RU2648167C2 - Вариант l-аспартат оксидазы и способ получения хинолината или никотиновой кислоты с его применением - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к биохимии, генетической инженерии, в частности к новому модифицированному варианту L-аспартат оксидазы, полинуклеотиду, его кодирующему, вектору для экспрессии указанного фермента, а также микроорганизму для его получения. Указанный микроорганизм используют для получения хинолината и никотиновой кислоты путём культивирования такого микроорганизма в необходимой среде. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность получения хинолината и никотиновой кислоты. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 14 табл., 3 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к вариантам L-аспартат оксидазы, к хинолинат-продуцирующим микроорганизмам, содержащим гены, которые кодируют варианты L-аспартат оксидазы, и к высокоэффективным способам получения хинолината или никотиновой кислоты с использованием этих микроорганизмов.

Предшествующий уровень техники

Никотиновая кислота представляет собой оксид никотина и один из комплексов витамина В. Это водорастворимый витамин, который также называется ниацином или витамином B3, и он преобладает у животных и в растениях. Дефицит никотиновой кислоты может вызывать заболевание пеллагру или невропатические расстройства. Вообще, никотиновая кислота присутствует в форме кофермента амида никотиновой кислоты, т.е. никотинамид аденин динуклеотида (NAD) или никотинамид аденин динуклеотид фосфата (NADP) in vivo, и она вовлечена в окислительно-восстановительные реакции.

Хинолинат, который также называется хинолиновой кислотой, получается при окислении хинолина. Известно, что хинолиновая кислота обладает нейротоксичностью и вызывает различные неврологические расстройства. Хинолинат также известен как предшественник никотиновой кислоты.

Никотиновая кислота, которая имеет широкое применение в пищевых и в медицинских продуктах, может быть получена методом химического синтеза или биологическим методом получения. Химический синтез никотиновой кислоты может приводить к получению больших количеств токсических отходов, включая катализаторы. Таким образом, с отходами необходимо аккуратно обращаться, а также им требуется дорогостоящая утилизация. Кроме того, пиримидин, используемый в качестве предшественника, имеет различные производные, и поэтому нестабильность поставок и колебания цены пиримидина, влекут за собой нестабильность цены на никотиновую кислоту.

Для решения таких проблем, связанных с химическим синтезом, изучались биологические методы получения никотиновой кислоты с использованием возобновляемых материалов, выделенных из углеводов. Биологическое получение никотиновой кислоты осуществляется, главным образом, посредством двух биосинтетических путей, один из которых представляет собой эукариотический биосинтетический путь никотиновой кислоты из триптофана в качестве исходного материал, а другой прокариотический - из аспарагиновой кислоты в качестве исходного материала. Оба пути используют хинолинат в качестве интермедиата и биосинтезируют никотиновую кислоту из хинолината путем действия хинолинат фосфорибозилтрансферазы (nadC), никотинат-мононуклеотид аденил трансферазы (nadD), NAD синтетазы (nadE), никотинамид-нуклеотид аденил трансферазы (NMN nadR), и никотинамидазы (рпсА).

Раскрыты методы биологического синтеза никотиновой кислоты путем использования рекомбинантных Е. coli или Corynebacterium glutamicum посредством пути аспарагиновой кислоты (Корейский Патент No. 10-1223904). В свою очередь авторы изобретения провели ряд исследований, целью которых было решение проблем, связанных с такими методами биологического синтеза никотиновой кислоты, и улучшение выхода хинолината или никотиновой кислоты, в результате чего они обнаружили варианты фермента, вовлеченные в получение хинолината с высоким выходом и осуществили данное изобретение.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

В изобретении предлагаются варианты L-аспартат оксидазы, которые не регулируются с обратной связью никотиновой кислотой или никотинамид аденин динуклеотидом (NAD).

В изобретении предлагаются хинолинат-продуцирующие микроорганизмы, которые включают варианты L-аспартат оксидазы.

В изобретении предлагаются способы получения хинолината путем культивирования микроорганизмов.

В изобретении предлагаются способы получения никотиновой кислоты путем культивирования микроорганизмов и декарбоксилирования хинолината.

Решение задачи

В первом аспекте настоящего изобретения предлагается вариант L-аспартат оксидазы, имеющий аминокислотную последовательность, где 302-ая аминокислота в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменена другой аминокислотой.

L-аспарта оксидаза обладает каталитической активностью окисления L-аспартата до иминосукцината, как представлено на Схеме реакции 1.

Схема реакции 1

L-аспартат оксидаза по настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. Однако, этим не ограничивается, так как могут иметься различия в аминокислотной последовательности белка в зависимости от видов микробов или штаммов. Другими словами, она может представлять собой мутантный белок или искусственный вариант с аминокислотной последовательностью, содержащей замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, при условии, что она может окислять L-аспартат до иминосукцината. В данном документе, термин «несколько» может варьироваться в зависимости от расположения или типа трехмерной структуры аминокислотных остатков белка, но конкретно означает 2-20, конкретно, 2-10, и более конкретно, 2-5. Кроме того, замена, делеция, вставка, добавление или инверсия аминокислот включает те, которые вызваны искусственными способами или естественной мутацией, если базироваться на различии индивидуумов или видов микроорганизмов.

Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность по настоящему изобретению, может содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, или гомологичную ей на 80% или более аминокислотную последовательность, конкретно на 90% или более, более конкретно, на 95% или более, и наиболее конкретно, гомологичную на 97% или более при условии, что она обладает сходной активностью как у L-аспартат оксидазы. Наиболее конкретно, это может быть полинуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 24.

Термин «гомология» относится к идентичности между двумя аминокислотными последовательностями и может определяться с помощью метода, хорошо известного специалистам в данной области, с использованием BLAST 2.0 для компьютерного расчета параметров, таких как балльная оценка, идентичность и сходство.

Кроме того, полинуклеотидная последовательность, кодирующая L-аспарат оксидазу по настоящему изобретению, может гибридизоваться с полинуклеотидом SEQ ID. NO: 24 или с приготовленным из него зондом в «жестких условиях» и может представлять собой вариант с модифицированной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей L-аспартат оксидазу, которая функционирует нормально. При использовании в данном документе, термин «жесткие условия» относится к условиям, которые дают возможность специфичной гибридизации между полинуклеотидами, и конкретно описаны, например, в Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) или в Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York). Где, например, описано, что гибридизацию проводят в гибридизационном буфере при 65°C (3,5×SSC, 0,02% Фиколл, 0,02% поливинилпирролидон, 0,02% бычий сывороточный альбумин, 2,5 мМ NaH₂PO₄ (рН 7), 0,5% SDS, 2 мМ EDTA). SSC представляет собой 0,15 М хлорид натрия/0,15 М цитрат натрия рН 7. После гибридизации мембрану, на которую была перенесена ДНК, промывали с 2 X SSC при комнатной температуре и затем промывали снова с использованием 0,1-0,5 X SSC/0,1 X SDS при температуре 68°C.

При использовании в данном документе, термин «другая аминокислота» относится к другому аминокислотному остатку за исключением аминокислоты, исходно локализованной в аминокислотной последовательности перед модификацией. Конкретно, аминокислота по настоящему изобретению может включать одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аргинина, глицина, аланина, серина, треонина, цистеина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина и гистидина, за исключением лизина. Конкретно, другая аминокислота может включать одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аргинина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, триптофана и гистидина. Например, другая аминокислота может включать аргинин.

При использовании в данном документе, термин «302-ая» относится к положению аминокислоты от метионина в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, так как метионин аминокислотной последовательности считается первым аминокислотным остатком.

Вообще, активность L-аспартат оксидазы регулируется никотиновой кислотой или NAD, аккумулированной в микроорганизмах, другими словами, она регулируется с по механизму обратной связи и ингибируется никотиновой кислотой или NAD. Регуляция с обратной связью никотиновой кислотой или NAD может отсутствовать в вариантах L-аспартат оксидазы по настоящему изобретению в отличие от обычной L-аспартат оксидазы.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, которая кодирует варианты L-аспартат оксидазы.

В воплощении настоящего изобретения, полинуклеотид может иметь нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант L-аспартат оксидазы, имеющий аминокислотную последовательность, где 302-ая аминокислота в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменена другой аминокислотой.

302-ая аминокислота может включать одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аргинина, глицина, аланина, серина, треонина, цистеина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина и гистидина. Соответственно, нуклеотидная последовательность, соответствующая 302-ой аминокислоте, может быть соответственно заменена. В конкретном воплощении, нуклеотиды 904-906 в нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:24, могут быть соответственно заменены любой комбинацией нуклеотидов, за исключением AAG, AAA, ТАА, TAG и TGA.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается вектор, включающий вышеописанный полинуклеотид, который функционально связан с регуляторной последовательностью.

Полинуклеотид может иметь нуклеотидную последовательность, где нуклеотиды 904-906 в нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 24, соответственно заменены. В конкретном воплощении, полинуклеотид может иметь нуклеотидную последовательность, где нуклеотиды 904-906 в нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:24, могут быть заменены любой комбинацией нуклеотидов, за исключением AAG, AAA, ТАА, TAG и TGA. Полинуклеотид может быть функционально связан с регуляторной последовательностью. Регуляторная последовательность может регулировать экспрессию L-аспартат оксидазы и включает промотор, терминатор или энхансер.

Вектор по настоящему изобретению конкретно никак не ограничен и может представлять собой любой вектор, известный в данной области. Например, вектор может представлять собой вектор pCR2.1-TOPO (Invitrogen, США) или pECCG117 (KFCC-10673), но не ограничиваясь ими.

Промотор по настоящему изобретению может представлять собой промотор лямбда PL, trp-промотор, lac-промотор, Т7-промотор, pPro-промотор, pCJ1-промотор или рС17-промотор (Корейский патент No. 10-0620092). В конкретном воплощении, промотор может представлять собой pCJ1-промотор, но не ограничиваясь этим.

Промотор может быть функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей ген. При использовании в данном документе, термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между последовательностью, регулирующей экспрессию, нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью, множеством сайтов связывания факторов регуляции транскрипции, терминатором или энхансером) и другими нуклеотидными последовательностями. Соответственно, регуляторная последовательность может регулировать транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности, кодирующей ген.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается микроорганизм, содержащий вышеописанный полинуклеотид, где полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, где 302-ая аминокислота в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ГО NO: 1, заменена на другую аминокислоту.

В конкретном воплощении с учетом замены 302-ой аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 24 может быть заменена. Например, полинуклеотид может содержать полинуклеотид, где нуклеотиды 904-906 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 24 заменены на другие нуклеотиды.

Полинуклеотид может быть получен посредством случайной мутации или генно-инженерными манипуляциями. Микроорганизм, в котором часть аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 частично заменена, может быть сконструирован путем трансформации полученного полинуклеотида.

При использовании в данном документе, термин «трансформация» относится к введению гена в клетку-хозяина для его экспрессии там. Трансформированный ген может быть любым геном, например, который встраивается в хромосому клетки-хозяина или который находится вне хромосомы клетки-хозяина при условии, что введенный ген может экспрессироваться внутри клетки-хозяина. Ген включает полинуклеотид, такой как ДНК или РНК, кодирующий полипептид. Например, ген может вводиться в клетку-хозяина в форме экспрессирующей кассеты, которая представляет собой полинуклеотидную структуру, включающую все элементы, требующиеся для самостоятельной генной экспрессии. Как правило, экспрессирующая кассета может включать промотор, функционально связанный с геном, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания с рибосомой и сигнал терминации трансляции. Экспрессирующая кассета может быть представлена в форме экспрессирующего вектора, который самореплицируется. Ген также может вводиться в клетку-хозяина сам по себе или в форме полинуклеотидной структуры и будучи функционально связанным с последовательностью, которая необходима для экспрессии в клетке-хозяине.

При использовании в данном документе, термин «микроорганизм, обладающий способностью продуцировать хинолинат» относится к микроорганизму, способному продуцировать хинолинат из источника углерода в культуральной среде и аккумулировать хинолинат.

Для улучшения способности продуцирования хинолината необходимо, чтобы микроорганизмы продуцировали большие количества хинолината и чтобы продуцированный хинолинат мог аккумулироваться и не использовался по-другому. Таким образом, в некоторых воплощениях настоящего изобретения микроорганизм, обладающий улучшенной способностью продуцировать хинолинат, может быть получен путем удаления или ослабления активности хинолинат фосфорибозилтрансферазы, которая вовлечена в путь распада хинолината, путем усиления экспрессии или активности хинолинат синтетазы, которая вовлечена в синтетический путь хинолината, или путем их комбинации.

В конкретном воплощении, микроорганизм, обладающий улучшенной способностью продуцировать хинолинат, может быть дополнительно модифицирован для усиления активности хинолинат синтетазы. Конкретно, усиленная активность хинолинат синтетазы может достигаться путем дополнительного введения хинолинат синтетазы для повышения ее экспрессии в микроорганизме. Усиленная активность хинолинат синтетазы также может достигаться путем замены промотора, связанного с хинолинат синтетазой в микроорганизме, на сильный промотор. Кроме того, усиленная активность хинолинат синтетазы может достигаться путем повышения собственной активности хинолинат синтетазы.

В случае, где вводится гетерогенная хинолинат синтетаза, полинуклеотид, кодирующий фермент, может вводиться для повышения экспрессии полинуклеотида. Полинуклеотид, кодирующий хинолинат синтетазу, может экспрессироваться в плазмиде микроорганизма или может быть встроен в хромосому микроорганизма и экспрессироваться там.

Хинолинат синтетаза может иметь аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, или может иметь гомологичную ей аминокислотную последовательность. Другими словами, она ничем не ограничивается, так как могут существовать различия в аминокислотной последовательности белка в зависимости от вида микроба или штамма. Она может представлять собой мутантный белок или искусственный вариант с аминокислотной последовательностью, содержащей замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 29, при условии, что она может синтезировать хинолиновую кислоту из иминосукциновой кислоты. Последовательность гена nadA, кодирующего этот фермент, может быть получена из геномной последовательности (gi: GI:89109380) Escherichia coli (E.coli), как раскрыто в статье (Mol Syst Biol., 2006; 2:2006.0007., Epub 2006 Feb 21) или в базе данных Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) или в Японском Банке Данных ДНК (DDBJ). Кроме того, полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность по настоящему изобретению, может содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, или гомологичную ей на 80% или более аминокислотную последовательность, конкретно на 90% или более, более конкретно, на 95% или более, и наиболее конкретно, гомологичную на 97% или более при условии, что она обладает активностью, сходной с активностью L-аспартат оксидазы. Наиболее конкретно, это может быть полинуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 26.

Хинолинат синтетаза обладает активностью синтезировать хинолиновую кислоту из иминосукциновой кислоты, как представлено на Схеме реакции 2.

Схема реакции 2

Таким образом, когда экспрессия гена, кодирующего хинолинат синтетазу, или активность этого фермента повышается, то выход хинолината в клетках может быть увеличен.

В некоторых воплощениях, в микроорганизме, обладающем способностью продуцировать хинолинат, активности оксидазы аспарагиновой кислоты и хинолинат синтетазы могут быть повышены при замене эндогенного промотора на сильный промотор путем введения мутации в промотор или путем повышения числа копий генов. Для замены на сильный промотор могут использоваться широко известные сильные промоторы, включающие рТас, pTrc, pPro, pR, pL, рСЛ, pCysK, и тому подобные.

В конкретном воплощении, предлагается микроорганизм, обладающий улучшенной способностью продуцировать хинолинат, где активность хинолинат фосфорибозилтрансферазы может быть дополнительно уменьшена или удалена.

Активность хинолинат фосфорибозилтрансферазы может быть уменьшена или удалена путем использования микроРНК, которая подавляет транскрипцию.

Хинолинат фосфорибозилтрансфераза может иметь аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, или может иметь высокогомологичную ей аминокислотную последовательность. Другими словами, она ничем не ограничивается, так как могут существовать различия в аминокислотной последовательности белка в зависимости от вида микроба или штамма. Она может представлять собой мутантный белок или искусственный вариант с аминокислотной последовательностью, содержащей замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, при условии, что она может синтезировать мононуклеотид никотиновой кислоты (никотинат) из хинолината.

Хинолинат фосфорибозилтрансфераза может обладать активностью синтезировать мононуклеотид никотиновой кислоты из хинолината, как представлено на Схеме Реакции 3. Таким образом, выход хинолината в клетках может быть повышен путем делеции гена, обладающего активностью синтезировать монокулеотид никотиновой кислоты или путем ослабления активности гена.

Схема реакции 3

Ослабление или удаление активности хинолинат фосфорибозилтрансферазы может осуществляться путем замены эндогенного гена, кодирующего хинолинат фосфорибозилтрансферазу на модифицированный ген для ослабления или удаления активности фермента, путем замены промотора эндогенного гена на слабый промотор или путем делеции эндогенного гена, кодирующего фермент, из хромосомы.

В конкретном воплощении, в микроорганизме, обладающем улучшенной активностью продуцировать хинолинат, активность хинолинат фосфорибозилтрансферазы, превращающей хинолинат в мононуклеотид никотиновой кислоты, может быть удалена. Наконец, ген nadC, кодирующий хинолинат фосфорибозилтрансферазу, может быть удален из генома микроорганизма путем гомологичной рекомбинации. Последовательность гена nadC может быть получена из геномной последовательности (GI:89106990) Е. coli, как раскрыто в статье (Mol Syst Biol., 2006; 2:2006.0007, Epub 2006 Feb 21), или в базе данных Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) или в Японском Банке Данных ДНК (DDBJ). Кроме того, полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность по настоящему изобретению, может содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, или гомологичную ей на 80% или более аминокислотную последовательность, конкретно на 90% или более, более конкретно, на 95% или более, и наиболее конкретно, гомологичную на 97% или более при условии, что она обладает активностью, сходной с активностью L-аспартат оксидазы. Наиболее конкретно, это может быть полинуклеотидная последовательность, представленная с помощью SEQ ID NO: 25.

В конкретном воплощении, микроорганизм, обладающий способностью продуцировать хинолинат, может быть прокариотическим микроорганизмом или эукариотическим микроорганизмом.

В некоторых воплощениях, примеры микроорганизма, обладающего способностью продуцировать хинолинат, могут принадлежать к роду Enterbacter, Escherichia, Erwinia, Serratia, Providencia, Corynebacterium и к роду Brevibacterium, но не ограничиваясь ими.

В конкретном воплощении, микроорганизм, обладающий способностью продуцировать хинолинат, может принадлежать к роду Escherichia.

Конкретно, микроорганизм, обладающий способностью продуцировать хинолинат, может представлять собой Escherichia coli (Е. coli).

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения хинолината, включающий: культивирование микроорганизма, который включает полинуклеотид, кодирующий L-аспартат оксидазу, где 302-ая аминокислота в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, заменена на другую аминокислоту, и извлечение хинолината из культурального раствора.

Культивирование микроорганизма может осуществляться с использованием подходящей культуральной среды при подходящих условиях культивирования, которые хорошо известны в данной области. Такие культуральные процедуры могут использоваться обычным специалистом в данной области и могут легко регулироваться в зависимости от выбранного микроорганизма. Способ культивирования может включать периодический тип культивирования, непрерывный тип культивирования и тип культивирования с подпиткой, но не ограничивается ими. Различные примеры методов культивирования раскрыты, например, в "Biochemical Engineering" (James М. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176").

Необходимо, чтобы культуральная среда, используемая для процесса культивирования, создавала подходящие условия для выбранного микроорганизма. Различные культуральные среды для микроорганизмов раскрыты, например, в "Manual of Methods for General Bacteriology (American Society for Bacteriology, Washington D.C., U.S.A, 1981)". Например, культуральная среда может включать различные источники углерода, источники азота и редкие элементы.

Примеры источников углерода, доступных для культуральной среды, могут включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза и крахмал; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как гликоль и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота, которые могут использоваться индивидуально или в комбинации, но не ограничиваясь ими.

Примеры источников азота, доступных для культуральной среды, могут включать органические источники азота, такие как пептоны, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, экстракт солода, жидкий кукурузный экстракт (CSL), соевая мука и мочевина; и неорганические источники азота, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония, которые могут использоваться индивидуально или в комбинации, но не ограничиваясь ими.

Примеры источников фосфора, доступных для культуральной среды, могут включать дигидрофосфат калия, дикалий гидрофосфат, и соответствующие натрий-содержащие соли. В некоторых воплощениях, культуральная среда также может включать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа. В некоторых воплощениях, культуральная среда может дополнительно включать аминокислоты, витамины и подходящие предшественники дополнительно к вышеперечисленным компонентам. Культуральная среда для культивирования микроорганизмов или индивидуальные компоненты могут быть добавлены к культуральному раствору периодическим или непрерывным способом.

В некоторых воплощениях, во время культивирования рН культурального раствора может регулироваться путем добавления соединения, например, гидроксида аммония, гидроксида калия, аммония, фосфорной кислоты или серной кислоты подходящим образом. Кроме того, во время культивирования вспенивание в культуральном растворе может подавляться с использованием антивспенивающего агента, такого как, например, полигликолевый эфир. Для поддержания культурального раствора в аэробных условиях, кислород или кислород-содержащий газ (например, воздух) может подаваться в культуральный раствор. Температура культурального раствора может поддерживаться в температурном интервале от около 20°C до около 45°C, конкретно, от около 25°C до около 40°C. Культивирование может поддерживаться до момента получения целевого количества хинолината, конкретно, период может составлять от около 10 часов до около 160 часов.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения никотиновой кислоты, включающий: культивирование микроорганизма, который включает полинуклеотид, кодирующий L-аспартат оксидазу, где 302-ая аминокислота в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, заменена на другую аминокислоту; и осуществление реакции декарбоксилирования путем добавления кислоты к продукту культуры.

При использовании в данном документе, термин «реакция декарбоксилирования» относится к реакции с получением никотиновой кислоты путем удаления карбоксильной группы из хинолината и высвобождения диоксида углерода.

Конкретно, после культивирования микроорганизма полученный в результате хинолинат-включающий культуральный раствор может быть подвергнут центрифугированию или мембранной фильтрации для удаления микроорганизма. Затем для ускорения реакции декарбоксилирования, кислота, которая обеспечивает водородную группу, может быть добавлена в хинолинат-включающий культуральный раствор. Может использоваться любая кислота без ограничения при условии, что она может обеспечивать водородную группу для культурального раствора.

В одном воплощении, хинолинат-включающий культуральный раствор может использоваться без очистки.

В одном воплощении, кислота, добавляемая к культуральному раствору, может быть хлороводородной кислотой или серной кислотой.

В одном воплощении, после добавления кислоты, культуральный раствор может иметь рН около 5 или менее, или конкретно, может быть в интервале от около 2 до около 3.

В одном воплощении, реакция декарбоксилирования культурального раствора может осуществляться при температуре от около 100°C до около 150°C, или конкретно, может быть в интервале от около 120°C до около 135°C.

В одном воплощении, реакция декарбоксилирования культурального раствора может осуществляться при давлении от около 0,1 МПа до около 0,5 МПа, или конкретно, может осуществляться при давлении от около 0,2 МПа до около 0,4 МПа.

При осуществлении декарбоксилирования при высокотемпературных условиях с высоким давлением в течение от около 1 часа до около 3 часов после добавления кислоты в хинолиат-включающий культуральный раствор, хинолинат в культуральном растворе может превращаться в никотиновую кислоту, как представлено на Схеме реакции 4.

Схема реакции 4

В одном воплощении, способ получения никотиновой кислоты может дополнительно включать извлечение и очистку никотиновой кислоты.

В одном воплощении, извлечение никотиновой кислоты может проводиться обычным методом, известным в данной области, включая фильтрацию культурального раствора и способ кристаллизации.

Предпочтительные эффекты изобретения

Согласно воплощению настоящего изобретения, хинолинат может быть эффективно получен путем культивирования микроорганизма, содержащего вариант L-аспартат оксидазы, который не регулируется с обратной связью никотиновой кислотой или NAD. Никотиновая кислота высвобождается. Эти способы с использованием микроорганизмов могут решить проблемы, связанные со стандартными методами химического синтеза, затрагивающими окружающую среду, что связано с побочными продуктами катализа, высоким потреблением энергии и использованием не возобновляемых источников, а также проблему низкого выхода при стандартных методах биосинтеза. Следовательно, этими способами можно эффективно получать хинолинат и никотиновую кислоту так, что это безвредно для окружающей среды.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует путь получения никотиновой кислоты в способе получения никотиновой кислоты согласно воплощению настоящего изобретения.

Способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью следующих примеров. Эти примеры приведены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1. Получение вариантов L-аспартат оксидазы, где снята обратная регуляция с помощью NAD

<1-1> Конструирование плазмиды, экспрессирующей L-аспартат оксидазу

Для получения вариантов L-аспартат оксидазы, полученный из Е. coli ген nadB, кодирующий L-аспартат оксидазу, клонировали в экспрессирующий вектор. С этой целью, хромосому штамма E.coli К12 W3110 использовали в качестве матрицы. Штамм был получен из Американской Типированной Коллекции Клеточных Культур (АТСС No.23257). На основе нуклеотидной последовательности для гена nadB (NCBI Регистрационный No. «GI:89109380»), представленной SEQ ID NO: 24, полученной из Банка генов Национального Института Здоровья (NIH GenBank) конструировали праймеры SEQ ID NO: 2 и 3, содержащие сайты распознавания ферментов рестрикции NdeI и BamHI, для амплификации ORP-области гена nadB для клонирования гена.

ПЦР проводили с использованием хромосомной ДНК E.coli К12 W3110 в качестве матрицы и олигонуклеотидов, представленных SEQ ID NO: 2 и 3, в качестве праймеров. Используемая полимераза представляла собой PfuUltraTM ДНК-полимеразу (Stratagene, США.), и ПЦР проводили путем повторения 30 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд, и элонгации при 72°C в течение 2 минут. Посредством ПЦР был получен амплифицированный ген около 1,9 т.п.о., включая область ORF гена nadB и сайты распознавания ферментов рестрикции NdeI и BamHI.

Ген nadB, полученный посредством ПЦР, извлекали с помощью элюирования из агарозного геля и затем обработки с использованием ферментов рестрикции NdeI и BamHI, с последующим лигированием в вектор pProLar (CloneTech, США), обработанный ферментами рестрикции NdeI и BamHI для экспрессии L-аспартат оксидазы из гена nadB, связанного с промотором рРго. Полученный в результате вектор назвали «вектор pPro-nadB».

<1-2> Конструирование плазмидной библиотеки вариантов L-аспартат оксидазы

Для получения вариантов L-аспартат оксидазы, конструировали библиотеку вариантов гена nadB с использованием вектора pPro-nadB, полученного в <1-1>, в качестве матрицы с помощью ПЦР пониженной точности в присутствии dGTP и MnSO₄.

В ПЦР пониженной точности с использованием рекомбинантного вектора pPro-nadB в качестве матрицы использовали праймеры 4 и 5, концентрации dGTP и MnSO₄ в ПЦР-миксе, которые использовали для контроля степени GC и степени ошибки, составили 2 мМ и 8 мМ, соответственно, и используемая полимераза представляла собой PfuUltraTM ДНК-полимеразу (Stratagene, США). ПЦР проводили путем повторения 30 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд, и протяжки при 72°C в течение 2 минут. Посредством ПЦР получали ДНК-фрагмент около 1,9 т.п.о. Данный ДНК-фрагмент очищали посредством элюирования из агарозного геля, обработки с использованием фермента рестрикции Dpnl (NEB, США) в течение около 1 часа и затем трансформации в штамм E.coli DH5α (Invitrogen, США.) CaCl₂-методом. Трансформированный штамм E.coli DH5α высевали на твердую среду Luria-Bertani (LB)-канамицин(Km) (дрожжевой экстракт 10 г/л, NaCl 5 г/л, триптон 10 г/л, канамицин 25 мкг/л) и культивировали в течение ночи при 37°C для получения канамицин-устойчивых колоний. Из них случайно выбирали десять клонов с последующим секвенированием. В результате степень ошибки гена nadB оценивали на уровне около 4,5 нуклеотидов/1 т.п.о. Количество клеток с полученными вариантами гена nadB составило около 3×10⁵ или более.

<1-3> Отбор вариантов L-аспартат оксидазы, демонстрирующих отсутствие регуляции с обратной связью NAD

<1-3-1> Конструирование штамма, дефицитного по L-аспартат оксидазе

Ген nadB отрицательно влияет на продуцирование хинолината когда он регулируется с обратной связью NAD (J Biol Chem. 1982 Jan 25; 257(2):626-32.). По этой причине, важным оказалось открытие того, что ген nadB может быть освобожден от регуляции с обратной связью NAD. Для эффективного отбора лучших вариантов гена naB из штамма удаляли эндогенный ген nadB. На основе нуклеотидной последовательности для гена nadB (NCBI Регистрационный No. «GI:89109380»), представленной SEQ ID NO: 24, полученной из Банка генов Национального института здоровья (NIH GenBank), конструировали праймеры SEQ ID NO: 6 и 7, способные амплифицировать 3'-область гена nadB, праймеры SEQ ID NO: 8 и 9, способные амплифицировать 5'-область гена nadB, и праймеры SEQ ID NO: 10 и 11, способные амплифицировать loxpCm.

ПЦР осуществляли с использованием хромосомной ДНК Е. coli К12 W3110 (АТСС NO. 23257) в качестве матрицы и олигонуклеотидов SEQ ID NO. 6 и 7 в качестве праймеров для амплификации 5'-области и SEQ ID NO. 8 и 9 в качестве праймеров для амплификации 3'-области гена nadB размером 0,4 т.п.о. и 0,4 т.п.о., соответственно. Кроме того, ПЦР осуществляли с использованием плазмидного вектора, содержащего loxpCm, вектора pLoxpCat2 в качестве матрицы и с использованием олигонуклеотидов SEQ ID NO. 10 и 11 в качестве праймеров для амплификации гена loxpCm, имеющего последовательность 1 т.п.о., гомологичную гену nadB с обоих концов. Используемая полимераза представляла собой PfuUltraTM ДНК-полимеразу (Stratagene, США.), и ПЦР проводили путем повторения 30 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 30 секунд, отжига при 53°C в течение 30 секунд, и элонгации при 72°C в течение 1 минуты с последующим элюированием из агарозного геля с получением фрагмента, расположенного в 5'-области от гена nadB, фрагмента, расположенного в 3'-области от гена nadB, и фрагмента loxpCm. ПЦР проводили с использованием этих полученных фрагментов в качестве матрицы при условиях ПЦР с повторением 10 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 60 секунд, отжига при 50°C в течение 60 секунд и элонгации при 72°C в течение 1 минуты, и с повторением цикла 20 раз после добавления праймеров SEQ ID NO. 7 и 8. В результате была получена nadB-дефицитная кассета, содержащая 5'-область nadB ген-loxpCm-3'-область гена nadB размером 1,8 т.п.о.

Штамм Е. coli К12 W3110, содержащий pKD46 в качестве вектора, экспрессирующего red-рекомбиназу лямбда, трансформировали nadB-дефицитной кассетой с помощью электропорации и затем штамм высевали на твердую среду LB (триптон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, NaCl 10 г, хлорамфеникол 15 мкг/л, и агар 1,5%), содержащую хлорамфеникол в качестве маркера селекции. Затем культивировали при 37°C в течение ночи для отбора штаммов микроорганизма, демонстрирующих устойчивость против хлорамфеникола.

Отобранные штаммы использовали непосредственно в качестве матриц для осуществления ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO. 7 и 8 при таких же условиях. Размеры гена штамма дикого типа и nadB-дефицитного штамма идентифицировали как 2,4 т.п.о. и 0,8 т.п.о., соответственно, на 1%-агарозном геле, подтверждая, таким образом, делецию гена nadB в Е. coli К12 W3110. Конструирование nadB-дефицитного штамма, названного W3110-ΔnadB, была завершена.

<1-3-2> Отбор вариантов L-аспартат оксидазы

Чтобы обнаружить, что ген nadB устойчив к регуляции NAD по механизму регуляции с помощью обратной связи с, использовали 6-аминопиридин-3-карбоновую кислоту (6-NA, получено из Aldrich, США) в качестве аналога никотиновой кислоты, и 6-аминоникотинамид (6-Nm, получено из Aldrich, США) в качестве аналога никотинамида. Хотя следует использовать аналоги 6-NAD благодаря структурному сходству NAD с никотиновой кислотой и никотинамидом, устойчивые варианты гена nadB выбирались главным образом с использованием аналога никотиновой кислоты и аналога никотинамида, и поэтому подтверждали устойчивость к регуляции NAD по механизму регуляции с обратной связью каждого из выбранных вариантов гена nadB (ссылка Journal of bacteriology, June 1983, p. 1126-1136). Плазмидную библиотеку вариантов L-аспартат оксидазы, сконструированную в <1-2> Примера 1, трансформирвали в W3110-ΔnadB штамм посредством CaCl₂-метода.

Трансформирванный штамм W3110-ΔnadB высевали на M9-(6,NA)-(6,Nm) твердую среду (NaHPO₄-7H₂O 12,8 г, KH₂PO₄ 3 г, NaCl 0,5 г, NH₄Cl 1 г, MgSO₄ 2 мМ, CaCl₂ 0,1 мМ, казаминовая кислота 1 г, 6-аминопиридин-3-карбоновая кислота (6-NA) 0,3 г/л, 6-аминоникотинамид (6-Nm) 0,3 г/л) для отбора колоний с более высокой скоростью роста по сравнению с nadB дикого типа. Суммарно 1×10⁷ колоний скринировали, и три из них отобрали и затем дали им названия pPro-nadB64, pPro-nadB67 и pPro-nadB110, соответственно. Каждый из трех отобранных штаммов инокулировали и культивировали в жидкой среде M9-(6,NA)-(6,Nm) (NaHPO₄-7H₂O 12,8 г, KH₂PO₄ 3 г, NaCl 0,5 г, NH₄Cl 1 г, MgSO₄ 2 мМ, CaCl₂ 0,1 мМ, казаминовая кислота 1 г, 6-аминопиридин-3-карбоновая кислота (6-NA) 0,3 г/л, 6-аминоникотинамид (6-Nm) 0,3 г/л), и затем сравнивали их оптические плотности (OD). В результате было обнаружено, что скорости роста pPro-nadB67 были выше, чем у pPro-nadB64 и pPro-nadB72 в среде, содержащей 6-NA и 6-Nm, как представлено в таблице 4. Соответственно, pPro-nadB67 отбирали и идентифицировали ее последовательность. В результате было обнаружено, что pPro-nadB67 включает аргинин в качестве заместителя лизина - 302-ой аминокислоты от стартовой аминокислоты метионина.

Штамм Е. coli К12 W3110, который является дефицитным по гену nadC и содержит pPro-nadB67(Lys302Arg)-pCJ-nadA, что было сделано путем введения вектора pProlar в качестве экспрессирующего вектора для варианта гена nadB, был назван CV01-0518. Затем он был депонирован согласно Будапештской конвенции в Корейском Центре Культур Микроорганизмов (КССМ) под регистрационным No. КССМ11434Р, 20.06.2013.

Пример 2. Сравнение выхода хинолиновой кислоты между вариантами гена nadB

<2-1> Конструирование штамма, дефицитного по хинолинат фосфорибозилтрансферазе

ПЦР проводили с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК Е. coli К12 W3110 с получением гена nadC, который вовлечен в путь распада хинолината. На основе нуклеотидной последовательности для гена nadC (NCBI Регистрационный No. «GI:89106990»), представленной SEQ ID NO: 25, полученной из Банка генов Национального института здоровья (NIH GenBank), конструировали праймеры SEQ ID NO: 12 и 13, способные амплифицировать 3'-область гена nadC, праймеры SEQ ID NO: 14 и 15, способные амплифицировать 5'- и 3'-область гена nadC и ген loxpCm, и праймеры SEQ ID NO: 16 и 17, способные амплифицировать 5'-область гена nadC.

ПЦР осуществляли с использованием хромосомной ДНК Е. coli К12 W3110 в качестве матрицы и олигонуклеотидов SEQ ID NO: 12 и 13, и 16 и 17 в качестве праймеров для амплификации 5'- и 3'-области гена nadC размером 0,5 т.п.о. и 0,3 т.п.о., соответственно. Кроме того, ПЦР осуществляли с использованием плазмидного вектора, включающего loxpCm, вектора pLoxpCat2 в качестве матрицы и с использованием олигонуклеотидов SEQ ID NO. 14 и 15 в качестве праймеров для амплификации гена loxpCm, имеющего последовательность 1 т.п.о., гомологичную гену nadC с обоих концов. Используемая полимераза представляла собой PfuUltraTM ДНК-полимеразу (Stratagene, США.), и ПЦР проводили путем повторения 30 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 30 секунд, отжига при 53°C в течение 30 секунд, и элонгации при 72°C в течение 1 минуты. В результате были получены 5'-фрагмент nadC, 3'-фрагмент nadC и loxpCm-фрагмент. ПЦР проводили с использованием этих фрагментов, полученных из вышеописанной ПЦР, в качестве матрицы при условиях ПЦР с повторением 10 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 60 секунд, отжига при 50°C в течение 60 секунд и элонгации при 72°C в течение 1 минуты, и с повторением цикла 20 раз после добавления праймеров SEQ ID NO 12 и 17. В результате была получена nadC-дефицитная кассета, содержащая 5'-область nadC ген-loxpCm-3'-область reHanadC размером 1,8 т.п.о.

Штамм Е. coli К12 W3110, содержащий pKD46 в качестве вектора, экспрессирующего red-рекомбиназу лямбда, трансформировали nadC-дефицитной кассетой с помощью электропорации, и затем штамм высевали на твердую среду LB (триптон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, NaCl 10 г, хлорамфеникол 1,5%), содержащую хлорамфеникол в качестве маркера селекции и культивировали при 37°C в течение ночи для отбора штаммов микроорганизма, демонстрирующих устойчивость против хлорамфеникола.

Отобранные штаммы непосредственно использовались в качестве матрицы для осуществления ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 13 и 16 при таких же условиях, и на 1%-агарозном геле идентифицировали, что размеры гена штамма дикого типа и nadC-дефицитного штамма составили 1,6 т.п.о. и 1,3 т.п.о., соответственно, подтверждая делецию гена nadC в Е. coli К12 W3110. Конструирование nadC-дефицитного штамма, названного W3110-ΔnadC, было завершено.

<2-2> Конструирование плазмиды для экспрессии аспартат оксидазы и хинолинат синтетазы

Два фермента, аспартат оксидаза и хинолинат синтетаза, необходимы для продуцирования хинолината. Соответственно, конструировали плазмиду, способную экспрессировать оба гена, nadB и nadA, кодирующие два фермента. Сначала осуществляли ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК Е. coli W3110 с получением гена nadA, кодирующего хинолинат синтетазу. На основе нуклеотидной последовательности для гена nadA (NCBI Регистрационный No. «GI:89107601»), представленной SEQ ID NO: 26, полученной из Банка генов Национального института здоровья (NIH GenBank), синтезировали праймеры SEQ ID NO: 18 и 19, способные амплифицировать ORF-область гена nadA, включающего области ATG и ТАА и содержащие сайты распознавания ферментов рестрикции ApaI и NotI.

ПЦР проводили с использованием хромосомной ДНК E.coli К12 W3110 в качестве матрицы и олигонуклеотидов, представленных SEQ ID NO: 18 и 19, в качестве праймеров. Используемая полимераза представляла собой PfuUltraTM ДНК-полимеразу (Stratagene, США.), и ПЦР проводили путем повторения 30 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд, и элонгации при 72°C в течение 1 минуты. В результате был получен амплифицированный ген около 1 т.п.о., включая ген nadA и сайты распознавания ферментов рестрикции ApaI и NotI.

pCJ1-промотор получали посредством ПЦР с использованием плазмиды, включающей pCJ1-промотор, в качестве матрица, на основе раскрытия выложенного Корейского Патента No. 10-2006-0068505. Конструировали праймеры, представленные SEQ ID NO: 20 и 21, содержащие сайты распознавания ферментов рестрикции BamHI и Apal, для лигирования pCJ1-промотора с амплифицированным геном nadA.

ПЦР проводили с использованием хромосомной ДНК E.coli К12 W3110 в качестве матрицы и олигонуклеотидов, представленных SEQ ID NO: 20 и 21, в качестве праймеров. Используемая полимераза представляла собой PfuUltraTM ДНК-полимеразу (Stratagene, США.), и ПЦР проводили путем повторения 30 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд, и элонгации при 72°C в течение 1 минуты. В результате был получен амплифицированный фрагмент около 0,3 т.п.о., включая pCJ1-промотор и сайты распознавания ферментов рестрикции BamHI и ApaI.

Ген nadA, полученный посредством ПЦР, обрабатывали с использованием ферментов рестрикции ApaI и NotI, и амплифицированный фрагмент pCJ1-промотора обрабатывали с использованием ферментов рестрикции ApaI и BamHI. Ген nadA и фрагмент pCJ1-промотора, обработанные ферментами рестрикции, соответственно, клонировали посредством лигирования в вектор pPro-nadB, полученный в <1-1>, который бы обработан ферментами рестрикции NotI и BamHI. Наконец, конструировали рекомбинантный вектор pPro-nadB-pCJl-nadA 5,9 т.п.о., в котором экспрессия гена nadB регулируется промотором pPro в качестве конститутивного промотора, а экспрессия гена nadA регулируется промотором pCJ1. Сконструированный pPro-nadB-pCJl-nad имел последовательность, представленную SEQ ID NO: 27. Кроме того, посредством вышеописанных процессов также был сконструирован рекомбинантный вектор pPro-nadB67-pCJl-nadA, включающий вариант nadB и ген nadA дикого типа. Сконструированный pPro-nadB67-pCJl-nadA имел последовательность, представленную SEQ ID NO: 28.

<2-2-1> Конструирование вектора, в котором 302-ая аминокислота гена pPro-nadB67-pCJl-nadA заменена на аминокислоту, за исключением лизина и аргинина.

Для подтверждения устойчивости к обратной регуляции с помощью NAD варианта гена nadB67, включающего аргинин вместо лизина в качестве 302-ой аминокислоты, начиная от метионина L-аспартат оксидазы, 302-ая аминокислота гена nadB была заменена каждой из 18 различных аминокислот за исключением лизина и аргинина. Осуществляли быстрый мутагенез с использованием рекомбинантного вектора pPro-nadB67-pCJl-nadA в качестве матрицы. Используемая полимераза представляла собой PfuUltraTM ДНК-полимеразу (Stratagene, США). ПЦР проводили путем повторения 18 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд, и элонгации при 68°C в течение 15 минут. Полученный в результате ПЦР-продукт обрабатывали с использованием фермента рестрикции DpnI (NEB, США) и затем трансформировали в штамм E.coli DH5α (Invitrogen, США.) CaCl₂-методом. Трансформированный штамм E.coli DH5α высевали на твердую среду LB-Km (дрожжевой экстракт 10 г/л, NaCl 5 г/л, триптон 10 г/л, канамицин 25 мкг/л) и культивировали в течение ночи при 37°C для получения канамицин-устойчивых колоний. Полученные в результате колонии подвергали экстракции плазмиды и секвенированию для идентификации замены 302-ой аминокислоты с помощью 18 различных аминокислот. Полученные в результате варианты в виде плазмид назвали как представлено в таблице 8.

<2-3> Оценка хинолинат-продуцирующей способности вариантов дикого типа nadB и nadB67 по отношению к концентрации NAD

Для сравнения способности продуцировать хинолинат в гене nadB дикого типа и в вариантах гена nadB по отношению к концентрации NAD, проводили анализ титра хинолината. После того как хинолинат-продуцирующий штамм (W3110-ΔnadC), полученный в <2-1> Примера 2, трансформировали плазмидой pPro-nadB67-pCJq1-nadA, сконструированной в <2-2> Примера 2, и каждым из 18 типов вариантов nadB67, сконструированных в <2-2-1> Примера 2, посредством CaCl₂-метода. Трансформированные штаммы культивировали в течение ночи на твердой среде LB-Km при периодическом культивировании при 37°C для получения единственной колонии, и затем единственную колонию инокулировали с помощью одного платинового пула в 25 мл культуральной среды для анализа эффективности хинолината и культивировали при 37°C в течение периода от 24 часов до 72 часов при встряхивании при 250 об./мин. Таблица 9 демонстрирует состав культуральной среды для продуцирования хинолината. Для идентификации устойчивости вариантов гена nadB67 к обратной регуляции NAD, никотиновую кислоту (NA) добавляли в культуральную среду при различных концентрациях с последующим сравнением полученных количеств хинолината.

Количество хинолината (хинолиновая кислота, QA) в каждом из культуральных растворов анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Результаты представлены в таблице 10. Таблица 10 демонстрирует способность продуцировать хинолинат вариантов nadB67 по отношению к концентрации NAD.

Для двух хинолинат-продуцирующих вариантов, включающих плазмиды pPro-nadB67(D)-pCJ-nadA и pPro-nadB67(E)-pCJ-nadA, ген nadB нарушен и потерял активность. В результате хинолиат-продуцирующие варианты по большей части имеют очень низкий уровень хинолината (QA), который превращался в остаточный относительно выхода в процентном соотношении (%). Он базировался на 100% полученного уровня QA, когда концентрация никотиновой кислоты (NA) составляет 0 мкМ.

Что касается таблицы 11, выход хинолината составил менее, чем 50%, когда использовалась плазмида pPro-nadB-pCJ-nadA, включающая ген nadB дикого типа, и культуральная среда содержит никотиновую кислоту, около 5 мкМ или выше. Тогда как выход хинолината составил 70% или выше при использовании плазмиды pPro-nadB67-pCJ-nadA и рекомбинантной плазмиды с вариантами по 302-ой аминокислоте, включающих вариант гена nadB. Штамм W3110-ΔnadC является ауксотрофным по NAD, что требует наличия внешнего источника NAD для роста. Штамм W3110-ΔnadC не способен непосредственно акцептировать NAD и использует гетерогенную никотиновую кислоту (NA) или никотинамид (Nm) для продуцирования NAD. Когда количество внутриклеточного NAD составляет 1 мМ или выше, то ген nadB подвергается обратной регуляции для поддержания количества внутриклеточного постоянного количества NAD. Соответственно, продуцирование QA может быть ограничено геном nadB, который подвергается обратной регуляции. Добавление NA к культуральной среде означает повышение NAD в штамме. Соответственно, сравнивали количества продуцирования QA между штаммами с добавлением NA к культуральной среде в различных концентрациях для идентификации степени обратной регуляции в вариантах гена nadB по отношению к концентрации NAD. В результате было обнаружено, что варианты гена nadB с замененными 302-ыми аминокислотами не регулируются NAD по механизму регуляции с обратной связью.

<2-4> Продуцирование никотиновой кислоты посредством реакции декарбоксилирования

Для идентификации способности продуцировать никотиновую кислоту хинолинат-продуцирующих штаммов, в которые были введены варианты гена nadB, использовали выход хинолината, как в таблице 10. Способ продуцирования никотиновой кислоты, используемый в данном документе, представлял собой декарбоксилирование хинолинат-включающего культурального раствора при условиях высокой температуры и высокого давления на основе раскрытия Корейского Патента No. 10-1223904, для превращения хинолината в никотиновую кислоту. Для удаления клеток из хинолинат-содержащего культурального раствора осуществляли центрифугирование со скоростью от около 3000 об./мин. до около 4000 об./мин. в течение от около 10 минут до около 30 минут. Хинолинат-содержащую надосадочную жидкость, полученная в результате центрифугирования, отделяли и использовали в качестве образца для реакции декарбоксилирования.

Реакцию декарбоксилирования проводили при около 135°C и при около 0,2 МПв в течение около 3 часов. Используемые образцы представлены в таблице 12. Водный раствор хинолината (стандартный продукт Sigma-Aldrich Со.) в деионизированной воде использовали в качестве контрольной группы. Каждый из образцов водных растворов хинолината титровали с гидроксидом натрия, водным раствором аммиака, соляной кислотой или серной кислотой, конкретно, превращение хинолината в никотиновую кислоту происходило при рН 2. таблица 12 демонстрирует количества выработки никотиновой кислоты, превращенной из хинолината таблицы 10 посредством реакции при высокой температуре и при высоком давлении.

Эксперимент превращения хинолината в водном растворе (деионизированная вода) в никотиновую кислоту, как раскрыто ранее в ссылке Китайского Патента No. 101353322, осуществляли при 135°C и при 0,2 МПа в течение около 3 часов. Уровень температуры и давления был ниже, чем 150°C-250°C, как в предыдущей ссылке, соответственно. Результаты представлены в таблице 12.

Пример 3: Подтверждение активности вариантов L-аспартат оксидазы в отношении устойчивости к обратной регуляции NAD

<3-1> Конструирование плазмиды, сверхэкспрессирующей L-аспартат оксидазу

Для большего прояснения активностей вариантов L-аспартат оксидазы в отношении устойчивости к обратной регуляции NAD, оценивали устойчивость к обратной регуляции NAD варианта L-аспартат оксидазы, кодируемого вариантом nadB67, отобранным в <Примере 1-3-2>. Для клонирования nadB дикого типа и вариантов nadB в векторе pCDF-duet, содержащем гистидиновый маркер (His)-tag, осуществляли ПЦР с использованием плазмиды pPro-nadB, содержащей ген дикого типа, и pPro-nadB67 с рекомбинантным геном в качестве матрицы, соответственно. Для использования в ПЦР конструировали праймеры SEQ ID NO: 22 и 23, способные амплифицировать ORF-область nadB дикого типа и варианта гена nadB67, который включает области ATG и ТАА, и содержит сайты распознавания ферментов рестрикции BamHI и NdeI.

Используемая полимераза представляла собой PfuUltraTM ДНК-полимеразу (Stratagene, США.), и ПЦР проводили путем повторения 30 раз цикла, включающего денатурацию при 96°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд, и элонгации при 72°C в течение 2 минут. В результате были получены амплифицированные гены около 1,9 т.п.о., nadB дикого типа и вариант nadB67, включающие сайты распознавания ферментов рестрикции BamHI и NdeI.

Ген nadB дикого типа и вариант nadB67, полученные посредством ПЦР, обрабатывали с использованием ферментов рестрикции BamHI и NdeI, и затем клонировали посредством лигирования в вектор pCDF-duet, обработанный с использованием ферментов рестрикции BamHI и NdeI. В конечном счете конструировали рекомбинантные векторы, включающие гены nadB дикого типа и вариант nadB67, соответственно, где экспрессию каждого из генов контролировали с помощью Т7-промотора в качестве конститутивного промотора, и гены содержали His-маркер, дающий возможность очистки белка. Сконструированные рекомбинантные векторы назвали рТ7-nadB и pT7-nadB67, соответственно. Конструировали другие рекомбинантные векторы, в которых валин, лейцин, изолейцин и гистидин заменяли 302-ую аминокислоту nadB дикого типа, соответственно, с использованием такого же метода и были названы рТ7-nadB67(V), pT7-nadB67(L), pT7-nadB67(I), pT7-nadB67(H), соответственно.

<3-2> Очистка L-аспартат оксидазы

После того, как рекомбинантный вектор pT7-nadB, pT7-nadB67, pT7-nadB67(V), pT7-nadB67(L), pT7-nadB67(I), or pT7-nadB67(H) был трансформирован в штамм «tuner» посредством CaCl₂-метода, трансформированные штаммы высевали на твердую среду LB-SP (дрожжевой экстракт 10 г/л, NaCl 5 г/л, триптон 10 г/л и стрептомицин 50 мкг/л) и культивировали в течение ночи при 37°C для селекции стрептомицин-устойчивых колоний. Одну из колоний отбирали и культивировали в жидкой среде LB-SP (дрожжевой экстракт 10 г/л, NaCl 5 г/л, триптон 10 г/л, спектиномицин 50 мкг/л) и затем добавляли туда производное изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозида (IPTG), когда значение оптической плотности как показателя роста (OD) достигало 0,4, и культивировали при около 18°C в течение ночи. Клетки, включающие сверхэкспрессированные L-аспартат оксидазу дикого типа и варианты L-аспартат оксидазы, извлекали из культуральной среды с последующей очисткой L-аспартат оксидазы дикого типа и вариантов L-аспартат оксидазы из извлеченных клеток с помощью набора реагентов «Ni-NTA spin kit» (Quiagen, США). Извлеченный белок составил 50% от суммарного белка, около 2% извлеченного белка был извлечен в виде L-аспарат оксидазы.

<3-3> Тест активности вариантов L-аспарат оксидазы

L-аспартат оксидаза превращает аспартат в качестве субстрата в иминоаспартат в присутствии FAD в качестве кофактора, и иминоаспартат превращается в оксалоацетат. Пероксид водорода (Н₂О₂), который генерируется посредством вышеописанной реакции, использовали для идентификации активности nadB. Поглощение при 560 нм продукта реакции Н₂О₂ с использованием продукта из реакции измеряли с использованием Amplex Red (Invitrogen, Корея) для определения активности nadB. Здесь добавляли NAD в различных концентрациях для создания конкурентного ингибирования для FAD так, чтобы оценить устойчивость L-аспартат оксидазы против обратной регуляции с помощью NAD. Относительная активность L-аспартат оксидазы дикого типа при концентрации NAD 1 мМ составила менее чем 50%, в то время как относительная активность вариантов L-аспартат оксидазы при такой же концентрации NAD оставалась около 70% или выше (таблица 14), что указывало, таким образом, на то, что варианты L-аспартат оксидазы не регулируются NAD по механизму регуляции с обратной связью.

Учреждение Депозитария: Корейский Цент Культур Микроорганизмов (КССМ) (Полномочия Международного Депозитария)

Регистрационный номер No: КССМ11434

Дата депонирования: Июнь, 20,2013

Хотя настоящее изобретение было конкретно показано и описано со ссылкой на его примерные воплощения, специалистам в этой области будет понятно, что могут быть сделаны различные изменения в форме и деталях, не покидая при этом рамок и сущности следующей формулы изобретения.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение относится к вариантам L-аспартат оксидазы, которые устойчивы к обратной регуляции с помощью никотиновой кислоты или NAD, и, таким образом, могут эффективно продуцировать хинолинат. Хинолинат может быть эффективно получен путем культивирования микроорганизма, включающего такой вариант L-аспартат оксидазы согласно воплощениям настоящего изобретения. Хинолинат также может быть эффективно получен с использованием микроорганизма, в котором активность хинолинат синтетазы дополнительно усилена или активность хинолинат фосфорибозилтрансферазы дополнительно ослаблена. Посредством такой трансформации микроорганизма, выход хинолината или никотиновой кислоты может быть улучшен, что имеет большую пользу с промышленной точки зрения.

Claims (12)

1. Вариант L-аспартат оксидазы, имеющий аминокислотную последовательность, где 302-я аминокислота в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменена другой аминокислотой, причем указанный вариант L-аспартат оксидазы может окислять L-аспартат до иминосукцината, и указанную другую аминокислоту выбирают из группы, состоящей из аргинина, глицина, аланина, серина, треонина, цистеина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана, аспарагина, глутамина и гистидина.

2. Вариант L-аспартат оксидазы по п. 1, где другая аминокислота выбрана из группы, состоящей из аргинина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, триптофана и гистидина.

3. Вариант L-аспартат оксидазы по п. 1, где снята регуляция никотиновой кислотой или NAD по механизму обратной связи.

4. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, где 302-я аминокислота в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, заменена другой аминокислотой, причем указанная нуклеотидная последовательность кодирует вариант L-аспартат оксидазы по п. 1, и указанную другую аминокислоту выбирают из группы, состоящей из аргинина, глицина, аланина, серина, треонина, цистеина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана, аспарагина, глутамина и гистидина.

5. Вектор, содержащий полинуклеотид по п. 4, который функционально связан с регуляторной последовательностью, где указанный вектор предназначен для экспрессии варианта L-аспартат оксидазы по п. 1.

6. Микроорганизм, содержащий полинуклеотид по п. 4, где указанный микрооорганизм предназначен для экспрессии варианта L-аспартат оксидазы по п. 1 и принадлежит роду Enterbacter, роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacterium или к роду Brevibacterium.

7. Микроорганизм по п. 6, где микроорганизм принадлежит к роду Escherichia.

8. Микроорганизм по п. 6, где усилена активность хинолинат синтетазы.

9. Микроорганизм по п. 6, где уменьшена активность эндогенной хинолинат фосфорибозилтрансферазы.

10. Способ получения хинолината, причем способ включает:

культивирование микроорганизма по п. 6 в среде и извлечение хинолината из культуральной среды.

11. Способ получения никотиновой кислоты, причем способ включает: культивирование микроорганизма по п. 6 в среде и проведение реакции декарбоксилирования путем добавления кислоты к культуральной среде.

Images