WO2016148490A1 - 피루브산 디하이드로게나아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 - Google Patents

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microorganism
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허란
문준옥
배현원
김형준
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present application is a novel pyruvate dehydrogenase variant, a polynucleotide encoding the variant, the corynebacterium genus microorganism having the L-amino acid producing ability and the microorganism, including the pyruvate dehydrogenase variant. It relates to a method for producing L-amino acid using.
  • Pyruvate dehydrogenase multienzyme complex is an enzyme that converts pyruvate produced in glycolysis to acetyl-CoA and is an important enzyme that determines the influx of carbon into the TCA pathway.
  • PDHC consists of pyruvate dehydrogenase (E1p), dihydrolipoamide acetyltransferase (E2p), dihydrolipoamide dehydrogenase (E3p).
  • E1p pyruvate dehydrogenase
  • E2p dihydrolipoamide acetyltransferase
  • E3p dihydrolipoamide dehydrogenase
  • the E1p enzyme is encoded by the aceE gene. L-lysine production changes in L-lysine producing strains due to aceE gene deletion and attenuation have been known (Blombach et al ., Appl. Microbiol.
  • the present inventors have made efforts to develop E1p variants and microorganisms using the same, which can be used to produce high concentrations of L-amino acids. As a result, the inventors have developed E1p variants and can produce L-amino acids in high yield from microorganisms including the variants. It confirmed and completed this invention.
  • One object of the invention is to provide novel pyruvate dehydrogenase variants.
  • Another object of the invention is to provide a polynucleotide encoding the variant.
  • Another object of the present invention is to produce a L-amino acid by (a) culturing a microorganism of the genus Corynebacterium having L-amino acid producing ability, including the pyruvic acid dehydrogenase variant in a medium; And (b) recovering the L-amino acid from the microorganism or the medium.
  • the pyruvate dehydrogenase variant of the present application can obtain an enzyme whose activity is weakened.
  • L-amino acid can be produced with high efficiency as compared to the L-amino acid producing strain containing the wild-type pyruvate dehydrogenase protein.
  • lysine is an essential amino acid of animal feed, which requires industrial mass production, and thus production of L-lysine at high efficiency as described herein can also reduce the cost of feed production.
  • One embodiment embodying the invention is a pyruvate dehydrogenase variant having one or more amino acid mutations at amino acid sites 190-205 or amino acids 415-440 in SEQ ID NO: 1.
  • pyruvate dehydrogenase is one of the enzymes that make up the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex (PDHC) and is involved in the conversion of pyruvate to acetyl-CoA.
  • the pyruvic acid dehydrogenase herein is not particularly limited as long as it has the activity, but may be a microorganism of the genus Corynebacterium, specifically, pyruvic acid dehydrogenase derived from Corynebacterium glutamicum, but is not limited thereto. It is not.
  • the pyruvic acid dehydrogenase is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or more than 75%, specifically 80% or more, more specifically 85% or more, even more specifically 90%, 91%, 92% , Amino acid sequences having at least 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology.
  • the E1p protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the aceE gene having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • sequence having homology with the sequence is an amino acid sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to the protein of SEQ ID NO: 1, even if some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added herein It is obvious that it is included in the category. Any polynucleotide sequence encoding pyruvate dehydrogenase herein can be included within the scope of the present application.
  • polynucleotide sequence encoding the protein does not change the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region, due to the degeneracy of the codon or taking into account the codons preferred in the organism to which the protein is to be expressed.
  • Various modifications may be made to the coding region within the range.
  • Pyruvate dehydrogenase variant according to the present application is at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7 at amino acid sites of 190 to 205 or at amino acids 415 to 440 in SEQ ID NO: 1. At least 8, at least 9, or at least 10 amino acid mutations.
  • the pyruvate dehydrogenase variant according to the present application may have one or more, two or more, three or more or four or more amino acid mutations at amino acid sites 190 to 205 in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid that is mutated at the amino acid sites of 190 to 205 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of amino acids 190, 195, 199 and 201, but is not limited thereto.
  • amino acid variation in the amino acid region of 190 to 205 of SEQ ID NO: 1 one or more amino acids of the amino acid region of 190 to 205 may be substituted with another amino acid, more specifically, 190,
  • One or more amino acids of amino acids 195, 199 and 201 may be substituted with other amino acids, more specifically 190-glutamic acid to valine (E190V), 195 glutamine to histidine ( Q195H), 199 proline to serine substitution (P199S) and 201 tyrosine to alanine substitution (Y201A), but may be one or more selected from the group consisting of, but not limited thereto.
  • the pyruvic acid dehydrogenase variant according to the present application may have one or more, two or more, three or more, four or more, five or more, or six or more amino acid mutations at sites 415 to 440.
  • the amino acid that is mutated at the amino acid sites 415 to 440 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of amino acids 418, 428, 432, 435 and 438.
  • the amino acid variation in the amino acid region 415 to 440 of SEQ ID NO: 1 may be one or more amino acids of the amino acid sites 415 to 440 is substituted with another amino acid, specifically, 418, 428,
  • One or more of amino acids 432, 435 and 438 may be substituted with another amino acid, and more specifically, substitution of tyrosine 418 to histidine (Y418H) and substitution of 428 asparagine to alanine (N428A), substitution of glutamine to glutamic acid at No. 432 (Q432E), substitution of alanine at no. 432 (Q432A), substitution of alanine at no. 435 (K435A) and substitution of proline at no of 438 leucine (L438P) At least one selected from the group consisting of, but is not particularly limited thereto.
  • the pyruvic acid dehydrogenase variant may have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14 to 33.
  • the pyruvate dehydrogenase variant is not only a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 14-33, but also 75% or more, specifically 80% or more, more specifically 85% or more, and even more specifically with the amino acid sequence.
  • sequence having such homology is an amino acid sequence having the same or corresponding biological activity as that of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 14 to 33, and some of the sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added It is obvious that it is included in the scope of the present application.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another may be determined by known techniques. For example, homology can be determined by aligning sequence information and directly aligning sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules using readily available computer programs.
  • the computer program may be BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign TM (DNASTAR Inc), or the like.
  • homology between polynucleotides can be determined by hybridizing polynucleotides under conditions of stable double stranding between homologous regions, followed by digestion with single-strand-specific nucleases to determine the size of the digested fragments.
  • Another aspect of the invention is to provide a polynucleotide encoding the pyruvic acid dehydrogenase variant.
  • the pyruvic acid dehydrogenase variant is as described above.
  • the polynucleotide encoding the pyruvic acid dehydrogenase variant may be included in the scope of the present application as long as it is a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 14 to 33.
  • at least 75%, specifically at least 80%, more specifically at least 85%, even more specifically at 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% Polynucleotides having at least 96%, 97%, 98%, or 99% homology.
  • polynucleotide refers to a polymer of nucleotides in which nucleotide units are elongated by covalent bonds, and generally refer to DNA or RNA strands of a certain length and which encodes the pyruvate dehydrogenase variant herein. Means polynucleotide.
  • the polynucleotide may have a variety of nucleotide sequences that encode the same amino acid sequence due to genetic code degeneracy. It may also have codon-optimized sequences to optimize expression depending on the type of host cell.
  • Another specific embodiment of the present application is a microorganism of the genus Corynebacterium having the ability to produce L-amino acid, including the pyruvic acid dehydrogenase variant.
  • the microorganism may be transformed by a vector comprising the pyruvate dehydrogenase variant by mutation or a polynucleotide encoding the pyruvate dehydrogenase variant.
  • the term "vector” refers to any medium for cloning and / or transferring bases to a host cell.
  • the vector may be a replica that other DNA fragments can bind to and result in replication of the bound fragments.
  • "Replication unit” refers to any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions as a self-unit of DNA replication in vivo, i.e., is replicable by its own regulation.
  • the vector is not particularly limited as long as the vector is replicable in the host, and any vector known in the art may be used.
  • Vectors used in the preparation of the recombinant vector may be natural or recombinant plasmid, cosmid, virus and bacteriophage.
  • pWE15, M13, [lambda] EMBL3, [lambda] EMBL4, [lambda] FIXII, [lambda] DASHII, [lambda] ZAPII, [lambda] gt10, [lambda] gt11, Charon4A, and Charon21A can be used as the phage vector or cosmid vector.
  • pBluescriptII system pGEM system
  • pTZ system pCL system
  • pET system pET system
  • the vector which can be used is not specifically limited, A well-known expression vector can be used.
  • pDZ Korean Patent No. 10-0924065; incorporated herein by reference in its entirety
  • pDZ Korean Patent No. 10-0924065; incorporated herein by reference in its entirety
  • transformation refers to introduction of a gene into a host cell so that it can be expressed in the host cell, and the transformed gene may be located outside the chromosome or the chromosome of the host cell if it can be expressed in the host cell. Anything may be included without limitation.
  • the gene may be introduced into the host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette typically includes a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site, and translation termination signal operably linked to the gene.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the gene may be introduced into the host cell in the form of a polynucleotide structure itself or operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • the microorganism may include any of prokaryotic and eukaryotic microorganisms if it contains a protein having the pyruvate dehydrogenase variant activity or if it is transformed to express the glycoprotein.
  • Escherichia Escherichia
  • An air Winiah Erwinia
  • Serratia marcescens Serratia
  • Providencia Providencia
  • Enterobacter bacteria Enterobacter bacteria
  • Salmonella Salmonella
  • genus Streptomyces Streptomyces
  • Pseudomonas Pseudomonas
  • Brevibacterium Brevibacterium
  • Corynebacterium Corynebacterium
  • Coynebacterium Corynebacterium
  • the pyruvate dehydrogenase variant protein of the present invention when included in a microorganism having L-amino acid producing ability, compared to the microorganism containing the wild-type pyruvate dehydrogenase protein, the growth of L-amino acid is not significantly inhibited. Improve production capacity
  • L-amino acid includes all L-amino acids that can be produced via pyruvate from various carbon sources, specifically pyruvate to acetyl CoA on the biosynthetic pathway. L-amino acid without going through the step of conversion. More specifically L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine, L-valine, L-leucine, or L-alanine, and more specifically L-lysine or L- It may be valine.
  • the microorganism producing L-amino acid includes all prokaryotic or eukaryotic microorganism strains capable of producing L-amino acid in an organism, and the types of microorganisms that can be applied to the example are as described above.
  • the microorganism producing L-amino acid includes, without limitation, the type of microorganism as long as it has the ability of producing L-amino acid, and includes both wild-type and recombinant strains.
  • a microorganism of the genus Corynebacterium capable of producing L-lysine may be a mutant that is resistant to L-lysine analogs or modified to enhance the activity of L-lysine biosynthesis related proteins in comparison to non-mutant strains.
  • expression improvement may be achieved by gene amplification, replacement or modification of a sequence such as a promoter or initiation codon, or introduction of a mutation for improved expression
  • the present invention is not limited thereto.
  • genes related to L-lysine biosynthesis include genes located on the L-lysine biosynthetic pathway, and specifically, dihydrodipicolinic acid synthase gene (dapA), asparto kinase gene (lysC), and di Hydrodipicolinic acid reductase gene (dapB), diaminopimelic acid decarboxylase gene (lysA), diaminopimelic acid dehydrogenase gene (ddh), phosphoenolpyruvic acid carboxylase gene (ppc), as Partate semialdehyde dehydrogenase gene (asd), aspartase gene (aspB), pyruvate carboxylase (Pyc), but are not limited to these.
  • transketolase (tkt) and the like present on the pentose phosphate pathway may be included, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium that may have the L- lysine production ability may exhibit L- lysine production capacity by including a variation known in the art related to L- lysine production, but is not limited thereto.
  • Microorganisms with L-threonine production capacity include, but are not limited to, methionine requirements, resistance to threonine analogs, resistance to lysine analogs, resistance to isoleucine analogs, and / or to methionine analogs. It may be a microorganism having resistance to.
  • the methionine analog may be, for example, one or more compounds selected from the group consisting of D, L-ethionine, norleucine, ⁇ -methylmethionine, and L-methionine-D, L-sulfoxymine
  • the nin analog may be one or more compounds selected from the group consisting of ⁇ -amino- ⁇ -hydroxy valeric acid and D, L-threonine hydroxyxamate, the lysine analogue being S- (2-aminoethyl) -L At least one compound selected from the group consisting of -cysteine and? -Methyl-L-lysine.
  • microorganisms with L-threonine production have attenuated activity of PckA protein involved in converting oxaloacetate (OAA), an L-threonine biosynthetic intermediate, into phosphoenolpyruvate (PEP).
  • OAA oxaloacetate
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • the microorganism having L-isoleucine producing ability may be a microorganism resistant to L-isoleucine or a derivative thereof or genetically engineered to release feedback inhibition by L-isoleucine or a derivative thereof.
  • Examples of the derivatives of L-isoleucine include, but are not limited to, 4-thiaisoleucine (4-thiaisoleucine, thiaile) or isoleucine-hydroxamate (ileHx).
  • the microorganism having L-valine production ability may be a microorganism that is resistant to L-valine or a derivative thereof or a microorganism genetically engineered so that an enzyme on the biosynthetic pathway of L-valine releases feedback by L-valine or a derivative thereof.
  • Examples include, but are not limited to, microorganisms comprising acetohydroxy acid synthase variants, in which feedback inhibition to L-valine is released.
  • the microorganism may be mutated to enhance the expression of L-valine operon, for example, the whole or part of the polynucleotide sequence encoding the leader peptide in the regulatory region of the L- valine operon is deleted of L-valine operin Expression may be enhanced (Korean Patent Publication No. 10-2014-0111421; the entire specification may be included as a reference, but is not limited thereto).
  • Another specific embodiment of the present invention comprises the steps of (a) culturing in the medium a microorganism of the genus Corynebacterium having L-amino acid production capacity comprising the pyruvic acid dehydrogenase variant to produce L-amino acid; And (b) recovering the L-amino acid from the microorganism or the medium.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having the L-amino acid producing ability is as described above.
  • the term "culture” means to grow the microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions. Cultivation process of the present application can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. Conditions such as specific incubation temperature, incubation time and pH of the medium may be carried out according to the general knowledge of a person skilled in the art or a method known in the art, and can be adjusted accordingly. Specifically, these known culture methods are described in Chmiel; Bioreatechnik 1. Einbigung indie Biovonstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), and Storhas; Bioreaktoren und periphere bamboo (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994). In addition, the culture method may include a batch culture, a continuous culture (cintinuous culture) and fed-batch culture, specifically, a batch process or injection batch or repeated batch batch (fed batch) or repeated fed batch process), but is not limited thereto.
  • Carbon sources that can be used in the medium include sugars and carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmit Acids, stearic acid, fatty acids such as linoleic acid, glycerol, alcohols such as ethanol, organic acids such as acetic acid, and the like, but are not limited thereto. These materials can be used individually or as a mixture, but are not limited to these.
  • Nitrogen sources that may be used may include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate, and the like.
  • the nitrogen source may also be used individually or as a mixture, but is not limited thereto.
  • Personnel that may be used may include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or a corresponding sodium-containing salt.
  • the culture medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • suitable precursors to the culture medium may be used.
  • the raw materials described above may be added batchwise or continuously in a suitable manner to the culture during the culturing process, but are not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in a suitable manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without injecting gas to maintain anaerobic and unaerobic conditions.
  • the temperature of the culture is usually 27 ° C to 37 ° C, specifically 30 ° C to 35 ° C. The incubation period may continue until the desired amount of useful material is obtained, specifically 10 to 100 hours.
  • L-amino acids may be released into the culture medium or may be contained in microorganisms.
  • the method for producing L-amino acid of the present application is well known in the art for recovering L-amino acid from the cultured microorganism or culture medium. Filtration, anion exchange chromatography, crystallization, HPLC, and the like may be used for the L-amino acid recovery method, but are not limited to these examples.
  • a vector library for primary cross-insertion in a chromosome was prepared by the following method.
  • AceE gene variants randomly introduced with base substitutions were subjected to Error-prone PCR for the aceE gene (SEQ ID NO: 2) encoding E1p (SEQ ID NO: 1) derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13032. 2852 bp) were obtained.
  • Error-prone PCR was performed using a GenemorphII Random Mutagenesis Kit (Stratagene), and primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 4) were used as Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genomic DNA as a template.
  • Primer 1 (SEQ ID NO: 3): 5'-TGGGA CCGGG AAACC GGG-3 '
  • Primer 2 (SEQ ID NO: 4): 5'-GATTT ATCTG TCCCT TGA-3 '
  • the amplified gene fragment was linked to the pCR2.1-TOPO vector (hereinafter 'pCR2.1') using the pCR2.1-TOPO TA cloning kit (Invitrogen), and transformed into E. coli DH5 ⁇ to give kanamycin (25 mg / L). Plated in the included LB solid medium. After selecting 20 transformed colonies, plasmids were obtained, and the polynucleotide sequences were analyzed. As a result, mutations were introduced at different positions at 1.4 mutations / kb frequency. About 20,000 transformed E. coli colonies were taken and the plasmids extracted, which was named pCR2.1-aceE (mt) library.
  • mt pCR2.1-aceE
  • a plasmid having aceE gene of wild type for use as a control was prepared .
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genomic DNA was PCR using the primers 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 4) under the same conditions as the template.
  • PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase (Stratagene) was used as the polymerase.
  • the prepared plasmid was named pCR2.1-aceE (WT).
  • KCCM11016P The microorganism was published as KFCC10881, re-deposited by the International Depository under the Treaty of Budapest, and assigned the accession number as KCCM11016P, Korea Registered Patent No. 10-0159812) pCR2.1-aceE as a parent strain (mt) aceE- deficient strains were introduced to introduce the library.
  • Primer 3 (SEQ ID NO: 5) and Primer 4 (SEQ ID NO: 6), Primer 5 (SEQ ID NO: 7), and Primer 6 (SEQ ID NO: 6) were prepared using the chromosome of wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template to construct aceE deletion vector. PCR was performed using No. 8).
  • Primer 3 (SEQ ID NO: 5): 5'-GCAGG TCGAC TCTAG ATGCG ATTCG CGTCA AACGT G-3 '
  • Primer 4 (SEQ ID NO: 6): 5'-GTCCC TTGAG GTGAT GTGAA TCCAT CCACT-3 '
  • Primer 5 (SEQ ID NO: 7): 5'-AGTGG ATGGA TTCAC ATCAC CTCAA GGGAC-3 '
  • Primer 6 (SEQ ID NO: 8): 5'-CCGGG GATCC TCTAG ACGAA GCGCC GTGAG CAATT C-3 '
  • PCR conditions were modified for 5 minutes at 95 °C, 95 °C 30 seconds denaturation, 55 °C 30 seconds annealing, 72 °C 30 seconds polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out at 72 °C 7 minutes.
  • PCR was performed using primers 3 (SEQ ID NO: 5) and primer 6 (SEQ ID NO: 8) having the amplified SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 as templates. PCR conditions were modified for 5 minutes at 95 °C, 95 °C 30 seconds denaturation, 55 °C 30 seconds annealing, 72 °C 60 seconds polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out at 72 °C 7 minutes.
  • aceE SEQ ID NO: 11 (hereinafter, referred to as ⁇ aceE ) of 1029 bp linked to the 5 ′ and 3 ′ ends of the gene was amplified.
  • the non-replicable pDZ vector (Korean Patent No. 10-0924065) and the amplified ⁇ aceE fragment in Corynebacterium glutamicum were treated with restriction enzyme XbaI, and then linked using DNA conjugated enzyme, followed by cloning. Thereby obtaining a plasmid, which was named pDZ- ⁇ aceE .
  • pDZ- ⁇ aceE was transformed into L-lysine-producing strain Corynebacterium glutamicum KCCM11016P by electropulse method (Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999) 52: 541-545), followed by kanamycin 25mg. Transformed strains were obtained in selective medium containing / L. A strain in which the aceE gene was inactivated by the DNA fragment ⁇ aceE inserted into the genome by the second cross-over was obtained and named as KCCM11016P ⁇ aceE .
  • the prepared pCR2.1-aceE (mt) library was transformed by homologous chromosomal recombination using the prepared KCCM11016P ⁇ aceE strain as a parent strain and plated on a flat plate containing kanamycin (25 mg / L). Colonies were obtained and each colony was named from KCCM11016P ⁇ aceE /pCR2.1-aceE(mt)-1 to KCCM11016P / pCR2.1-aceE (mt) -10000.
  • Glucose 10g Peptone 10g, Beef extract 5g, Yeast extract 5g, Brain Heart Infusion 18.5g, NaCl 2.5g, Urea 2g, Sorbitiol 91g, Agar 20g (based on 1 liter of distilled water)
  • the 10,000 colonies secured were inoculated in 300 ⁇ L of selective medium and incubated for 24 hours at 32 ° C. and 1000 rpm in 96-deep well plates.
  • the ninhydrin method was used to analyze the production of L-lysine produced in the culture (J. Biol. Chem. 1948. 176: 367-388).
  • the selected 256 strains were repeatedly subjected to the ninhydrin reaction in the same manner as above, and the top 53 strains with improved L-lysine production capacity were selected compared to the KCCM11016P ⁇ aceE / pCR2.1-aceE (WT) strains.
  • Each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium and shaken at 200 rpm for 20 hours at 30 ° C.
  • a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of lysine production medium was inoculated with 1 ml of the seed culture and shaken at 200 rpm for 72 hours at 30 ° C.
  • the concentration of L-lysine was analyzed using HPLC.
  • Glucose 20g Peptone 10g, Yeast extract 5g, Urea 1.5g, KH 2 PO 4 4 g, K 2 HPO 4 8 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, biotin 100 ⁇ g, thiamine HCl 1000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2000 ⁇ g, nicotinamide 2000 ⁇ g (based on 1 liter of distilled water)
  • glucose 100 g of glucose, (NH 4 ) 2 SO 4 40g, Soy Protein 2.5g, Corn Steep Solids 5g, Urea 3g, KH 2 PO 4 1 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, biotin 100 ⁇ g, thiamine hydrochloride 1000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2000 ⁇ g, nicotinamide 3000 ⁇ g, CaCO 3 30 g (based on 1 liter of distilled water).
  • Table 1 The selected 10 kinds KCCM11016P ⁇ aceE / pCR2 .1- aceE ( mt) L- lysine-producing concentration Strain L-lysine (g / L) Batch 1 Batch 2 Batch 3 Average Control KCCM11016P ⁇ aceE /pCR2.1-aceE(WT) 42.1 41.9 41.7 41.9 One KCCM11016P ⁇ aceE /pCR2.1-aceE(mt)-1235 45.1 46.2 45.8 45.7 2 KCCM11016P ⁇ aceE /pCR2.1-aceE(mt)-1542 45.6 46.1 44.9 45.5 3 KCCM11016P ⁇ aceE /pCR2.1-aceE(mt)-3152 46.1 45.7 46.0 45.9 4 KCCM11016P ⁇ aceE /pCR2.1-aceE(mt)-5013 44.5 45.1 45.7 45.1 5 KCCM11016P ⁇ aceE /pCR2.1-aceE
  • L-lysine yield of 10 selected strains increased up to 22% compared to the control KCCM11016P ⁇ aceE /pCR2.1-aceE (WT) strain.
  • the polynucleotide sequence of the aceE variant was analyzed to identify the mutations introduced into E1p of the 10 strains selected in Example 4. PCR was performed using Primer 1 (SEQ ID NO: 3) and Primer 2 (SEQ ID NO: 4) to determine the polynucleotide sequence.
  • Primer 1 (SEQ ID NO: 3): 5'-TGGGA CCGGG AAACC GGG-3 '
  • Primer 2 (SEQ ID NO: 4): 5'-GATTT ATCTG TCCCT TGA-3 '
  • the polynucleotide sequence of the mutated aceE gene was confirmed by polynucleotide sequence analysis of each of the obtained variant aceE gene fragments and compared with the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, thereby confirming the amino acid sequence of variant E1p.
  • Variation information of the E1p amino acid sequence of the selected strain is shown in Table 2.
  • Example 5 In order to confirm the effect of applying the E1p mutation identified in Example 5 was prepared a vector that can be introduced on the chromosome.
  • primer 9 SEQ ID NO: 12
  • primer 10 SEQ ID NO: 13
  • PCR was performed on each of the selected ten chromosomes as a template to amplify 10 mutant aceE (mt) gene fragments. PCR conditions were modified for 5 minutes at 94 °C, 94 °C 30 seconds denaturation, 56 °C 30 seconds annealing, 72 °C 2 minutes polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out at 72 °C 7 minutes.
  • Primer 9 (SEQ ID NO: 12): 5'-AATCT AGATG GGACC GGGAA ACCGG G-3 '
  • Primer 10 (SEQ ID NO: 13): 5'-AATCT AGAGA TTTAT CTGTC CCTTG A-3 '
  • Plasmids were obtained using a commonly known plasmid extraction method, and pDZ-E1p (Q432E) and pDZ, respectively, according to the mutations inserted into E1p of the plasmid.
  • E190V pDZ-E1p
  • L438P pDZ-E1p
  • Q195H pDZ-E1p
  • P199S pDZ-E1p
  • K435A pDZ-E1p
  • Q432A pDZ-E1p
  • Y418H pDZ- It was named E1p (N428A), pDZ-E1p (Y201A).
  • Example 7 KCCM11016P origin E1p Mutant introduction strain production and L- Lysine Productivity compare
  • Example 6 Using the 10 new vector for introducing a variant prepared in Example 6 was transformed L-lysine producing strain Corynebacterium glutamicum KCCM11016P through two-step homologous chromosome recombination. Afterwards, strains in which E1p mutations were introduced on the chromosome were selected through polynucleotide sequencing analysis.
  • KCCM11016P E1p (Q195H), KCCM11016P :: E1p (P199S), KCCM11016P :: E1p (K435A), KCCM11016P :: E1p (Q432A), KCCM11016P :: E1p (Y418H), KCCM11016P: 428E16 :: E1p (Y201A).
  • Ten new mutant strains (KCCM11016P :: E1p (Q432E), KCCM11016P :: E1p (E190V), KCCM11016P :: E1p (L438P), KCCM11016P :: E1p (Q195H), KCCM11016P :: E1p (P199S), K: C1110 K435A), KCCM11016P :: E1p (Q432A), KCCM11016P :: E1p (Y418H), KCCM11016P :: E1p (Y201A), KCCM11016P :: E1p (N428A)) showed a slight decrease in sugar consumption and lysine production compared to the parent strain. Up to 10% increase.
  • KCCM11016P E1p (N428A), which is a representative strain among the L-lysine-producing strains, was named Corynebacterium glutamicum "CA01-2289", and the Budapest Treaty on October 23, 2014 was given. He was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM), an international depository organization, and was assigned accession number KCCM11590P.
  • KCCM Korea Microorganism Conservation Center
  • E1p variants E1p (Q432E) (SEQ ID NO: 14), E1p (E190V) (SEQ ID NO: 15), E1p (L438P) (SEQ ID NO: 16), E1p (Q195H) (SEQ ID NO: 17), E1p (P199S) (SEQ ID NO: 18), E1p (K435A) (SEQ ID NO: 19), E1p (Q432A) (SEQ ID NO: 20), E1p (Y418H) (SEQ ID NO: 21), E1p (Y201A) (SEQ ID NO: 22), E1p (N428A) (SEQ ID NO: 23) was divided into two groups of E1p proteins (190 amino acid residues to 201 amino acid residues, and 418 amino acid residues to 438 amino acid residues).
  • Example 8 E1p Pyruvate for Mutant Dehydrogenase Composite ( Pyruvate Dehydrogenase Complex (PDHC) activity measurement
  • KCCM11016P, KCCM11016P ⁇ aceE and 10 selected strains (KCCM11016P :: E1p (Q432E), KCCM11016P :: E1p (E190V), KCCM11016P :: E1p (L438P), KCCM11016P :: E1p (Q195p16): KCCM11016P (P199S), KCCM11016P :: E1p (K435A), KCCM11016P :: E1p (Q432A), KCCM11016P :: E1p (Y418H), KCCM11016P :: E1p (Y201A), KCCM11016P :: E1p (N428A) specified in Example 4 After inoculation into 25 mL of medium, the
  • the final suspension was suspended in 2 mL of buffer solution, and the cell suspension was physically crushed for 10 minutes by general glass beads vortexing, and then the supernatant was recovered by two centrifugations (13,000 rpm, 4 ° C., 30 minutes) to measure PDHC enzyme activity.
  • KCCM11016P 100 KCCM11016P ⁇ aceE 0 KCCM11016P :: E1p (Q432E) 39 KCCM11016P :: E1p (E190V) 56 KCCM11016P :: E1p (L438P) 53 KCCM11016P :: E1p (Q195H) 55 KCCM11016P :: E1p (P199S) 51 KCCM11016P :: E1p (K435A) 53 KCCM11016P :: E1p (Q432A) 42 KCCM11016P :: E1p (Y418H) 36 KCCM11016P :: E1p (Y201A) 46 KCCM11016P :: E1p (N428A) 35
  • PDHC activity of the new mutant transgenic strains showed an activity of 35% to 56% relative to the parent strain.
  • AceE-deficient strain KCCM11016P ⁇ aceE and 10 strains (KCCM11016P :: E1p (Q432E), KCCM11016P :: E1p (E190V), KCCM11016P :: E1p (L438P), KCCM11016P :: E1p (Q195H) prepared in Example 2 KCCM11016P :: E1p (P199S), KCCM11016P :: E1p (K435A), KCCM11016P :: E1p (Q432A), KCCM11016P :: E1p (Y418H), KCCM11016P :: E1p (Y201A), KCCM11016P :: E1p (N
  • the culture was carried out in the same manner as in Example 4 using the following medium containing ammonium acetate. The concentration of L-lysine was analyzed by HPLC, and the residual sugar concentration was measured 18 hours after the start of culture
  • Lysine production medium with ammonium acetate pH 7.0
  • KCCM11016P ⁇ aceE strain increased 9.6% lysine production compared to the parent strain, but the growth rate was significantly slowed.
  • the mutant introduced strains showed an increase in lysine yield and a rate of sugar consumption similar to those without the addition of ammonium acetate.
  • the aceE mutant introduced strain of the present invention is able to produce lysine at high yield without significant difference in growth rate.
  • Example 10 KFCC10750 origin E1p Mutant introduction strain production and L- Lysine Productivity compare
  • Corynebacterium glutamicum KFCC10750 (L-lysine producing strain using the same method as in Example 7 to confirm the effect of introducing 10 new mutations in other strains belonging to Corynebacterium glutamicum (The The microorganisms were published as KFCC10750 and re-established by the International Depository under the Budapest Treaty, and were given KCCM11347P, which produced strains in which 10 E1p variants were introduced in Korean Patent Registration No. 10-0073610), and KFCC10750 :: E1p.
  • KFCC10750 E1p (E190V), KFCC10750 :: E1p (L438P), KFCC10750 :: E1p (Q195H), KFCC10750 :: E1p (P199S), KFCC10750 :: E1p (K435A), KFCC10750 :: E1p ), KFCC10750 :: E1p (Y418H), KFCC10750 :: E1p (Y201A), and KFCC10750 :: E1p (N428A). Eleven strains containing the KFCC10750 strain as a control were cultured in the same manner as in Example 4, and the concentration of L-lysine was analyzed therefrom (Table 7).
  • Example 11 KCCM10770P origin E1p Mutant introduction strain production and L- Lysine Productivity compare
  • Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al., Genome Biology 2012), L-lysine producing strain in the same manner as in Example 7, to confirm the effect in other strains belonging to Corynebacterium glutamicum , 13: R40) to prepare a strain introduced E1p mutation, CJ3P :: E1p (Q432E), CJ3P :: E1p (E190V), CJ3P :: E1p (L438P), CJ3P :: E1p (Q195H), CJ3P: : E1p (P199S), CJ3P :: E1p (K435A), CJ3P :: E1p (Q432A), CJ3P :: E1p (Y418H), CJ3P :: E1p (Y201A), CJ3P :: E1p (N428A). Cultured in the same manner as in Example 4, from which the concentration of L-ly
  • Example 13 KCCM11201P origin E1p Mutant-introduced strain production and L-valine Productivity compare
  • KCCM11201P :: E1p (Q432E), KCCM11201P :: E1p (E190V), KCCM11201P :: E1p (L438P), KCCM11201P :: E1p (Q195H) , KCCM11201P :: E1p (P199S), KCCM11201P :: E1p (K435A), KCCM11201P :: E1p (Q432A), KCCM11201P :: E1p (Y418H), KCCM11201P :: E1p (Y201A), KCCM11201P (: A) It was.
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of L-valine production medium specified below, followed by incubation at 200 ° C. for 72 hours at 200 rpm.
  • the concentration of L-valine was analyzed using HPLC. TABLE 10.
  • glucose 50 g of glucose, (NH 4 ) 2 SO 4 20g, Corn Steep Liquid 20g, KH 2 PO 4 1 g, 0.5 g MgSO 4 7H 2 O, 200 ⁇ g biotin, 30 g CaCO 3 (based on 1 liter of distilled water).
  • Corynebacter was tested in the same manner as in Example 7 above to reaffirm valine production capacity for four of the E1p variants selected in Example 7, which showed a high L-valine yield increasing effect in Example 13.
  • a strain in which E1p mutations were introduced into Leeum glutamicum ATCC13032 was prepared and named as ATCC13032 :: E1p (E190V), ATCC13032 :: E1p (L438P), ATCC13032 :: E1p (Y418H), ATCC13032 :: E1p (N428A). .
  • each strain was transformed with L-valine biosynthesis overexpression vector pECCG117-DvalS (Korean Patent Publication No. 10-2014-0111421) by electroporation and then kanamycin (kanamycin).
  • Transgenic strains were obtained from a selection medium containing 25 mg / L, and ATCC13032 :: E1p (E190V) _DvalS, ATCC13032 :: E1p (L438P) _DvalS, ATCC13032 :: E1p (Y418H) _DvalS, ATCC13032 :: E1p (N428A) Named _DvalS.
  • the strain was cultured in the same manner as in Example 13, from which the concentration of L-valine was analyzed (Table 11).

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Abstract

본 발명은 신규한 피루브산 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 포함하는, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

피루브산 디하이드로게나아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법
본원은 신규한 피루브산 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 포함하는, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
PDHC(pyruvate dehydrogenase multienzyme complex)는 해당과정에서 생성되는 피루브산(pyruvate)을 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로 전환하는 역할을 수행하는 효소로서, TCA 경로로의 탄소유입을 결정하는 중요한 효소이다. PDHC는 피루브산 디하이드로게나아제(Pyruvate dehydrogenase, E1p), 다이하이드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라아제(Dihydrolipoamide acetyltransferase, E2p), 다이하이드로리포아미드 디하이드로게나아제(dihydrolipoamide dehydrogenase, E3p)로 구성된다. 그 중, E1p 효소는 aceE 유전자에 의해 암호화된다. 상기 aceE 유전자 결손 및 약화에 따른 L-라이신 생산 균주에서의 L-라이신 생산 변화에 대해서는 알려진 바 있으나(Blombach et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 76:615, 2007; Buchholz J et al., Appl Environ Microbiol., 79(18):5566-75, 2013), L-아미노산 생산능을 높일 수 있는 E1p 변이체에 대해서는 보고된 바 없다.
본 발명자들은 고농도의 L-아미노산 생산에 사용할 수 있는 E1p 변이체 및 이를 이용한 미생물을 개발하고자 예의 노력한 결과, E1p 변이체를 개발하였고, 상기 변이체를 포함하는 미생물로부터 고수율로 L-아미노산을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본원의 하나의 목적은 신규 피루브산 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase) 변이체를 제공하는 것이다.
본원의 다른 목적은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 포함하는, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 (a) 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 포함하는, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 L-아미노산을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 미생물 또는 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본원의 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 통해 당해 활성이 약화된 효소를 얻을 수 있다. 이와 같이 활성이 약화된 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 포함하는 균주를 이용하면, 야생형 피루브산 디하이드로게나아제 단백질을 포함하는 L-아미노산 생산 균주에 비하여 L-아미노산을 높은 효율로 생산할 수 있다. 또한, 상기 균주를 이용하는 경우에는 피루브산 디하이드로게나아제 결손 균주와 달리, 상기 균주의 성장을 거의 저해하지 않으면서도 L-아미노산의 효과적인 생산을 가져올 수 있다. 예를 들어, 라이신은 동물사료의 필수 아미노산으로 산업적으로 대량 생산이 요구되는 바, 본원과 같이 높은 효율로 L-라이신을 생산하면 사료 제조 비용의 절감 효과도 얻을 수 있다.
본원을 구현하는 하나의 양태는, 서열번호 1에서 190번 내지 205번 아미노산 부위 또는 415번 내지 440번 아미노산 부위에 하나 이상의 아미노산 변이를 가지는, 피루브산 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase) 변이체이다.
본원에서 용어, "피루브산 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)"는 PDHC(pyruvate dehydrogenase multienzyme complex)를 구성하는 효소 중 하나로, 피루브산의 아세틸-CoA로의 전환에 관여한다. 본원에서 상기 피루브산 디하이드로게나아제는 당해 활성을 가지는 한 특별히 제한되지 않으나, 코리네박테리움 속 미생물, 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 피루브산 디하이드로게나아제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 피루브산 디하이드로게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 75%이상, 구체적으로는 80%이상, 더욱 구체적으로는 85%이상, 더더욱 구체적으로는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 E1p 단백질은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 aceE 유전자에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본원의 범주에 포함됨은 자명하다. 본원에서 피루브산 디하이드로게나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 본원의 범주에 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 75%이상, 구체적으로는 80%이상, 더욱 구체적으로는 85%이상, 더더욱 구체적으로는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 또한, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
본원에 따른 피루브산 디하이드로게나아제 변이체는 서열번호 1에서 190번 내지 205번 아미노산 부위 또는 415번 내지 440번 아미노산 부위에 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상의 아미노산 변이를 가질 수 있다.
여기서, 상기 본원에 따른 피루브산 디하이드로게나아제 변이체는 서열번호 1에서 190번 내지 205번 아미노산 부위에서 1 이상, 2 이상, 3 이상 또는 4 이상의 아미노산 변이를 가지는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1의 190번 내지 205번 아미노산 부위에서 변이되는 아미노산은 190번, 195번, 199번 및 201번 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 1의 190번 내지 205번 아미노산 부위에서의 아미노산 변이는, 상기 190번 내지 205번 아미노산 부위의 하나 이상의 아미노산이 다른 종류의 아미노산으로 치환되는 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 190번, 195번, 199번 및 201번 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 종류의 아미노산으로 치환되는 것일 수 있으며, 더 구체적으로는 190번 글루탐산에서 발린으로의 치환(E190V), 195번 글루타민에서 히스티딘으로의 치환(Q195H), 199번 프롤린에서 세린으로의 치환(P199S) 및 201번 타이로신에서 알라닌으로의 치환(Y201A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 본원에 따른 피루브산 디하이드로게나아제 변이체는 415번 내지 440번 부위에 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6 이상의 아미노산 변이를 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1의 415번 내지 440번 아미노산 부위에서 변이되는 아미노산은 418번, 428번, 432번, 435번 및 438번 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 415번 내지 440번 아미노산 부위에서의 아미노산 변이는 상기 415번 내지 440번 아미노산 부위 중 하나 이상의 아미노산이 다른 종류의 아미노산으로 치환되는 것일 수 있으며, 구체적으로는 418번, 428번, 432번, 435번 및 438번 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 종류의 아미노산으로 치환되는 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 418번 타이로신에서 히스티딘으로의 치환(Y418H), 428번 아스파라긴에서 알라닌으로의 치환(N428A), 432번 글루타민에서 글루탐산으로의 치환(Q432E), 432번 글루타민에서 알라닌으로의 치환(Q432A), 435번 라이신에서 알라닌으로의 치환(K435A) 및 438번 류신에서 프롤린으로의 치환(L438P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체는 서열번호 14 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체는 서열번호 14 내지 33으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열과 75% 이상, 구체적으로는 80%이상, 더욱 구체적으로는 85%이상, 더더욱 구체적으로는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 변이체로서, 실질적으로 야생형에 비하여 피루브산 디하이드로게나아제 활성이 저해된 것이라면 제한없이 포함될 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 14 내지 33으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본원의 범위에 포함됨은 자명하다.
본원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등 일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본원의 또 하나의 양태는 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 구체적으로, 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14 내지 33으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드라면 본원의 범주에 포함될 수 있다. 이뿐만 아니라, 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 75%이상, 구체적으로는 80%이상, 더욱 구체적으로는 85%이상, 더더욱 구체적으로는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체가 공유결합에 의하여 길게 사슬 모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체로, 일반적으로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미하며 본원에서는 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일한 아미노산 서열을 코딩하는, 다양한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 또한, 숙주세포의 종류에 따라 발현을 최적화하기 위하여 코돈-최적화된 서열을 가질 수 있다.
본원의 구체적인 또 하나의 양태는 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 포함하는, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물이다.
구체적으로 상기 미생물은 돌연변이에 의해 상기 피루브산 디하이드로게나제 변이체를 포함하거나, 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.
본원에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본원에 있어서 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 재조합 벡터의 제작에 사용된 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ (한국 등록특허 제10-0924065호; 본원 발명에서 전체로서 인용되어 포함된다.)가 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 용어, "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다.
상기 유전자는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인, 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물은 당해 피루브산 디하이드로게나아제 변이체 활성을 가지는 단백질을 포함하거나 당해 당백질이 발현되도록 형질전환이 된다면 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로는, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이고, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본원의 피루브산 디하이드로게나아제 변이체 단백질이 L-아미노산 생산능을 갖는 미생물에 포함되는 경우, 야생형 피루브산 디하이드로게나아제 단백질을 포함하는 미생물에 비하여 세포의 성장을 크게 저해하지 않고 L-아미노산의 생산능을 향상시킬 수 있다.
본원에서 용어, "L-아미노산"은 각종 탄소원으로부터 피루브산(Pyruvate)을 거쳐 생산될 수 있는 모든 L-아미노산을 포함하며, 구체적으로는 생합성 경로 상에 파이루베이트를 아세틸코에이(acetyl CoA)로 전환하는 단계를 거치지 않는 L-아미노산일 수 있다. 보다 구체적으로는 L-라이신, L-쓰레오닌, L-메티오닌, L-이소루신, L-발린, L-류신, 또는 L-알라닌이 포함되며, 보다 더욱 구체적으로는 L-라이신 또는 L-발린일 수 있다.
상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 L-아미노산을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주를 모두 포함하며, 그 예로 적용될 수 있는 미생물의 종류는 상기 기술한 바와 같다. 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 L-아미노산 생산능을 갖는다면 미생물의 종류에 대해 제한없이 포함하며, 야생형 균주 및 재조합 균주의 형태를 모두 포함한다.
예를 들어, L-라이신 생산능을 가질 수 있는 코리네박테리움 속 미생물은 L-라이신 유사체에 내성을 갖는 변이주가 되거나 L-라이신 생합성 관련 단백질의 활성이 비변이 균주에 비하여 강화되도록 변형된 것일 수 있다. 구체적으로, L-라이신 생합성 관련 유전자 1종 이상의 발현을 향상시키는 경우, 이러한 발현 향상은 유전자 증폭, 프로모터 또는 개시코돈과 같은 서열의 교체 혹은 변형, 발현의 향상을 위한 변이의 도입 등으로 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, L-라이신 생합성 관련 유전자의 예로서는, L-라이신 생합성 경로 상에 위치하는 유전자를 들 수 있으며, 구체적으로 디하이드로디피콜린산 신타제 유전자(dapA), 아스파르토 키나제 유전자(lysC), 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자(dapB), 디아미노피멜산 데카르복실라제 유전자(lysA), 디아미노피멜산 데하이드로게나제 유전자(ddh), 포스포에놀피루브산 카르복실라제 유전자(ppc), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), 아스파르타제 유전자(aspB), 파이루베이트 카르복실라제(Pyc)를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 펜토스 포스페이트 경로 상에 존재하는 트랜스케토라제(tkt) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
한편, 상기 L-라이신 생산능을 가질 수 있는 코리네박테리움 속 미생물은 L-라이신 생산과 관련된 당업계에 공지된 변이를 포함하도록 함으로써 L-라이신 생산능을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
L-쓰레오닌 생산능을 갖는 미생물은, 특별히 이에 제한되지는 않으나, 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 라이신 유사체에 대한 내성, 이소루이신 유사체에 대한 내성 또는/및 메티오닌 유사체에 대한 내성을 갖는 미생물일 수 있다. 메티오닌 유사체는 예를 들면, D,L- 에티오닌, 노르루이신, α-메틸메티오닌, 및 L-메티오닌-D,L-술폭시민으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있고, 쓰레오닌 유사체는 α-아미노-β-히드록시 발레르산 및 D,L-쓰레오닌 히드록사메이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있으며, 라이신 유사체는 S-(2- 아미노에틸)-L-시스테인 및 δ-메틸-L-라이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다. 또한, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 미생물은 L-쓰레오닌 생합성 중간체인 옥살로아세테이트(OAA)를 포스포에놀파이루베이트(PEP)로 전환하는데 관여하는 PckA 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화된 미생물, 또는 옥살로아세테이트로부터 아스파테이트로 전환하는 lysC 유전자를 억제하는 TyrR가 약화 또는 불활성화된 미생물, 또는 포도당 유입에 관여하는 galP 유전자의 발현을 억제하는 GalR이 약화 또는 불활성화된 미생물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
L-이소루신 생산능을 갖는 미생물은, L-이소루신 또는 이의 유도체에 대해 내성을 가진 미생물이거나 L-이소루신 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해가 해제되도록 유전자 조작된 것일 수 있다. 상기 L-이소루신의 유도체의 예로는 4-티아이소루신(4-thiaisoleucine, thiaile) 또는 이소루신-하이드록사메이트(isoleucine-hydroxamate, ileHx)을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
L-발린 생산능을 갖는 미생물은, L-발린 또는 이의 유도체에 내성을 가지는 미생물이거나 L-발린의 생합성 경로 상의 효소가 L-발린 또는 이의 유도체에 의한 피드백이 해제되도록 유전자 조작된 미생물일 수 있다. 그 예로 L-발린에 대한 피드백 저해가 해제된, 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하는 미생물을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 미생물은 L-발린 오페론의 발현이 강화되도록 변이된 것일 수 있으며, 그 예로 L-발린 오페론의 조절 부위 내의 리더펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 전체 또는 일부가 결손되어 L-발린 오페린의 발현이 강화(대한민국 공개특허 제10-2014-0111421호; 명세서 전체가 참고자료로서 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않음) 된 것일 수 있다.
본원의 구체적인 또 하나의 양태는 (a) 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 포함하는 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 L-아미노산을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 미생물 또는 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법이다.
상기 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 등에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 구체적인 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 당업자의 일반적인 지식 또는 종래에 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있으며, 이에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 구체적으로는 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 및 Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]에 상세히 기술되어 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있으며, 구체적으로는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 상기 배지에서 사용될 수 있는 탄소원으로는 포도당, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄 등이 포함될 수 있고, 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염 등이 포함될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 구체적으로는 30℃ 내지 35℃이다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속 될 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100시간일 수 있다. L-아미노산은 배양 배지 중으로 배출되거나, 미생물 중에 포함되어 있을 수 있다.
또한, 본원의 L-아미노산을 생산하는 방법에는 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 L-아미노산 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인공돌연변이법을 이용한 E1p 변이 라이브러리 제작
본 실시예에서는 변이형 E1p를 획득하기 위하여 하기의 방법으로 염색체 내 1차 교차삽입용 벡터 라이브러리를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 E1p(서열번호 1)를 암호화하는 aceE 유전자(서열번호 2)를 대상으로 Error-prone PCR 법을 수행하여 염기치환변이가 무작위적으로 도입된 aceE 유전자 변이체(2852bp)들을 획득하였다. Error-prone PCR은 GenemorphII Random Mutagenesis Kit(Stratagene)을 사용하여 수행하였으며, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 사용하였다.
프라이머 1(서열번호 3): 5'-TGGGA CCGGG AAACC GGG-3'
프라이머 2(서열번호 4): 5'-GATTT ATCTG TCCCT TGA-3'
증폭된 유전자 단편 내에 변이가 1kb당 0 내지 3.5개가 도입되도록 하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다.
증폭된 유전자 단편을 pCR2.1-TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(이하 'pCR2.1')에 연결하였고, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신(25mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 폴리뉴클레오티드 서열을 분석한 결과 1.4 mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 20,000개의 형질전환된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 pCR2.1-aceE(mt) 라이브러리로 명명하였다.
또한, 대조군으로 사용하기 위한 야생형의 aceE 유전자를 갖는 플라스미드를 제작하였다. 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 상기와 같은 조건으로 PCR하였다. 중합효소는 PfuUltra High-Fidelity DNA 중합효소(Stratagene)를 사용하였다. 제작된 플라스미드를 pCR2.1-aceE(WT)으로 명명하였다.
실시예 2: aceE 결손 균주 제작
KCCM11016P(상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11016P로 기탁번호를 부여받았음, 한국 등록특허 제10-0159812호) 균주를 모균주로 하여 pCR2.1-aceE(mt) 라이브러리를 도입하기 위한 aceE 결손 균주를 제작하였다.
aceE 결손 벡터를 제작하기 위하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 프라이머 3(서열번호 5) 및 프라이머 4(서열번호 6), 프라이머 5(서열번호 7) 및 프라이머 6(서열번호 8)을 이용하여 PCR을 수행하였다.
프라이머 3(서열번호 5): 5'-GCAGG TCGAC TCTAG ATGCG ATTCG CGTCA AACGT G-3'
프라이머 4(서열번호 6): 5'-GTCCC TTGAG GTGAT GTGAA TCCAT CCACT-3'
프라이머 5(서열번호 7): 5'-AGTGG ATGGA TTCAC ATCAC CTCAA GGGAC-3'
프라이머 6(서열번호 8): 5'-CCGGG GATCC TCTAG ACGAA GCGCC GTGAG CAATT C-3'
PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과 aceE 유전자 5'말단과 3'말단을 각각 포함하는 521bp의 서열번호 9와 538bp의 서열번호 10을 수득하였다.
증폭된 서열번호 9와 서열번호 10을 주형으로 하여, 프라이머 3(서열번호 5) 및 프라이머 6(서열번호 8)으로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, aceE 유전자의 5' 말단과 3' 말단이 연결된 1029bp의 서열번호 11(이하, △aceE)가 증폭되었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(한국 등록특허 제10-0924065호)와 증폭된 △aceE 단편을 제한효소 XbaⅠ으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-△aceE라 명명하였다.
pDZ-△aceE를 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545)으로 각각 형질전환한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 게놈상에 삽입된 DNA 단편 △aceE에 의하여 aceE 유전자가 불활성화된 균주를 획득하였고, KCCM11016P△aceE 로 명명하였다.
실시예 3: E1p 인공돌연변이 라이브러리 제작 및 L- 라이신 생산능 증가 균주 선별
상기 제작된 KCCM11016P△aceE 균주를 모균주로 하여 상기 제작된 pCR2.1-aceE(mt) 라이브러리를 상동염색체 재조합에 의해 형질전환하고 카나마이신(25mg/L)이 포함된 복합평판배지에 도말하여 약 10,000개의 콜로니를 확보하였으며, 각 콜로니를 KCCM11016P△aceE /pCR2.1- aceE(mt)-1부터 KCCM11016P/pCR2.1- aceE(mt)-10000까지로 명명하였다.
또한, 상기 제작된 pCR2.1- aceE(WT) 벡터를 KCCM11016P△aceE 균주에 형질전환하여 대조군 균주를 제작하였으며, KCCM11016P△aceE / pCR2.1- aceE(WT)으로 명명하였다.
<복합평판배지 (pH 7.0)>
포도당 10g, Peptone 10g, Beef extract 5g, Yeast extract 5g, Brain Heart Infusion 18.5g, NaCl 2.5g, Urea 2g, Sorbitiol 91g, Agar 20g(증류수 1 리터 기준)
확보된 10,000개의 콜로니를 각각 300μL의 선별배지에 접종하여 96-딥 웰 플레이트에서 32℃, 1000rpm으로 약 24시간 동안 배양하였다. 배양액에 생산된 L-라이신의 생산량을 분석하기 위하여 닌하이드린 방법을 이용하였다(J. Biol. Chem. 1948. 176:367-388). 배양이 완료된 후 배양 상층액 10μl 와 닌하드린 반응용액 190μl 를 65℃에서 30분간 반응시킨 후 파장 570 nm에서 spectrophotometer로 흡광도를 측정하고 대조구 KCCM11016P△aceE / pCR2.1-aceE(WT) 균주의 흡광도와 비교해 10% 이상 증가된 흡광도를 보이는 변이 균주 256개의 콜로니를 선별하였다. 그 외 콜로니들은 대조구 대비 유사 또는 감소한 흡광도를 나타내었다.
<선별배지 (pH 8.0)>
포도당 10g, (NH4)2SO4 5.5g, MgSO4·7H2O 1.2g, KH2PO4 0.8g, K2HPO4 16.4g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 2000㎍(증류수 1 리터 기준)
선별된 256개의 균주는 상기와 같은 방법으로 닌하이드린 반응을 반복수행하였으며, KCCM11016P△aceE / pCR2.1-aceE(WT) 균주 대비 L-라이신 생산능이 향상된 균주 상위 53종을 선별하였다.
실시예 4: E1p 인공돌연변이 라이브러리 선별주의 L-라이신 생산능 확인
상기 실시예 3에서 선별한 53종 균주들의 L-라이신 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 성분을 분석하였다.
종 배지 25㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200rpm으로 진탕 배양하였다. 라이신 생산 배지 24㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 1㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 L-라이신의 농도를 분석하였다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20g, Peptone 10g, Yeast extract 5g, Urea 1.5g, KH2PO4 4g, K2HPO4 8g, MgSO4·7H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 2000㎍(증류수 1 리터 기준)
<라이신 생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100g, (NH4)2SO4 40g, 대두 단백질 2.5g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5g, Urea 3g, KH2PO4 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 3000㎍, CaCO3 30g (증류수 1리터 기준).
53종의 균주 중 L-라이신 농도 상위 10개의 균주를 선별하여 상기 배양 및 분석을 반복수행 하였으며, 분석된 L-라이신의 농도는 [표 1]과 같다.
표 1
선별된 10종 KCCM11016P △ aceE / pCR2 .1- aceE (mt) L- 라이신 생산 농도
균주 L-라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(WT) 42.1 41.9 41.7 41.9
1 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-1235 45.1 46.2 45.8 45.7
2 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-1542 45.6 46.1 44.9 45.5
3 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-3152 46.1 45.7 46.0 45.9
4 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-5013 44.5 45.1 45.7 45.1
5 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-5312 45.9 44.9 46.1 45.6
6 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-6001 44.8 45.7 45.4 45.3
7 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-7139 46.1 46.3 45.9 46.1
8 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-8264 46.6 48.1 47.3 47.3
9 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-9174 45.6 45.1 44.8 45.2
10 KCCM11016P△aceE/pCR2.1-aceE(mt)-9586 46.1 46.6 45.9 46.2
L-라이신 농도 분석 결과, 10종 선별주의 L-라이신 수율이 대조군 KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE (WT) 균주 대비 최대 22% 증가함을 확인하였다.
실시예 5: E1p 인공돌연변이 라이브러리 선별주의 aceE 유전자 변이 확인
상기 실시예 4에서 선별된 10종 균주들의 E1p에 도입된 변이를 확인하기 위하여 aceE 변이체의 폴리뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
프라이머 1(서열번호 3): 5'-TGGGA CCGGG AAACC GGG-3'
프라이머 2(서열번호 4): 5'-GATTT ATCTG TCCCT TGA-3'
확보된 각각의 변이형 aceE 유전자 단편들의 폴리뉴클레오티드 서열 분석을 통하여 변이형 aceE 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하고 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하였으며, 이를 통해 변이형 E1p의 아미노산 서열을 확인하였다. 선별된 균주의 E1p 아미노산 서열의 변이 정보는 [표 2]와 같다.
표 2
선별 10종 KCCM11016P/pCR2.1-aceE(mt) E1p 아미노산 변이
균주 E1p 아미노산 변이
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-1235 Q432E
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-1542 E190V
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-3152 L438P
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-5013 Q195H
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-5312 P199S
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-6001 K435A
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-7139 Q432A
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-8264 Y418H
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-9174 N428A
KCCM11016P△aceE /pCR2.1-aceE(mt)-9586 Y201A
실시예 6: E1p 변이 염색체 도입용 벡터 제작
상기 실시예 5에서 확인된 E1p 변이 적용 효과를 확인하기 위하여 이를 염색체상에 도입할 수 있는 벡터를 제작하였다.
보고된 폴리뉴클레오티드 서열에 근거하여 5' 말단에 XbaⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머 9(서열번호 12)와 3' 말단에 XbaⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머 10(서열번호 13)을 합성하였다. 이 프라이머 쌍을 이용하여, 상기 선별된 10종의 염색체를 각각 주형으로 PCR을 수행하여 10종의 변이형 aceE(mt) 유전자 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
프라이머 9(서열번호 12): 5'-AATCT AGATG GGACC GGGAA ACCGG G-3'
프라이머 10(서열번호 13): 5'-AATCT AGAGA TTTAT CTGTC CCTTG A-3'
PCR로 증폭된 10종의 유전자 단편을 제한효소 XbaⅠ으로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 XbaⅠ 말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드의 E1p에 삽입된 변이에 따라 각각 pDZ-E1p(Q432E), pDZ-E1p(E190V), pDZ-E1p(L438P), pDZ-E1p(Q195H), pDZ-E1p(P199S), pDZ-E1p(K435A), pDZ-E1p(Q432A), pDZ-E1p(Y418H), pDZ-E1p(N428A), pDZ-E1p(Y201A)으로 명명하였다.
실시예 7: KCCM11016P 유래 E1p 변이 도입 균주 제작 및 L- 라이신 생산능 비교
상기 실시예 6에서 제조한 신규 변이 도입용 벡터 10종을 이용하여 2단계 상동염색체 재조합을 통해 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P를 형질전환시켰다. 그 후 폴리뉴클레오티드 서열 분석을 통해 염색체 상의 E1p 변이가 도입된 균주를 선별하였으며, 삽입된 E1p 변이에 따라 각각 KCCM11016P::E1p(Q432E), KCCM11016P::E1p(E190V), KCCM11016P::E1p(L438P), KCCM11016P::E1p(Q195H), KCCM11016P::E1p(P199S), KCCM11016P::E1p(K435A), KCCM11016P::E1p(Q432A), KCCM11016P::E1p(Y418H), KCCM11016P::E1p(N428A), KCCM11016P::E1p(Y201A)으로 명명하였다.
실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신의 농도를 분석하였며, 제작된 균주들의 성장속도를 측정하기 위하여 배양시작 18시간 후 잔류 당 농도를 측정하였다[표 3].
표 3
KCCM11016P 균주 유래 E1p 변이 도입주 중간당(g/L) 및 L-라이신 생산 농도(g/L)
균주 배치 1 배치 2 배치 3 평균
중간당 L-라이신 중간당 L-라이신 중간당 L-라이신 중간당 L-라이신
대조군 KCCM11016P 35.8 42.8 34.5 41.6 35.1 43.1 35.1 42.5
1 KCCM11016P::E1p(Q432E) 41.2 46.2 40.5 45.8 42.1 45.2 41.3 45.7
2 KCCM11016P::E1p(E190V) 43.2 45.2 41.8 45.8 43 46.7 42.7 45.9
3 KCCM11016P::E1p(L438P) 40.5 45.1 41.1 45.9 40.6 45.8 40.7 45.6
4 KCCM11016P::E1p(Q195H) 38.1 44.5 37.5 45.2 38.5 44.9 38.0 44.9
5 KCCM11016P::E1p(P199S) 44.1 46.2 43.5 45.9 44.8 44.8 43.8 45.6
6 KCCM11016P::E1p(K435A) 44.1 45.2 43.5 45.1 42.9 46.5 43.5 45.6
7 KCCM11016P::E1p(Q432A) 40.5 46.5 38.9 46.1 40.3 45.8 39.9 46.1
8 KCCM11016P::E1p(Y418H) 38.5 47.5 37.6 46.6 39.1 46.5 38.4 46.9
9 KCCM11016P::E1p(Y201A) 42.5 45.7 43.1 44.6 40.5 45.8 42.0 45.4
10 KCCM11016P::E1p(N428A) 39.8 46.5 40.1 47.9 40.3 46.2 40.1 46.9
신규 변이주 10종(KCCM11016P::E1p(Q432E), KCCM11016P::E1p(E190V), KCCM11016P::E1p(L438P), KCCM11016P::E1p(Q195H), KCCM11016P::E1p(P199S), KCCM11016P::E1p(K435A), KCCM11016P::E1p(Q432A), KCCM11016P::E1p(Y418H), KCCM11016P::E1p(Y201A), KCCM11016P::E1p(N428A))은 모균주 대비 당소모 속도가 소폭 하락하고 라이신 생산능은 최대 10% 증가하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 L-라이신 생산능이 향상된 균주 중 대표적인 균주인 KCCM11016P::E1p(N428A)를 코리네박테리움 글루타미쿰 "CA01-2289"라 명명하였고, 2014년 10월 23일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11590P를 부여받았다.
고찰 결과, 10종의 E1p 변이(E1p(Q432E)(서열번호 14), E1p(E190V)(서열번호 15), E1p(L438P)(서열번호 16), E1p(Q195H)(서열번호 17), E1p(P199S)(서열번호 18), E1p(K435A)(서열번호 19), E1p(Q432A)(서열번호 20), E1p(Y418H)(서열번호 21), E1p(Y201A)(서열번호 22), E1p(N428A)(서열번호 23))는 E1p 단백질의 두 그룹(190번째 아미노산 잔기부터 201 번째 아미노산 잔기, 418번째 아미노산 잔기부터 438번째 아미노산 잔기)으로 나뉘어져 집중되어 분포되어 있었다.
각 그룹에 속한 변이들이 조합으로 포함된 균주 10종(KCCM11016P::E1p(E190V, Q195H), KCCM11016P::E1p(E190V, P199S), KCCM11016P::E1p(Q195H, P199S), KCCM11016P::E1p(E190V, Y201A), KCCM11016P::E1p(Q195H, Y201A), KCCM11016P::E1p(P199S, Y201A), KCCM11016P::E1p(N428A, Q432E), KCCM11016P::E1p(N428A, K435A), KCCM11016P::E1p(Y418H, K435A), KCCM11016P::E1p(Y418H, Q432A)을 제작하였으며, 상기와 같은 방법으로 라이신 생산능을 측정하였다[표 4].
표 4
KCCM11016P 균주 유래 E1p 변이 조합 도입주 중간당(g/L) 및 L-라이신 생산 농도(g/L)
균주 배치 1 배치 2 배치 3 평균
중간당 L-라이신 중간당 L-라이신 중간당 L-라이신 중간당 L-라이신
대조군 KCCM11016P 35.2 42.1 34.6 42.5 35.6 42.5 35.1 42.4
1 KCCM11016P::E1p(E190V, Q195H) 47.1 47.1 46.5 48.1 46 43.1 46.5 46.1
2 KCCM11016P::E1p(E190V, P199S) 45.2 45.2 46.3 46.1 46 45 45.8 45.4
3 KCCM11016P::E1p(Q195H, P199S) 46.2 49.8 45.7 48.7 44 48.5 45.3 49.0
4 KCCM11016P::E1p(E190V, Y201A) 42.8 46.1 43.1 45.7 42.5 46 42.8 45.9
5 KCCM11016P::E1p(Q195H, Y201A) 48.3 45.3 47.5 47.1 47 46.2 47.6 46.2
6 KCCM11016P::E1p(P199S, Y201A) 39.1 45.3 38.6 45.9 39.2 45.6 39.0 45.6
7 KCCM11016P::E1p(N428A, Q432E) 45.9 48.1 47.1 49.2 46.5 49.3 46.5 48.9
8 KCCM11016P::E1p(N428A, K435A) 46.1 47.9 45.8 48.3 46.7 47.9 46.2 48.0
9 KCCM11016P::E1p(Y418H, K435A) 38.2 45.9 37.6 45.7 39.1 46 38.3 45.9
10 KCCM11016P::E1p(Y418H, Q432A) 41.2 46.1 40.9 45.1 39.9 47.2 40.7 46.1
상기 표에 나타낸 바와 같이, 신규 변이 조합 도입주 10종 모두 모균주 대비 당 소모 속도가 소폭 하락하고 라이신 생산능은 최대 15.6% 증가하였다. 이는 신규변이 1종이 도입되었을 때보다 조합으로 도입될 경우, 더 큰 라이신 생산능 증가 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
상기 결과는, E1p 단백질의 신규 변이 10종은 당 소모 속도가 크게 감소되지 않으면서 라이신 생산능을 모균주 대비 크게 증가시키는데 효과적인 변이이며, 190번째 아미노산 잔기부터 205번째 아미노산 잔기 또는 415번째 아미노산 잔기부터 440번째 아미노산 잔기가 상기 효과를 나타내는 주요한 부분임을 나타낸다.
실시예 8: E1p 변이주에 대한 피루브산 디하이드로게나아제 복합체( Pyruvate Dehydrogenase Complex, PDHC) 활성 측정
선행 문헌에 보고된 방법(Schreiner et al., J. Bacteriol. 187:6005, 2005)을 통해 상기 선별된 균주를 대상으로 PDHC 활성을 측정하였다. 대조군으로 사용한 KCCM11016P, KCCM11016P△aceE 및 선별 균주 10종(KCCM11016P::E1p(Q432E), KCCM11016P::E1p(E190V), KCCM11016P::E1p(L438P), KCCM11016P::E1p(Q195H), KCCM11016P::E1p(P199S), KCCM11016P::E1p(K435A), KCCM11016P::E1p(Q432A), KCCM11016P::E1p(Y418H), KCCM11016P::E1p(Y201A), KCCM11016P::E1p(N428A)을 실시예 4에 명시된 종배지 25mL에 접종한 후, 대수기 후반까지 배양하였다. 원심분리를 통해 균체를 회수한 후, 100mM Tris-HCl(pH 7.2, 3mM L-cysteine, 10mM MgCl2)완충용액으로 2회 세척하였고, 동일한 완충용액 2mL에 최종 현탁하였다. 균체 현탁액을 일반적인 글래스비드 볼텍싱법으로 10분간 물리적으로 파쇄한 후, 2회의 원심분리(13,000rpm, 4℃, 30분)를 통하여 상층액을 회수, PDHC 효소 활성 측정을 위한 조효소액(crude extract)으로 사용하였다. PDHC 효소활성 측정을 위하여 효소활성 측정용 반응액(MgCl2 10mM,시스테인 3mM, NAD 2mM, 티아민 피로인산(thiamine diphosphate) 0.9mM, 클로르프로마진(chlorpromazine) 0.25mM, 피루브산(pyruvate) 6mM, CoA 0.2 mM in Tris-HCl 완충용액(pH 7.2)) 0.95mL에 0.05mL 조효소액을 첨가한 후, 30℃에서 반응하였다. PDHC 활성 유닛(unit)은 분당 소모한 NADH μmol 수로 정의하였으며, 효소 활성 측정 결과는 하기 [표 5]와 같다.
표 5
PDHC 효소활성(%) 측정
균주 PDHC 활성 (%)
KCCM11016P 100
KCCM11016P△aceE 0
KCCM11016P::E1p(Q432E) 39
KCCM11016P::E1p(E190V) 56
KCCM11016P::E1p(L438P) 53
KCCM11016P::E1p(Q195H) 55
KCCM11016P::E1p(P199S) 51
KCCM11016P::E1p(K435A) 53
KCCM11016P::E1p(Q432A) 42
KCCM11016P::E1p(Y418H) 36
KCCM11016P::E1p(Y201A) 46
KCCM11016P::E1p(N428A) 35
신규 변이 도입주의 PDHC 활성은 모균주 대비 35% 내지 56%의 활성을 나타내었다.
실시예 9: aceE 결손 균주와의 L-라이신 생산능 비교
실시예 2에서 제작한 aceE 결손 균주 KCCM11016P△aceE 및 선별균주 10종(KCCM11016P::E1p(Q432E), KCCM11016P::E1p(E190V), KCCM11016P::E1p(L438P), KCCM11016P::E1p(Q195H), KCCM11016P::E1p(P199S), KCCM11016P::E1p(K435A), KCCM11016P::E1p(Q432A), KCCM11016P::E1p(Y418H), KCCM11016P::E1p(Y201A), KCCM11016P::E1p(N428A))을 비교 평가하기 위하여 암모늄아세테이트를 포함하는 하기 배지를 이용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하였다. HPLC를 이용하여 L-라이신의 농도를 분석하였으며 제작된 균주들의 성장속도를 측정하기 위하여 배양시작 18시간 후 잔류 당 농도를 측정하였다[표 6].
<암모늄아세테이트 포함 라이신 생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100g, CH3COONH3 5g, (NH4)2SO4 40g, 대두 단백질 2.5g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5g, Urea 3g, KH2PO4 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 3000㎍, CaCO3 30g(증류수 1리터 기준)
표 6
KCCM11016P 균주 유래 E1p 변이 도입주 및 aceE 결손주 중간당(g/L) 및 L-라이신 생산 농도(g/L)
균주 배치 1 배치 2 배치 3 평균
중간당 L-라이신 중간당 L-라이신 중간당 L-라이신 중간당 L-라이신
대조군 KCCM11016P 45.7 40.9 45.6 42.1 46.7 41.3 46.0 41.4
실험구 KCCM11016P△aceE 67.1 45.6 66.8 45.2 68.2 45.4 67.4 45.4
1 KCCM11016P::E1p(Q432E) 48.2 43.7 46.5 44.2 47.5 43.4 47.4 43.8
2 KCCM11016P::E1p(E190V) 49.7 44.6 47.8 43.8 48.1 44.4 48.5 44.3
3 KCCM11016P::E1p(L438P) 47.9 45.3 48.9 43.2 47.5 44.6 48.1 44.4
4 KCCM11016P::E1p(Q195H) 46.7 42.9 46.3 43.6 45.6 43.0 46.2 43.2
5 KCCM11016P::E1p(P199S) 50.4 45.2 50.6 45.1 51.2 44.6 50.7 45.0
6 KCCM11016P::E1p(K435A) 51.3 44.9 50.9 45.2 52.7 45.0 51.6 45.0
7 KCCM11016P::E1p(Q432A) 48.9 45.6 47.8 46.0 47.9 45.9 48.2 45.8
8 KCCM11016P::E1p(Y418H) 44.6 45.8 45.7 46.5 47.3 46.3 45.9 46.2
9 KCCM11016P::E1p(Y201A) 47.6 43.8 46.7 44.5 48.7 43.7 47.7 44.0
10 KCCM11016P::E1p(N428A) 49.7 46.2 47.8 45.2 48.3 45.7 48.6 45.7
KCCM11016P△ aceE 균주는 모균주 대비 라이신 생산능이 9.6% 증가하였으나, 성장속도가 현저히 느려졌다. 이에 비해 변이 도입 균주는 암모늄아세테이트를 첨가하지 않은 조건과 비슷한 정도의 라이신 수율 증가폭과 당 소모 속도를 나타내었다.
상기 결과는 라이신 수율이 증가하지만 성장 속도가 크게 하락하는 특징이 나타나는 aceE 결손 균주에 비해 본 발명의 aceE 변이 도입 균주는 성장 속도에 있어 큰 차이 없이 고수율로 라이신을 생산할 수 있음을 나타낸다.
실시예 10: KFCC10750 유래 E1p 변이 도입 균주 제작 및 L- 라이신 생산능 비교
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 균주들에서 신규 변이 10종의 도입효과를 확인하기 위해 상기 실시예 7과 같은 방법을 이용하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750(상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11347P를 부여받았음. 한국 등록특허 제10-0073610호)에 10종의 E1p 변이가 각각 도입된 균주들을 제작하고 KFCC10750::E1p(Q432E), KFCC10750::E1p(E190V), KFCC10750::E1p(L438P), KFCC10750::E1p(Q195H), KFCC10750::E1p(P199S), KFCC10750::E1p(K435A), KFCC10750::E1p(Q432A), KFCC10750::E1p(Y418H), KFCC10750::E1p(Y201A), KFCC10750::E1p(N428A)으로 명명하였다. KFCC10750 균주를 대조군으로 포함한 11종의 균주를 실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신의 농도를 분석하였다(표 7).
표 7
KFCC10750 균주 유래 E1p 변이 도입주 L-라이신 생산 농도
균주 L-라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KFCC10750 38.8 38.1 37.9 38.3
1 KFCC10750::E1p(Q432E) 43.1 42.8 43.5 43.1
2 KFCC10750::E1p(E190V) 41.2 42.1 41.8 41.7
3 KFCC10750::E1p(L438P) 40.9 41.3 41.5 41.2
4 KFCC10750:E1p(Q195H) 41.6 42.3 41.8 41.9
5 KFCC10750::E1p(P199S) 42 42.4 41.9 42.1
6 KFCC10750::E1p(K435A) 41.8 42.1 42.2 42.0
7 KFCC10750::E1p(Q432A) 40.2 41.1 41.2 40.8
8 KFCC10750::E1p(Y418H) 44.5 44.9 44.8 44.7
9 KFCC10750::E1p(Y201A) 40.9 41 41.1 41.0
10 KFCC10750::E1p(N428A) 44.5 44.1 45.8 44.8
그 결과, 신규 변이 도입주 10종은 모균주 대비 L-라이신 생산능이 최대 17% 증가된 것을 확인하였다.
실시예 11: KCCM10770P 유래 E1p 변이 도입 균주 제작 및 L- 라이신 생산능 비교
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 균주들에서 신규 변이 10종의 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 7과 같은 방법을 이용하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(한국 등록특허 제10-0924065호)에 E1p 변이가 도입된 균주를 제작하고 KCCM10770P::E1p(Q432E), KCCM10770P::E1p(E190V), KCCM10770P::E1p(L438P), KCCM10770P::E1p(Q195H), KCCM10770P::E1p(P199S), KCCM10770P::E1p(K435A), KCCM10770P::E1p(Q432A), KCCM10770P::E1p(Y418H), KCCM10770P::E1p(Y201A), KCCM10770P::E1p(N428A)으로 명명하였다. 실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신의 농도를 분석하였다[표 8].
표 8
KCCM10770P 균주 유래 E1p 변이 도입주 L-라이신 생산능
균주 L-라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM10770P 48.1 47.5 47.8 47.8
1 KCCM10770P::E1p(Q432E) 53.3 53.4 54.1 53.6
2 KCCM10770P::E1p(E190V) 51.2 52.1 52.8 52.0
3 KCCM10770P::E1p(L438P) 51.5 51.3 50.7 51.2
4 KCCM10770P::E1p(Q195H) 51.9 52.1 52 52.0
5 KCCM10770P::E1p(P199S) 51.3 52.1 52.7 52.0
6 KCCM10770P::E1p(K435A) 52.4 52.6 51.4 52.1
7 KCCM10770P::E1p(Q432A) 50.2 51.2 50 50.5
8 KCCM10770P::E1p(Y418H) 55.8 54.5 54.1 54.8
9 KCCM10770P::E1p(Y201A) 49.9 50.3 50.7 50.3
10 KCCM10770P::E1p(N428A) 56.1 55.7 55.9 55.9
그 결과, 신규 변이 도입주 10종은 모균주 대비 L-라이신 생산능이 최대 17% 증가된 것을 확인하였다.
실시예 12: CJ3P 유래 E1p 변이 도입 균주 제작 및 L-라이신 생산능 비교
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 균주들에서의 효과도 확인하기 위해 상기 실시예 7과 같은 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al., Genome Biology 2012, 13:R40)에 E1p 변이가 도입된 균주를 제작하고, CJ3P::E1p(Q432E), CJ3P::E1p(E190V), CJ3P::E1p(L438P), CJ3P::E1p(Q195H), CJ3P::E1p(P199S), CJ3P::E1p(K435A), CJ3P::E1p(Q432A), CJ3P::E1p(Y418H), CJ3P::E1p(Y201A), CJ3P::E1p(N428A)으로 명명하였다. 실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신의 농도를 분석하였다[표 9].
표 9
CJ3P 균주 유래 E1p 변이 도입주 L-라이신 생산 농도
균주 L-라이신(g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 CJ3P 8.2 8.3 8 8.2
1 CJ3P::E1p(Q432E) 9.5 9.3 9.4 9.4
2 CJ3P::E1p(E190V) 8.8 9 8.7 8.8
3 CJ3P::E1p(L438P) 9.1 8.7 8.9 8.9
4 CJ3P::E1p(Q195H) 9.2 8.9 9 9.0
5 CJ3P::E1p(P199S) 9.3 9 9.1 9.1
6 CJ3P::E1p(K435A) 9.1 9 8.9 9.0
7 CJ3P::E1p(Q432A) 8.7 8.9 8.8 8.8
8 CJ3P::E1p(Y418H) 9.6 9.6 9.5 9.6
9 CJ3P::E1p(Y201A) 8.7 8.7 8.9 8.8
10 CJ3P::E1p(N428A) 9.7 9.8 9.8 9.8
그 결과, 신규 변이 도입주 10종은 모균주 대비 L-라이신 생산능이 최대 19.5% 증가된 것을 확인하였다.
상기 결과는 신규 확보된 10종의 E1p 변이(E1p(Q432E), E1p(E190V), E1p(L438P), E1p(Q195H), E1p(P199S), E1p(K435A), E1p(Q432A), E1p(Y418H), E1p(Y201A), E1p(N428A))들이 각각 L-라이신 생산능 증가에 우수한 효과가 뛰어남을 의미한다.
실시예 13: KCCM11201P 유래 E1p 변이 도입 균주 제작 및 L-발린 생산능 비교
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 아미노산 생산균주에서도 선별된 E1p 변이 10종의 효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 7과 같은 방법으로 L-발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(한국 등록특허 제 10-1117022호)에 E1p 변이가 도입된 균주를 제작하고 KCCM11201P::E1p(Q432E), KCCM11201P::E1p(E190V), KCCM11201P::E1p(L438P), KCCM11201P::E1p(Q195H), KCCM11201P::E1p(P199S), KCCM11201P::E1p(K435A), KCCM11201P::E1p(Q432A), KCCM11201P::E1p(Y418H), KCCM11201P::E1p(Y201A), KCCM11201P::E1p(N428A)으로 명명하였다.
제작된 균주를 평가하기 위해 하기에 명기한 L-발린 생산배지 25㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였다. [표 10].
<발린 생산배지 (pH 7.2)>
포도당 50g, (NH4)2SO4 20g, 옥수수 침지액 (Corn Steep liquid) 20g, KH2PO4 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, 바이오틴 200㎍, CaCO3 30g(증류수 1리터 기준).
표 10
KCCM11201P 유래 E1p 변이 도입주 L-발린 생산 농도
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 평균
대조군 KCCM11201P 2.8 2.8 2.8
1 KCCM11201P::E1p(Q432E) 3.1 3.0 3.1
2 KCCM11201P::E1p(E190V) 3.3 3.2 3.3
3 KCCM11201P::E1p(L438P) 3.2 3.2 3.2
4 KCCM11201P::E1p(Q195H) 3.0 3.1 3.1
5 KCCM11201P::E1p(P199S) 3.1 3.3 3.2
6 KCCM11201P::E1p(K435A) 3.1 3.1 3.1
7 KCCM11201P::E1p(Q432A) 3.2 3.2 3.2
8 KCCM11201P::E1p(Y418H) 3.3 3.4 3.4
9 KCCM11201P::E1p(Y201A) 3.0 3.0 3.0
10 KCCM11201P::E1p(N428A) 3.4 3.4 3.4
그 결과, 신규 변이 도입주 10종은 모균주 대비 L-발린 생산능이 최대 21% 증가된 것을 확인하였다.
실시예 14: 야생형 유래 E1p 변이 도입 균주 제작 및 L-발린 생산능 비교
상기 실시예 7에서 선별된 E1p 변이 10종 중 실시예 13에서 높은 L-발린 수율 증가 효과를 보인 4종의 변이에 대해, 발린 생산능을 재확인하기 위해 상기 실시예 7와 같은 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 E1p 변이가 도입된 균주를 제작하고, ATCC13032::E1p(E190V), ATCC13032::E1p(L438P), ATCC13032::E1p(Y418H), ATCC13032::E1p(N428A)로 명명하였다.
상기 균주의 L-발린 생산능을 확인하기 위해 각각의 균주에 L-발린 생합성 과발현 벡터 pECCG117-DvalS(대한민국 특허 공개번호 제10-2014-0111421호)를 전기천공법으로 형질전환한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환균주를 획득하고 ATCC13032::E1p(E190V)_DvalS, ATCC13032::E1p(L438P)_DvalS, ATCC13032::E1p(Y418H)_DvalS, ATCC13032::E1p(N428A)_DvalS로 명명하였다.
상기 균주를 실시예 13과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-발린의 농도를 분석하였다(표 11).
표 11
야생형 유래 E1p 변이 도입주 L-발린 생산 농도
균주 L-발린 (g/l)
배치 1 배치 2 평균
ATCC13032 0.1 0.1 0.1
대조군 ATCC13032_DvalS 1.3 1.2 1.3
1 ATCC13032::E1p(E190V) 0.1 0.1 0.1
2 ATCC13032::E1p(E190V)_DvalS 1.5 1.7 1.6
3 ATCC13032::E1p(L438P) 0.1 0.1 0.1
4 ATCC13032::E1p(L438P)_DvalS 1.4 1.4 1.4
5 ATCC13032::E1p(Y418H) 0.1 0.1 0.1
6 ATCC13032::E1p(Y418H)_DvalS 1.8 1.7 1.8
7 ATCC13032::E1p(N428A) 0.1 0.1 0.1
8 ATCC13032::E1p(N428A)_DvalS 1.9 1.7 1.8
그 결과, 신규 변이 도입주 4종은 대조군 대비 L-발린 생산능이 최대 38% 증가된 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2016002594-appb-I000001

Claims (10)

  1. 서열번호 1에서 190번 내지 205번 아미노산 부위 또는 415번 내지 440번 아미노산 부위에 하나 이상의 아미노산 변이를 가지는, 피루브산 디하이드로게나아제 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 190번 내지 205번 아미노산 부위에서 변이되는 아미노산은 190번, 195번, 199번 및 201번 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 피루브산 디하이드로게나아제 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 190번 내지 205번 아미노산 부위에서의 아미노산 변이는, 190번 글루탐산에서 발린으로의 치환(E190V), 195번 글루타민에서 히스티딘으로의 치환(Q195H), 199번 프롤린에서 세린으로의 치환(P199S) 및 201번 타이로신에서 알라닌으로의 치환(Y201A)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 피루브산 디하이드로게나아제 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1에서 415번 내지 440번 아미노산 부위에서 변이되는 아미노산은 418번, 428번, 432번, 435번 및 438번 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 피루브산 디하이드로게나아제 변이체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 415번 내지 440번 아미노산 부위에서의 아미노산 변이는 418번 타이로신에서 히스티딘으로의 치환(Y418H), 428번 아스파라긴에서 알라닌으로의 치환(N428A), 432번 글루타민에서 글루탐산으로의 치환(Q432E), 432번 글루타민에서 알라닌으로의 치환(Q432A), 435번 라이신에서 알라닌으로의 치환(K435A) 및 438번 류신에서 프롤린으로의 치환(L438P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 피루브산 디하이드로게나아제 변이체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 피루브산 디하이드로게나아제 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 14 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열인 것인, 피루브산 디하이드로게나아제 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 피루브산 디하이드로게나아제 변이체를 포함하는, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물.
  10. (a) 제8항의 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 L-아미노산을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 미생물 또는 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는,
    L-아미노산을 생산하는 방법.
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