -5575, 2013. MARK E. SCHREINER et al. E1 Enzyme of the Pyruvate Dehydrogenase Complex in Corynebacterium glutamicum: Molecular Analysis of the Gene and Phylogenetic Aspects, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Vol. 187, No. 17, pp. 6005-6018, 2005. * |
| BUCHHOLZ J. et al. Platform Engineering of Corynebacterium glutamicum with Reduced Pyruvate Dehydrogenase Complex Activity for Improved Production of L-Lysine, L-Valine, and 2-Ketoisovalerate, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 79, No. 18, pp. 5566 -5575, 2013. * |
| MARK E. SCHREINER et al. E1 Enzyme of the Pyruvate Dehydrogenase Complex in Corynebacterium glutamicum: Molecular Analysis of the Gene and Phylogenetic Aspects, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Vol. 187, No. 17, pp. 6005-6018, 2005. * |
| UniProtKB - Q8NNF6 (ODP1_CORGL), 01.10.2002; Найдено в Интернет по адресу: www.uniprot.org/uniprot/Q8NNF6. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2822660C1 (ru) * | 2020-09-01 | 2024-07-11 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Микроорганизмы, продуцирующие L-валин, и способ получения L-валина с их использованием |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018512132A (ja) | 2018-05-17 |
| KR101776375B1 (ko) | 2017-09-08 |
| HUE064139T2 (hu) | 2024-03-28 |
| JP6625133B2 (ja) | 2019-12-25 |
| ES2959213T3 (es) | 2024-02-21 |
| KR101776375B9 (ko) | 2022-01-11 |
| US10526586B2 (en) | 2020-01-07 |
| US20190292526A1 (en) | 2019-09-26 |
| EP3272860A4 (en) | 2018-08-08 |
| JP2020000250A (ja) | 2020-01-09 |
| KR20160113377A (ko) | 2016-09-29 |
| BR112017019057B1 (pt) | 2024-03-05 |
| BR112017019057A2 (pt) | 2018-04-17 |
| US20180057798A1 (en) | 2018-03-01 |
| CN106715687A (zh) | 2017-05-24 |
| PL3272860T3 (pl) | 2024-02-05 |
| EP3272860B1 (en) | 2023-08-09 |
| CN106715687B (zh) | 2021-04-27 |
| MY187636A (en) | 2021-10-05 |
| WO2016148490A1 (ko) | 2016-09-22 |
| DK3272860T5 (da) | 2024-06-10 |
| DK3272860T3 (da) | 2023-10-30 |
| EP3272860A1 (en) | 2018-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2683208C1 (ru) | Мутант пируватдегидрогеназы, микроорганизм, содержащий мутант, и способ получения L-аминокислоты с использованием микроорганизма | |
| RU2615454C1 (ru) | Способ получения L-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать L-лизин | |
| RU2730867C1 (ru) | Модифицированная гомосериндегидрогеназа и способ получения гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, с ее использованием | |
| RU2733426C1 (ru) | Модифицированная гомосериндегидрогеназа и способ получения гомосерина или l-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, с использованием такой гомосериндегидрогеназы | |
| JP6359037B2 (ja) | Ｌ−バリン産生能が向上した菌株及びこれを用いたｌ−バリンの産生方法 | |
| RU2681475C1 (ru) | Вариант репрессора глюконата, микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий его, и способ получения L-лизина с его использованием | |
| RU2698394C1 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий L-изолейцин-продуцирующей способностью, и способ получения L-изолейцина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2676137C2 (ru) | Микроорганизм для продуцирования О-ацетилгомосерина и способ получения О-ацетилгомосерина с использованием этого микроорганизма | |
| CN106029879B (zh) | 具有提高的l-苏氨酸生产能力的微生物以及使用其生产l-苏氨酸的方法 | |
| KR20130082124A (ko) | 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법 | |
| RU2692645C2 (ru) | Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, и способ получения L-триптофана с его использованием | |
| JP2018528771A (ja) | Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ−リジン生産方法 | |
| RU2668830C2 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-лизина и способ получения L-лизина с его помощью | |
| JP2018523496A (ja) | Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ−リジン生産方法 | |
| KR20080052593A (ko) | 미생물을 사용한 아미노산 생산 방법 | |
| RU2706535C2 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий O-ацетилгомосерин, и способ получения O-ацетилгомосерина с использованием этого микроорганизма | |
| KR20220152728A (ko) | 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도 | |
| JP2023503218A (ja) | アセトヒドロキシ酸シンターゼ新規変異体及びこれを含む微生物 | |
| CN111676205B (zh) | L-赖氨酸生产力提高的微生物和利用其生产l-赖氨酸的方法 | |
| RU2805253C1 (ru) | Новый модифицированный полипептид с ослабленной активностью цитратсинтазы и способ получения L-аминокислоты с его использованием | |
| JP2024515389A (ja) | Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたｌ－リシンの生産方法 | |
| EP3015547B1 (en) | Rna polymerase sigma factor 32 variant and production method for l-threonine using a microorganism expressing the variant |