KR102168039B1 - 대사공학적으로 조작된 미생물을 이용한 헴의 세포외 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 heme의 세포외 생성능을 가지는 미생물 변이체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 대사공학적으로 조작된 heme의 세포외 생성능을 가지는 미생물 변이체 및 이를 이용한 heme의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 포르피린증의 치료 건강식품 또는 식품보충제로서 사용이 증가하고 있는 착염인 heme을 기존의 화학합성이나 효소합성이 아닌 미생물 변이체를 이용하여 고수율로 세포외로 생산할 수 있는 효과가 있다.

Description

대사공학적으로 조작된 미생물을 이용한 헴의 세포외 생산방법{Method for Producing Exracellular Heme Using Metabolically Engineered Microorganism}

본 발명은 헴의 세포외 생성능을 가지는 미생물 변이체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 대사공학적으로 조작된 헴의 세포외 생성능을 가지는 미생물 변이체 및 이를 이용한 헴의 제조방법에 관한 것이다.

헴(heme)은 철이온(Fe²⁺)과 프로토포르피린(protoporphyrin)으로 구성된 포르피린 유도체로, 대부분의 원핵세포 및 진핵세포에서 발견되는, 산소를 운반하고, 활성 산소 종을 제거하며, 전자를 전달하여 에너지를 생성시키는 역할을 하는 착염이다. 헴(heme)은 건강관리 및 식품 보조제 산업에서, 생체 이용이 가능한 철 공급제로 널리 사용된다. 특히 hemin은 염화 리간드를 보유하는 3가 철이온 (Fe^{3 +})을 함유하는 산화된 형태의 heme 유도체로, 급성간헐성 포르피린증의 치료에 사용되고 있어 heme에 대한 수요가 증가하고 있다. 따라서, heme의 효율적인 생산은 지난 수십 년 동안 큰 관심의 대상이 되었다.

기존의 화학 합성을 통한 heme의 합성 및 유기물 추출 또는 효소 가수분해를 통한 식물 조직 및 동물 혈액으로부터의 heme 분리 방법은 복잡하고, 수율이 낮으며 시간이 오래 걸릴 뿐만 아니라 친환경적이지 않은 단점이 있다. 따라서, 재조합 미생물, 그 중에서도 대장균을 이용한 생합성 방법을 통해 heme을 생산하려는 몇몇 시도가 있어 왔다. 그러나 생산된 heme이 세포 내에 축적되기 때문에 추후 이용을 위해서는 세포로부터 heme 추출이 불가피하여, 기존의 heme 생산 한계점을 극복하지 못하였다. 미생물을 이용하여 생산한 heme을 헴단백질이나 헴펩타이드 형태로 세포 바깥으로 생산하는 시도가 있었으나(EP 0,631,631; US 5,681,725; 및 US2016-0340411), 자유 heme을 생산하기 위해서는 여전히 세포 밖으로 분비된 헴프로테인이나 헴펩타이드로부터의 추출이 필요하다. 따라서 자유 heme의 친환경적이고 경제적인 산업적 생산을 위해서는 자유 heme의 세포외 생산 구현이 필요하다.

Heme은 거의 모든 미생물에게 필수적인 화합물이지만 고농도로 존재할 경우 다양한 미생물에서 독성을 유발한다(Anzaldi et al., Infect.Immun. 78, 4977-4989, 2010). 일부 미생물은 heme이나 heme이 축적되어 발생하는 독성 대사물질을 세포 바깥으로 능동적으로 수송하여 heme 내성을 획득한다. 대장균에서는 세포 내에서 합성된 자유 heme을 주변 세포질로 분비해 시토크롬 c의 생합성에 관여하는 단백질에 heme을 공급하는 heme 엑스포터 (heme exporter)를 암호화하는 유전자 ccmABC가 알려진 바 있다(Feissner et al., Mol. Microbiol. 61:219-231, 2006). 비록 해당 유전자가 자유 heme으로 인한 독성 내성에 관여하는지는 보고된 바가 없으나, 본 발명자들은 자유 heme의 생합성을 증진시킴으로써 ccmABC 유전자로부터 발현한 heme 엑스포터에 의한 세포 밖으로의 heme 분비를 촉진시키고, 이를 통해 세포외 자유 heme 생산이 가능할 것이라고 판단하였다.

Heme의 생합성은 5-aminolevulinate(ALA)의 생합성으로부터 시작한다.(도 1)(Layer G. et al., Protein Sci. 19:1137-1161, 2010).ALA는 종에 따라 두 가지 다른 경로 (C4 또는 C5 경로)를 통해 합성되고, Archaea, 식물 및 대부분의 박테리아는 글루타밀-tRNA 합성 효소(GluRS), 글루타밀-tRNA 환원 효소(GluTR) 및 글루타메이트-1-세미알데히드 2,1-아미노뮤테이즈(GSAM)에 의해 촉매되는 일련의 반응을 통해 L-글루타메이트를 ALA로 전환시키는 C5 경로를 보유하고 있다. 반면, 인간을 비롯한 동물, 균류 및 자색 비황 광영양세균은 ALA 합성효소(ALAS)에 의해 L-글리신 및 숙시닐-CoA를 ALA로 전환시키는 C4 경로를 보유하고 있다. 미생물을 이용한 ALA 생산을 위해서는 두 경로 모두가 활발하게 연구되어왔으나 (Ding et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 44:1127-1135, 2017.; Zhang et al., Sci. Rep. 5:8584, 2015; Kang et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 33 doi: 10.1007/s11274-017-2366-7, 2017), heme을 생산하는 데에는 C5 ALA 생합성 경로를 이용한 보고가 없다.

Heme 생합성 경로의 하류에서는, C4 혹은 C5 경로를 통해 합성된 ALA 두 분자가 포르포빌리노겐 합성효소(porphobilinogen synthase, PBGS)에 의해 축합되어 포르포빌리노겐(porphobilinogen, PBG)을 형성한다. 4분자의 PBG는 포르포빌리노겐 디아미네이즈(porphobilinogen deaminase, PBGD)에 의해 1-히드록시메틸부탄(HMB)으로 축합되고, 우로포르피리노겐 III 합성효소(Uroporphyrinogen III synthase; UROS)에 의해 HMB의 고리화가 일어난다(도 1). 이어서, 우로포르피노겐 III 디카르복실레이즈(uroporphyrinogen III decarboxylase, UROD), 코프로포르피리노겐 III 옥시데이즈(coproporphyrinogen III oxidase, CPO) 및 프로토포르피리노겐 옥시데이즈(protoporphyrinogen oxidase, PPO)에 의해 촉매된 탈카복실화 및 산화 반응을 포함하는 후속 반응으로 우로포르피리노겐 III(uroporphyrinogen III)를 프로토포르피린 IX로 전환시킨다. 마지막으로 페로킬레테이즈(FECH)는 제1철(Fe²⁺)을 삽입하여 프로토포르피린 IX를 heme으로 전환시킨다.

대장균을 조작하여 heme을 생산하려는 몇몇 시도가 있었으며, 첫 번째 연구는 C4 경로의 ALAS를 코딩하는 Rhodobacter capsulatus 유래 hemA 유전자 (hemA _Rca )를 비롯하여, 대장균유래 hemB, hemC, hemD 및 Synechocystis sp. 유래의 hemF 및 바실러스 서브틸리스 유래의 hemH 및 hemH를 포함하는 8개의 유전자를 항시적으로 과발현시킨 대장균 변이체를 제작하였다. 상기 대장균 변이체는 LB 배지에서 3.3±0.3μM(2.03±0.18mg/L)의 heme을 생산하였다(Kwon S. J. et al., Appl. Environ. Microbiol. 69: 4875-4883, 2003). 그러나, 이 방법은 전구체(L-glycine과 succinyl-CoA)의 공급이 제한되어 있고, 최적이 아닌 heme 생합성 경로를 사용하기 때문에 수율이 낮았다.

다른 연구에서, ALAS를 코딩하는 Rhodobacter sphaeroides 유래 hemA 유전자 (hemA _Rsp ), NADP 의존성 말산탈수소효소를 코딩하는 내인성 maeB 및 디카르복실레이트 트랜스포터를 코딩하는 내인성 dctA를 대장균에서 함께 발현시켰다.이 균주는 10g/L 숙신산 및 2g/L의 글리신을 첨가한 LB 배지에서 6.4 mg/L의 heme을 생산하였다(Kwon O. H. et al., J. Microbiol. Biotechnol. 19:604-609, 2009). 이 균주를 이용한 추가 연구에서, 내재적인 coaA (판토텐산 키나아제를 암호화 함), hemB, hemC, hemD 및 hemE 유전자를 과발현시키는 경우, 0.49μmol gDCW^-1의 heme을 생산하였으며, 실제 heme 농도는 바이오매스 농도가 기재되지 않았기 때문에 알 수 없었다(Lee M. J. et al. J. Microbiol. Biotechnol. 23:668-673, 2013). 최근의 연구에서, 상기 연구자들은 연속 배양으로 250 mL 용량의 배양기에서 9.1 μmol의 gDCW^-1 heme (여기서도, 바이오매스 농도를 알 수 없음)을 생산하였다(Pranawidjaja S. et al., J. Microbiol. Biotechnol. 25:880-886, 2015). 상기 기술된 재조합 대장균 균주에 의해 heme이 생성될 수 있지만, 최종 heme의 수율은 매우 낮았으며, 세포 밖으로의 자유 heme 분비가 보고된 바 없다. 상기 연구들에서 heme의 생산량이 낮은 것은 주로 heme 생합성을 위한 heme 전구체를 공급하는 데 있어서, 최적경로가 아닌 대사 경로를 사용하였기 때문이다. 또한, L-글리신 및 숙신산의 첨가는 대규모 생산에 바람직하지 않다.

따라서 heme의 효율적인 생산을 위한 고성능 heme 생산 미생물을 제조하고, heme 생산량 증가에 따른 세포 밖으로의 heme 분비를 확인하여, 효과적으로 세포외 자유 heme을 생산하는 재조합 미생물 제조가 필요하다.

이에, 본 발명자들은 heme을 고수율로 생산하여, 세포외로 분비할 수 있는 변이체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 대장균에서 헴의 전구체인 5-아미노레불린산의 생산을 증가시킬 수 있는 C5 경로와 heme 생합성 경로를 과발현시킨 변이체가, 기존 heme 생성균주들 보다 월등한 수율로 heme을 생성할 뿐만 아니라, heme을 세포외로 생산한다는 것을 확인하였다. 이에, heme을 세포외로 분비하는 유전자인 ccmABC를 추가적으로 과발현시킴으로써, heme 생산량을 보다 향상시키고 세포외로의 자유 heme 분비 역시 더욱 향상시킨 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 heme을 고수율로 생성하면서, 생성된 heme을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물 변이체를 이용한 heme의 세포외 분비·생산방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 C5 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자를 가지고 있는 미생물에서, heme 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 heme을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 미생물 변이체를 배양하여 heme을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 heme을 수득하는 단계를 포함하는 heme의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 포르피린증의 치료 및 건강식품 또는 식품보충제로서 사용이 증가하고 있는 착염인 heme을 기존의 화학합성이나 효소합성이 아닌 미생물 변이체를 이용하여 고수율로 세포외로 분비·생산함으로써, 생산한 heme을 이용하기 위해 필요한 정제 과정을 친환경적이고 경제적이며 용이하게 할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 heme 생성을 위한 생합성 경로를 나타낸 것이다. 굵게 표시된 항목들은 본 발명에 따른 HEME7 균주에서 해당 유전자가 과발현된 것들을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 대장균에서 heme을 고수율로 생산하기 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 HEME1, HEME2, HEME3, HEME4, HEME5 및 HEME6 균주의 플라스크 배양에 의한 ALA 및 heme 생산량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 HEME6 균주의 TB, TB-Fe7.5, LB, LB-Fe7.5, MR-Fe0, MR-Fe7.5 배지를 이용한 플라스크 배양에 의한 heme 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 HEME6 균주의 배양에 이용한 배지 상의 FeSO₄7H₂O의 농도를 달리함에 따른 플라스크 배양에 의한 heme 생산량을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 HEME6 균주의 배양 온도를 달리함에 따른 플라스크 배양에 의한 heme 생산량을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 HEME6 균주의 회분식 배양에 의한 heme의 생산량을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 HEME6 균주의 유가식 배양에 의한 heme의 생산량을 나타낸 것으로, 배양시 유입 용액의 성분을 다음과 같이 달리하여 배양한 것이다 (a) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, 20 mg/L FeSO₄·7H₂O; (b) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, 20 mg/L FeSO₄·7H₂O, 5 g/L (NH₄)₂SO₄; (c) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, 20 mg/L FeSO₄·7H₂O, 20 g/L l-glutamate.
도 9는 본 발명에 따른 HEME7 균주의 유가식 배양에 의한 heme의 생산량을 나타낸 것으로, 배양시 유입 용액의 성분을 다음과 같이 달리하여 배양한 것이다 (a) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, 20 mg/L FeSO₄·7H₂O, 5 g/L (NH₄)₂SO₄; (b) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, 20 mg/L FeSO₄·7H₂O, 20 g/L l-glutamate.

Heme은 건강관리 및 식품 보충제 산업에서 널리 응용되고 있는 착염으로, 기존에는 화학적 합성, 유기물 추출 또는 효소 가수 분해를 통해 제작되고 있으나, 복잡하고, 수율이 낮아 미생물을 이용하여 고수율로 heme을 생성하고자 대장균 변이체를 제작하였다. 또한 생산한 heme을 세포 내에 축적하는 기존의 대장균 변이체와 달리 생산한 자유 heme을 세포 밖으로 분비해 추후 자유 heme의 회수를 용이하게 하는 대장균 변이체를 제작하였다.

Heme은 미생물에게 필수적인 화합물이지만 고농도로 존재할 경우 독성을 유발하기 때문에, 일부 미생물은 heme이나 heme 축적으로 인해 축적되는 독성 대사물질을 세포 바깥으로 능동적으로 수송함으로써 heme 내성을 획득한다. 대장균의 경우 시토크롬 c의 생합성에 관여하는 단백질에 heme을 공급하는 heme 엑스포터 (heme exporter)를 암호화하는 유전자 ccmABC가 알려진 바 있으나 (Feissner et al., Mol. Microbiol. 61:219-231, 2006), 해당 유전자가 자유 heme으로 인한 독성 내성에 관여하는지는 보고된 바가 없다. 그럼에도 본 발명자들은 자유 heme의 생합성을 증진시킴으로써 ccmABC 유전자로부터 발현된 heme 엑스포터에 의한 세포 밖으로의 heme 분비를 촉진시키고, 이를 통해 세포외 자유 heme 생산이 가능할 것이라고 판단하였다.

기존에 대장균을 이용한 heme 생산 변이체는 L-글리신과 숙신산 공급과 함께 C4 경로를 제공하는 5-아미노레불린산을 통해 heme을 생산하도록 설계되었지만 최종 heme 생산수율은 매우 낮았다. 본 발명자들은 heme을 보다 효율적으로 생산하기 위하여, L-glutamate를 5-아미노레불린산으로 전환시키는 C5 경로를 이용한, 공학적으로 설계된 대장균 균주를 제작하였으며, 여러 가지 전략을 사용하여 대장균에서의 heme 생산을 향상시켰다(도 2).

첫째, 전구물질을 공급하지 않고 ALA를 생산하는 C4 및 C5 경로의 용량을 조사하였으며, C4 경로에 비해 C5 경로의 우수한 성능을 확인한 후에, C5 경로의 대사 유전자 및 heme 생합성을 위한 하류 경로를 과발현시켰다. 다음으로, heme 생합성과 관련된 대사 경로는 관련 유전자의 발현 수준을 조절하여 최적화시켰다. 추가적인 heme 생산성 향상을 위하여, heme 분해효소를 코딩하는 유전자로 추정되는 yfeX와 락테이트 및 아세테이트 합성경로를 결실시켰으며, 회분식 발효를 통하여 고수율로 heme이 생성되는 것을 확인하였으며, 또한, 생성된 heme이 세포외로 분비되는 것을 확인하였다. 또한, heme을 세포외로 분비하는 heme exporter를 암호화하는 ccmABC 유전자를 과발현한 대장균 변이체를 제조하고, 회분식 발효를 통하여 heme이 보다 고효율로 생성되는 것을 확인하였으며, 또한, 생성된 heme 중 보다 많은 비율이 세포외로 분비되는 것을 확인하였다.

따라서,본 발명은 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자를 가지고 있는 미생물에서, heme 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 heme을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체에 관한 것이다.

본 발명에서 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자를 가지고 있는 미생물은 야생형으로서 상기 유전자들을 가지고 있는 미생물뿐만 아니라, 상기 유전자들이 도입되어 있는 미생물을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 변이체는 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

Heme을 생합성하기 위해서는 전구체인 5-aminolevulinate (ALA) 필요하며, ALA 생합성 경로에는 C4 경로와 C5 경로가 존재한다. ALA 생산을 위한 미생물 변이체에 C4 경로와 C5 경로가 이용된 사례가 모두 있으나, heme을 생합성하기 위한 변이체에서 C5 경로를 적용한 것은 본 발명이 처음이다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 탄소원으로부터 알파-케토글루타르산을 생성할 수 있는 미생물을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

기존의 C4 경로를 채용한 heme 생합성능을 가지는 미생물의 경우, 배양 시에 ALA의 전구체인 숙신산과 글리신을 첨가해 주어야 하였으며, 글리신의 경우 세포독성을 가지기 때문에 고농도로 첨가할 수 없는 문제가 있었다. 또한, 숙신산과 글리신을 첨가해 주어도, 최종적인 heme 생산량은 6.4 mg/L 정도에 불과하였다.

본 발명에서는 heme의 생산성이 높은 미생물 변이체를 제작하기 위하여, C4 경로와 C5 경로를 가지는 미생물 변이체를 각각 제조하고, heme 생성능을 확인하였다.

본 발명에서 사용가능한 미생물 균주는 박테리아, 고세균, 효모, 곰팡이, 원생동물 (편모충류, 아메바류, 깃편모충류, 리조리아, 크로말베올라타), 동물세포, 미세조류, 식물세포 등을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 Escherichia coli, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Pseudomonas sp., Anacystis sp., Anabena sp., Chlorobium sp., Chloroflexus sp., Clostridium sp., methanobacterium, Propionibacterium sp., Rhodopsueomonas sp., Rhodobacter sp., Rhodovulum sp., Streptococcus sp., Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Arabidopsis sp.,Glycine sp., Nicotiana sp., Zea sp. 등을 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactococcus lactis, Aspergillus niger, Saccharomyceses cerevisiae, Saccharomyces pombe 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에서, C4 경로와 C5 경로를 각각 도입한 대장균을 배양 시에 전구체를 첨가하지 않고 배양하는 경우, C5 경로에서 더 많은 ALA를 생산하였다. 따라서, 본 발명에서는 heme 생합성에 C5 경로를 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 C5 생합성 경로에 관여하는 유전자는 글루타밀-tRNA 합성 효소 (GluRS)를 암호화하는 gltX, 글루타밀-tRNA 환원효소 (GluTR)를 암호화하는 hemA 및 글루타메이트-1-세미알데히드 2,1-아미노뮤테이즈 (GSAM)를 암호화하는 hemL 이고, 상기 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자는 포르포빌리노겐 합성 효소 (PBGS)를 암호화하는 hemB, 포르포빌리노겐 디아미네이즈 (PBGD)를 암호화하는 hemC, 우로포르피리노겐 III 합성효소 (UROS)를 암호화하는 hemD, 우로포르피리노겐 III 디카르복실레이즈 (UROD)를 암호화하는 hemE, 코프로포르피리노겐 III 옥시데이즈 (CPO)를 암호화하는 hemF, 프로토포르피리노겐 옥시데이즈 (PPO)를 암호화하는 hemG 및 페로킬레테이즈(FECH)를 암호화하는 hemH인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 변이체는 heme 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 변이체는 heme 또는 heme 중간체 분해 효소를 암호화하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 heme 또는 heme 중간체 분해 효소를 암호화하는 유전자는 yfeX 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, C5 경로를 각각 도입한 대장균에 heme 생합성 경로의 유전자들을 함께 과발현시키고, 각 효소의 발현에 이용한 벡터를 최적화하고, 초산 및 젖산 생산에 관여하는 유전자를 결실시키고, 기존에 heme의 분해에 관여하는지에 대한 여부에 논란이 있어온 yfeX 유전자를 결실시킨 대장균 변이체의 경우, 7.5 mg/L FeSO₄7H₂O를 첨가한 LB 배지를 이용한 플라스크 배양에서, 7.13 mg/L의 heme을 생산하였다.

따라서, 본 발명에서는 yfeX 유전자의 넉아웃이 heme 생산량을 증가시킨다는 것을 최초로 확인하였다.

본 발명의 다른 양태는 ALA의 C4 경로가 과발현된 미생물에 yfeX 유전자가 결실되어 있는 변이체에 관한 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 양태에서는 상기 제작한 대장균 변이체 균주를 5 g/L yeast extract가 첨가되고 FeSO₄7H₂O 농도가 7.5 mg/L로 조정된 MR 배지에서 플라스크 배양한 경우, 7.45 mg/L heme을 생산하였으며, 배양 시간 및 온도 최적화를 진행하여, IPTG에 의한 단백질 과발현을 유도 후, 30℃에서 60시간 배양한 결과 7.78 mg/L의 heme을 생산하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 본 발명에 따른 상기 대장균 변이체 및 최적화 조건을 이용하여, 회분식 발효를 수행한 결과, 56시간 배양 시에 총 14.24mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 1.18mg/L(8.29%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 본 발명에 따른 상기 대장균 변이체를 유가식 배양(fed-batch culture)한 결과, 56시간째에 49.18mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 16.77 mg/L(34.10%)의 heme이 세포 바깥에서 확인되었다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 heme 한 분자에 N 원자가 4개 필요하므로 질소원 결핍(nitrogen deficiency)의 우려를 해소하기 위하여, (NH₄)₂SO₄를 첨가하여 유가식 배양한 결과, 104.90mg/L의 heme을 생산하였다. 이중 54.61mg/L(52.06%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 (NH₄)₂SO₄를 대신하여, C5 ALA 생합성 경로의 전구체인 l-glutamate을 첨가하여 배양한 결과, 64시간째에, 228.46mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 131.90 mg/L(57.734%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.

상기 결과들을 고려하면, 생산된 heme의 총량이 증가함에 따라, 세포외로 분비되는 heme의 비율이 증가하는 것을 알 수 있다. 이는 세포 내의 높은 heme 농도가 세포에 독성을 나타내기 때문에, 본 발명자들이 수립한 가설과 같이 heme export의 기능 혹은 발현이 촉진되었을 수 있다고 판단하였다. 따라서 heme exporter를 암호화하는 것으로 알려진 ccmABC 유전자를 과발현시킬 경우 세포 밖으로의 heme 분비가 더욱 촉진되고, 그 결과 세포내 자유 heme으로 인한 독성이 줄어 heme 생산량 역시 증가할 것으로 판단하여, ccmABC 유전자를 과발현 시키는 방법을 시도하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 C5 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자가 과발현되어 있고, heme 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있어 heme을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체를 배양하는 것을 특징으로 하는 heme의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서는 상기 heme 생성 변이 대장균 균주에서, heme export를 코딩하는 ccmABC 유전자를 과발현시킨 균주를 (NH₄)₂SO₄ 첨가조건에서 유가식으로 배양한 결과, 배양 64시간에 114.79 mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 71.91mg/L(62.64%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.

본 발명의 다른 양태에서는, 본 발명의 균주를 glutamate 첨가조건에서, 유가식 배양한 결과, 배양 72시간째에, 246.69mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 164.12mg/L(66.53%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.

본 발명의 미생물 변이체를 이용한 heme의 생산의 경우, 일 실시예에서, 전구체 첨가 여부에 따라, 114.79mg/L 또는 246.69 mg/L의 heme을 생산하였으며, 이는 기존 heme 생성 대장균 변이체가 6.4 mg/L의 heme을 생성한 것과 비교하여 각각 17.9배 또는 38.5배의 수율을 나타내는 것이다.

또한, 본 발명에서는 미생물의 heme 생산량이 증가함에 따라 세포외 heme의 비율도 증가한다는 것을 최초로 확인하였으며, heme exporter 유전자 ccmABC를 과발현시키는 경우, 세포외 heme의 비율이 증가될 뿐만 아니라, 세포 전체의 heme의 생산량이 증가한다는 것을 최초로 확인하였다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 실시예 및 하기 실시예들에서 사용한 제한효소는 New England Biolabs (미국) 및 Enzynomics(한국), PCR 중합효소는 BIOFACT(한국), DNA 접합 효소 (DNA ligase)는 Elpis Biotech (한국)에서 구입하였다. 이외의 것에 대해서는 별도로 표시하였다.

실시예 1: 고효율 heme 생산을 위한 ALA 생합성 경로 선정

1-1: C4 및 C5 ALA 생합성 유전자를 발현하는 벡터(pRSF-C4 및 pRSF-C5)의 제작

E. coli 균주 BL21(DE3) (Studier et al.,, J. Mol. Biol. 189:113-130, 1986)에서 C4 및 C5 ALA 생합성 유전자를 발현할 수 있는 벡터 pRSF-C4 및 pRSF-C5를 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

C4 ALA 생합성 유전자를 발현할 수 있는 벡터 pRSF-C4는 pRSFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 Rhodobacter sphaeroides 2.4.1에서 유래한 aminolevulinic acid synthase (ALAS)의 유전자(hemA _Rsp )와 E. coli에서 유래한 maeB 및 coaA 유전자를 삽입하여 제작하였다. Rhodobacter sphaeroides 2.4.1에서 유래한 hemA _Rsp 유전자를 증폭하기 위해 E. coli의 코돈출현빈도 (codon usage)에 따라 코돈 최적화 (codon optimization)이 된 hemA _Rsp 유전자(서열번호 1)를 합성하여(Genotech, Korea) 템플릿을 준비하였으며, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. E. coli에서 유래한 maeB(서열번호 4) 및 coaA 유전자(서열번호 5)는 E. coli BL21(DE3)의 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하고 각각 서열번호 6과 서열번호 7의 프라이머 및 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 7의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 coaA 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.

서열번호	염기서열
서열번호 2	5′-CATGCCATGG ATTATAACCT GGCACTGG-3′
서열번호 3	5′-CCGGAATTCT TAGGCAACCA CTTCCGC-3′
서열번호 6	5′-GAAGATCTAT GGATGACCAG TTAAAACAAA G-3′
서열번호 7	5′-CCGCTCGAGT TACAGCGGTT GGGTTTG-3′
서열번호 8	5′-CGAGCTCATA AAAGGAGGAA AATATATGAG TATAAAAGAG CAAACGTT-3′
서열번호 9	5′-ACGCGTCGAC TTATTTGCGT AGTCTGACCT CT-3′

증폭한 서열은 각각 BglII와 XhoI, SacI과 SalI, 그리고 NcoI과 EcoRI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pRSFDuet-1 벡터(Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 최종적으로 pRSF-C4를 제작하였다.

C5 ALA 생합성 유전자를 발현할 수 있는 벡터 pRSF-C5는 E. coli에서 유래한 gltX(서열번호 10), hemL(서열번호 11) 및 음성 피드백 저항성 hemA (hemA ^fbr ) 유전자(서열번호 12)를 삽입하여 제작하였다. 각 유전자는 E. coli BL21(DE3)의 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하고 각각 서열번호 13과 서열번호 14의 프라이머, 서열번호 15와 서열번호 16의 프라이머, 그리고 서열번호 17과 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 15의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemL 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다. 또한 서열번호 17의 프라이머에 포함된 threonine과 leucine을 암호화하는 염기서열에 의하여 BL21(DE3) 유래 hemA 유전자가 음성 피드백 저항성 hemA (hemA ^fbr )로 전환되었다.

서열번호	염기서열
서열번호 13	5′-GGAATTCCAT ATGAAAATCA AAACTCGCTT C-3′
서열번호 14	5′-CCGCTCGAGT TACTGCTGAT TTTCGCGT-3′
서열번호 15	5′-CGAGCTCATA AAAGGAGGAA AATATATGAG TAAGTCTGAA AATCTTTACA G-3′
서열번호 16	5′-AAGGAAAAAA GCGGCCGCTC ACAACTTCGC AAACACC-3′
서열번호 17	5′-CATGCCATGG GTACCAAGAA GCTTTTAGCA CTCGGTATCA ACC-3′
서열번호 18	5′-CGCGGATCCC TACTCCAGCC CGAGGCT-3′

증폭한 gltX, hemA ^fbr , hemL 유전자 서열은 각각 NdeI과 XhoI, NcoI과 BamHI, 그리고 SacI과 NotI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pRSFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 최종적으로 pRSF-C5를 제작하였다.

1-2: C4 및 C5 ALA 생합성 유전자를 과발현한 E. coli BL21(DE3) 균주의 ALA 생산능 비교

C4 및 C5 ALA 생합성 경로를 도입한 균주에 각 경로가 사용하는 전구체 (C4 ALA 생합성 경로의 경우, glycine과 succinate, C5 ALA 생합성 경로의 경우, glutamate)를 공급하지 않고 배양하였을 때, ALA 생산능을 비교하기 위하여, E. coli BL21(DE3) 균주에 실시예 1-1에서 제작한 pRSF-C4 및 pRSF-C5 벡터를 각각 도입하여 E. coli C4 균주 및 C5 균주를 제작하였다(표 3). 음성대조군으로는 E. coli BL21(DE3)를 이용하였다 (표 3).

Strain	Description
BL21(DE3)	E. coli BL21(DE3)
C4	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C4
C5	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5

표 3에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin이 첨가된 5 mL LB 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. 상기 균주를 이용하여 ALA를 생산하기 위하여, 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한 동일 배지 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다. 그 결과, BL21(DE3) 균주(음성대조군)와 C4 균주 및 C5 균주에서 각각 0.02g/L, 0.31g/L 및 1.74g/L ALA가 생산되어, 전구체를 공급하지 않는 경우 C5 ALA 생합성 경로가 C4 ALA 생합성 경로보다 5배 이상 높은 ALA를 생산하는 것으로 나타났다 (도 2a). 따라서 추후 heme 생산 균주 제작에 있어 ALA 생합성을 위해 C5 ALA 생합성 경로를 이용하기로 결정하였다.

실시예 2: C5 ALA 생합성 경로를 도입한 heme 생산 균주 제작

2-1: Heme 생산을 위한 과발현 표적 유전자 선정

ALA 생합성 경로를 통해 생산된 ALA로부터 heme을 생산하는 데에 hemB, hemC, hemD, hemE, hemF, hemG, hemH 유전자로부터 발현된 효소들이 필요하다 (도 1). E. coli는 내재적으로 상기 유전자를 보유하고 있어 야생형 균주도 heme을 생산할 수 있으나, 생존에 필수적인 만큼만 heme을 생산하기 때문에 생산된 heme은 대부분 단백질과 결합한 형태로 존재하여 야생형 균주에서는 자유 heme을 검출하기 어렵다. 따라서 자유 heme을 과생산하기 위해서는 상기 유전자를 과발현시켜 ALA로부터 heme을 생산하는 데 포함되는 대사의 흐름을 증가시켜야 하나, 상기 유전자를 모두 과발현시킬 경우 단백질의 과도한 과발현으로 인해 heme 생산 균주의 대사에 과부하가 발생할 수 있다고 판단하였다. 따라서 heme을 과생산하는 데 E. coli BL21(DE3) 균주 고유의 발현 강도가 충분하지 않아 추가적인 과발현이 필수적인 유전자만을 선정하고 최소한의 heme 생합성 유전자만을 선택적으로 과발현시킴으로써, 단백질 과발현으로 인한 균주의 과부하를 최소화하고 heme 과생산을 극대화하기로 하였다.

(a) Heme 생산을 위한 hemB 및 hemH 유전자의 과발현 필요성 확인

Heme 생합성 유전자 중 hemB 유전자(서열번호 19) 및 hemH 유전자(서열번호 20)를 과발현시킬 경우 heme 생산에 전구체로 사용되는 ALA의 생산량이 감소하며 (Zhang et al., Sci. Rep. 5, 8584, 2015), 반대로 상기 두 유전자의 발현량을 감소시킬 경우 ALA로부터 heme을 생산하는 대사경로의 대사량이 감소한다는 보고가 있다(Li et al., FEMS Microbiol. Lett. 350, 209-215, 2014). 따라서 효과적인 heme 과생산을 위해서는 hemB 및 hemH 유전자의 과발현이 필수적이라고 판단하였다.

상기 두 유전자를 과발현하며 C5 ALA 생합성 경로를 과발현시키는 플라스미드와 간섭을 일으키지 않는 벡터 pET-hemBH는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemB와 hemH 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 21과 서열번호 22의 프라이머 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이어머를 이용하였다.

서열번호	염기서열
서열번호 21	5′-GGAATTCCAT ATGACAGACT TAATCCAACG C-3′
서열번호 22	5′-CCGCTCGAGT TAACGCAGAA TCTTCTTCTC AG-3′
서열번호 23	5′-GGAATTCCAT ATGCGTCAGA CTAAAACCGG-3′
서열번호 24	5′-CCGCTCGAGT TAGCGATACG CGGCAAC-3′

증폭한 서열은 NdeI과 XhoI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pETDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 각각 삽입하여 pET-hemB 및 pET-hemH를 제작하였다.

E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머를 이용해 hemB 유전자를 증폭하였으며, 증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pET-hemH 벡터에 삽입하여 최종적으로 pET-hemBH를 제작하였다.

서열번호	염기서열
서열번호 25	5′-CATGCCATGG GTACAGACTT AATCCAACGC-3′
서열번호 26	5′-CGCGGATCCT TAACGCAGAA TCTTCTTCTC AG-3′

상기 제작한 pET-hemB, pET-hemH 및 pET-hemBH를 재조합 E. coli C5 균주에 각각 도입하여 E. coli C5-B, C5-H 및 C5-BH 균주를 제작하였다(표 6).

Strain	Description
C5-B	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5 and pET-hemB
C5-H	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5 and pET-hemH
C5-BH	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5 and pET-hemBH

상기 제작한 E. coli 균주들의 ALA, heme 및 heme 생합성 중간체 (uroporphyrinogen III, coproporphyrinogen III, protoporphyrin IX) 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 6에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin 및 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220rpm의 조건에서 12시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본 배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO₄7H₂O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.

또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 여과한 뒤 HPLC를 이용하는 기존에 알려진 방법으로 heme 농도를 측정하였다(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012).

Heme 생합성 중간체 확인에는 heme 생산량 확인에 이용한 것과 동일한 샘플을 이용하되, HPLC-MS를 이용하는 기보고된 방법 (Pranawidjaja et al., J. Microbiol. Biotechnol. 25, 880-886, 2015; Bu et al., J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 783, 411-423, 2003)을 이용하였다.

그 결과, 예상대로 C5-BH 균주가 다른 두 균주보다 많은 양의 heme 생합성 중간체인 uroporphyrinogen III 및 coproporphyrinogen III)를 생산하였다(표 7). 또한, C5-B 및 C5-H와 비교해 C5-BH에서 더 적은 양의 ALA가 확인되었다. 그러나 표 6에 개시된 세 균주 모두에서 자유 heme을 검출할 수는 없었다.

Strains	ALA (g l-1)	Uroporphyrinogen III (AU)b	Coproporphyrinogen III (AU)b	Protoporphyrin IX (AU)b	Heme (g l-1)
C5-B	0.712	153	119	-	-
C5-H	1.409	-	-	-	-
C5-BH	0.726	787	158	-	-

(b) Heme 과생산을 위한 hemC , hemD , hemE , hemF 및 hemG 유전자의 과발현 필요성 확인

Heme 생합성 유전자 중 hemB 및 hemH 유전자를 제외한 나머지 다섯 유전자 (hemC(서열번호 27), hemD(서열번호 28), hemE(서열번호 29), hemF(서열번호 30), hemG(서열번호 31) 중 heme 과생산을 위해 필수적으로 과발현시켜야 하는 유전자를 선별하기 위해 C5-BH 균주에서 상기 5개 유전자를 각각 과발현시킨 후, heme 생산 및 heme 생합성 중간체의 생산 프로필을 분석하였다. 상기 다섯 가지 유전자를 각각 과발현시키는 플라스미드 pCDF-hemC, pCDF-hemD, pCDF-hemE, pCDF-hemF 및 pCDF-hemG는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemC, hemD, hemE, hemF, 및 hemG 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 32와 서열번호 33의 프라이머, 서열번호 34와 서열번호 35의 프라이머, 서열번호 36과 서열번호 37의 프라이머, 서열번호 38과 서열번호 39의 프라이머 및 서열번호 40과 서열번호 41의 프라이머를 이용하였다.

서열번호	염기서열
서열번호 32	5′-CATGCCATGG GTATGTTAGA CAATGTTTTA AGAATTGC-3′
서열번호 33	5′-CGCGGATCCT CATGCCGGAG CGTCTC-3′
서열번호 34	5′-CATGCCATGG GTATGAGTAT CCTGGTCACC CG-3′
서열번호 35	5′-CGCGGATCCT TATTGTAATG CCCGTAAAAG C-3′
서열번호 36	5′-CATGCCATGG GTATGACCGA ACTTAAAAAC GATC-3′
서열번호 37	5′-CCGGAATTCT TAGCGGTGAT ATTGTTCAGA C-3′
서열번호 38	5′-CATGCCATGG GTATGAAACC CGACGCACAC-3′
서열번호 39	5′-CGCGGATCCT TACACCCAAT CCCTGACCT-3′
서열번호 40	5′-CATGCCATGG GTGTGAAAAC ATTAATTCTT TTCTCAAC-3′
서열번호 41	5′-CGAGCTCTTA TTTCAGCGTC GGTTTGTC-3′

증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI, NcoI과 BamHI, NcoI과 EcoRI, NcoI과 BamHI 및 NcoI과 SacI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pCDFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 각각 삽입하여 pCDF-hemC, pCDF-hemD, pCDF-hemE, pCDF-hemF 및 pCDF-hemG를 제작하였다.

상기 제작한 pCDF-hemC, pCDF-hemD, pCDF-hemE, pCDF-hemF 및 pCDF-hemG를 재조합 E. coli C5-BH 균주에 각각 도입하여 E. coli C5-BCH, C5-BDH, C5-BEH, C5-BFH 및 C5-BGH 균주를 제작하였다 (표 9).

Strain	Description
C5-BCH	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5, pET-hemBH, and pCDF-hemC
C5-BDH	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5, pET-hemBH, and pCDF-hemD
C5-BEH	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5, pET-hemBH, and pCDF-hemE
C5-BFH	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5, pET-hemBH, and pCDF-hemF
C5-BGH	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5, pET-hemBH, and pCDF-hemG

상기 제작한 E. coli 균주들의 ALA, heme 및 heme 생합성 중간체 (uroporphyrinogen III, coproporphyrinogen III 및 protoporphyrin IX) 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 9에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin 및 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5mL LB 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO₄7H₂O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.

또한, heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플을 1mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1M NaOH 수용액 500μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 여과한 후, HPLC를 이용하는 기보고된 방법으로 heme 농도를 측정하였다(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012).

Heme 생합성 중간체 확인에는 heme 생산량 확인에 이용한 것과 동일한 샘플을 이용하되, HPLC-MS를 이용하는 기존 방법을 이용하였다(Pranawidjaja et al., J. Microbiol. Biotechnol. 25, 880-886, 2015; Bu et al., J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 783, 411-423, 2003).

그 결과, 비록 상기 다섯 균주 모두에서 heme이 검출되지는 않았으나 (도 2b), C5-BH 균주 (표 7)와 비교해 C5-BCH 및 C5-BDH 균주에서는 uroporphyrinogen III의 신호가, C5-BDH, C5-BEH 및 C5-BFH 균주에서는 coproporphyrinogen III의 신호가 더 높게 검출되었다. 특히 C5-BDH 균주에서는 C5-BH 균주에서는 검출되지 않은 protoporphyrin IX이 검출되었다. 상기 결과를 바탕으로 효과적인 heme 과생산을 위해 hemC, hemD, hemE 및 hemF 유전자의 과발현이 필수적이라는 결론을 얻었다.

Strains	ALA (g l-1)	Uroporphyrinogen III (AU)b	Coproporphyrinogen III (AU)b	Protoporphyrin IX (AU)b	Heme (g l-1)
C5-BCH	0.553	1259	164	-	-
C5-BDH	0.459	1460	429	89	-
C5-BEH	0.494	693	549	-	-
C5-BFH	0.462	680	525	-	-
C5-BGH	0.463	717	134	-	-

반면 C5-BGH 균주는 C5-BH 균주(표 7)와 비교해 ALA 및 heme 생합성 중간체 생산량에서 두드러진 차이를 발견할 수 없었다(표 10). Heme 과생산을 위해 hemG의 과발현이 필수적인지 재차 확인하고자 C5-BH 균주를 기반으로 hemC, hemD, hemE 및 hemF 유전자를 과발현시키는 균주 HEME1와 C5-BH 균주를 기반으로 hemC, hemD, hemE, hemF 및 hemG 유전자를 모두 과발현시키는 균주 HEME2를 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

상기 hemC, hemD, hemE 및 hemF 유전자를 과발현시키는 플라스미드 pCDF-hemCDEF는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemC, hemD, hemE 및 hemF 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 42와 서열번호 43의 프라이머, 서열번호 44와 서열번호 45의 프라이머, 서열번호 46과 서열번호 47의 프라이머 및 서열번호 48과 서열번호 49의 프라이머를 이용하였다.

이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 44와 서열번호 48의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemD 및 hemF 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.

서열번호	염기서열
서열번호 42	5′-GGGAATTCCA TATGTTAGAC AATGTTTTAA GAATTGC-3′
서열번호 43	5′-GAAGATCTTC ATGCCGGAGC GTCTC-3′
서열번호 44	5′-GAAGATCTAT AAAAGGAGGA AAATATATGA GTATCCTGGT CACCCG-3′
서열번호 45	5′-CCGCTCGAGT TATTGTAATG CCCGTAAAAG C-3′
서열번호 46	5′-CATGCCATGG GTACCGAACT TAAAAACGAT C-3′
서열번호 47	5′-CGAGCTCTTA GCGGTGATAT TGTTCAGAC-3′
서열번호 48	5′-CGAGCTCATA AAAGGAGGAA AATATATGAA ACCCGACGCA CAC-3′
서열번호 49	5′-AAAACTGCAG TTACACCCAA TCCCTGACCT-3′

증폭한 서열은 각각 NdeI과 BglII, BglII와 XhoI, NcoI과 SacI 및 SacI과 PstI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pCDFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국) 에 순차적으로 삽입하여 pCDF-hemCDEF를 제작하였다.

상기 hemC, hemD, hemE, hemF 및 hemG 유전자를 과발현시키는 플라스미드 pCDF-hemCDEFG는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemG 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 50과 서열번호 51의 프라이머를 이용하였다. 이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 50의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemG 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.

서열번호	염기서열
서열번호 50	5′-AAAACTGCAG ATAAAAGGAG GAAAATATGT GAAAACATTA ATTCTTTTCT CAAC-3′
서열번호 51	5′-AAGGAAAAAA GCGGCCGCTT ATTTCAGCGT CGGTTTGTC-3′

증폭한 서열은 PstI과 NotI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pCDF-hemCDEF 벡터에 삽입하여 최종적으로 플라스미드 pCDF-hemCDEFG를 제작하였다.

상기 제작한 pCDF-hemCDEF 및 pCDF-hemCDEFG를 재조합 E. coli C5-BH 균주에 각각 도입하여 E. coli HEME1 및 HEME2 균주를 제작하였다 (도 2c 및 표 13).

Strain	Description
HEME1	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5, pET-hemBH, and pCDF-hemCDEF
HEME2	E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-C5, pET-hemBH, and pCDF-hemCDEFG

상기 제작한 E. coli 균주들의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 13에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220rpm의 조건에서 12시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본 배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO₄7H₂O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200rpm의 조건에서 48시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 샘플을 전처리 및 분석하였다.

또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1M NaOH 수용액 500μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 여과한 후 HPLC를 이용하여 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, HEME1 및 HEME2 균주에서 각각 0.14 mg/L 및 0.53 mg/L heme이 검출되었다(도 3). HEME1 균주와 비교해 hemG를 추가로 과발현시킨 HEME2 균주에서 3배 이상의 heme이 더 많이 생산된 결과를 통해 효과적인 heme 과생산을 위해 C5-BH 균주에서 hemC, hemD, hemE, hemF 및 hemG 유전자를 모두 과발현시켜야 한다는 결론을 얻었다.

2-2: Heme 증산을 위한 heme 생합성 유전자의 과발현 수준 조정

실시예 2-1에서 제작한 HEME2의 ALA 생산량 (308 mg/L)이 heme 생산량 (0.53 mg/L)보다 현저히 높은 것으로 미루어 보아 ALA 생합성 경로의 대사 흐름이 과도하다고 판단하였다. 균주에서 과발현시킬 수 있는 단백질 총량이 유한하다는 판단 아래 과도한 단밸질의 과발현을 줄임으로써 부족한 단백질의 과발현을 증진시켜 heme을 증산하고자, 다음과 같은 과정을 통해 상대적으로 부족한 ALA로부터 heme을 생산하는 경로의 대사량을 증진시키고 상대적으로 과도한 ALA 생산 경로의 대사량을 감소시켜 heme을 증산하였다.

(a) 플라스미드 pCDF-hemAL의 제작

플라스미드 pRSFDuet-1보다 플라스미드 복제 개수가 적은 플라스미드 pCDFDuet-1(Novagen, 미국)를 기반으로 C5 ALA 생합성 경로의 유전자를 과발현함으로써 pRSF-C5를 이용하는 경우보다 ALA 생합성 유전자의 발현량을 감소시키고 결과적으로 해당 경로의 대사량도 낮출 수 있도록 하였다. 또한 C5 ALA 생합성 경로에서 glutamate를 glutamyl-tRNA로 전환하는 glutamyl tRNA synthetase (GluRS)의 유전자 gltX를 과발현시키지 않음으로써 다른 단백질들의 과발현량이 증진될 수 있도록 하였다. pCDFDuet-1을 기반으로 C5 ALA 생합성 경로를 과발현시키는 플라스미드 pCDF-hemAL은 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemL 및 음성 피드백 저항성 hemA (hemA ^fbr ) 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 15와 서열번호 16의 프라이머, 서열번호 17과 서열번호 18의 프라이머를 이용하였다.

이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 15의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemL 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다. 또한 서열번호 17의 프라이머에 포함된 threonine과 leucine을 암호화하는 염기서열에 의하여 BL21(DE3) 유래 hemA 유전자가 음성 피드백 저항성 hemA (hemA ^fbr )로 전환되었다.

증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI 및 SacI과 NotI 으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pCDFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 pCDF-hemAL을 제작하였다.

(b) 플라스미드 pRSF-hemBCD의 제작

플라스미드 pETDuet-1 보다 플라스미드 복제 개수가 많은 플라스미드 pRSFDuet-1을 기반으로 ALA로부터 heme을 생산하는 대사 경로의 상단부에 관여하는 유전자 hemB, hemC, hemD를 과발현함으로써 ALA로부터 heme을 생산하는 대사 경로의 흐름이 증진되도록 하였다. pRSFDuet-1을 기반으로 hemB, hemC, hemD 유전자를 과발현시키는 플라스미드 pRSF-hemBCD는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemB, hemC, hemD 유전자를 증폭하기 위해 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머, 서열번호 42와 서열번호 43의 프라이머 및 서열번호 44와 서열번호 45의 프라이머를 이용하였다.

이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 44의 프라이머에 포함된 ribosome binding site(RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemD 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.

증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI, NdeI과 BglII 및 BglII와 XhoI 으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pRSFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 pRSF-hemBCD를 제작하였다.

(c) 플라스미드 pET-hemEFGH의 제작

플라스미드 pCDFDuet-1보다 플라스미드 복제 개수가 많은 플라스미드 pETDuet-1을 기반으로 ALA로부터 heme을 생산하는 대사 경로의 하류에 관여하는 유전자 hemE, hemF, hemG 및 hemH를 과발현함으로써 ALA로부터 heme을 생산하는 대사 경로의 흐름이 증진되도록 하였다. pETDuet-1을 기반으로 hemE, hemF, hemG 및 hemH 유전자를 과발현시키는 플라스미드 pET-hemEFGH는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemE, hemF, hemG 및 hemH 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 46과 서열번호 47의 프라이머, 서열번호 48과 서열번호 49의 프라이머, 서열번호 50과 서열번호 51의 프라이머 및 서열번호 23와 서열번호 24의 프라이머를 이용하였다.

이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 48과 서열번호 50의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemF 및 hemG 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.

증폭한 서열은 각각 NcoI과 SacI, SacI과 PstI, PstI와 NotI 및 NdeI과 XhoI 으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pETDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 pET-hemEFGH를 제작하였다.

(d) 재조합 E. coli HEME3의 제작

상기 제작한 플라스미드 pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD 및 pET-hemEFGH를 E. coli BL21(DE3) 균주에 한데 도입하여 E. coli HEME3 균주를 제작하였다 (도 2d 및 표 14).

Strain	Description
HEME3	E. coli BL21(DE3) harboring pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD, and pET-hemEFGH

상기 제작한 E. coli 균주의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 14에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO₄7H₂O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.

또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, HEME2 균주 (0.53 mg/L)와 비교해 HEME3 균주에서는 heme 생산량이 3.79 mg/L로 증산되었다 (도 2d 및 도 3). 즉, heme 생합성 경로 유전자들의 발현량을 조정함으로써 heme을 증산할 수 있었다.

실시예3: Heme 증산을 위한 경쟁 대사회로 결실

Heme 증산을 위해 heme 생합성 경로와 경쟁 관계에 있는 대사 경로들을 결실시킬 수 있다. 먼저 포도당으로부터 C5 ALA 생합성 경로의 전구체인 glutamate까지의 대사 흐름을 증가시키기 위해 해당과정의 대사 산물들이 초산이나 젖산 등의 부산물로 전환되는 것을 막을 수 있다. 또한 생성된 heme이 분해되는 것을 막음으로써 heme의 생산량을 높일 수 있다.

3-1: Heme 증산을 위한 ldhA 및 pta 유전자의 결실

C5 ALA 생합성 경로를 이용하는 본 발명의 균주 내에서 포도당이 glutamate로 전환되는 수율 및 대사량을 높이기 위해 해당과정의 대사 산물인 pyruvate 및 acetyl-CoA가 각각 젖산 및 초산으로 전환되는 것을 막는 것이 필요하다. Pyruvate를 젖산으로 전환다는 데 관여하는 ldhA 유전자 및 acetyl-CoA를 초산으로 전환하는 데 관여하는 pta 유전자를 결실시킴으로써 glutamate 생산량을 높일 수 있다는 기존 보고 (Vuoristo et al., AMB Express 5, 61, 2015)에 따라 다음과 같은 과정을 통해 HEME3로부터 ldhA 및 pta 유전자를 결실하였다.

(a) 유전자 결실용 DNA 절편 제작

기보고된 λ Red recombineering 기법 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 이용해 ldhA 및 pta 유전자를 결실시키고자 유전자 결실에 필요한 DNA 절편을 제작하였다. 플라스미드 pECmulox(Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008)로부터 ldhA 유전자를 결실시키는 데 이용할 DNA 절편 (ΔldhA::cat)와 pta 유전자를 결실시키는 데 이용할 DNA 절편 (Δpta::cat)을 증폭하기 위해 서열번호 52와 서열번호 53의 프라이머 및 서열번호 54와 서열번호 55의 프라이머를 이용하였다.

서열번호	염기서열
서열번호 52	5′-TATTTTTAGT AGCTTAAATG TGATTCAACA TCACTGGAGA AAGTCTTATG TAGGTGACAC TATAGAACGC G-3′
서열번호 53	5′-CTCCCCTGGG TTGCAGGGGA GCGGCAAGAT TAAACCAGTT CGTTCGGGCA TAGTGGATCT GATGGGTACC-3′
서열번호 54	5′-GCTGTTTTGT AACCCGCCAA ATCGGCGGTA ACGAAAGAGG ATAAACCGTG TAGGTGACAC TATAGAACGC G-3′
서열번호 55	5′-GCAGCGCAAA GCTGCGGATG ATGACGAGAT TACTGCTGCT GTGCAGACTG TAGTGGATCT GATGGGTACC-3′

(b) BL21(DE3)로부터 ldhA 유전자 결실

상기 제작한 DNA 절편을 이용해 ldhA 유전자를 결실시키기 위해 BL21(DE3) 균주에 플라스미드 pKD46 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 도입한 뒤 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 overnight 배양하였다. 배양한 균체 및 배지 1 mL를 50μg/mL ampicillin 및 1 mM arabinose가 첨가된 100 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 배양한 균체는 회수 후 0℃로 냉각된 10% glycerol로 2회 세척 후 동일한 수용액 150 μL에 다시 풀어내었다. 이후 천공법을 통해 상기 제작한 ldhA 유전자 결실용 DNA 절편 (ΔldhA::cat)을 도입한 뒤 ldhA 유전자가 결실되면서 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)가 도입된 콜로니를 8.5μg/mL chloramphenicol이 포함된 LB-agar 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 37℃로 배양하여 선별하였다.

콜로니 선별을 위한 37℃ 배양 중 상기 선별된 콜로니에서 플라스미드 pKD46이 제거된 것을 확인한 뒤 다시 플라스미드 pJW168 (Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998)을 도입하고 50μg/mL ampicillin 및 1 mM IPTG가 첨가된 LB-agar 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 30℃로 배양하여 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)를 제거하였다. 제작된 균주 BL21(DE3) ΔldhA (표 16)에서 ldhA 유전자의 결실은 sequencing을 통해 확인하였다.

Strain	Description
Bl21(DE3) ΔldhA	E. coli BL21(DE3) ΔldhA

(c) BL21(DE3) ΔldhA로부터 pta 유전자 결실

상기 제작한 DNA 절편을 이용해 pta 유전자를 결실시키기 위해 BL21(DE3) 균주에 플라스미드 pKD46 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 도입한 뒤 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 overnight 배양하였다. 배양한 균체 및 배지 1 mL를 50μg/mL ampicillin 및 1 mM arabinose가 첨가된 100 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 배양한 균체는 회수 후 0℃로 냉각된 10% glycerol로 2회 세척 후 동일한 수용액 150 μL 에 다시 풀어내었다. 이후 천공법을 통해 상기 제작한 pta 유전자 결실용 DNA 절편 (Δpta::cat)을 도입한 뒤 pta 유전자가 결실되면서 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)가 도입된 콜로니를 8.5μg/mL chloramphenicol이 포함된 LB-agar 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 37℃로 배양하여 선별하였다.

콜로니 선별을 위한 37℃ 배양 중 상기 선별된 콜로니에서 플라스미드 pKD46이 제거된 것을 확인한 뒤 다시 플라스미드 pJW168(Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998)을 도입하고 50μg/mL ampicillin 및 1 mM IPTG가 첨가된 LB-agar 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 30℃로 배양하여 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)를 제거하였다. 제작된 균주 BL21(DE3) Δpta ΔldhA에서 pta 유전자의 결실은 sequencing을 통해 확인하였다.

Strain	Description
Bl21(DE3) Δpta ΔldhA	E. coli BL21(DE3) Δpta ΔldhA

(d) 재조합 E. coli HEME5의 제작

상기 표 17에 개시된 BL21(DE3) Δpta ΔldhA에 실시예 2-2에서 제작한 플라스미드 pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD 및 pET-hemEFGH를 한데 도입하여 E. coli HEME5 균주를 제작하였다 (표 18).

Strain	Description
HEME5	E. coli BL21(DE3) Δpta ΔldhA harboring pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD, and pET-hemEFGH

상기 제작한 E. coli 균주의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 18에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO₄7H₂O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.

또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, HEME3 균주 (3.79 mg/L)와 비교해 HEME5 균주에서는 heme 생산량이 4.17 mg/L로 증산되었다 (도 3).

3-2: Heme 증산을 위한 yfeX 유전자의 결실

기존의 연구에서 yfeX 유전자로부터 발현된 단백질이 heme으로부터 Fe²⁺ 이온을 제거하는 heme dechelatase라고 보고한 바 (Letoffe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 11719-11724, 2009) 있지만 다른 보고에서는 yfeX 유전자의 발현 산물이 heme dechelatase가 아닌 porphyrinogen을 porphyrin으로 전환하는 peroxidase라고 보고한 바 있다 (Dailey et al., mBio 2, e00248-00211, 2011). 그러나 또 다른 연구에서는 yfeX 유전자를 과발현시킬 경우 heme 항상성이 무너진다고 보고하였다 (Turlin et al., Microbiology Open 3, 849-859, 2014). 여전히 yfeX 유전자의 정확인 기능은 밝혀지지 않았으나 yfeX 유전자를 결실시켰을 때 heme이 증산될 가능성이 있다고 판단하여 yfeX 유전자 결실이 heme 생산량에 미치는 영향을 다음과 같은 과정을 통해 확인하였다.

(a) 유전자 결실용 DNA 절편 제작

기보고된 λ Red recombineering 기법 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 이용해 yfeX 유전자를 결실시키고자 유전자 결실에 필요한 DNA 절편을 제작하였다. 플라스미드 pECmulox (Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008)로부터 ldhA 유전자를 결실시키는 데 이용할 DNA 절편 (ΔyfeX::cat)을 증폭하기 위해 서열번호 56과 서열번호 57의 프라이머를 이용하였다.

서열번호	염기서열
서열번호 56	5′-TCAACAATGC CACGGATTGC GTGGCATTCT TATTTTCAGG AGGAACAATG TAGGTGACAC TATAGAACGC G-3′
서열번호 57	5′-CTGGCCTTTA ATCAATGAAT CAGAAACGCT TACAGCGCCA TCAACTTGTC TAGTGGATCT GATGGGTACC-3′

(b) BL21(DE3)로부터 yfeX 유전자 결실

상기 제작한 DNA 절편을 이용해 yfeX 유전자를 결실시키기 위해 BL21(DE3) 균주에 플라스미드 pKD46 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 도입한 뒤 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 overnight 배양하였다. 배양한 균체 및 배지 1 mL를 50μg/mL ampicillin 및 1 mM arabinose가 첨가된 100 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 배양한 균체는 회수 후 0℃로 냉각된 10% glycerol로 2회 세척 후 동일한 수용액 150 μL에 다시 풀어내었다. 이후 천공법을 통해 상기 제작한 yfeX 유전자 결실용 DNA 절편 (ΔyfeX::cat)을 도입한 뒤 yfeX 유전자가 결실되면서 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)가 도입된 콜로니를 8.5μg/mL chloramphenicol이 포함된 LB-agar 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 37℃로 배양하여 선별하였다.

콜로니 선별을 위한 37℃ 배양 중 상기 선별된 콜로니에서 플라스미드 pKD46이 제거된 것을 확인한 뒤 다시 플라스미드 pJW168(Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998)을 도입하고 50μg/mL ampicillin 및 1 mM IPTG가 첨가된 LB-agar 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 30℃로 배양하여 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)를 제거하였다. 제작된 균주 BL21(DE3) ΔyfeX (표 20)에서 yfeX 유전자의 결실은 sequencing을 통해 확인하였다.

Strain	Description
Bl21(DE3) ΔyfeX	E. coli BL21(DE3) ΔyfeX

(c) 재조합 E. coli HEME4의 제작

상기 표 20에 개시된 BL21(DE3) ΔyfeX에 실시예 2-2에서 제작한 플라스미드 pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD 및 pET-hemEFGH를 한데 도입하여 E. coli HEME4 균주를 제작하였다 (표 21).

Strain	Description
HEME4	E. coli BL21(DE3) ΔyfeX harboring pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD, and pET-hemEFGH

상기 제작한 E. coli 균주의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 21에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO₄7H₂O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.

또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, HEME3 균주 (3.79 mg/L)와 비교해 HEME4 균주에서는 heme 생산량이 6.21 mg/L로 증산되었다 (도 3).

3-3: Heme 증산을 위한 pta , ldhA 및 yfeX 유전자의 결실

실시에 3-1 및 3-2에 개시된 바와 같이 HEME3 균주 (3.79 mg/L)와 비교해 pta 및 ldhA 유전자를 결실시킨 균주 HEME5 (4.17mg/mL heme)와 yfeX 유전자를 결실시킨 균주 HEME4 (6.21mg/mL heme)에서 heme이 증산되었다. 따라서 실시예 3-1 및 실시예 3-2의 유전자 결실 전략을 함께 사용할 경우 heme을 추가 증산할 수 있는지 확인하기 위해 상기 세가지 유전자를 모두 결실시킨 균주를 다음과 같은 과정을 통해 확인하였다.

(a) 유전자 결실용 DNA 절편 제작

기보고된 λ Red recombineering 기법 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 이용해 yfeX 유전자를 결실시키고자 유전자 결실에 필요한 DNA 절편을 제작하였다. 플라스미드 pECmulox (Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008)로부터 ldhA 유전자를 결실시키는 데 이용할 DNA 절편 (ΔyfeX::cat)을 증폭하기 위해 서열번호 56과 서열번호 57의 프라이머를 이용하였다.

(b) BL21(DE3) ΔPL 로부터 yfeX 유전자 결실

상기 제작한 DNA 절편을 이용해 yfeX 유전자를 결실시키기 위해 BL21(DE3) ΔPL 균주에 플라스미드 pKD46(Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 도입한 뒤 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 overnight 배양하였다. 배양한 균체 및 배지 1 mL를 50μg/mL ampicillin 및 1 mM arabinose가 첨가된 100 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 배양한 균체는 회수 후 0℃로 냉각된 10% glycerol로 2회 세척 후 동일한 수용액 150 μL 에 다시 풀어내었다. 이후 천공법을 통해 상기 제작한 yfeX 유전자 결실용 DNA 절편 (ΔyfeX::cat)을 도입한 뒤 yfeX 유전자가 결실되면서 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)가 도입된 콜로니를 8.5μg/mL chloramphenicol이 포함된 LB-agar 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 37℃로 배양하여 선별하였다.

콜로니 선별을 위한 37℃ 배양 중 상기 선별된 콜로니에서 플라스미드 pKD46이 제거된 것을 확인한 뒤 다시 플라스미드 pJW168(Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998)을 도입하고 50μg/mL ampicillin 및 1 mM IPTG가 첨가된 LB-agar 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 30℃로 배양하여 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)를 제거하였다. 제작된 균주 BL21(DE3) Δpta ΔldhA ΔyfeX (표 22)에서 yfeX 유전자의 결실은 sequencing을 통해 확인하였다.

Strain	Description
Bl21(DE3) Δpta ΔldhA ΔyfeX	E. coli BL21(DE3) Δpta ΔldhA ΔyfeX

(c) 재조합 E. coli HEME6의 제작

상기 표 22에 개시된 BL21(DE3) Δpta ΔldhA ΔyfeX에 실시예 2-2에서 제작한 플라스미드 pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD 및 pET-hemEFGH를 한데 도입하여 E. coli HEME6 균주를 제작하였다 (도 2e 및 표 23).

Strain	Description
HEME6	E. coli BL21(DE3) Δpta ΔldhA ΔyfeX harboring pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD, and pET-hemEFGH

상기 제작한 E. coli 균주의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 14에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO₄7H₂O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.

또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, HEME3 균주 (3.79 mg/L), HEME5 균주 (4.17mg/mL) 및 HEME4 균주 (6.21mg/mL)와 비교해 HEME6 균주에서는 heme 생산량이 7.13 mg/L로 증산되었다 (도 2e 및 도 3).

실시예4: Heme 증산을 위한 배양 조건 최적화

4-1: Heme 생산 배지 최적화: 기본 배지 조성 선별

실시예 3에서 제작한 HEME6 균주의 heme 생산량을 추가로 증진시기키 위해 균주 배양에 이용하는 배지의 조성을 최적화하였다. LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract), TB 배지 (16.43g/L K₂HPO₄·3H₂0, 2.31g/L, KH₂PO₄, 4g/L glycerol, 12g/L tryptone 12g/L, 24g/L yeast extract 24g/L) 및 MR-Fe0 배지 (6.67g/L KH₂PO₄, 4g/L (NH₄)₂HPO₄, 0.8g/L MgSO₄7H2O, 0.8g/L citric acid, 5 g/L yeast extract, 5 mL/L trace metal solution, pH7.0)를 포함에 각 배지에 7.5 mg/L FeSO₄7H₂O를 첨가한 LB-Fe7.5, TB-Fe7.5 및 MR-Fe7.5 배지에서 HEME6 균주를 배양해 heme 생산량을 측정하였다. 단, trace metal solution I의 조성은 다음과 같다: 0.5 M HCl, 2g/L CaCl₂, 2.2g/L ZnSO₄7H₂O, 0.5g/L MnSO₄4H₂O, 1g/L CuSO₄5H₂O, 0.1g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄4H₂O, 0.02g/L Na₂B₄O₇10H₂O.

상기 배지에서 HEME6 균주의 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 14에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 상기 6가지 배지 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, MR-Fe7.5 배지에서 HEME6 균주를 배양한 경우 (7.45 mg/L) 가장 많은 양의 heme을 생산하는 것을 확인하였다 (도 4).

4-2: Heme 생산 배지 최적화: 철 이온 농도 선별

실시예 4-1에서 선별한 MR-Fe7.5 배지에서의 heme 생산량과 MR-Fe0 배지에서의 heme 생산량 차이가 두드러지게 차이난다는 결과로부터 철 이온의 농도가 heme 생산량에 큰 영향을 준는지 여부를 확인하였다. 따라서 배지의 철 이온 농도를 최적화함으로써 HEME6 균주의 heme 생산량을 추가로 증진시키고자 하였다. 실시예 4-1의 MR-Fe0 배지를 기준으로 FeSO₄7H₂O를 각각 0, 10, 20, 40, 60 100 mg/L 첨가하여 MR-Fe0, MR-Fe10, MR-Fe20, MR-Fe40, MR-FE60, MR-Fe100 배지를 제작하였다.

상기 배지에서 HEME6 균주의 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 14에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 상기 6가지 배지 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

Heme의 생산량을 확인하기 위하여 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, 20 mg/L FeSO₄7H₂O을 포함한 경우 (MR-Fe20 배지) 가장 많은 양의 heme을 생산하였다 (도 5).

4-3: 배양 온도 최적화

HEME6 균주를 이용해 heme을 생산하는데 최적의 배양 온도를 선정하기 위해 다음과 같은 과정을 통해 균주를 배양하였다.

표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD₆₀₀이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 24℃, 30℃ 및 37℃, 200 rpm의 조건에서 72시간 동안 배양하였으며, 첫 24시간 동안은 6시간 간격으로, 이후로는 12시간 간격으로 샘플링을 하였다.

Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, 1 mM IPTG를 첨가하고 30℃에서 60시간 동안 배양한 경우 (7.78g/L) 가장 많은 양의 heme을 생산하는 것을 확인하였다 (도 6).

실시예5: 회분 발효 및 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산

5-1: 회분 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산

Heme 생산을 위해 발효기를 이용한 발효를 진행한 사례가 보고된 바 없으므로 실시예4에서 최적화한 배양 조건을 기반으로 HEME6 균주를 이용한 회분식 발효를 진행하였다.

표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH₄OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. OD₆₀₀이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하였다..

Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 배지 및 파쇄한 세포 샘플은 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, 56시간 째에 가장 많은 양인 총 14.24 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 1.18 mg/L의 heme (8.29%)이 배지에서 검출되었다. 56시간 동안 전체 생산성은 0.25 mg/L/h였다 (도 7). 본 실시예의 회분식 발표를 통해 1 mg/L 이상의 세포외 자유 heme을 검출할 수 있었다는 데 큰 의의가 있다.

5-2: 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산

실시예 5-1의 회분식 발효 결과를 바탕으로 보다 많은 양의 heme을 생산하기 위해 유가 배양식 발효를 진행하였다.

표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH₄OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO₄7H₂O, 20 mg/L FeSO₄7H₂O)를 공급하였다. OD₆₀₀이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하였다.

Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 배지 및 파쇄한 세포 샘플은 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, 56시간째에 가장 많은 양인 총 49.18 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 16.77 mg/L의 heme (34.10%)이 배지에서 검출되었다. OD₆₀₀은 32시간 째에 최대치인 67.2에 이렀다 (도 8a).

5-3: (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 를 공급한 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산

Heme 한 분자를 생산하는 데 질소 원자가 4개 필요하다는 사실에 착안하여 질소원을 공급함으로써 heme을 증산할 수 있을 것이라 판단하였다. 가설을 검증하기 위해 (NH₄)₂SO₄를 질소원으로 공급하며 유가 배양식 발효를 진행하였다.

표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH₄OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO₄7H₂O, 20 mg/L FeSO₄7H₂O, 5g/L (NH₄)₂SO₄)를 공급하였다. OD₆₀₀이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하였다.

Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 배지 및 파쇄한 세포 샘플은 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, 56시간 째에 가장 많은 양인 총 104.90 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 54.61 mg/L의 heme (52.06%)이 배지에서 검출되었다. OD₆₀₀은 48시간 째에 최대치인 93.8에 이렀다 (도 8b).

5-4: Glutamate를 공급한 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산

본 발명에서 제작한 HEME6 균주는 상기 실시예들에서 검증된 바와 같이 ALA 생산 전구체를 공급하지 않고도 세계 최고 heme 생산량을 보이는 것이 장점이나, 가격이 비교적 비싸고 세포 독성이 있는 C4 ALA 생합성 경로의 전구체 glycine과 달리 HEME6 균주가 이용하는 C5 ALA 생합성 경로의 전구체인 glutamate는 비교적 값이 저렴할뿐더러 세포독성을 보이지 않는다. 따라서 본 발명에서 제작한 HEME6 균주의 최대 heme 생산능을 시험하기 위해 glutamate를 질소원으로 공급하며 유가 배양식 발효를 진행하였다.

표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH₄OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO₄7H₂O, 20 mg/L FeSO₄7H₂O, 20g/L glutamate)를 공급하였다. OD₆₀₀이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하였다.

Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 배지 및 파쇄한 세포 샘플은 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.

그 결과, 64시간 째에 가장 많은 양인 총 228.46 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 131.90 mg/L의 heme (57.734%)이 배지에서 검출되었다. OD₆₀₀은 48시간 째에 최대치인 172.8에 이렀다 (도 8c).

실시예6: Heme exporter 과발현을 통한 heme 증산 및 세포 밖으로의 heme 분비 증진

6-1: Heme exporter 유전자 ccmABC 을 과발현하는 균주 제작

실시예 5에서 heme의 총 생산량이 증가함에 따라 세포 바깥으로 분비된 heme의 비율이 점차 증가함을 확인할 수 있었다. 이는, 세포 독성이 있는 heme (Anzaldi et al., Infect. Immun. 78, 4977-4989, 2010)이 과량 생산될 경우 heme exporter CcmABC에 의한 세포 바깥으로의 heme 분비 (Schulz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6462-6467, 1999)가 촉진되어 세포외 자유 heme을 생산할 수 있을 것이라는 본 발명의 시작에 앞선 가설을 뒷받침한다. 동일 맥락으로 ccmABC 유전자를 과발현하면 세포 바깥으로의 heme 분비를 더욱 촉진시킬 수 있을 것이라고 판단하여 다음과 같은 과정을 통해 ccmABC 유전자를 과발현하는 균주를 제작하였다.

(a) 플라스미드 pACYC-ccmABC의 제작

Heme exporter를 암호화하는 유전자 ccmA (서열번호 58), ccmB (서열번호 59) 및 ccmC 유전자 (서열번호 60)를 과발현시키는 플라스미드 pACYC-ccmABC는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.

E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 ccmA, ccmB 및 ccmC 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 61과 서열번호 62의 프라이머, 서열번호 63과 서열번호 64의 프라이머 및 서열번호 65와 서열번호 66의 프라이머를 이용하였다.

이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 65의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 ccmC 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.

서열번호	염기서열
서열번호 61	5′-GGGAATTCCA TATGGGTATG CTTGAAGCCA GAGAGTT-3′
서열번호 62	5′-CCGCTCGAGT CATGCGGCCC TCGTTT-3′
서열번호 63	5′-CATGCCATGG TGTTCTGGCG CATT-3′
서열번호 64	5′-CGCGGATCCT TATTGAATGC TGATTCGTAA C-3′
서열번호 65	5′-CCGGAATTCA TAAAAGGAGG AAAATATATG TGGAAAACAC TGCATCAAC-3′
서열번호 66	5′-ACGCGTCGAC TCATTTACGG CCTCTTTTCA G-3′

증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI, EcoRI과 SalI 및 NdeI과 XhoI 으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pACYCDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 pACYC-ccmABC를 제작하였다.

(b) 재조합 E. coli HEME7의 제작

상기 제작한 플라스미드 pACYC-ccmABC를 표 23에 개시된 HEME6 균주에 도입하여 E. coli HEME7 균주를 제작하였다 (표 25).

Strain	Description
HEME7	E. coli BL21(DE3) harboring pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD, pET-hemEFGH and pACYC-ccmABC

6-2: (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 를 공급한 HEME7 균주의 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산

실시예 6-1에서 제작한, heme exporter 유전자 ccmABC를 과발현하는 HEME7 균주의 heme 생산능을 확인하고자 (NH₄)₂SO₄를 질소원으로 공급하며 유가 배양식 발효를 진행하였다.

표 25에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 17μg/mL chloramphenicol이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 17μg/mL chloramphenicol이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin, 17μg/mL chloramphenicol 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH₄OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO₄7H₂O, 20 mg/L FeSO₄7H₂O, 5g/L (NH₄)₂SO₄)를 공급하였다. OD₆₀₀이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하여, Heme의 생산량을 확인하였다.

그 결과, 64시간째에 가장 많은 양인 총 114.79 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 71.91mg/L의 heme (62.64%)이 배지에서 검출되었다. OD₆₀₀은 56시간 째에 최대치인 76.9mg/L에 이르렀다 (도 9a). 실시예 5-3의 유가 배양식 발효 결과와 비교할 때, 본 실시예에서의 가설과 같이 ccmABC 유전자를 과발현시킴으로써 세포 바깥으로의 heme 분비율을 10.58% 증진시킬 수 있었으며, 동시에 총 heme의 생산량 역시 9.89mg/L 증진시킬 수 있었다.

6-3: Glutamate를 공급한 HEME7 균주의 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산

실시예 6-1에서 제작한, heme exporter 유전자 ccmABC를 과발현하는 HEME7 균주의 C5 ALA 생합성 경로의 전구체가 공급되었을 때 heme 최대 생산능을 확인하고자 glutamate를 질소원으로 공급하며 유가 배양식 발효를 진행하였다.

표 25에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 17μg/mL chloramphenicol이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본 배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 17μg/mL chloramphenicol이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin, 17μg/mL chloramphenicol 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 시 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH₄OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO₄7H₂O, 20 mg/L FeSO₄7H₂O, 20g/L glutamate)를 공급하였다. OD₆₀₀이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하여 Heme의 생산량을 확인하였다.

그 결과, 72시간 째에 가장 많은 양인 총 246.69 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 164.12 mg/L의 heme (66.529%)이 배지에서 검출되었다. OD₆₀₀은 64시간 째에 최대치인 142.8에 이렀다 (도 9b). 실시예 5-4의 유가 배양식 발효 결과와 비교할 때, ccmABC 유전자를 과발현시킴으로써 세포 바깥으로의 heme 분비율을 8.759% 증진시킬 수 있었으며, 동시에 총 heme의 생산량 역시 18.23 mg/L 증진시킬 수 있었다.

실시예7 : Corynebacterium glutamicum 에서의 heme 생산

자유 heme을 생산하고 세포 외로 분비하는 대장균을 개발하기 위해 사용한 전략이 다른 균주에서도 heme하는 데 적용될 수 있는지 확인하고자 인체에 무해함이 입증되어 글루탐산을 비롯한 아미노산 생산에 널리 이용되고 있는 Corynebacterium glutamicum에서 C5 ALA 생합성경로를 도입하여 heme을 생산하였다.

글루탐산을 과생산하는 호기성 미생물인 C. glutamicum은 대장균과 유사하게 글루타메이트로부터 ALA를 생산하는 C5 생합성 경로 및 ALA로부터 heme을 생산하는 heme 생합성 경로를 보유하고 있다. C5 생합성 경로에 상응하는 C. glutamicum의 hemA 및 hemL 유전자를 과발현시키기 위해 산업 C. glutamicum ATCC 13032의 유전체 DNA로부터 서열번호 67과 68의 프라이머, 서열번호 69와 70의 프라이머를 이용해 각각 hemA와 hemL 유전자를 증폭하였다. 이 과정에서 hemA 유전자로부터 발현되는 단백질의 두 번째 아미노산과 세 번째 아미노산 사이에 아미노산 리신 두 개가 삽입되어 HemA 단백질이 음성 피드백에 저항성을 보이도록 (HemA^fbr) hemA 유전자의 서열이 수정되었다. 증폭된 두 유전자는 깁슨어셈블리(Gibson assembly)를 통해 pEKEx1 플라스미드의 EcoRI site에 함께 클로닝하여 C. glutamicum에 도입되었을 때 HemA^fbr 및 HemL 단백질을 발현하는 pEKEx1-hemAL 플라스미드를 제작하였다.

서열번호	염기서열
서열번호 67	5′-TGAGCGGATA ACAATTTCAC ACAGGAAACA GAATTCATGG TGAGTAAGAA GGTACTCATC GTAGGGATGT CGCACA-3′
서열번호 68	5′-GCGGATCGAG CCGTATTGGA CGATGTCATT GTTTCCTGTG TGAAATTACT CCCTCGTTTG TGTGGCAGAA-3′
서열번호 69	5′-CACCTTCTGC CACACAAACG AGGGAGTAAT TTCACACAGG AAACAATGAC ATCGTCCAAT ACGGCTCGAT-3′
서열번호 70	5′-GCCAAGCTTG GCTGCAGGTC GACGGATCCC CGGGAATTCT CATGATGCCT TCGCTTCTGC TGCT-3′

또한 상기 실시예 2-1의 (a)와 같이 ALA로부터 heme을 생산하는 데 관여하는 단백질의 유전자 중 hemB 및 hemH 유전자의 과발현을 먼저 시험하기 위해 hemB와 hemH 유전자를 과발현하는 벡터를 구축하였다. 이를 위해 서열번호 71과 72, 73과 74를 이용해 C. glutamicum ATCC 13032의 유전체 DNA로부터 각각 hemB와 hemH 유전자를 증폭하였다. 또한 pCES208-spc 플라스미드를 서열번호 75 및 76의 프라이머를 이용해 증폭한 뒤 Gibson assembly를 통해 상기 증폭된 hemB 및 hemH 유전자와 결합시켜 pCES-hemBH 플라스미드를 제작하였다.

서열번호	염기서열
서열번호 71	5′-GCACCTTGGT TGGTAGGAGT AGCATGGGAT CCATGCATCA CCATCACCAT CATAGCACTT CTTCTGATTA CTCCCACG-3′
서열번호 72	5′-TTGTTTCCTG TGTGAAATTA AGCGTTTCGC AGTGCGCGGG-3′
서열번호 73	5′-TAATTTCACA CAGGAAACAA TGAATGAACG CACATCGGAT GC-3′
서열번호 74	5′-AATTATAATG GCCGGCTGGG CCTCTAGACT AGTTGGCAGC TGGCGCCGCT GA-3′
서열번호 75	5′-TCTAGAGGCC CAGCCGGCCA TTATAATTAG-3′
서열번호 76	5′-GGATCCCATG CTACTCCTAC CAACCAAGGT-3′

산업 균주인 C. glutamicum S112 균주에 상기 제작한 플라스미드 pEKEx1-hemAL 혹은 두 플라스미드 pEKEx1-hemAL과 pCES-hemBH를 도입함으로써 C. glutamicum S112-AL 및 S112-AL-BH 균주를 제작하였다.

Strain	Description
S112-AL	C. glutamicum S112 harboring pEKEx1-hemAL
S112-AL-BH	C. glutamicum S112 harboring pEKEx1-hemAL and pCES-hemBH

상기 제작한 두 C. glutamicum 균주 S112-Al과 S112-AL-BH의 heme 생성능을 확인하기 위한 플라스크 배양을 위해 250 mL 배플 플라스크에 담긴, 표 29의 조성을 가지는 seed 배지 10 mL에 상기 균주를 각각 접종하고 OD₆₀₀이 20에 이를 때까지 약 12 시간 동안 30℃, 200 rpm의 조건으로 배양하였다.

Component	Concentration
Glucose	40.0 g/L
MgSO47H2O	0.4 g/L
FeSO47H2O	10.0 mg/L
MnSO45H2O	10.0 mg/L
KH2PO4	1.0 g/L
Urea	4.0 g/L
Thiamine-HCl	200 μg/L
Biotin	50.0 μg/L
Soy bean hydrolysate	55.0 mL/L
pH	7.0

이후 배양액 100 μL를 250 mL 배플 플라스크에 담긴, 표 30의 조성을 가지는 주 배지 10 mL에 접종하고 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

Component	Concentration
Glucose	70.0 g/L
MgSO47H2O	0.4 g/L
FeSO47H2O	10.0 mg/L
MnSO45H2O	10.0 mg/L
(NH4)2SO4	30.0 g/L
KH2PO4	1.0 g/L
Thiamine-HCl	200 μg/L
Biotin	50.0 μg/L
Soy bean hydrolysate	55.0 mL/L
CaCO3	50.0 g/L
pH	8.0

그 결과, heme 생합성 관련 유전자를 과발현하지 않는 C. glutmicum S112에서는 heme이 생산되지 않은 데 반해 S112-AL 및 S112-AL-BH 균주에서는 세포 내에 heme이 각각 0.77 ± 0.23 및 1.64 ± 0.30 mg/L (배양액 부피 기준)씩 축적되는 것을 확인하였다. 이로써 C. glutamicum에서도 C5 생합성 경로 및 heme 생합성 경로를 과발현시킴으로써 heme을 생산할 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Producing Exracellular Heme Using Metabolically Engineered Microorganism <130> P17-B300 <160> 76 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1224 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hemA-Rsp <400> 1 atggattata acctggcact ggataccgcg ctgaatcgtc tgcataccga aggtcgttac 60 cgcacgttta ttgatatcga acgtcgcaaa ggcgccttcc cgaaagcaat gtggcgcaaa 120 ccggatggta gcgaaaaaga aattaccgtt tggtgcggca acgattatct gggtatgggc 180 cagcatccgg tggttctggg tgcgatgcac gaagccctgg atagtaccgg tgcaggcagc 240 ggcggtacgc gtaacattag cggcaccacg ctgtatcata aacgcctgga agcggaactg 300 gccgatctgc acggcaaaga agcggccctg gtgtttagct ctgcatacat cgcgaacgat 360 gccaccctga gcacgctgcc gcagctgatc ccgggtctgg tgattgttag cgataaactg 420 aaccatgcat ctatgattga aggtatccgt cgctctggca ccgaaaaaca tatcttcaaa 480 cacaacgatc tggatgatct gcgtcgcatc ctgacgagta ttggtaaaga tcgtccgatc 540 ctggttgcgt ttgaaagcgt gtattctatg gatggtgatt tcggccgcat tgaagaaatc 600 tgcgatattg cagatgaatt tggcgcgctg aaatatattg atgaagttca cgcggtgggc 660 atgtacggtc cgcgtggcgg tggcgtggca gaacgtgatg gtctgatgga tcgcatcgat 720 attatcaatg gcaccctggg caaagcctat ggcgttttcg gtggctacat tgcagcgagt 780 agcaaaatgt gtgatgccgt gcgcagctac gcaccgggtt ttatcttctc taccagtctg 840 ccgccggtgg ttgccgcagg tgcggccgca tctgttcgtc atctgaaagg cgatgtggaa 900 ctgcgcgaaa aacaccagac gcaggcgcgt attctgaaaa tgcgcctgaa aggtctgggc 960 ctgccgatta tcgatcatgg tagtcacatc gtgccggttc atgtgggcga tccggttcac 1020 tgcaaaatga ttagcgatat gctgctggaa cattttggta tctatgttca gccgattaac 1080 ttcccgaccg tgccgcgtgg cacggaacgt ctgcgcttta ccccgtctcc ggtgcatgat 1140 agtggcatga tcgatcacct ggttaaagcg atggatgtgc tgtggcagca ctgtgcactg 1200 aatcgcgcgg aagtggttgc ctaa 1224 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 catgccatgg attataacct ggcactgg 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccggaattct taggcaacca cttccgc 27 <210> 4 <211> 2280 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maeB gene <400> 4 atggatgacc agttaaaaca aagtgcactt gatttccatg aatttccagt tccagggaaa 60 atccaggttt ctccaaccaa gcctctggca acacagcgcg atctggcgct ggcctactca 120 ccaggcgttg ccgcaccttg tcttgaaatc gaaaaagacc cgttaaaagc ctacaaatat 180 accgcccgcg gtaacctggt ggcggtgatc tctaacggta cggcggtgct ggggttaggc 240 aacattggcg cgctggcagg caaaccggtg atggaaggca agggcgttct gtttaagaaa 300 ttcgccggga ttgatgtatt tgacattgaa gttgacgaac tcgacccgga caaatttatt 360 gaagttgtcg ccgcgctcga accaaccttc ggcggcatca acctcgaaga cattaaagcg 420 ccagaatgtt tctatattga acagaaactg cgcgagcgga tgaatattcc ggtattccac 480 gacgatcagc acggcacggc aattatcagc actgccgcca tcctcaacgg cttgcgcgtg 540 gtggagaaaa acatctccga cgtgcggatg gtggtttccg gcgcgggtgc cgcagcaatc 600 gcctgtatga acctgctggt agcgctgggt ctgcaaaaac ataacatcgt ggtttgcgat 660 tcaaaaggcg ttatctatca gggccgtgag ccaaacatgg cggaaaccaa agccgcatat 720 gcggtggtgg atgacggcaa acgtaccctc gatgatgtga ttgaaggcgc ggatattttc 780 ctgggctgtt ccggcccgaa agtgctgacc caggaaatgg tgaagaaaat 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gggtgattat 1680 catgaacatt ttagcgtggt gaaaaatgtc tttggttatc gcgatggcgt tcacaccgca 1740 ggtgccatga acgcgctgct gctgccgagt ggtaacacct ttattgccga tacatatgtt 1800 aatgatgaac cggatgcaga agagctggcg gagatcacct tgatggcggc agaaactgtc 1860 cgtcgttttg gtattgagcc gcgcgttgct ttgttgtcgc actccaactt tggttcttct 1920 gactgcccgt cgtcgagcaa aatgcgtcag gcgctggaac tggtcaggga acgtgcacca 1980 gaactgatga ttgatggtga aatgcacggc gatgcagcgc tggtggaagc gattcgcaac 2040 gaccgtatgc cggacagctc tttgaaaggt tccgccaata ttctggtgat gccgaacatg 2100 gaagctgccc gcattagtta caacttactg cgtgtttcca gctcggaagg tgtgactgtc 2160 ggcccggtgc tgatgggtgt ggcgaaaccg gttcacgtgt taacgccgat cgcatcggtg 2220 cgtcgtatcg tcaacatggt ggcgctggcc gtggtagaag cgcaaaccca accgctgtaa 2280 2280 <210> 5 <211> 951 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coaA gene <400> 5 atgagtataa aagagcaaac gttaatgacg ccttacctac agtttgaccg caaccagtgg 60 gcagctctgc gtgattccgt acctatgacg ttatcggaag atgagatcgc ccgtctcaaa 120 ggtattaatg aagatctctc gttagaagaa gttgccgaga 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 cgcggatcct tattgtaatg cccgtaaaag c 31 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 catgccatgg gtatgaccga acttaaaaac gatc 34 <210> 37 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ccggaattct tagcggtgat attgttcaga c 31 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 catgccatgg gtatgaaacc cgacgcacac 30 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 cgcggatcct tacacccaat ccctgacct 29 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 catgccatgg gtgtgaaaac attaattctt ttctcaac 38 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cgagctctta tttcagcgtc ggtttgtc 28 <210> 42 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gggaattcca tatgttagac aatgttttaa gaattgc 37 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gaagatcttc atgccggagc gtctc 25 <210> 44 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gaagatctat aaaaggagga aaatatatga gtatcctggt cacccg 46 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 ccgctcgagt tattgtaatg cccgtaaaag c 31 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 catgccatgg gtaccgaact taaaaacgat c 31 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 cgagctctta gcggtgatat tgttcagac 29 <210> 48 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 cgagctcata aaaggaggaa aatatatgaa acccgacgca cac 43 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 aaaactgcag ttacacccaa tccctgacct 30 <210> 50 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 aaaactgcag ataaaaggag gaaaatatgt gaaaacatta attcttttct caac 54 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 aaggaaaaaa gcggccgctt atttcagcgt cggtttgtc 39 <210> 52 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 tatttttagt agcttaaatg tgattcaaca tcactggaga aagtcttatg taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 53 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ctcccctggg ttgcagggga gcggcaagat taaaccagtt cgttcgggca tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 54 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gctgttttgt aacccgccaa atcggcggta acgaaagagg ataaaccgtg taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 55 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gcagcgcaaa gctgcggatg atgacgagat tactgctgct gtgcagactg tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 56 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 tcaacaatgc cacggattgc gtggcattct tattttcagg aggaacaatg taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 57 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ctggccttta atcaatgaat cagaaacgct tacagcgcca tcaacttgtc tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 58 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ccmA gene <400> 58 gtgggtatgc ttgaagccag agagttactt tgtgagcggg atgaacgaac cttatttagt 60 ggcttgtcat ttacgctgaa cgcaggagag tgggtacaaa tcaccggtag caacggcgcg 120 gggaagacaa cgcttctccg tttgctgacg gggttgtctc gccctgacgc aggcgaggtt 180 ctctggcaag ggcagccctt gcatcaggta cgcgacagct accatcaaaa cctgttatgg 240 ataggccatc agccggggat caaaacccgg ctgacggcgt tagaaaatct gcacttttat 300 catcgcgatg gcgataccgc acaatgtctg gaagccctgg cgcaggccgg gcttgccgga 360 ttcgaagata ttcctgtaaa tcagctctcg gccgggcaac aacgccgcgt cgctttagcg 420 cgtctgtggc tgacccgtgc cacgttatgg atcctcgacg agccttttac cgcgattgac 480 gttaacggcg tcgatcgtct gacccagcgt atggcgcagc atacggagca gggggggatt 540 gtgattctga ctacccacca gccgctcaac gttgctgaaa gtaaaattcg ccgcatttca 600 ctgacgcaaa cgagggccgc atga 624 <210> 59 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ccmB gene <400> 59 atgatgttct ggcgcatttt ccgtcttgag ctgcgtgtag cgtttcgcca tagcgccgaa 60 atcgccaacc cgctgtggtt cttcctgatt gtaattaccc tttttccgct cagtatcggt 120 ccggagccgc aactgctggc gcgtattgca ccgggcatta tctgggttgc tgcgctgctt 180 tcatccttgc tggcgctgga acgactgttc cgtgacgatt tgcaggacgg cagtcttgaa 240 caattgatgt tgttgccgtt acccttgccc gccgttgtgc tggcgaaggt gatggcgcac 300 tggatggtaa ccggtctgcc gttactcatc ctttcgccac tggtagcaat gctactggga 360 atggatgttt atggctggca agtgatggcg ctgacgctgc tgctgggaac gcctacgctt 420 ggctttctcg gtgcaccggg tgtggcgttg acagtgggac ttaagcgcgg tggtgtgctg 480 ctcagcatac tggtgttacc gctgactatc ccattactca tctttgccac cgccgcgatg 540 gacgcggctt ccatgcattt gcccgttgac gggtatctgg caattttagg cgcgttgctg 600 gcaggcaccg cgacattaag tccttttgcg acggcggcag cgttacgaat cagcattcaa 660 taa 663 <210> 60 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ccmC gene <400> 60 atgtggaaaa cactgcatca actggcgatc ccaccacggc tgtatcaaat ctgtggctgg 60 tttataccgt ggctggcaat tgccagtgtg gtcgtgctta ccgtcggctg gatctgggga 120 ttcggctttg ctccggctga ttatcagcag ggaaatagct accgcattat ctacctgcat 180 gtgcctgcgg cgatctggtc gatgggcatt tatgcatcaa tggcagtggc agcgtttatt 240 ggccttgtct ggcagatgaa aatggccaac ctggcggtgg cggcgatggc ccccattggt 300 gccgtgttta cctttattgc cctggttacc ggctctgcat ggggaaaacc gatgtggggc 360 acctggtggg tatgggatgc acgtctgact tctgaactgg tgctgctgtt tttgtatgtg 420 ggtgtgattg ccctgtggca cgccttcgac gaccgccgtc tggcgggccg tgcggcaggt 480 atcctggtgc tgattggcgt ggtgaatctg ccgattattc attactccgt ggagtggtgg 540 aacaccctgc atcagggatc aacgcggatg cagcaaagta tcgatccggc gatgcgttcg 600 ccgctgcgct ggtcgatttt tggcttcctg ctcctgtctg ccacgctgac gctgatgcgg 660 atgcgtaatt tgattttgct gatggaaaaa cgccgtccgt gggtgagtga actgatactg 720 aaaagaggcc gtaaatga 738 <210> 61 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 gggaattcca tatgggtatg cttgaagcca gagagtt 37 <210> 62 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 ccgctcgagt catgcggccc tcgttt 26 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 catgccatgg tgttctggcg catt 24 <210> 64 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 cgcggatcct tattgaatgc tgattcgtaa c 31 <210> 65 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 ccggaattca taaaaggagg aaaatatatg tggaaaacac tgcatcaac 49 <210> 66 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 acgcgtcgac tcatttacgg cctcttttca g 31 <210> 67 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaattcatgg tgagtaagaa ggtactcatc 60 gtagggatgt cgcaca 76 <210> 68 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 gcggatcgag ccgtattgga cgatgtcatt gtttcctgtg tgaaattact ccctcgtttg 60 tgtggcagaa 70 <210> 69 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 caccttctgc cacacaaacg agggagtaat ttcacacagg aaacaatgac atcgtccaat 60 acggctcgat 70 <210> 70 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 gccaagcttg gctgcaggtc gacggatccc cgggaattct catgatgcct tcgcttctgc 60 tgct 64 <210> 71 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 gcaccttggt tggtaggagt agcatgggat ccatgcatca ccatcaccat catagcactt 60 cttctgatta ctcccacg 78 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 ttgtttcctg tgtgaaatta agcgtttcgc agtgcgcggg 40 <210> 73 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 taatttcaca caggaaacaa tgaatgaacg cacatcggat gc 42 <210> 74 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 aattataatg gccggctggg cctctagact agttggcagc tggcgccgct ga 52 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 tctagaggcc cagccggcca ttataattag 30 <210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ggatcccatg ctactcctac caaccaaggt 30

Claims (12)

1. 피루브산 (pyruvic acid)으로부터 5-아미노레뷸론산(ALA)을 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 헴(heme)을 합성하는 경로에 관여하는 유전자를 가지고 있는 미생물에서, 헴 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 헴(heme)을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체.
   
2. 제1항에 있어서, 탄소원으로부터 글루탐산을 생성할 수 있는 미생물인 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
   
3. 제1항에 있어서, 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 헴(heme)을 합성하는 경로에 관여하는 유전자가 도입 또는 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로는 C5생합성 경로인 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 C5 생합성 경로에 관여하는 유전자는 글루타밀-tRNA 합성 효소 (GluRS)를 암호화하는 gltX 유전자, 글루타밀-tRNA 환원효소 (GluTR)를 암호화하는 hemA 유전자 및 글루타메이트-1-세미알데히드 2,1-아미노뮤테이즈 (GSAM)를 암호화하는 hemL 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이체.
   
6. 제3항에 있어서, 상기 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자는 포르포빌리노겐 합성 효소 (PBGS)를 암호화하는 hemB 유전자, 포르포빌리노겐 디아미네이즈 (PBGD)를 암호화하는 hemC 유전자, 우로포르피리노겐 III 합성효소 (UROS)를 암호화하는 hemD 유전자, 우로포르피리노겐 III 디카르복실레이즈 (UROD)를 암호화하는 hemE 유전자, 코프로포르피리노겐 III 옥시데이즈 (CPO)를 암호화하는 hemF 유전자, 프로토포르피리노겐 옥시데이즈 (PPO)를 암호화하는 hemG 유전자 및 페로킬레테이즈(FECH)를 암호화하는 hemH 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이체.
   
7. 제4항에 있어서, 상기 C5 생합성 경로에 관여하는 유전자글루타밀-tRNA 합성 효소 (GluRS)를 암호화하는 gltX 유전자, 글루타밀-tRNA 환원효소 (GluTR)를 암호화하는 hemA 유전자 및 글루타메이트-1-세미알데히드 2,1-아미노뮤테이즈 (GSAM)를 암호화하는 hemL 유전자가 도입 또는 과발현되어있고, 상기 ALA로부터 헴(heme)을 합성하는 경로에 관여하는 유전자로 포르포빌리노겐 합성 효소 (PBGS)를 암호화하는 hemB 유전자, 포르포빌리노겐 디아미네이즈 (PBGD)를 암호화하는 hemC 유전자, 우로포르피리노겐 III 합성효소 (UROS)를 암호화하는 hemD 유전자, 우로포르피리노겐 III 디카르복실레이즈 (UROD)를 암호화하는 hemE 유전자, 코프로포르피리노겐 III 옥시데이즈 (CPO)를 암호화하는 hemF 유전자, 프로토포르피리노겐 옥시데이즈 (PPO)를 암호화하는 hemG 유전자 및 페로킬레테이즈(FECH)를 암호화하는 hemH 유전자가 도입 또는 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
   
8. 제1항에 있어서, heme 또는 heme 중간체 분해 효소를 암호화하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
   
9. 제8항에 있어서, yfeX 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
   
10. 제1항에 있어서 Escherichia coli, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Pseudomonas sp., Anacystis sp., Anabena sp., Chlorobium sp., Chloroflexus sp., Clostridium sp., methanobacteria, Propionibacterium sp., Rhodopsueomonas sp., Rhodobacter sp., Rhodovulum sp., Streptococcus sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Yarrowia sp. 및 Aspergillus sp.으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
    
11. 다음 단계를 포함하는 heme의 제조방법;
    (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한항의 미생물 변이체를 배양하여 heme을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 heme을 수득하는 단계.
    
12. 제11항에 있어서, (a) 단계의 배양에 질소원을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
    
    
    

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