BR102014018364A2 - variante de l-aspartato oxidase; polinucleotídeo; vetor; microrganismo; método de produção de quinolinato; e método de produção de ácido nicotínico - Google Patents

Abstract

resumo variante de l-aspartato oxidase; polinucleotídeo; vetor; microrganismo; método de produção de quinolinato; e método de produção de ácido nicotínico para produzir quinolinato eficazmente, uma variante de l-aspartato oxidase cuja regulação por retroalimentação pelo ácido nicotínico ou nad é liberada, e um microrganismo que inclui a variante de l-aspartato oxidase. o quinolinato pode ser produzido de modo eficaz através da cultura do microrganismo que inclui a variante de l-aspartato oxidase.

Description

VARIANTE DE L-ASPARTATO OXIDASE; POLINUCLEOTÍDEO; VETOR; MICRORGANISMO; MÉTODO DE PRODUÇÃO DE QUINOLINATO; E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO NICOTÍNICO CAMPO DA TÉCNICA [001] A invenção refere-se a variantes de L-aspartato oxidase, microrganismos produtores de quinolinato que incluem genes que codificam as variantes de L-aspartato oxidase, e a métodos de produção de quinolinato ou ácido nicotinico em alta eficiência com o uso dos microrganismos.

TÉCNICA ANTERIOR [002] O ácido nicotinico é um óxido de nicotina e um dos complexos de vitamina B. Ele é uma vitamina solúvel em água, também chamado de niacina ou vitamina B3, e prevalente em animais e plantas. A deficiência de ácido nicotinico pode causar doença de pelagra ou neuropatias. Em geral, o ácido nicotinico está presente na forma de coenzima de amida de ácido nicotinico, isto é, nicotinamida adenina dinucleotideo (NAD) ou nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato (NADP) , in vivo, e está envolvido em reações de redução de oxidação. [003] O quinolinato, o qual também é chamado de ácido quinolinico, é produzido pela oxidação de quinolina. 0 ácido quinolinico é conhecido por ter neurotoxicidade e causar diversos distúrbios neurológicos. 0 quinolinato também é conhecido como um precursor de ácido nicotinico. [004] O ácido nicotinico que é amplamente aplicável a alimentos e produtos medicinais pode ser preparado por um método sintético quimico ou um método de produção biológica. A sintese quimica de ácido nicotinico pode resultar em grandes quantidades de resíduo tóxico que inclui catalisadores. Deste modo, o resíduo é necessário para um gerenciamento completo e grandes despesas para eliminação. Além disso, a pirimidina usada como um precursor possui várias derivações, e então flutuações em suprimento e preço da pirimidina causam um preço instável do ácido nicotínico [005] Para solucionar trais problemas do método de síntese química, métodos biológicos de produção de ácido nicotínico com o uso de materiais derivados de carboidrato renovável têm sido estudados. A produção biológica de ácido nicotínico é realizada principalmente através de duas vias biosintéticas, uma das quais consiste em uma via biossintética de ácido nicotínico a partir de triptofano como um material de partida em eucariontes, e a outra consiste a partir de ácido aspártico como um material de partida como um procariotos. Ambas as vias utilizam quinolinato como um intermediário e biosintetizam ácido nicotínico a partir de quinolinato pela ação de quinolinato fosforribosiltransferase (nadC), nicotinato-mononucleotídeo adenil transferase (nadD), NAD sintetase (nadE), nicotinamida-nucleotídeo adenil transferase (NMN nadR) e nicotinamidase (pncA). [006] Métodos de síntese biológica de ácido nicotínico com o uso de E. coli recombinante ou Corynebacterium glutamicum através da via do ácido aspártico são apresentados (patente coreana n2 10-1223904). Enquanto que os inventores da presente invenção pesquisaram para tratar dos problemas de tais métodos de síntese biológica de ácido nicotínico e para aperfeiçoar o rendimento de quinolinato ou ácido nicotínico, descobriram variantes de enzima envolvidas na produção de alto rendimento de quinolinato e completaram a presente invenção.

INVENÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

PROBLEMA DA TÉCNICA [007] A invenção fornece variantes de L-aspartato oxidase que demonstram que a regulação por retroalimentação pelo ácido nicotinico ou nicotinamida adenina dinucleotideo (NAD) é revelada. [008] A invenção fornece microrganismos produtores de quinolinato que incluem variantes de L-aspartato oxidase. [009] A invenção fornece métodos de produção de quinolinato por cultura dos microrganismos. [010] A invenção fornece métodos de produção de ácido nicotinico por cultura dos microrganismos e descarboxilação de quinolinato.

SOLUÇÃO DA TÉCNICA [011] Um aspecto da presente invenção provê uma variante de L-aspartato oxidase possuindo uma sequência de aminoácidos na qual um 302° aminoácido na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 é substituido por outro aminoácido. [012] A L-aspartato oxidase tem uma atividade catalítica de oxidação de L-aspartato em iminosuccinato, conforme representado no Esquema de Reação 1. <Esquema de Reação 1> L-Aspartato + Fumarato <=> α-iminosuccinato + Succinato + H+ L-Aspartato + Oxigênio <=> Peróxido de hidrogênio + a-iminosuccinato + H+ [013] A L-aspartato oxidase da presente invenção pode compreender a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1. Entretanto, não é limitada a esta, pois pode haver a diferença da sequência de aminoácidos da proteína dependendo da espécie ou cepa do microrganismo. Em outras palavras, pode ser uma variação de proteína mutante ou artificial com uma sequência de aminoácidos compreendendo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos em um ou mais locais da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, contanto que possa oxidar L-aspartato a iminosuccinato. Deste modo, "vários" pode diferir dependendo da localização ou tipo na estrutura tridimensional dos resíduos de aminoácido da proteína, mas especificamente significa entre 2 e 20, mais especificamente entre 2 e 10, e mais especificamente entre 2 a 5. Adicionalmente, a substituição, deleção, inserção, adição ou inversão do aminoácido inclui aquelas causadas por variantes artificiais ou mutações naturais, se baseadas na diferença individual ou da espécie do microrganismo. [014] O polinucleotídeo codificando a sequência de aminoácidos da presente invenção pode compreender a sequência de polinucleotídeos codificadora da proteína possuindo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, ou a sequência de aminoácidos com 80% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, e particularmente especificamente 97% ou mais de homologia com a mesma, contanto que ela possua atividade similar de L-aspartato oxidase. O mais específico, pode ser a sequência de polinucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 24 . [015] O termo "homologia" refere-se a identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada pelo método bastante conhecido aos técnicos no assunto, utilizando BLAST 2.0 para computar o parâmetro como pontuação, identidade e similaridade. [016] Adicionalmente, a sequência de polinucleotideos que codifica L-aspartato oxidase da presente invenção pode ser hibridizada com o polinucleotideo de SEQ ID NO: 24 ou a sonda preparada a partir das mesmas "condições restritas", e pode ser uma sequência de polinucleotideos variante modificada que codifica L-aspartato oxidase que funciona normalmente. Conforme utilizado aqui, "condições restritas" refere-se a condições que permitem uma hibridização especifica entre o polinucleotideo, e são especificamente descritos, por exemplo, em Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Noca Iorque, 1989) ou em Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque). Descreve-se, por exemplo, a hibridização carreada em um tampão de hibridização de 65°C (3.5 χ SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polivinilpirolidona, 0.02% albumina de soro bovino, 2.5 mM NaH2P04 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA) . SSC é 0,15M de cloreto de sódio/0,15M de citrato de sódio de pH 7. Após a hibridização, a membrana na qual o DNA transferido é entregue é limpa com 2 X SSC em temperatura ambiente e depois limpa novamente com 0,1 a 0,5 X SSC/0,1 X SDS a uma temperatura de 6 8 ° C . [017] Conforme utilizado aqui, o termo "outro aminoácido" refere-se a um outro residuo de aminoácido exceto o residuo de aminoácido originalmente localizado na sequência de aminoácido antes da modificação. Especificamente, o outro aminoácido da presente invenção pode incluir um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em arginina, glicina, alanína, serina, treonina, cisteina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolína, fenilalanina, tirosina, tríptofano, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina e histidina, exceto lisina. Especificamente, o outro aminoácido pode incluir um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em arginina, valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano e histidina. Por exemplo, o outro aminoácido pode incluir arginina. [018] Conforme descrito, o termo "302o" refere-se a posição do aminoácido a partir da metionina da sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 1, uma vez que a metionina da sequência de aminoácido é contada a partir do primeiro residuo de aminoácido. [019] Em geral, a atividade de L-aspartato oxidase é regulada pelo ácido nicotinico ou pelo NAD acumulado em microrganismos, em outras palavras, o feedback de regulação é inibido por ácido nicotinico ou NAD. O feedback de regulação por ácido nicotinico ou NAD pode ser liberado nas variantes de L-aspartato oxidase da presente invenção, diferentemente das L-aspartato oxidases comuns. [020] O outro aspecto da presente invenção provê um polinucleotideo tendo uma sequência de nucleotideos que codificam as variantes de L-aspartato oxigenase. [021] Em uma realização da presente invenção, um polinucleotideo pode ter uma sequência de nucleotideos que codificam uma variante de L-aspartato oxigenase tendo uma sequência de aminoácidos na qual um 302° animoácido na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 é substituído por outro aminoácido. [022] Ο 302° aminoácido pode incluir um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, glicina, alanina, serina, treonina, cisterna, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofano, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina e histidina. De acordo, uma sequência de nucleotideos correspondente ao 302° aminoácido pode ser adequadamente substituída. Em uma realização especifica, 904-a 906- nucleotideos em uma sequência de nucleotideos representados pela sequência SEQ ID NO: 24 pode ser adequadamente substituídos com qualquer combinação de nucleotideos AAG, AAA, TAA, TAG e TGA. [023] Outro aspecto da presente invenção provê um vetor incluindo o polinucleotideo descrito acima, que é operacionalmente ligado a uma sequência reguladora. [024] O polinucleotideo pode ter uma sequência de nucleotideos em que 904£ ao 9062 nucleotideos na sequência de nucleotideos representada pela sequência SEQ ID NO: 24 são adequadamente substituídos. Em uma realização especifica, o polinucleotideo pode ter uma sequência de nucleotideos em que 904£ ao 9062 nucleotideos na sequência de nucleotideos representada pela sequência SEQ ID NO: 24 são substituídos por qualquer combinação de nucleotideos, exceto AAG, AAA, TAA, TAG e TGA. O polinucleotideo pode ser ligado de modo operável a uma sequência reguladora. A sequência reguladora pode regular a expressão de L-aspartato oxidase, e inclui um promotor, um terminador ou um intensificador. [025] O vetor da presente invenção não é especificamente limitado, e pode ser qualquer vetor conhecido no estado da técnica. Por exemplo, o vetor pode ser um vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen, E.U.A) ou pECCG117 (KFCC-10673), mas não são limitados a estes. [026] O promotor da presente invenção pode ser um promotor lambda PL, um promotor trp, um promotor lac, um promotor T7, um promotor pPro, um promotor pCJl ou um promotor pCJ7 (patente coreana n° 10-0620092) . Em uma realização especifica, o promotor pode ser um promotor pCJl, mas não limitado a este. [027] O promotor pode ser ligado de modo operável a uma sequência de nucleotideos que codifica um gene. Para uso na presente invenção, o termo "ligado de modo operável" se refere a uma ligação funcional entre uma sequência reguladora de ácido nucleico (por exemplo, um promotor, uma sequência de sinal, uma disposição de locais de ligação de fator regulador transcricional, um terminador ou um intensificador) e outras sequências de nucleotideos. Consequentemente, a sequência reguladora pode regular a transcrição e/ou translação da sequência de nucleotideos que codifica o gene. [028] Outro aspecto da presente invenção provê um microrganismo compreendendo o polinucleotideo mencionado acima, em que o polinucleotideo pode compreender uma sequência de nucleotideos que codifica uma sequência de aminoácidos em que um 302- aminoácido na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 é substituído por outro aminoácido. [029] Em uma realização específica, de acordo com a substituição do 302£ aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, parte de uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 24 pode ser substituída. Por exemplo, o polinucleotídeo pode compreender um polinucleotldeo em que 904£ ao 906- nucleotídeo na sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 24 são substituídos por outros nucleotídeos. [030] O polinucleotídeo pode ser obtido através de mutação aleatória ou manipulação de engenharia genética. Um microrganismo, no qual parte de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é parcialmente substituída, pode ser construído por meio da transformação do polinucleotídeo. [031] Para uso na presente invenção, o termo "transformação" se refere á introdução de um gene em uma célula hospedeira a ser expressão no mesmo. O gene transformado pode ser em qualquer gene, por exemplo, que é inserida em um cromossomo da célula hospedeira, ou que é do cromossomo da célula hospedeira, contanto que o gene introduzido seja exprimível dentro da célula hospedeira. O gene inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, tais como DNA e RNA. Por exemplo, o gene pode ser introduzido na forma de um cassete de expressão, o qual é uma estrutura de polinucleotídeo que inclui todos os elementos exigidos para a autoexpressão do gene, em uma célula hospedeira. Tipicamente, o cassete de expressão pode incluir um promotor ligado de modo operável ao gene, um sinal de terminação de transcrição, um local de ligação de ribossomo e um sinal de terminação de translação. O cassete de expressão pode ser na forma de um vetor de expressão que é autorreplicável. O gene também pode ser introduzido em uma célula hospedeira por si mesmo ou na forma de uma estrutura de polinucleotídeo e ligado de modo operável a uma sequência que é exigida para a expressão na célula hospedeira. [032] Conforme utilizado na presente invenção, o termo "microrganismo que tem uma capacidade de produzir quinolinato" se refere a um microrganismo capaz de produzir quinolinato a partir de uma fonte de carbono em um meio de cultura e de acumular quinolinato. [033] Para aperfeiçoar a capacidade de produzir quinolinato, é exigido que os microrganismos produzam grandes quantidades de quinolinato, e o quinolinato produzido pode ser acumulado sem que seja usado de outras formas. Portanto, em algumas realizações da presente invenção, o microrganismo que tem uma capacidade aperfeiçoada de produzir quinolinato pode ser obtido mediante a remoção ou enfraquecimento da atividade de quinolinato fosforribosiltransferase que está envolvido em uma via de decomposição de quinolinato, mediante a otimização da expressão ou atividade de quinolinato sintetase que está envolvido em uma via sintética de quinolinato, ou por combinação dos mesmos. [034] Em uma realização especifica, o microrganismo que tem uma capacidade aperfeiçoada de produzir quinolinato pode ser ainda modificado para aumentar a atividade de quinolinato sintetase. Especificamente, a atividade otimizada da quinolinato sintetase pode ser alcançada introduzindo-se adicionalmente a quinolinato sintetase para aumentar a expressão do mesmo no microrganismo. A atividade otimizada da quinolinato sintetase também pode ser alcançada substituindo-se um promotor ligado a quinolinato sintetase no microrganismo por um promotor forte. Adicionalmente, a atividade otimizada da quinolinato sintetase pode ser alcançada aumentando-se a atividade do próprio quinolinato sintetase. [035] No caso onde a quinolinato sintetase heterogênea é introduzida, um polinucleotideo que codifica essa enzima pode ser introduzido para aumentar a expressão do polinucleotideo. O polinucleotideo que codifica para quinolinato sintetase pode ser expresso em um plasmideo do microrganismo ou pode ser inserido em um cromossomo do microrganismo e expresso no mesmo. [036] A quinolinato sintetase pode ter uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 29 ou pode ter uma sequência de aminoácidos que é homóloga à mesma. Em outras palavras, não é limitada a esta, porque podem possuir diferenças na sequência de aminoácidos da proteína dependente da espécie ou cepa do microrganismo. Pode ser uma proteína mutante ou variante artificial com uma sequência de aminoácidos compreendendo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos em uma ou mais localizações da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 29, contanto que possa sintetizar ácido quinolínico a partir de ácido iminosuccínico. A sequência de gene nadA que codifica esta enzima pode ser obtida a partir da sequência de genoma (gi: GI:89109380) de Escherichía colí (E. coli) , conforme apresentado em um artigo (Mol Syst Biol., 2006; 2:2006-0007., Epub 21 de fevereiro de 2006) ou no banco de dados disponível junto ao National Center for Biotechnology Information (NCBI) ou DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Ainda, o polinucleotideo que codifica a sequência de aminoácidos da presente invenção pode compreender a sequência de polinucleotideo codificando a proteína tendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 29, ou a sequência de aminoácidos com 80% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, e particularmente especificamente 97% ou mais de homologia com a mesma, contanto que ela possua atividade similar de L-aspartato oxidase. O mais especifico, pode ser a sequência de polinucleotideos representada pela SEQ ID NO: 26. [037] A quinolinato sintetase tem uma atividade para sintetizar o ácido quinolínico a partir de ácido iminosuccínico, conforme mostrado no Esquema de Reação 2. <Esquema de Reação 2> α-iminosuccinato + dihidroxiacetona fosfato <=> quinolinato + fosfato + 2H20 [038] Portanto, quando a expressão de um gene que codifica a quinolinato sintetase ou a atividade desta enzima é otimizada, o rendimento de quinolinato em células pode ser aumentado. [039] Em algumas realizações, no microrganismo que tem uma capacidade de produzir quinolinato, as atividades de ácido aspártico oxidase e quinolinato sintetase podem ser otimizadas substituindo-se os promotores endógenos com promotores fortes, por meio da indução de uma mutação nos promotores, ou aumentando-se o número de cópias dos genes. Para a substituição por promotores fortes, geralmente conhecidos como promotores fortes, que incluem pTac, pTrc, pPro, pR, pL, pCJl, pCysK, e similares, podem ser usados. [040] Em uma realização especifica, é provido um microrganismo que tem uma capacidade aperfeiçoada de produzir quinolinato, em que a atividade de quinolinato fosforribosiltransferase pode ser adicionalmente reduzida ou removida. [041] A atividade de quinolinato fosforribosiltransferase pode ser reduzida ou removida mediante a modificação de um gene que codifica quinolinato fosf orribosiltransferase ou com o uso de um microRNA que suprime a transcrição. [042] A quinolinato fosforribosiltransferase pode ter uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30 ou uma sequência de aminoácidos que é altamente homóloga à mesma. Em outras palavras, não é limitada a esta, porque podem possuir diferenças na sequência de aminoácidos da proteina dependente da espécie ou cepa do microrganismo. Pode ser uma proteina mutante ou variante artificial com uma sequência de aminoácidos compreendendo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos em uma ou mais localizações da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30, contanto que possa sintetizar o mononucleotideo de ácido nicotinico (nicotinato) a partir de quinolinato. [043] A quinolinato fosforribosiltransferase pode ter uma atividade para sintetizar o mononucleotideo de ácido nicotinico a partir de quinolinato, conforme mostrado no Esquema de Reação 3. Portanto, o rendimento de quinolinato em células pode ser aumentado deletando-se um gene que tem a atividade para sintetizar mononucleotideo de ácido nicotinico ou enfraquecendo-se a atividade do gene. <Esquema de Reação 3> 5-Fosfο-α-D-ribose 1-difosfato + Quinolinato + 2H+ <=> CO2 + Difosfato + Nicotinato ribonucleotideo [044] O enfraquecimento ou remoção da atividade de quinolinato fosforribosiltransferase pode ser executada mediante a substituição de um gene endógeno que codifica quinolinato fosforribosiltransferase por um gene modificado para enfraquecer ou remover a atividade da enzima, substituindo-se um promotor do gene endógeno por um promotor fraco, ou deletando-se o gene endógeno que codifica a enzima a partir do cromossomo. [045] Em uma realização especifica, no microrganismo que tem uma atividade aperfeiçoada para produzir quinolinato, a atividade de quinolinato fosforribosiltransferase converte quinolinato em mononucleotídeo de ácido nicotinico pode ser removida. Com esta finalidade, o gene nadC que codifica quinolinato fosforribosiltransferase pode ser removido a partir do genoma do microrganismo por recombinação homóloga. A sequência do gene nadC pode ser obtida a partir da sequência de genoma (GI:89106990) de E. coli, conforme apresentado em um artigo (Mol Syst Biol., 2006;2:2006-0007, Epub 21 de fevereiro de 2006), ou no banco de dados disponivel junto ao National Center for Biotechnology Information (NCBI) ou no DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Ainda, o polinucleotideo que codifica a sequência de aminoácidos da presente invenção pode compreender a sequência de polinucleotideo codificando a proteina tendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30, ou a sequência de aminoácidos com 80% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, e particularmente especificamente 97% ou mais de homologia com a mesma, contanto que ela possua atividade similar de L-aspartato oxidase. O mais especifico, pode ser a sequência de polinucleotideos representada pela SEQ ID NO: 25 . [046] Em uma realização especifica, o microrganismo que tem uma capacidade de produzir quinolinato pode ser um microrganismo procariótico ou um microrganismo eucariótico. [047] Em algumas realizações, exemplos do microrganismo que tem uma capacidade de produzir quinolinato podem pertencer ao gênero Enterobacter, gênero Escherichia, gênero Erwinia, gênero Serratia, gênero Providencia, gênero Corynebacterium e gênero Brevibacterium, mas não são limitados a estes. [048] Em uma realização especifica, o microrganismo que tem uma capacidade de produzir quinolinato pode pertencer ao gênero Escherichia. [049] Especificamente, o microrganismo que tem uma capacidade de produzir quinolinato pode ser Escherichia coli (E. coli) . [050] Outro aspecto da presente invenção provê um método de produção de quinolinato compreendendo: cultivar um microrganismo que inclui um polinucleotideo que codifica uma L-aspartato oxidase, na qual um 3022 aminoácido na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 é substituído por outro aminoácido; e recuperar quinolinato a partir de uma solução cultivado. [051] A cultura do microrganismo pode ser executada com o uso de um meio de cultura adequado sob condições de cultura adequadas que são bem conhecidas na técnica. Tais procedimentos de cultura podem ser usados por um elemento versado na técnica e podem ser prontamente ajustados dependendo de um microrganismo selecionado. O método de cultura de incubação pode incluir um tipo de cultura em lote, um tipo de cultura contínua e um tipo descontínuo alimentado. Vários exemplos de métodos de cultura exemplificadores são apresentados, por exemplo, em "Biochemical Engineering" (por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, páginas 138 a 176)". [052] O meio de cultura usado no processo de cultura satisfaça as condições adequadas para um microrganismo selecionado. Diversos meios de cultura para microrganismos são apresentados, por exemplo, em "Manual of Methods for General Bacteríology (pela American Society for Bacteriology, Washington D.C., E.U.A, 1981)". Por exemplo, o meio de cultura pode incluir diversas fontes de carbono, fontes de nitrogênio e elementos-traço. [053] Exemplos de fontes de carbono disponíveis para o meio de cultura podem incluir carboidratos, tais como glicose, sucrose, lactose, frutose, maltose e amido; óleos e gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de ricino e óleo de coco; ácidos graxos, tais como ácido palmitico, ácido esteárico e ácido linoleico; alcoóis, tais como glicol e etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido acético, o qual pode ser usado sozinho ou em combinação, mas não são limitados a estes. [054] Exemplos de fontes de nitrogênio disponíveis para o meio de cultura podem incluir fontes de nitrogênio orgânico, tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, liquido de maceração de milho (CSL), farinha de soja e ureia; e fontes de nitrogênio inorgânico, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio, os quais podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas não são limitados a estes. [055] Exemplos de fontes de fósforos disponíveis para os meios de cultura podem incluir fosfato de dihidrogênio potássio, fosfato de hidrogênio dipotássio e sais contendo sódio correspondentes. Em algumas realizações, o meio de cultura também pode incluir sais de metal, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. Em algumas realizações, o meio de cultura pode incluir, adicionalmente, aminoácidos, vitaminas e precursores adequados, em adição aos componentes listados acima. O meio de cultura para cultivar microrganismos ou componentes individuais pode ser adicionado a uma solução de cultura de uma maneira continua ou por lote. [056] Em algumas realizações, durante a cultura, o pH da solução de cultura pode ser ajustado mediante a adição de um composto, por exemplo, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de maneira adequada. Adicionalmente, durante a cultura, a formação de espuma na solução de cultura pode ser suprimida com o uso de um agente anti-espumante, tal como um ácido graxo, por exemplo, poliglicol éster. Para manter a solução de cultura em uma condição aeróbica, oxigênio ou um gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) pode ser suprido na solução de cultura. A temperatura da solução de cultura pode ser mantida em uma faixa de temperatura de cerca de 20 °C a cerca de 45 °C, especificamente cerca de 25 °C a cerca de 40 °C. A cultura pode ser mantida até que uma quantidade alvo de quinolinato seja obtida, especificamente, o período pode ser cerca de 10 horas a 160 horas. [057] Outro aspecto da presente invenção provê um método de produção de ácido nicotínico compreendendo: cultivar um microrganismo que inclui um polinucleotídeo que codifica L-aspartato oxidase onde um 302- aminoácido na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 é substituído por outro aminoácido; e conduzir a reação de descarboxilação mediante a adição de um ácido a um produto cultivado. [058] Conforme utilizado aqui, o termo "reação de descarboxilação" se refere a um produto para gerar ácido nicotinico através da remoção de um grupo carboxilico do quinolinato e liberação de dióxido de carbono. [059] Em particular, após a cultura do microrganismo, a solução de cultura que inclui quinolinato resultante pode ser submetida à centrifugação ou filtração de membrana para remover o microrganismo. Então, para acelerar a reação de descarboxilação, um ácido que fornece um grupo hidrogênio pode ser adicionado na solução de cultura que inclui quinolinato. Qualquer ácido pode ser usado, sem limitação, contanto que possa fornecer grupo hidrogênio para a solução de cultura. [060] Em uma realização, a solução de cultura que inclui quinolinato pode ser usada sem purificação. [061] Em uma realização, o ácido adicionado na solução de cultura pode ser ácido clorídrico ou ácido sulfúrico. [062] Em uma realização, após a adição do ácido, a solução de cultura pode ter um pH de cerca de 5 ou menos, ou especificamente uma faixa de cerca de 2 a cerca de 3 . [063] Em uma realização, a reação de descarboxilação da solução de cultura pode ser executada em uma temperatura de cerca de 100 °C a cerca de 150 °C, ou especificamente uma faixa de cerca de 130 °C a cerca de 135 °c. [064] Em uma realização, a reação de descarboxilação da solução de cultura pode ser executada em uma pressão de cerca de 0,1 MPa a cerca de 0,5 Mpa, ou especificamente ser executada a uma pressão de cerca de 0,2 MPa a cerca de 0,4 MPa. [065] Sob a condução da descarboxilação sob condições de alta temperatura e alta pressão por cerca de 1 hora a 3 horas após a adição de um ácido na solução de cultura que inclui quinolinato, o quinolinato na solução de cultura pode ser convertido em ácido nicotinico, conforme mostrado no Esquema de Reação 4. [066] <Esquema de Reação 4> [067] Quinolinato + 2H+ <=> C02 + Ácido nicotinico [068] Em uma realização, o método de produção de ácido nicotinico pode incluir, adicionalmente, recuperar e purificar o ácido nicotinico. [069] Em uma realização, a recuperação de ácido nicotinico pode ser conduzida por um método comum conhecido na técnica, que inclui processos de filtração da solução de cultura e cristalização.

EFEITOS VANTAJOSOS [070] De acordo com as realizações da presente invenção, o quinolinato pode ser produzido de modo eficaz cultivando-se um microrganismo que inclui uma variante de L-aspartato oxidase que é regulada por retroalimentação pelo ácido nicotinico ou NAD. O ácido nicotinico é liberado. Estes métodos que utilizam o microrganismo podem resolver os problemas dos métodos de síntese química convencionais, em relação a problemas ambientais devido à geração de subprodutos de catalisação, alto consumo de energia e uso de recursos não renováveis, e o problema de baixo rendimento com os métodos de biossintese convencionais. Consequentemente, estes métodos podem produzir de modo eficaz quinolinato e ácido nicotinico de uma maneira ambientalmente amigável.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [071] A Figura 1 ilustra uma via para produzir ácido nicotinico em um método de produção de ácido nicotinico de acordo com uma realização da presente invenção.

MODO DA INVENÇÃO [072] A presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos são para propósitos ilustrativos somente e não se destinam a limitar o escopo da invenção. [073] Exemplo 1. Preparação de variantes de L- aspartato oxidase resistentes à regulação por retroalimentação por NAD é descrita. [074] <1—1> Construção de plasmideo expressando L-aspartato oxidase [075] Para preparar variantes de L-aspartato oxidase, um gene nadB derivado de E. coli que codifica L-aspartato oxidase selvagem foi clonado em um vetor de expressão. Com esta finalidade, um cromossomo da cepa K12 W3110 de E.coli foi usado como um modelo. A cepa foi adquirida junto à American Type Culture Collection (ATCC n°. 23257) . Com base na sequência de nucleotideos para o gene nadB (n2. de registro NCBI "GI:89109380") representada pela SEQ ID NO: 24 obtida junto ao GenBank do National Institute of Health (NIH GenBank). Primers de SEQ ID NOs: 2 e 3 tendo locais de reconhecimento de enzimas de restrição Ndel e BamHI são construídos para amplificar a região ORF do gene nadB para clonagem de gene. [076] [Tabela 1] [077] A PCR foi conduzida com o uso de DNA cromossômico de K12 W3110 de E.coli como o modelo e oligonucleotídeos representado por SEQ ID NOs: 2 e 3 como primers. A polimerase usada foi DNA polimerase PfuUltra™ (Stratagene, E.U.A.), e a PCR foi conduzida repetindo-se 30 vezes um ciclo que compreende a desnaturação a 96 °C por 30 segundos, anelamento a 50 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 2 minutos. Através da PCR, foi obtido um gene amplificado de cerca de 1,9 kb que inclui o gene nadB ORF e os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição Ndel e BamHI. [078] 0 gene nadB obtido através da PCR foi recuperado por eluição de gel de agarose e, então, tratado com as enzimas de restrição Ndel e BamHI, seguido pela ligação em um vetor pProLar (CloneTech, E.Ü.A) tratado com as enzimas de restrição Ndel e BamHI, a fim de expressar L-aspartato oxidase a partir do gene nadB ligado a um promotor pPro. O vetor resultante foi chamado de "vetor pPro-nadB". [079] <l-2> Construção de biblioteca plasmídica de variante de L-aspartato oxidase [080] Para obter variantes de L-aspartato oxidase, uma biblioteca de variante de gene nadB foi construída com o uso do vetor pPro-nadB obtido em <1-1> como um modelo por PCR propensa a erro na presença de dGTP e MnS04. [081] Na PCR propensa a erro com o uso do vetor recombinante de pPro-nadB como um modelo, os primers 4 e 5 foram usados, as concentrações de dGTP e MnS04 em uma mistura de PCR, as quais foram usadas para controlar uma taxa de GC e uma taxa de erro, foram de 2 mM e 8 mM, respectivamente, e a polimerase usada foi DNA polimerase PfuUltra™ (Stratagene, E.Ü.A.) . A PCR foi conduzida repetindo-se 30 vezes um ciclo que compreende a desnaturação a 96 °C por 30 segundos, anelamento a 50 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 2 minutos. Através da PCR, um fragmento de DNA de cerca de 1,9 kb foi obtido. Este fragmento de DNA foi purificado através de eluiçâo de gel de agarose, tratado com a enzima de restrição Dpnl (NEB, E.U.A) por cerca de 1 hora e, então, transformado em cepa DH5a de E.coli (Invitrogen, E.U.A.) através do método CaCl2. A cepa DH5a de E.coli transformada foi colocada em um meio de placa de Lurla-Bertani (LB) -canamicina (Km) (extrato de levedura 10 g/L, NaCl 5 g/L, triptona 10 g/L, canamicina 25 pg/L) e cultivada de um dia para o outro a 37 °C para obter colônias resistentes à canamicina. Dez clones foram selecionados aleatoriamente a partir das mesmas, seguido pelo sequenciamento. Como consequência disto, a taxa de erro do gene nadB foi estimada como cerca de 4,5 nucleotideo/1 kb. 0 número de cepas com uma variante de gene nadB obtida foi de cerca de 3x 105 ou mais. [082] [Tabela 2] [083] <l-3> Seleção de variantes de L-aspartato oxidase demonstrando liberação regulada por retroalimentação por NAD [084] <l-3-l> Construção de cepa deficiente de L-aspartato oxidase [085] O gene nadB afeta negativamente a produção de quinolinato sob a regulação por retroalimentação por NAD (J Biol Chem. 1982 Jan 25;257 (2) :626 a 632). Por esta razão, é importante descobrir um gene nadB resistente à regulação por retroalimentação por NAD é liberada. Para selecionar de modo eficaz variantes de gene naB melhores, um gene nadB endógeno foi removido de uma cepa. Com base na sequência de nucleotideos para o gene nadB (n-. de registro NCBI "GI:89109380") representada por SEQ ID NO: 24 obtido a partir do GenBank do National Institute of Health (NIH GenBank) , os primers de SEQ ID NOs : 6 e 7 capazes de amplificar a região a jusante do gene nadB, os primers de SEQ ID NOs: 8 e 9 capazes de amplificar a região a montante do gene nadB e os primers de SEQ ID NOs: 10 e 11 capazes de amplificar loxpCm foram contruidos. [086] [Tabela 3] [087] A PCR foi executada com o uso de um DNA cromossômico de K12 W3110 de E. coli (ATCC NO. 23257) como um modelo e SEQ ID NOs. 6 e 7 como primers para amplificar as regiões a montante e SEQ ID Nos 8 e 9 como primers para amplificar as regiões a jusante do gene nadB de 0,4 kb e 0,4 kb, respectivamente. Além disso, a PCR foi executada com o uso do vetor de plasmideo contendo loxpCm, vetor pLoxpCat2, como um modelo e oligonucleotideos de SEQ ID NOs . 10 e 11 como primers para amplificar o gene loxpCm que tem a sequência homóloga ao gene nadB em ambas as extremidades de 1,0 kb. A polimerase usada foi DNA polimerase PfuUltra™ (Stratagene, E.U.A), e a PCR foi conduzida repetindo-se 30 vezes um ciclo que compreende a desnaturação a 96 °C por 30 segundos, anelamento a 53 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto, seguido pela eluição de gel de agarose para obter um fragmento a montante de nadB, um fragmento a jusante de nadB e um fragmento de loxpCm. A PCR foi conduzida com o uso destes fragmentos obtidos como modelos sob as condições de PCR repetindo-se 10 vezes o ciclo que compreende a desnaturação a 96 °C por 60 segundos, desnaturação a 50 °C por 60 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto, e 20 repetições do ciclo após a adição de primers de SEQ ID NOs. 7 e 8. Como consequência disto, foi obtido um cassete deficiente de nadB contendo a região a montante de gene nadB-loxpCm-região a jusante de gene nadB de 1,8 kb. [088] A cepa K12 W3110 de E. coli contendo pKD46 como vetor de expressão de recombinase lambda red foi transformado com o cassete deficiente de nadB por eletroporação e, então, a cepa foi colocada em meio de placa de LB (triptona 10 g, extrato de levedura 5 g, NaCl 10 g, cloranfenical 15 pg/L e ágar 1,5 %) contendo cloranfenicol como o marcador seletivo. Então, cultivada a 37 °C de um dia para o outro para selecionar cepas de microrganismo que exibem resistência ao cloranfenical. [089] As cepas selecionadas foram diretamente utilizadas como modelos a PCR com o uso de primers de SEQ ID NOs . 7 e 8 sob as mesmas condições. Os tamanhos de gene da cepa selvagem e da cepa deficiente de nadB foram identificados como 2,4 kb e 0,8 kb, respectivamente, em gel de agarose a 1,0%, confirmando, assim, a deleção do gene nadB em K12 W3110 de E. coli. A construção da cepa deficiente de nadB chamada de W3110-nadB foi finalizada. [090] <l-3-2> Seleção de variantes de L- aspartato oxidase [091] Para encontrar um gene nadB resistente à regulação por retroalimentação por NAD, ácido 6-aminopiridina-3-carboxilico (6-NA, comprada de Aldrich, E.U.A) como um análogo de ácido nicotinico, e 6- aminonicotinamida (6-Nm, comprada de Aldrich, E.U.A) como um análogo de nicotinamida foram usados. Embora um análogo de 6-NAD deveria ser usado, devido à similaridade estrutural de NAD com ácido nicotinico e nicotinamida, as variantes de gene nadB resistentes foram principalmente selecionadas com o uso do análogo de ácido nicotinico e análogo de nicotinamida e, então, a resistência à retroalimentação por NAD de cada uma das variantes de gene nadB selecionadas foi confirmada (ref. Journal of bacteriology, junho de 1983, páginas 1126 a 1136). A biblioteca plasmídica de variante de L-aspartato oxidase construída em <l-2> do Exemplo 1 foi transformada em cepa W3110-\3nadB através do método CaCl2- [092] A cepa W3110-nadB transformada foi colocada em um meio de placa de M9-(6, NA) - (6, Nm) (12,8 g de NaHP04-7H20, 3 g de KH2P04, 0,5 g de NaCl, 1 g de NH4C1, 2 mM de MgS04, 0,1 mM de CaCl2, 1 g de casaminoácido, 0,3 g/L de ácido 6-aminopiridina-3-carboxilico (6-NA), 0,3 g/L de 6- aminonicotinamida (6-Nm)) para selecionar colônias com taxa de crescimento maior em comparação com o nadB selvagem. Um total de 1 x 107 colônias foram examinadas e três dessas foram selecionadas e nomeadas pPro-nadB64, pPro-nadB67 e pPro-nadBl10, respectivamente. Cada uma dentre as três cepas selecionadas foi inoculada e cultivada em um meio liquido de M9-6 M9- (6,NA) - (6,Nm) (12,8 g de NaHP04-7H20, 3 g de KH2P04, 0,5 g de NaCl, 1 g de NH4C1, 2 mM de MgS04, 0,1 mM de CaCl2, 1 g de casaminoácido, 0,3 g/L de ácido 6-aminopiridina-3-carboxilico (6-NA), 0,3 g/L de 6-aminonicotinamida (6-Nm)) e, então, as densidades ópticas (ODs) das mesmas foram comparadas. Como consequência disto, descobriu-se que as taxas de crescimento de pPro-nadB67 foram maiores do que aquelas do pPro-nadB64 e pPro-nadB72 nos meios contendo 6-NA e 6-Nm, conforme mostrado na Tabela 4. Consequentemente, o pPro-nadB67 foi selecionado e a sequência do mesmo foi identificada. Como consequência isto, descobriu-se que o pPro-nadB67 inclui arginina como substituinte para lisina, o 302£ aminoácido a partir do aminoácido metiona inicial. [093] K12 W3110 de E. coli, que é deficiente de gene nadC, contendo um pPro-nadB67(Lys302Arg)-pCJ-nadA por utilizar um vetor pProlar como um vetor de expressão para o gene de nadB variante, foi nomeado CV01-0518. Foi então depositado sob o Tratado de Budapeste no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) com número de acesso KCCM11434P em 20 de junho de 2013. [094] [Tabela 4] Comparação de taxa de crescimento de três variantes de nadB em meios liquidos contendo 6-NA e 6-Nm [095] Exemplo 2. Comparação de rendimento de ácido quinolínico entre variantes de gene nadB [096] <2-l> Construção de cepa deficiente de quino1inato fosforribosiltransferase [097] A PCR foi conduzida com o uso de um DNA cromossômico de K12 W3110 de E. colí como um modelo para obter um gene nadC que está envolvido na via de decomposição de quinolinato. Com base na sequência de nucleotideos para o gene nadC (n£. de registro NCBI "GI:89106990") representada por SEQ ID NO: 25 obtida a partir do GenBank do National Institute of Health (NIH GenBank), os primers representada por SEQ ID NOs: 12 e 13 capazes de amplificar a região a jusante do gene nadC, os primers de SEQ ID NOs: 14 e 15 capazes de amplificar as regiões a jusante e a montante do gene nadC, e gene loxpCm, e os primers de SEQ ID NOs: 16 e 17 capazes de amplificar a região a montante do gene nadC foram construídos. [098] [Tabela 5] [099] A PCR foi executada com o uso de DNA cromossômico de E. coli Kl 2 W3110 como um modelo e oligonucleotideos de SEQ ID NOs : 12 e 13, e 16 e 17 como primers para amplificar as regiões a jusante e a montante de gene nadC de 0,5 kb e 0,3 kb, respectivamente. Além disso, a PCR foi executada com o uso de um vetor de plasmideo que inclui loxpCm, vetor pLoxpCat2, como um modelo e oligonucleotideos de SEQ ID NOS. 14 e 15 como primers para amplificar o gene loxpCm que tem a sequência homóloga ao gene nadC em ambas as extremidades de 1,0 kb. A polimerase usada foi DNA polimerase PfuUltra™ (Stratagene, E.Ü.A), e a PCR foi conduzida repetindo-se 30 vezes um ciclo que compreende a desnaturação a 96 °C por 30 segundos, anelamento a 53 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto. Como consequência disto, um fragmento a montante de nadC, um fragmento a jusante de nadC e um fragmento de loxpCm foram obtidos. A PCR foi conduzida com o uso destes fragmentos, que resultam da PCR descrita acima, como modelos sob as condições de PCR que incluem 10 repetições do ciclo que compreende a desnaturação a 96 °C por 60 segundos, desnaturação a 50 °C por 60 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto, e 20 repetições do ciclo após a adição de primers de SEQ ID NOs: 12 e 17. Como consequência disto, foi obtido um cassete deficiente de nadC contendo a região a montante de gene nadC-loxpCm-região a jusante de gene nadC de 1,8 kb. [0100] A cepa K12 W3110 de E. coli contendo pKD46 como vetor de expressão de recombinase lambda red foi transformada com o cassete deficiente de nadC por eletroporação e, então, a cepa foi colocada em um meio de placa LB (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5% de ágar) contendo cloranf enicol como um marcador seletivo, e cultivada a 37°C de um dia para o outro para selecionar as cepas de microrganismo que exibem resistência a cloranfenical. [0101] As cepas selecionadas foram diretamente utilizadas como modelos para realizar PCR com o uso de primers de SEQ ID NOs. 13 e 16 sob as mesmas condições, e os tamanhos de gene da cepa selvagem e da cepa deficiente de nadC foram identificados como 1,6 kb e 1,3 kb, respectivamente, em gel de agarose a 1,0%, confirmando, assim, a deleção do gene nadC em K12 W3110 de E. coli. A construção da cepa deficiente de nadC chamada de W3110-nadC foi completada. [0102] <2-2> Construção de plasmideo para expressão de aspartato oxidase e quinolinato sintetase [0103] Duas enzimas aspartato oxidase e quinolinato sintetase são exigidas para produzir quinolinato. Consequentemente, foi construído um plasmideo capaz de expressar tanto o gene nadB como nadA que codifica as duas enzimas. Primeiramente, a PCR foi executada com o uso de DNA cromossômico de W3110 de E. coli para obter o gene nadA que codifica quinolinato sintetase. Com base na sequência de nucleotideos para o gene nadA (n2. de registro NCBI "GI: 89107601") representada por SEQ ID NO: 26 obtida junto ao GenBank do National Institute of Health (NIH GenBank), os primers de SEQ ID NOs:18 e 19 capazes de amplificar a região ORF do gene nadA que inclui regiões ATG e TAA e que tem os locais de reconhecimento de enzimas de restrição Apal e Notl foram sintetizados. [0104] [Tabela 6] [0105] O PCR foi executado com o uso de DNA cromossômico de K12 W3110 de E. coli como um modelo, e oligonucleotideos de SEQ ID NOs : 18 e 19 como primers . A polimerase usada foi DNA polimerase PfuUltra™ (Stratagene, E.U.A), e a PCR foi conduzida repetindo-se 30 vezes um ciclo que compreende a desnaturação a 96°C por 30 segundos, anelamento a 50°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto. Como consequência disto, foi obtido um gene amplificado de cerca de 1,0 kb que inclui o gene nadA e os locais de reconhecimento de enzimas de restrição Apal e Notl. [0106] Um promotor pCJl foi obtido através de PCR com o uso de um plasmideo que inclui o promotor pCJl como um modelo, com base na invenção divulgada da patente coreana n£. 10-2006-0068505. Os primers representados por SEQ ID NOs: 20 e 21 que têm os locais de reconhecimento de enzimas de restrição BamHI e Apal foram construidos para ligar o promotor pCJl ao gene nadA amplificado. [0107] [Tabela 7] [0108] A PCR foi executada com o uso de DNA cromossômico de K12 W3110 de E. coli como um modelo, e oligonucleotideos de SEQ ID NOs: 20 e 21 como primers. A polimerase usada foi DNA polimerase PfuUltra™ (Stratagene, E.U.A), e a PCR foi conduzida repetindo-se 30 vezes um ciclo que compreende a desnaturação a 96 °C por 30 segundos, anelamento a 50 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto. Como consequência disto, foi obtido um fragmento amplificado de cerca de 0,3 kb que inclui o promotor pCJl e os locais de reconhecimento das enzimas de restrição BamHI e Apal . [0109] O gene nadA obtido através da PCR foi tratado com enzimas de restrição Apal e Notl, e o fragmento de promotor pCJl amplificado foi tratado com enzimas de restrição Apal e BamHI . O gene nadA e fragmento de promotor pCJl tratados com as enzimas de restrição, respectivamente, foram clonados através da ligação no vetor pPro-nadB obtido em < 1 — 1 > que foi tratado com as enzimas de restrição Notl e BamHI. Finalmente, um vetor recombinante pPro-nadB-pCJl-nadA de 5,9 kb foi construido, no qual a expressão do gene nadB é regulada pelo promotor pPro como um promotor constitutivo, e o gene nadA com expressão é regulada pelo promotor pCJl. O pPro-nadB-pCJl-nadA construido tinha a sequência representada por SEQ ID NO: 27. Adicionalmente, através dos processos descritos acima, foi construido também um vetor recombinante pPro-nadB67-pCJl-nadA que inclui a variante de nadB e o gene nadA selvagem. O pPro-nadB67-pC Jl-nadA tinha a sequência representada por SEQ ID NO: 28. [0110] <2-2-l> Construção de vetor no qual o 302£ aminoácido do gene nadB de pPro-nadB67-pCJl-nadA é substituído pelo aminoácido, exceto lisina e arginina [0111] Para confirmar a resistência contra a regulação por retroalimentação por NAD da variante de gene nadB67, incluindo arginina em vez de lisina como o 302£ aminoácido, começando a partir de metionina de L-aspartato oxídase, o 302- aminoácido do gene nadB foi substituido por cada um dos 18 aminoácidos diferentes, exceto lisina e arginina. Mutagênese rápida, com o uso do vetor recombinante pPro-nadB67-pCJl-nadA como um modelo foi realizada. A polimerase usada foi DNA polimerase PfuUltra™ (Stratagene, E.U.A.) . A PCR foi conduzida repetindo-se 18 vezes o ciclo que compreende a desnaturação a 96 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 68 °C por 15 minutos. O produto de PCR resultante foi tratado com a enzima de restrição Dpnl (NEB, E.U.A) e, então, transformado em cepa DH5a de E.coli (Invitrogen, E.U.A.) através do método CaCl2. A cepa DH5a de E.coli transformada foi colocada em um meio de placa LB-Km (10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de triptona, 25 pg/L de canamicina) , e cultivada de um dia para o outro a 37 °C para selecionar colônias resistentes à canamicina. As colônias resultantes foram submetidas à extração de plasmideo e sequenciamento para identificar a substituição do 302£ aminoácido pelos 18 aminoácidos diferentes. As 18 variantes de nadB resultantes como plasmideos foram nomeadas conforme na Tabela 2. [0112] [Tabela 8] Variantes de L-aspartato oxidase nas quais ο 3022 aminoácido foi substituido por outro aminoácido [0113] <2-3> Avaliação de capacidade de produção de quinolinato de variantes de nadB67 e nadB selvagem em relação à concentração de NAD [0114] Para comparar a capacidade de produzir quinolinato no gene nadB do tipo selvagem e variantes de gene nadB em relação à concentração de NAD, foi conduzido um ensaio de titulação de quinolinato. Depois da produção de quinolinato, a cepa (W3110-nadC) obtida em <2-l> do Exemplo 2 foi transformada com o plasmideo pPro-nadB67-pCJql-nadA construído em <2-2> do Exemplo 2, e cada um dentre os 18 tipos de variantes de nadB67 construídos em <2-2-l> do Exemplo 2 através do método CaCl2. As cepas transformadas foram cultivadas de um dia para o outro em um meio de placa LB-Km em um banho de cultira a 37 °C para obter uma única colônia e, então, a única colônia foi inoculada por um pool de platina em 25 ml de um meio de cultura para o ensaio de potência de quinolinato e cultivada a 37 °C por 24 horas a 72 horas com agitação em 250 rpm. A Tabela 9 mostra a composição do meio de cultura para produção de quinolinato. Para identificar a resistência à retroalimentação por NAD das variantes de nadB67, o ácido nicotinico (NA) foi adicionado ao meio de cultura em diferentes concentrações, seguido pela comparação das quantidades produzidas de quinolinato. [0115] [Tabela 9] Composição do meio de cultura para ensaio de potência de quinolinato [0116] A quantidade de quinolinato (ácido quinolinico, QA) em cada uma dentre as soluções de cultura foi analisada por cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC) . Os resultados são mostrados na Tabela 10. A Tabela 10 mostra a capacidade de produzir quinolinato das variantes de nadB67 em relação à concentração de NAD.

[0117] [Tabela 10] Quantidades de produção de quinolinato em relação às concentrações de NAD [0118] [Tabela 11] Rendimento relativo de quinolinato em relação à concentração de NAD [0119] Para as duas variante de produção de quinolinato que incluem os plasmideos pPro-nadB67(D)-pCJ-nadA e pPro-nadB67(E)-pCJ-nadA, o gene nadB foi destruído e perdeu atividade. Como consequência disto, as variantes de produção de quinolinato tiveram predominantemente níveis muitos baixos de quinolinato (QA), os níveis foram convertidos a um rendimento residual relativo em porcentagem (%) . Foi baseado em 100% do nível de QA produzido quando um ácido nicotínico (NA) é 0 uM. [0120] Com referência à Tabela 11, o rendimento de quinolinato foi inferior a 50%, quando o plasmídeo pPro-nadB-pC J-nadA que inclui o gene nadB do tipo selvagem foi usado, e o meio de cultura contém ácido nicotínico, acima de 5 uM ou maior. Considerando que o rendimento de quinolinato foi de 70% ou mais quando o plasmídeo pPro-nadB67-pCJ-nadA, e os plasmldeos recombinantes de variantes de 302° que incluem a variante do gene nadB. A cepa W3110-nadC é uma auxotrofia de NAD que exige o suprimento de NAD externo para crescimento. A cepa W3110-nadC é incapaz de aceitar diretamente NAD, e utiliza ácido nicotinico (NA) ou nicotinamida (Nm) heterogêneo para gerar NAD. Quando a quantidade de NAD intracelular é 1 mM ou maior, o gene nadB é regulado por retroalimentação para manter a quantidade de NAD intracelular constante. Consequentemente, a produção de QA pode ser limitada pelo gene nadB que é regulado por retroalimentação. A adição de NA a um meio de cultura indica um aumento de NAD em uma cepa. Consequentemente, as quantidades de produção de QA foram comparadas entre as cepas com a adição de NA ao meio de cultura em diferentes concentrações para identificar um grau de regulação por retroalimentação nas variantes do gene nadB em relação à concentração de NAD. Como consequência, variantes do gene nadB com 302£ aminoácidos substituídos foram descobertos que são resistentes à regulação por retroalimentação por NAD quando liberado. [0121] <2-4> Produção de ácido nicotinico através da reação de descarboxilação [0122] Para identificar a capacidade de produzir ácido nicotinico das cepas de produção de quinolinato, nas quais as variantes de nadB foram introduzidas, foram usados os rendimentos de quinolinato na Tabela 10. 0 método de produção de ácido nicotinico usado no presente documento consistiu em descarboxilação da solução de cultura que inclui quinolinato sob condições de alta temperatura e alta pressão, com base na invenção da patente coreana n°. 10-1223904, para converter quinolinato para ácido nicotinico. Para remover as células a partir da solução de cultura contendo quinolinato, a centrifugação foi executada em cerca de 3000 rpm a cerca de 4000 rpm por cerca de 10 minutos a cerca de 30 minutos. O sobrenadante contendo quinolinato que resultou da centrifugação foi separado e usado como uma amostra para a reação de descarboxilação. [0123] A reação de descarboxilação foi conduzida a cerca de 135 °C em cerca de 0,2 MPa por cerca de 3 horas. As amostra usadas são mostradas na Tabela 12 . Uma solução aquosa de quinolinato (um produto padrão de Sigma-Aldrich Co.) em água desionizada foi usada como um grupo de controle. Cada amostra de soluções aquosas de quinolinato foram submetida à titulação com hidróxido de sódio, água amoniacal, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, especificamente a conversão de quinolinato em ácido nicotinico ocorreu em pH 2. A Tabela 12 mostra as quantidades de produção de ácido nicotinico convertido a partir de quinolinato da Tabela 10 através da reação de alta temperatura e alta pressão. [0124] [Tabela 12] [0125] O experimento de converter quinolinato em solução aquosa (água desionizada) para ácido nicotinico, conforme apresentado na patente chinesa de referência anterior n-. 101353322, foi executado a 135 °C e em 0,2 MPa por cerca de 3 horas. A temperatura e os niveis de pressão foram menores que 150 °C a 250 °C na referência anterior. Os resultados são mostrados na Tabela 12. [0126] Exemplo 3: Confirmação de atividade de resistência à retroalimentação por NAD de variantes de L- aspartato oxidase [0127] <3-l> Construção de plasmideo de superexpressão de L-aspartato oxidase [0128] Para melhor esclarecer as atividades de resistência à retroalimentação por NAD de variantes de L- aspartato oxidase, a resistência à retroalimentação por NAD de uma variante de L-aspartato oxidase codificada pela variante de nadB67 selecionada no <Exemplo l-3-2> foi avaliada. Para clonar as variantes de nadB e nadB do tipo selvagem em um vetor pCDF-duet contendo uma etiqueta de histidina (His), a PCR foi executada com o uso do plasmideo de pPro-nadB do tipo selvagem e o pPro-nadB67 recombinante como modelos, respectivamente. Para o uso em PCR, foram sintetizados os primers de SEQ ID NOs : 22 e 23 capazes de amplificar a região ORF do gene nadB do tipo selvagem e do gene nadB67 variante que inclui regiões ATG e TAA e que tem os locais de reconhecimento das enzimas de restrição BamHI e Ndel . [0129] [Tabela 13] [0130] A polimerase usada foi DNA polimerase PfuUltra™ (Stratagene, E.U.A), e a PCR foi conduzida repetindo-se 30 vezes um ciclo que compreende a desnaturação a 96 °C por 30 segundos, anelamento a 50 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 2 minutos. Como consequência disto, foram obtidos os genes amplificados de cerca de 1,9 kb da variante de nadB67 e nadB do tipo selvagem que inclui os locais de reconhecimento das enzimas de restrição BamHI e Ndel . [0131] Os genes da variante de nadB67 e nadB do tipo selvagem obtidos através da PCR foram tratados com as enzimas de restrição BamHI e Ndel e, então, clonados através da ligação em um vetor pCDF-duet tratado com as enzimas de restrição BamHI e Ndel. Finalmente, vetores recombinantes que incluem os genes da variante de nadB67 e nadB do tipo selvagem, respectivamente, foram construídos, nos quais a expressão de cada um dos genes é controlável por um promotor 17 como um promotor constitutivo e o gene contém a etiqueta His capaz de purificar proteína. Os vetores recombinantes construídos foram nomeados pI7-nadB e pT7-nadB67, respectivamente. Outros vetores recombinantes, nos quais valina, leucina, isoleucina e histidina foram usadas no lugar do 302£ aminoácido do nadB do tipo selvagem, respectivamente, foram construídos com o uso do mesmo método, e nomeados pT7-nadB67(V), pT7-nadB67(L), pT7-nadB67(I), pT7-nadB67(H), respectivamente. [0132] <3-2> Purificação de L-aspartato oxidase [0133] Depois que o vetor recombinante pT7-nadB, pT7-nadB67, pT7-nadB67(V), pT7-nadB67(L), pT7-nadB67{I) ou pT7-nadB67(H) foi transformado em uma cepa tuner através do método CaCÍ2, a cepa transformada foi colocada em um meio de placa LB-SP (10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de triptona e 50 pg/L de espectinomicina) e cultivada de um dia para o outro a 37 °C para selecionar colônias resistentes à espectinomicina. Uma colônia foi selecionada dentre as mesmas e cultivada em um meio líquido LB-SP (10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de triptona, 50 pg/L de espectinomicina) e, então, um derivado de isopropil- l-tio-(3-D-galactopiranosideo (IPTG) foi adicionado à mesma quando o valor de densidade óptica de crescimento (OD) alcançou a 0,4, e cultivada a cerca de 18 °C de um dia para o outro. As células que incluem variantes de L-aspartato oxidase e L-aspartato oxidase do tipo selvagem superexpresso foram recuperados a partir do meio de cultura, seguido pela purificação das variantes de L-aspartato oxidase e L-aspartato oxidase do tipo selvagem a partir das células recuperadas pelo kit de rotação Ni-NTA (Quiagen, E.U.A). A proteina recupera foi 50% de uma proteina total, cerca de 2% da proteina recuperada foram recuperados como L-aspartato oxidase. [0134] <3-3> Teste de atividade de variantes de L-aspartato oxidase [0135] A L-aspartato oxidase converte aspartato como um substrato para iminoaspartato na presença de um FAD como cofator, e o iminoaspartato é convertido a oxaloacetato. O peróxido de hidrogênio (H2O2) gerado através da reação descrita acima, foi usado para identificar a atividade do nadB. A absorvância em 560 nm de um produto de reação de H2C>2 com um produto a partir da reação foi medida com o uso de um Amplex Red (Invitrogen, Coréia) para determinar a atividade do nadB. Aqui, NAD foi adicionado em diferentes concentrações para criar uma condição para inibição competitiva para FAD, a fim de avaliar a resistência de L-aspartato oxidase contra a regulação por retroalimentação por NAD. A atividade relativa da L-aspartato oxidase do tipo selvagem em uma concentração de NAD de 1 mM foi menor do que 50 %, enquanto que as atividades relativas das variantes de L-aspartato oxidase na mesma concentração de NAD permaneceu cerca de 70% ou maior (Tabela 14), portanto indicando que a regulação por retroalimentação por NAD foi liberada em variantes de L-aspartato oxidase resistentes.

[0136] [Tabela 14] Comparação de atividade entre L-aspartato oxidases em relação à concentração de NAD

APLICABILIDADE INDUSTRIAL [0137] A presente invenção é relacionada a variantes de L-aspartato oxidase que são resistentes à regulação por retroalimentação por ácido nicotinico ou NAD, e, deste modo, pode produzir de modo eficaz quinolinato. O quinolinato pode ser produzido de modo eficaz cultivando um microrganismo que inclui tal variante de L-aspartato oxidase de acordo com as realizações da presente invenção. 0 quinolinato também pode ser produzido de modo eficaz com o uso do microrganismo no qual a atividade de quinolinato sintetase é adicionalmente otimizada ou a atividade de quinolinato fosforribosiltransferase é adicionalmente enfraquecida. Através de tal transformação do microrganismo, o rendimento de quinolinato ou ácido nicotinico pode ser aperfeiçoado, o qual é industrial e altamente útil. [0138] [Ν-. de acesso] [0139] Instituição depositária: Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) (Autoridade depositária internacional) [0140] N° de acesso: KCCM11434 [0141] Data do depósito: 20 de junho de 2013 [0142] Embora a invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência a realizações exemplificadoras da mesma, será compreendido que diversas alterações em forma e detalhes podem ser feitas na mesma sem que se desvie do espirito e escopo das seguintes reivindicações.

Claims (11)

1. VARIANTE DE L-ASPARTATO OXIDASE, caracterizada por ter uma sequência de aminoácidos na qual um 302£ aminoácido em uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 é substituído por outro aminoácido.

2. VARIANTE DE L-ASPARTATO OXIDASE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por outro aminoácido ser selecionado a partir do grupo que consiste em arginina, valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano e histidina.

3. VARIANTE DE L-ASPARTATO OXIDASE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela regulação por retroalimentação pelo ácido nicotinico ou NAD ser liberada.

4. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma sequência de aminoácidos, na qual um 302- aminoácido em uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 é substituído por outro aminoácido.

5. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotideo, conforme definido na reivindicação 4, o qual é ligado de modo operável a uma sequência reguladora.

6. MICRORGANISMO, caracterizado por compreender o polinucleotideo, conforme definido na reivindicação 4.

7. MICRORGANISMO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo microrganismo pertencer ao gênero Escherichia.

8. MICRORGANISMO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela atividade de quinolinato sintetase ser otimizada.

9. MICRORGANISMO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela atividade de quinolato fosforribosiltransferase endógena ser reduzida.

10. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE QUINOLINATO, caracterizado por compreender: cultivar o microrganismo, conforme definido na reivindicação 6, em um meio; e recuperar quinolinato a partir do meio cultivado.

11. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO NICOTÍNICO, caracterizado por compreender: cultivar microrganismo, conforme definido na reivindicação 6, em um meio; e conduzir uma reação de descarboxilação mediante a adição de um ácido ao meio cultivado.