CN101952418B - 生产(2s，3r，4s)-4-羟基-l-异亮氨酸的方法 - Google Patents

生产(2s，3r，4s)-4-羟基-l-异亮氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

一种使用L-异亮氨酸生产细菌生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，所述细菌用含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化；并且具有产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的能力。

Description

生产(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物工业，并特别涉及使用L-异亮氨酸生产细菌生产4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。这种细菌通过导入含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段而修饰，其导致(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的生成。
背景技术
4-羟基-L-异亮氨酸是能够从胡卢巴种子(fenugreek seeds)(Trigonellafoenum-graecum L.leguminosae)提取和纯化的氨基酸。4-羟基-L-异亮氨酸展现促胰岛素活性，所述促胰岛素活性非常引人关注，这是因为其刺激作用明显依赖于培养基中的血浆葡萄糖浓度，如在分离的灌注大鼠胰脏和人胰岛二者中所示(Sauvaire，Y.et al，Diabetes，47：206-210，(1998))。这种葡萄糖依赖性对于磺酰脲还未得到确认(Drucker，D.J.，Diabetes 47：159-169，(1998))，磺酰脲是目前用以治疗II型糖尿病(或称非胰岛素依赖性糖尿病(NIDD或NIDDM))的唯一促胰岛素药物类型。其结果是低血糖仍为磺酰脲治疗中常见的不理想的副作用(Jackson，J.，and Bessler，R.Drugs，22：211-245；295-320，(1981)；Jennings，A.et al.Diabetes Care，12：203-208，(1989))。还报道了改善葡萄糖耐受(Am.J.Physiol.Endocrinol.，Vol.287，E463-E471，2004)。已报道了这种葡萄糖代谢增强活性，及其在药学和保健食品中的潜在应用(特开平6-157302，US2007-000463A1)。
4-羟基-L-异亮氨酸仅见于植物，而且由于其特别的促胰岛素作用，其可认为是用于II型糖尿病治疗的新型促分泌剂，所述II型糖尿病的特征为与不同程度的胰岛素抗性相关的缺陷性胰岛素分泌(Broca，C.et al，Am.J.Physiol.277(Endocrinol.Metab.40)：E617-E623，(1999))。
已报导了将通过使用胡卢巴提取物的双加氧酶活性来氧化铁、抗坏血酸、2-氧化戊二酸(2-oxyglutaric aicd)和氧依赖性异亮氨酸的方法作为生产4-羟基-L-异亮氨酸方法(Phytochemistry，Vol.44，No.4，pp.563-566，1997)。然而，这种方法不足以生产4-羟基-L-异亮氨酸，因为所述酶的活性受20mM及以上的异亮氨酸浓度的抑制，所述酶尚未鉴定，所述酶源自植物提取物且无法以足够的量获得，并且所述酶不稳定。
还披露了一种总产率为39％的有效的光学纯(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸的八步合成。这种合成的关键步骤涉及使用白地霉(Geotrichum candidum)将2-甲基乙酰乙酸乙酯生物转化为(2S，3S)-2-甲基-3-羟基-丁酸乙酯以及不对称Strecker合成(Wang，Q.et al，Eur.J.Org.Chem.，834-839(2002))。
还披露了一种完全控制立体化学的(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸的短的六步化学酶合成，最后的步骤为通过使用商业上可以获得的固定在Eupergit C上的青霉素酰基转移酶G(E-PAC)水解N-苯乙酰内酯衍生物的酶促分解过程(Rolland-Fulcrand，V.et al，J.Org.Chem.，873-877(2004))。
然而时下并无使用通过导入含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段而修饰的L-异亮氨酸生产细菌生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的报道。
发明内容
本发明的目的是增强(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸(此术语包括其游离形式和盐二者，并且也可称作“(2S，3R，4S)-4HIL”)的产生，以提供通过L-异亮氨酸的直接酶羟化而生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。在这种方法中，使用通过导入含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段而修饰的L-异亮氨酸生产细菌。
本发明的发明人从自然界分离了具有高水平L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌，克隆了编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因，并发现了这种L-异亮氨酸双加氧酶优选用于(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的合成。
本发明的目的包括提供使用通过导入含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段而修饰的L-异亮氨酸生产细菌来产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的方法。上述目的是通过发现具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸而达成的。
本发明的目的是提供通过向L-异亮氨酸生产细菌导入含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段而构建(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸生产细菌的方法。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)或分枝杆菌属(Mycobacterium)。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)或白色分枝杆菌(Mycobacterium album)。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述基因选自下组：
(a)包含SEQ ID No：1的核苷酸序列的DNA；
(b)与具有与SEQ ID No：1的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA；
(c)编码包含SEQ ID No：2的氨基酸序列的蛋白质的DNA；
(d)编码具有SEQ ID No：2的氨基酸序列，但其中存在一个或数个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白质的DNA，并且所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性；和
(e)编码包含与SEQ ID No：2的氨基酸序列至少98％同源的氨基酸序列的蛋白质的DNA，且其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性。
本发明的进一步的目的是提供依照权利要求1～4中任一项的方法获得的(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸生产细菌。
本发明的进一步的目的是提供用于生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，其包括：
-在培养基中培养依照权利要求5的细菌；并
-分离(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌经修饰而增强了L-异亮氨酸双加氧酶的活性。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的活性是通过增加编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达而增强的。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的表达是通过修饰编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达控制序列或通过增加编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的拷贝数而增加的。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属、短杆菌属、棒杆菌属、沙雷氏菌属或分枝杆菌属。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、粘质沙雷氏菌或白色分枝杆菌。
在下文中详细描述本发明。
附图简述
图1显示重组质粒pMW119-IDO(Lys，23)的结构。
实施发明的最佳方式
1.本发明的细菌
在本发明中，术语“(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸”或“(2S，3R，4S)-4HIL”或“4HIL”指单一化合物或含有(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸的化合物的混合物。
如本说明书所用的术语“细菌”包括产生酶的细菌，其中存在目标酶活性或目标酶活性增强的这些细菌的突变体或遗传重组体，等等。
来自微生物细胞的L-异亮氨酸双加氧酶在下文中缩写为IDO。
以前，本发明的发明人筛选环境微生物揭示了独特的微生物苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株2-e-2，其可催化从L-异亮氨酸(该术语涵盖其游离形式和盐二者)直接形成(2S，3R，4S)-4HIL。本发明的发明人从培养的微生物细胞纯化并分离了新的L-异亮氨酸双加氧酶，在下文中缩写为IDO(Lys，23)。
此外，本发明的发明人通过纯化源自苏云金芽孢杆菌菌株2-e-2的双加氧酶而确定了IDO(Lys，23)的N末端氨基酸序列。将苏云金芽孢杆菌菌株2-e-2命名为苏云金芽孢杆菌AJ110584，并于2006年9月27日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan)，且根据布达佩斯条约的规定给予了登录号FERM BP-10688。
在实施例部分中鉴定的编码IDO(Lys，23)的DNA示于SEQ ID No：1。此外，由SEQ ID No：1的核苷酸序列编码的IDO(Lys，23)的氨基酸序列示于SEQID No：2。SEQ ID No：2为由SEQ ID No：1的核苷酸序列编码的IDO(Lys，23)的氨基酸序列。SEQ ID No：2的IDO(Lys，23)拥有L-异亮氨酸双加氧酶活性，并催化直接从一分子的L-异亮氨酸合成示于下文式(I)的(2S，3R，4S)-4HIL的反应。
编码催化从L-异亮氨酸形成(2S，3R，4S)-4HIL的反应的IDO的DNA不仅包括示于SEQ ID No：1中的DNA。这是因为在芽孢杆菌的不同菌株和菌种之间的IDO核苷酸序列中可能存在差异，该差异不影响从L-异亮氨酸产生(2S，3R，4S)-4HIL的活性。
本发明的DNA不仅包括分离的编码IDO的DNA，还包括其中人工导入了突变的DNA序列，例如，编码从产生IDO的微生物的染色体DNA分离的编码IDO的DNA，只要其编码能够催化所期望的反应的IDO即可。突变可使用已知方法人工导入，所述已知方法诸如如Method，in Enzymol.，154(1987)中所述的导入位点特异突变的方法。
在严格条件下与具有与SEQ ID No：1的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有IDO活性的DNA亦涵盖于本发明中。如本文所使用的，“严格条件”是指在这些条件下形成特异性杂交体，而不形成非特异性杂交体的条件。尽管难以用数字来明确表示这些条件，但是通过举例，提及下述这些条件：即在该条件下，具有较高同源性(例如，优选70％或更高，更优选80％或更高，还更优选90％或更高，且特别优选95％或更高的同源性)的DNA分子互相杂交，而具有较低同源性的DNA分子不互相杂交。或者，或在该条件下，在Southern杂交的通常洗涤条件下发生杂交，即，在37℃下盐浓度为0.1xSSC和0.1％SDS，优选在60℃下0.1xSSC和0.1％SDS，且更优选在65℃下0.1xSSC和0.1％SDS。探针的长度可适当选择，其取决于杂交条件，并通常在100bp到1kbp之间浮动。此外，“L-异亮氨酸双加氧酶活性”通常表示从L-异亮氨酸合成(2S，3R，4S)-4HIL。然而，当使用在严格条件下与同SEQ ID No：1的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列时，对于具有SEQ ID No：2的氨基酸序列的蛋白质优选在37℃和pH 8时保持10％或更多，优选30％或更多，更优选50％或更多，且还更优选70％或更多的L-异亮氨酸双加氧酶活性。
此外，编码与由SEQ ID No：1的DNA编码的IDO基本上相同的蛋白质的DNA亦涵盖于本发明中。即，包括下列：
(a)具有SEQ ID No：1核苷酸序列的DNA；
(b)在严格条件下与具有与SEQ ID No：1的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA；
(c)编码具有SEQ ID No：2的氨基酸序列的蛋白质的DNA；
(d)编码具有SEQ ID No：2的氨基酸序列，但其中存在一个或数个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白质的DNA，并且所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性；和
(e)编码具有与SEQ ID No：2的氨基酸序列至少70％同源，优选至少80％同源，更优选至少90％同源且还更优选至少95％同源的蛋白质的DNA，并且其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性。
在此，“一个或数个”指不显著损害所述蛋白质的3D结构或L-异亮氨酸双加氧酶活性的氨基酸变化数，且更具体地，范围是1～78的数，优选1～52，更优选1～26，且还更优选1～13。
所述一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位应为保持活性的保守突变。代表性的保守突变为保守取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met、Ile或Leu取代Val。
此外，“L-异亮氨酸双加氧酶活性”指如上所述从L-异亮氨酸合成(2S，3R，4S)-4HIL。然而，当SEQ ID NO：2的氨基酸序列含有一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位时，优选在30℃和pH 6.0下保持10％或更多，优选30％或更多，更优选50％或更多，且还更优选70％或更多的L-异亮氨酸双加氧酶活性。IDO的L-异亮氨酸双加氧酶活性可通过用高效液相层析(HPLC)测定(2S，3R，4S)-4HIL形成来测量。
此外，SEQ ID NO：1的同源DNA可用作编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因。同源DNA是否编码L-异亮氨酸双加氧酶可通过测量过表达该同源DNA的微生物的细胞裂解液的L-异亮氨酸双加氧酶活性来确认。
SEQ ID NO：1的同源DNA也可以制备自其它芽孢杆菌属菌种，例如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)与韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)。
短语“属于埃希氏菌属的细菌”指根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至埃希氏菌属的细菌。属于埃希氏菌属的细菌实例包括，但不限于，大肠杆菌(E.Coli)。
可用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌并不特别限定；然而，例如，包括Neidhardt，F.C.et al.(大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌(Escherichia coli andSalmonella typhimurium)，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，Table 1)所描述的细菌。
短语“属于短杆菌的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至短杆菌属的细菌。属于短杆菌属的细菌的实例包括，但不限于，黄色短杆菌。
短语“属于棒杆菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至棒杆菌属的细菌。属于棒杆菌属的细菌的实例包括，但不限于，谷氨酸棒杆菌。
短语“属于沙雷氏菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至沙雷氏菌属的细菌。属于沙雷氏菌属的细菌的实例包括，但不限于，粘质沙雷氏菌。
短语“属于分枝杆菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至分枝杆菌属的细菌。属于分枝杆菌属的细菌的实例包括，但不限于，白色分枝杆菌。
如本文所使用的术语“L-异亮氨酸生产细菌”意为能在培养基中以大于野生或亲本菌株的量产生L-异亮氨酸并导致L-异亮氨酸积累的细菌，并优选意为该微生物能以不低于0.5g/L，更优选不低于1.0g/L的量产生L-异亮氨酸并导致L-异亮氨酸的积累。
可用于本发明的L-异亮氨酸生产细菌的实例包括，但不限于，对6-二甲基氨基嘌呤具有抗性的突变体(JP 5-304969A)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸和异亮氨酸氧肟酸盐具有抗性的突变体，和另外的对DL-乙基硫氨酸和/或精氨酸氧肟酸盐等具有抗性的突变体(JP 5-130882A)。
此外，用编码L-异亮氨酸生物合成中涉及的蛋白质(如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase))的基因转化的重组菌株亦可用作亲本菌株(JP 2-458A，FR 0356739和美国专利No.5,998,178)。
根据本发明属于埃希氏菌属的L-异亮氨酸生产细菌更优选为携带thrABC操纵子的大肠杆菌细菌，所述thrABC操纵子包含编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因，并且基本上不受L-苏氨酸抑制。这种细菌还可以含有ilvGMEDA操纵子，所述ilvGMEDA操纵子包含编码苏氨酸脱氨酶的ilvA基因，基本上不受L-异亮氨酸抑制，且缺失了减弱作用所需的区域。此外，所述细菌的宿主菌株是thrC基因缺陷的，可在5mg/ml L-苏氨酸存在下增殖，苏氨酸脱氢酶活性缺陷，并且ilvA基因具有渗漏突变。其具体实例包括大肠杆菌菌株AJ12919与AJ13100(美国专利No.5,998,178)等。
根据本发明属于埃希氏菌属的L-异亮氨酸生产细菌也可以是含有thrABC操纵子的埃希氏菌属细菌，所述thrABC操纵子包含编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因，并且基本上不受L-苏氨酸抑制。这种细菌也可以含有编码天冬氨酸激酶III且基本上不受L-赖氨酸抑制的lysC基因。此外，这种细菌可以含有ilvGMEDA操纵子等，所述ilvGMEDA操纵子包含编码苏氨酸脱氨酶的ilvA基因，其基本上不受L-异亮氨酸抑制，并且缺失了减弱作用所需的区域(美国专利No.5,998,178)。
属于埃希氏菌属的细菌可包含如上所述的thrABC操纵子、lysC基因和ilvGMEDA操纵子，它们在装载它们的一个或多个质粒上。
此外，属于埃希氏菌属的L-异亮氨酸生产细菌可为具有增强的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和转氢酶活性，以及增强的天冬氨酸酶活性的大肠杆菌菌株(EP 1179597B1)。
属于短杆菌属的L-异亮氨酸生产细菌可优选为黄色短杆菌或乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)细菌。所述细菌优选对乙酰羟酸合酶的反馈抑制活性和苏氨酸脱氨酶的L-异亮氨酸抑制脱敏。其具体实例包括黄色短杆菌菌株AJ12406(FERM P-10143、FERM BP-2509)和乳发酵短杆菌AJ12403/pAJ220V3(EP0356739B1)等。
属于棒状菌的L-异亮氨酸生产细菌优选为属于棒状杆菌型谷氨酸形成霉菌的细菌，所述细菌对苏氨酸氧肟酸盐具有抗性。其具体实例包括谷氨酸棒杆菌菌株H-4260(JP62195293)等。
将含有编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的DNA片段导入细菌是通过用包含含有编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的DNA片段的载体转化所述细菌来实施的。合适的载体，例如，是在所选细菌的细胞中可自主复制的质粒。
“用编码蛋白质的DNA转化细菌”指将所述DNA导入细菌，例如，通过常规方法。这种DNA的转化会导致编码本发明的蛋白质的基因的表达增加，并且在所述细菌细胞中会增强所述蛋白质的活性。转化可以通过迄今为止已经报道的任何已知方法达成。举例而言，使用氯化钙处理受体细胞以增加所述细胞对DNA的透过性已报道用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.and Higa，A.，J.MoI.Biol，53，159(1970))，并且可以使用。
在细菌染色体中所述基因的存在与否可通过公知的方法(包括PCR、Southern印迹等)来检测。
制备质粒DNA、DNA的消化和连接、转化、作为引物的寡核苷酸的选择等，可通过本领域技术人员熟知的普通方法完成。这些方法描述于，例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，″Molecular Cloning A LaboratoryManual，Second Edition″，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中。
2.本发明的方法
本发明的方法是通过在培养基中培养本发明的细菌，并从所述培养基中分离(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸来产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的方法。
所选的培养基可以是人工的或天然的，只要其包含碳源和氮源，矿质，以及，如有必要，包含合适量的细菌可能需要用于生长的营养物。碳源可包括多种糖类，如葡萄糖和蔗糖，以及多种有机酸。取决于所选微生物的同化模式，可使用醇，包括乙醇和甘油。作为氮源，可使用多种铵盐如氨或硫酸铵，其它含氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨、大豆水解产物，以及消化的发酵微生物。作为矿质，可使用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。作为维生素，可使用硫胺素、酵母提取物等。
培养优选在有氧条件下进行，如振荡培养、和通气的搅拌培养，在20～40℃、优选30～38℃的温度下进行。培养的pH通常为5～9，优选6.5～7.2。培养的pH可使用氨、碳酸钙、多种酸、多种碱和缓冲液调整。
可使用分离和纯化方法，其中将(2S，3R，4S)-4HIL与离子交换树脂接触以吸附碱性氨基酸，继之以洗脱与结晶。另外，也可使用下述方法，即对洗脱所得产物进行脱色，并用活性炭过滤，继之以结晶以获取(2S，3R，4S)-4HIL。
实施例
本发明将参考下文所示实施例进行更详细的说明；然而，本发明不限于这些实施例。
实施例1.MG1655(P Lac -lacI-IlvA * )[pMW119-IDO(Lvs.23)；pVIC40]菌株 的构建
1.1pMW119-IDO(Lvs，23)质粒的构建
对苏云金芽孢杆菌菌株2-e-2染色体的0.8kb DNA片段使用寡核苷酸SVS 170(SEQ ID No：3)和SVS 169(SEQ ID No：4)作为引物并使用纯化的染色体DNA作为模板加以扩增。使用下述PCR实验方法：起始循环为94℃下30秒；4个循环的94℃下40秒；49℃下30秒；72℃下40秒；35个循环的94℃下30秒；54℃下30秒；72℃下30秒。所得PCR片段使用BamHI和SacI内切核酸酶消化，并随即连接至之前经相同内切核酸酶处理的pMW119载体中。从而构建了质粒pMW119-IDO(Lys，23)(图1)。
1.2MG1655(P Lac -lacI-IlvA * )[pMW119-IDO(Lvs，23)；pVIC40]菌株的构建
将菌株MG1655(PLac-lacI-IlvA*)(Sycheva E.Vet al.，Biotechnologiya(RU)，No.4，22-34，(2003))的细胞用质粒pMW119-IDO(Lys，23)转化。所得克隆在X-gal/IPTG琼脂板上选择(蓝/白测试)。从而得到菌株MG1655(PLac-lacI-IlvA*)[pMW119-IDO(Lys，23)]。将该菌株MG1655(PLac-lacI-IlvA*)[pMW119-IDO(Lys，23)]用质粒pVIC40(RU 1694643，US 7,138,266)转化。在L-琼脂上用Sm选择所得克隆。从而获得菌株MG1655(PLac-lacI-IlvA*)[pMW119-IDO(Lys，23)，pVIC40]。
实施例2.通过大肠杆菌菌株MG1655(P Lac -lacI-IlvA * )[PMWI119- IDO(Lys，23).PVIC40]产生4HIL
为测试编码IDO的基因的表达对4HIL生产的作用，将MG1655(PLac-lacI-IlvA*)[pMW119，pVIC40]和MG1655(PLac-lacI-IlvA*)[pMW119-IDO(Lys，23)，pVIC40]菌株的细胞接种至培养基ILE[葡萄糖-60g/l、(NH4)2SO415g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO41g/l、硫胺素0.001g/l、胰蛋白胨1g/l、酵母提取物0.5g/l、CaCO325g/l、pH 7.0(KOH)、1mM IPTG、合适的抗生素(Ap，100mg/l；Sm，100mg/l)]中。在强烈搅拌下将细胞在32℃下培养72小时。
然后，通过HPLC分析调查Ile和4HIL的积累。对于HPLC分析，使用带荧光分光光度计1100系列(Agilent，USA)的高压层析(Waters，USA)。所选的检测波长范围：激发波长为250nm，发射波长的范围为320-560nm。通过accq-标记方法的分离在柱Nova-PakTM C18150x3.9mm，4μm(Waters，USA)在+40℃下进行。样品的注入体积为5μl。氨基酸衍生物的形成及其分离根据Waters生产商的推荐加以实施(Liu，H.et al，J.Chromatogr.A，828，383-395(1998)；Waters accq-tag chemistry package.Instruction manual.Millipore Corporation，pp.1-9(1993))。为获取具有6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯的氨基酸衍生物，使用试剂盒Accq-FluorTM(Waters，USA)。通过accq-标记方法的分析使用浓缩Accq-标记Eluent A(Waters，USA)进行。所有溶液使用Milli-Q water制备，将标准溶液储藏于4℃。
测量由MG1655(PLac-lacI-IlvA*)[pMW119，pVIC40]和MG1655(PLac-lacI-IlvA*)[pMW119-IDO(LyS，23)，pVIC40]菌株产生的Ile和4HIL的结果示于表1。如表1所示，MG1655(PLac-lacI-IlvA*)[pMW119-IDO(Lys，23)，pVIC40]产生了4HIL，与MG1655(PLac-lacI-IlvA*)[pMW119，pVIC40]不同。
表1
Figure BPA00001161555200111
虽然本发明参照其优选实施方式进行了详细描述，但是很明显对于本领域技术人员而言可以在不背离本发明范围的前提下进行多种改变，并使用等效手段。所有在此引用的文献均通过述及并入作为本申请的一部分。
工业实用性
根据本发明，能够增强通过用含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化的细菌的(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸产生，所述(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸作为具有促胰岛素活性的药物组合物的组分是有用的。
序列表
<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)
<120>生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的方法
<130>C890-C8278
<150>RU 2007147438
<151>2007-12-21
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>717
<212>DNA
<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株FERM BP-10688
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(717)
<223>
<400>1
aaa atg agt ggc ttt agc ata gaa gaa aag gta cat gaa ttt gaa tct       48
Lys Met Ser Gly Phe Ser Ile Glu Glu Lys Val His Glu Phe Glu Ser
1               5                   10                  15
aaa ggg ttt ctt gaa atc tca aat gaa atc ttt tta caa gag gaa gag       96
Lys Gly Phe Leu Glu Ile Ser Asn Glu Ile Phe Leu Gln Glu Glu Glu
            20                  25                  30
aat cat agt tta tta aca caa gca cag tta gat tat tat aat ttg gaa      144
Asn His Ser Leu Leu Thr Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Tyr Asn Leu Glu
        35                  40                  45
gat gat gcg tac ggt gaa tgc cgt gct aga tct tat tca agg tat ata      192
Asp Asp Ala Tyr Gly Glu Cys Arg Ala Arg Ser Tyr Ser Arg Tyr Ile
    50                  55                  60
aag tat gtt gat tca cca gat tat att tta gat aat agt aat gat tac      240
Lys Tyr Val Asp Ser Pro Asp Tyr Ile Leu Asp Asn Ser Asn Asp Tyr
65                  70                  75                  80
ttc caa tct aaa gaa tat aac tat gat gat ggc ggg aaa gtt aga cag      288
Phe Gln Ser Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Asp Gly Gly Lys Val Arg Gln
                85                  90                  95
ttc aat agc ata aat gat agc ttt tta tgt aat cct tta att caa aat      336
Phe Asn Ser Ile Asn Asp Ser Phe Leu Cys Asn Pro Leu Ile Gln Asn
            100                 105                 110
atc gtg cgt ttc gat act gag ttt gca ttt aaa aca aat ata ata gat      384
Ile Val Arg Phe Asp Thr Glu Phe Ala Phe Lys Thr Asn Ile Ile Asp
        115                 120                 125
aaa agt aaa gat tta att ata ggc tta cat caa gta aga tat aaa gct      432
Lys Ser Lys Asp Leu Ile Ile Gly Leu His G1n Val Arg Tyr Lys Ala
    130                 135                 140
act aaa gaa aga cca tct ttt agt tca cct att tgg tta cat aaa gat      480
Thr Lys Glu Arg Pro Ser Phe Ser Ser Pro Ile Trp Leu His Lys Asp
145                 150                 155                 160
gat gaa cca gta gta ttt tta cac ctt atg aat tta agt aat aca gct      528
Asp Glu Pro Val Val Phe Leu His Leu Met Asn Leu Ser Asn Thr Ala
                165                 170                 175
atc ggc gga gat aat tta ata gct aat tct cct cgg gaa att aat cag      576
Ile Gly Gly Asp Asn Leu Ile Ala Asn Ser Pro Arg Glu Ile Asn Gln
            180                 185                 190
ttt ata agt ttg aag gag cct tta gaa act tta gta ttt gga caa aag      624
Phe Ile Ser Leu Lys Glu Pro Leu Glu Thr Leu Val Phe Gly Gln Lys
        195                 200                 205
gtc ttc cat gcc gta acg cca ctt gga aca gaa tgt agt acg gag gct      672
Val Phe His Ala Val Thr Pro Leu Gly Thr Glu Cys Ser Thr Glu Ala
    210                 215                 220
ttt cgt gat att tta tta gta aca ttt tct tat aag gag aca aaa          717
Phe Arg Asp Ile Leu Leu Val Thr Phe Ser Tyr Lys Glu Thr Lys
225                 230                 235
<210>2
<211>239
<212>PRT
<213>苏云金芽孢杆菌菌株FERM BP-10688
<400>2
Lys Met Ser Gly Phe Ser Ile Glu Glu Lys Val His Glu Phe Glu Ser
1               5                   10                  15
Lys Gly Phe Leu Glu Ile Ser Asn Glu Ile Phe Leu Gln Glu Glu Glu
            20                  25                  30
Asn His Ser Leu Leu Thr Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Tyr Asn Leu Glu
        35                  40                  45
Asp Asp Ala Tyr Gly Glu Cys Arg Ala Arg Ser Tyr Ser Arg Tyr Ile
    50                  55                  60
Lys Tyr Val Asp Ser Pro Asp Tyr Ile Leu Asp Asn Ser Asn Asp Tyr
65                  70                  75                  80
Phe Gln Ser Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Asp Gly Gly Lys Val Arg Gln
                85                  90                  95
Phe Asn Ser Ile Asn Asp Ser Phe Leu Cys Asn Pro Leu Ile Gln Asn
            100                 105                 110
Ile Val Arg Phe Asp Thr Glu Phe Ala Phe Lys Thr Asn Ile Ile Asp
        115                 120                 125
Lys Ser Lys Asp Leu Ile Ile Gly Leu His Gln Val Arg Tyr Lys Ala
    130                 135                 140
Thr Lys Glu Arg Pro Ser Phe Ser Ser Pro Ile Trp Leu His Lys Asp
145                 150                 155                 160
Asp Glu Pro Val Val Phe Leu His Leu Met Asn Leu Ser Asn Thr Ala
                165                 170                 175
Ile Gly Gly Asp Asn Leu Ile Ala Asn Ser Pro Arg Glu Ile Asn Gln
            180                 185                 190
Phe Ile Ser Leu Lys Glu Pro Leu Glu Thr Leu Val Phe Gly Gln Lys
        195                 200                 205
Val Phe His Ala Val Thr Pro Leu Gly Thr Glu Cys Ser Thr Glu Ala
    210                 215                 220
Phe Arg Asp Ile Leu Leu Val Thr Phe Ser Tyr Lys Glu Thr Lys
    225                 230                 235
<210>3
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物SVS 170
<400>3
ctctagagga tccttaagaa ggagatatac catgaaaatg agtggcttta gcatagaaga    60
aaagg                                                                65
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物SVS 169
<400>4
gaattcgagc tcttattttg tctccttata agaaa                               35

Claims (4)

1.一种制备(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸生产细菌的方法，其包括将由SEQ ID No：1的核苷酸序列组成的DNA或编码由SEQ ID No：2的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA导入属于大肠杆菌的L-异亮氨酸生产细菌。
2.一种(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸生产细菌，其是由依照权利要求1所述的方法获得的。
3.一种生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，其包括：
在培养基中培养依照权利要求2的细菌；并
分离(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。
4.依照权利要求3所述的方法，其中所述细菌经过修饰而增强了L-异亮氨酸双加氧酶的活性，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的活性是通过增加编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达而增强的，且其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的表达是通过修饰编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达控制序列或通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的拷贝数而增加的。
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