CN104450638A - L-天冬氨酸氧化酶变体和使用所述变体生产喹啉酸或烟酸的方法 - Google Patents

L-天冬氨酸氧化酶变体和使用所述变体生产喹啉酸或烟酸的方法 Download PDF

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Abstract

为有效生产喹啉酸，本发明提供其中由烟酸或NAD导致的反馈调节被解除的L-天冬氨酸氧化酶变体，和包括所述L-天冬氨酸氧化酶变体在内的微生物。可通过培养包括L-天冬氨酸氧化酶变体在内的微生物，有效生产喹啉酸。

Description

L-天冬氨酸氧化酶变体和使用所述变体生产喹啉酸或烟酸的方法
技术领域
本发明涉及L-天冬氨酸氧化酶变体，包括编码所述L-天冬氨酸氧化酶变体的基因的生产喹啉酸的微生物，和使用所述微生物高效生产喹啉酸或烟酸的方法。 
背景技术
烟酸是尼古丁的氧化物和复合维生素B的一员。它是一种水溶性维生素，也被称为尼克酸，或维生素B3，并在动物和植物中普遍存在。烟酸的缺乏可能会导致糙皮病或神经病变。通常，烟酸在体内以烟酸酰胺辅酶的形式存在，即，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，并参与氧化还原反应。 
喹啉酸(quinolinate)，其也被称为喹啉酸(quinolinic acid)，其由喹啉的氧化产生。喹啉酸已知具有神经毒性并导致多种神经障碍。喹啉酸也被认为是烟酸的前体。 
广泛地适用于食品和药品的烟酸可以通过化学合成法或生物学生产方法制备。化学合成烟酸可能导致包括催化剂在内的大量有毒废料。因此，该废料需要彻底的管理和高额费用进行处理。此外，作为前体的嘧啶具有多种衍生物，且嘧啶的供应和价格波动导致烟酸不稳定的价格。 
为了从化学合成方法解决这些问题，研究了通过使用来源于可再生的碳水化合物的材料生产烟酸的生物方法。主要通过两种生物合成途径完成烟酸的生物学生产，其中之一是由色氨酸作为真核生物起始原料开始的烟酸生物合成途径，另一种是由天冬氨酸作为原核生物起始原料开始的。两种途径都使用喹啉酸作为中间体，且通过喹啉酸磷酸核糖基转移酶(nadC)、烟酸-单核苷酸腺苷转移酶(nadD)、NAD合成酶(nadE)、烟酰胺-核苷酸腺苷转移酶(NMN nadR)和烟酰胺酶(pncA)的作用，从喹啉酸生物合成烟酸。 
经由天冬氨酸的途径使用重组大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌的烟酸的生物合成的方法已经公开(韩国专利号10-1223904)。本发明的发明人研究了从 烟酸的这些生物合成方法解决问题并改善喹啉酸或烟酸的产率，发现了涉及喹啉酸的高产率生产的酶变体，并完成了本发明。 
发明详述 
技术问题 
本发明提供了L-天冬氨酸氧化酶的变体，其显示出由烟酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)导致的反馈调节被解除。 
本发明提供了生产喹啉酸的微生物，所述微生物包含L-天冬氨酸氧化酶的变体。 
本发明提供了通过培养微生物生产喹啉酸的方法。 
本发明提供了通过培养微生物和喹啉酸的脱羧生产烟酸的方法。 
技术方案 
本发明的一个方面提供了L-天冬氨酸氧化酶的变体，其具有在SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。 
L-天冬氨酸氧化酶具有将L-天冬氨酸氧化成亚氨基琥珀酸的催化活性，如反应式1所示。 
<反应式1> 
L-天冬氨酸+富马酸<＝>α-亚氨基琥珀酸+琥珀酸+H+
L-天冬氨酸+氧<＝>过氧化氢+α-亚氨基琥珀酸+H+
本发明的L-天冬氨酸氧化酶可包括表示为SEQ ID NO：1的氨基酸序列。然而，它并不限于此，因为取决于微生物物种或菌株，蛋白质的氨基酸序列可能存在差异。换言之，它可以是突变体蛋白或人工变体，该突变体蛋白或人工变体具有在由SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸的取代、删除、插入或添加的氨基酸序列，只要它可以将L-天冬氨酸氧化成亚氨基琥珀酸。本文中，"多个″可依据蛋白质的氨基酸残基的三维结构中的位置或类型而有所不同，但具体地是指2至20，特别是2至10，且更具体地2至5。此外，若基于在个体或微生物的种类的差异，氨基酸的取代、删除、插入、添加或反转包括由人工变体或天然突变引发的那些。 
编码本发明的氨基酸序列的多核苷酸可包含编码具有表示为SEQ ID  NO：1的氨基酸序列、或与其同源性为80％或更多的氨基酸序列、特别是90％或更多的氨基酸序列、更具体地95％或更多的氨基酸序列、特别具体地97％或更多的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸序列，只要它具有与L-天冬氨酸氧化酶类似的活性。最具体地，它可以是由SEQ ID NO：24所表示的多核苷酸序列。 
术语“同源性”是指两个氨基酸序列之间的同一性，且其可由本领域技术人员熟知的方法确定，用BLAST2.0来计算参数，例如得分、同一性和相似性。 
此外，编码本发明的L-天冬氨酸氧化酶的多核苷酸序列可与SEQ ID.NO：24的多核苷酸杂交，或“严格条件”下与从所述SEQ ID.NO：24的多核苷酸制备的探针杂交，并且可为编码正常功能的L-天冬氨酸氧化酶的变体修饰的多核苷酸序列。本文所述的“严格条件”是指允许多核苷酸之间的特异性杂交的条件，并且例如在Molecular Cloning(A Laboratory Manual，J.Sambrook et al.，Editors，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989)或Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.，Editors，John Wiley&Sons，Inc.，New York)中有具体描述。例如，其描述，杂交是在65℃的杂交缓冲液(3.5×SSC、0.02％聚蔗糖、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mM NaH2PO4(pH 7)、0.5％SDS、2mMEDTA)中进行。SSC是pH＝7的0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠。杂交后，DNA被递送转移达到的膜在室温用2X SSC清洁冲洗，然后在68℃用0.1至0.5X SSC/0.1X SDS再次清洁冲洗。 
本文所述的术语“其他氨基酸”是指除了在修饰之前最初位于氨基酸序列中的氨基酸以外的其他氨基酸残基。具体地，本发明所述的其他氨基酸可以包括一种选自以下的氨基酸：精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸、但不包括赖氨酸。具体地，所述其他氨基酸可包括一种选自以下的氨基酸：精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸。例如，所述其他氨基酸可包括精氨酸。 
本文所述的术语“第302位”是指从表示为SEQ ID NO：1的氨基酸序列的甲硫氨酸开始的氨基酸位置，这是由于所述氨基酸序列的甲硫氨酸被计数为 第一个氨基酸残基。 
通常，L-天冬氨酸氧化酶的活性通过积聚在微生物中的烟酸或NAD调节，换言之，它的反馈调节通过烟酸或NAD诱导。由烟酸或NAD导致的反馈调节(feedback regulation by nicotinic acid or NAD)可以在本发明的L-天冬氨酸氧化酶的变体中解除，这与普通的L-天冬氨酸氧化酶不同。 
本发明的其他方面提供了具有编码L-天冬氨酸氧化酶变体的核苷酸序列的多核苷酸。 
在本发明的一个实施方式中，多核苷酸可具有编码L-天冬氨酸氧化酶的变体的核苷酸序列，所述L-天冬氨酸氧化酶的变体具有其中由SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。 
所述第302位氨基酸可包括一种选自以下的氨基酸：精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸。相应的，对应于第302位氨基酸的核苷酸序列可以被适当取代。在具体实施方式中，在SEQ ID NO：24表示的核苷酸序列中的第904位至第906位核苷酸可以被除AAG、AAA、TAA、TAG和TGA以外的任何核苷酸组合适当取代。 
本发明的其它方面提供了包括可操作地连接至调控序列的上述多核苷酸的载体。 
所述多核苷酸可以具有在SEQ ID NO：24表示的核苷酸序列中的第904位至第906位核苷酸被适当取代的核苷酸序列。在具体实施方式中，所述多核苷酸可以具有在SEQ ID NO：24表示的核苷酸序列中的第904位至第906位核苷酸被除AAG、AAA、TAA、TAG和TGA以外的任何核苷酸组合取代的核苷酸序列。该多核苷酸可以可操作地连接至调控序列。该调控序列可调节L-天冬氨酸氧化酶的表达，并包括启动子、终止子或增强子。 
本发明的载体没有具体限制，并且可以是本领域中已知的任何载体。例如，该载体可以是pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，USA)或pECCG117(KFCC-10673)，但不限于此。 
本发明的启动子可以是λPL启动子、trp启动子、lac启动子、T7启动子、pPro启动子、pCJ1启动子或pCJ7启动子(韩国专利10-0620092)。在具体实施方式中，所述启动子可以为pCJ1启动子，但不限于此。 
该启动子可以可操作地连接到编码基因的核苷酸序列。本文所述的术语“可操作地连接”是指核酸表达调控序列(例如，启动子、信号序列、转录调控因子结合位点的阵列、终止子或增强子)与其他核苷酸序列之间的功能性连接。因此，该调控序列可调节编码该基因的核苷酸序列的转录和/或翻译。 
本发明的另一个方面提供了包含上述多核苷酸的微生物，其中所述多核苷酸可以包含编码在SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列的核苷酸序列。 
在具体实施方式中，根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第302位氨基酸，SEQ ID NO：24的部分核苷酸序列可以被取代。例如多核苷酸可包含在SEQ ID NO：24的核苷酸序列中的第904位至第906位核苷酸被其他核苷酸取代的多核苷酸。 
所述多核苷酸可以通过随机突变或基因工程操作获得。其中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的一部分被部分取代的微生物可以通过获得的多核苷酸的转化来构建。 
本文所述的术语“转化”是指将基因导入宿主细胞中以在其中表达。转化的基因可以是任何基因，例如，被插入到宿主细胞的染色体中的基因，或者宿主细胞的染色体中不存在的基因，只要导入的基因是在宿主细胞内可表达的。该基因包含编码多肽的多核苷酸，如DNA和RNA。例如，该基因可以表达盒的形式导入宿主细胞，所述表达盒是多核苷酸结构，其包括所述基因的自我表达所需要的元素。通常，表达盒可以包括可操作地连接到基因的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。该表达盒可以是可自我复制的表达载体形式。该基因也可以自身被导入宿主细胞或以多核苷酸结构的形式导入宿主细胞，并且可操作地连接到宿主细胞中表达所需的序列。 
本文所述的术语“具有生产喹啉酸的能力的微生物”是指能够从培养基中的碳源生产喹啉酸并积累喹啉酸的微生物。 
为提高生产喹啉酸的能力，需要微生物生产大量的喹啉酸，且生产的喹啉酸可累积而不用于其他途径。因此，在本发明的一些实施方式中，可以通过去除或削弱涉及喹啉酸的分解途径的喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性，或通过增强涉及喹啉酸的合成途径的喹啉酸合成酶的表达或活性，或通过它们的组合，获得具有改善的生产喹啉酸的能力的微生物。 
在具体实施方式中，具有改善的生产喹啉酸的能力的微生物还可以被修饰以增强喹啉酸合成酶的活性。具体地，喹啉酸合成酶的活性增强可以通过额外导入喹啉酸合成酶以增加其在微生物中表达而实现。喹啉酸合成酶的活性增强也可以通过用强启动子替换微生物中连接到喹啉酸合成酶的启动子来实现。此外，喹啉酸合成酶的活性增强可以通过增加喹啉酸合成酶本身的活性来实现。 
在将异源喹啉酸合成酶导入的情况下，可以导入编码该酶的多核苷酸，以增加该多核苷酸的表达。编码喹啉酸合成酶的多核苷酸可以表达于微生物的质粒中，或可被插入到所述微生物的染色体中，并在其中表达。 
喹啉酸合成酶可以具有由SEQ ID NO：29所表示的氨基酸序列，或者可以具有与其同源的氨基酸序列。换言之，它不局限于此，因为取决于微生物物种或菌株，蛋白质的氨基酸序列可能存在差异。它可以是具有下述氨基酸序列的突变体蛋白或人工变体，所述氨基酸序列在由SEQ ID NO：29所表示的氨基酸序列的一个或多个位置包含取代、删除、插入或添加一个或多个氨基酸，只要它可以从亚氨基琥珀酸合成喹啉酸。编码该酶的基因nadA的序列可以通过大肠杆菌的基因组序列(gi：GI：89109380)获得，该序列披露于文章(MolSystBiol.，2006；2：2006.0007.，Epub 2006年2月21日)，或可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库或日本DNA数据库(DDBJ)获得。另外，编码本发明的氨基酸序列的多核苷酸可包含编码具有表示为SEQ ID NO：29的氨基酸序列、或与其同源性为80％或更多的氨基酸序列、特别是90％或更多的氨基酸序列、更具体地95％或更多的氨基酸序列、特别具体地97％或更多的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸序列，只要它具有与L-天冬氨酸氧化酶类似的活性。最具体地，它可以是由SEQ ID NO：26所表示的多核苷酸序列。 
喹啉酸合成酶具有从亚氨基琥珀酸合成喹啉酸的活性，如反应式2所示。 
<反应式2> 
α-亚氨基琥珀酸+二羟基丙酮磷酸<＝>喹啉酸+磷酸+2H2O 
因此，编码该喹啉酸合成酶的基因的表达增强或这种酶的活性增强时，喹啉酸在细胞中的产率会增加。 
在一些实施方式中，在具有生产喹啉酸能力的微生物中，天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的活性可以通过用强启动子取代内源性启动子增强，或通 过诱导启动子的突变增强，或通过增加基因的拷贝数增强。对于强启动子的取代，可以使用通常已知的强启动子，其包括pTac、pTrc、pPro、pR、pL、pCJ1、pCysK等。 
在具体实施方式中，提供了具有改善的生产喹啉酸的能力的微生物，其中，喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性可以额外降低或消除。 
喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性可通过修饰编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因，或通过使用抑制转录的microRNA被降低或去除。 
喹啉酸磷酸核糖基转移酶可具有由SEQ ID NO：30所表示的氨基酸序列或与其高度同源的氨基酸序列。换言之，它不局限于此，因为取决于微生物物种或菌株，蛋白质的氨基酸序列可能存在差异。它可以是具有下述氨基酸序列的突变体蛋白或人工变体，所述氨基酸序列在由SEQ ID NO：30所表示的氨基酸序列的一个或多个位置包含取代、删除、插入或添加一个或几个氨基酸，只要它可以从喹啉酸合成烟酸单核苷酸。 
喹啉酸磷酸核糖基转移酶可具有从喹啉酸合成烟酸单核苷酸的活性，如反应式3所示。因此，通过删除具有合成烟酸单核苷酸的活性的基因或通过削弱该基因活性，喹啉酸在细胞的产率可以增加。 
<反应式3> 
5-磷酸基-α-D-核糖-1-二磷酸+喹啉酸+2H+<＝>CO2+二磷酸+烟酸核糖核苷酸 
可以通过将编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的内源基因取代为修饰的基因以降低或去除酶的活性，或通过用弱启动子取代内源性基因的启动子，或者通过从染色体上删除编码酶的内源基因，从而降低或去除喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性。 
在具体实施方式中，在具有改善的生产喹啉酸的能力的微生物中，喹啉酸磷酸核糖基转移酶将喹啉酸转化为烟酸单核苷酸的活性可以被去除。为此，编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的nadC基因可以从该微生物的基因组中通过同源重组删除。所述基因nadC的序列可以通过大肠杆菌的基因组序列(gi：GI：89109380)获得，该序列披露于文章(Mol Syst Biol.，2006；2：2006.0007.，Epub 2006年2月21日)，或可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库或日本DNA数据库(DDBJ)获得。另外，编码本发明的氨基酸序列的多核苷酸可包含编码具有表示为SEQ ID NO：30的氨基酸序 列、或与其同源性为80％或更多的氨基酸序列、特别是90％或更多的氨基酸序列、更具体地95％或更多的氨基酸序列、特别具体地97％或更多的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸序列，只要它具有与L-天冬氨酸氧化酶类似的活性。最具体地，它可以是由SEQ ID NO：25所表示的多核苷酸序列。 
在具体实施方式中，具有生产喹啉酸能力的微生物可以是原核微生物或真核微生物。 
在一些实施方式中，具有生产喹啉酸的能力的微生物的实例可以属于以下：肠杆菌属(Enterbacter)、埃希杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏杆菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)，但不限于此。 
在具体实施方式中，具有生产喹啉酸能力的微生物可属于埃希杆菌属(Escherichia)。 
具体地，具有生产喹啉酸能力的微生物可以是大肠杆菌(E.coli)。 
本发明的其他方面提供了生产喹啉酸的方法，其包括：培养含有编码其中SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的L-天冬氨酸氧化酶的多核苷酸的微生物；并从培养溶液中回收喹啉酸。 
微生物的培养可使用合适的培养基在本领域熟知的合适的培养条件下进行。这样的培养方法，可以被本领域普通技术人员使用，并且可根据所选择的微生物容易地调整。培养方法可包括分批培养型、连续培养型和加料分批培养型，但并不限于此。培养方法的多种实例公开在，例如，“Biochemical Engineering”(James M.Lee，Prentice-Hall International Editions，pp 138-176)。 
在培养过程中使用的培养基应满足针对所选择的微生物的适当的条件。各种微生物培养基被公开在，例如，“Manual of Methods for General Bacteriology(the American Society for Bacteriology，Washington D.C.，U.S.A，1981)”。例如，培养基中可包含多种碳源、氮源和微量元素。 
可用于培养基的碳源的实例可包括碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖和淀粉；油和脂肪，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如乙二醇和乙醇；和有机酸，如乙酸，它们可以单独使用或组合使用，但并不局限于此。 
可用于培养基的氮源的实例可包括有机氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆(CSL)、大豆粉和尿素；以及无机氮源，如 硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，它们可以单独使用或组合使用，但并不限于此。 
可用于该培养基的磷源的实例可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。在一些实施方式中，培养基还可以包括金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。在一些实施方式中，除了上面列出的组分，培养基还可以包括氨基酸、维生素和适当的前体。可以以分批或连续的方式，向培养溶液中添加用于培养微生物的培养基或单个组分。 
在一些实施方式中，在培养过程中，培养溶液的pH可以通过以适当的方式加入化合物调整，例如，氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸或硫酸。另外，在培养过程中，可以使用如脂肪酸的消泡剂(例如，聚乙二醇酯)抑制培养溶液形成泡沫。为了保持培养溶液在需氧条件下，氧或含氧气体(例如空气)可被供给到培养溶液中。培养溶液的温度可以维持在约20℃至约45℃的温度范围内，特别是约25℃至约40℃。可以持续培养，直到得到目标量的喹啉，具体地，时间可为约10小时至160小时。 
本发明的另一个方面提供了制备烟酸的方法，其包括：培养含有编码其中SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的L-天冬氨酸氧化酶的多核苷酸的微生物；并通过添加酸至培养的产物进行脱羧反应。 
本文所述的术语“脱羧反应”指的是通过从喹啉酸除去羧基并释放二氧化碳的反应以产生烟酸。 
特别地，培养微生物后，所得到的含有喹啉酸的培养溶液可以进行离心或膜过滤以除去微生物。然后，为了加速脱羧反应，提供氢基的酸可以被添加至含有喹啉酸的培养溶液。可使用任何酸而没有限制，只要它能够提供氢基至培养溶液中。 
在一个实施方式中，含有喹啉酸的培养溶液可以无需纯化即使用。 
在一个实施方式中，被添加到培养溶液中的酸可以是盐酸或硫酸。 
在一个实施方式中，在加入酸后，培养溶液可以具有为约5或更低的pH值，或具体地可在约2至约3的范围。 
在一个实施方式中，培养溶液的脱羧反应可以在约100℃至约150℃的温度下进行，或具体地可以在约120℃至约135℃的范围。 
在一个实施方式中，培养溶液的脱羧反应可以在约0.1MPa至约0.5MPa 的压力下进行，或具体地可以在约0.2Mpa至约0.4Mpa的压力下进行。 
在向含有喹啉酸的培养溶液中加入酸后，紧接着在高温和高压的条件下进行脱羧约1小时至3小时，在培养溶液中的喹啉酸可转化成烟酸，如反应式4所示。 
<反应式4> 
喹啉酸+2H+<＝>CO2+烟酸 
在一个实施方式中，生产烟酸的方法还可以包括回收和纯化烟酸。 
在一个实施方式中，烟酸的回收可以通过本领域中通常已知的方法进行，包括培养溶液的过滤和结晶方法。 
有益效果 
根据本发明的实施方式，通过培养包含L-天冬氨酸氧化酶(其中由烟酸或NAD导致的反馈调节被解除)变体的微生物，有效生产喹啉酸。这些使用微生物的方法可以解决传统化学合成方法的问题，该问题是关于由于生成催化剂副产物、高能量消耗和使用不可再生的资源产生的环境问题，以及传统生物合成方法产率低的问题。因此，这些方法可以有效地以环境友好的方式生产喹啉酸和烟酸。 
附图说明
附图1示例了在根据本发明的实施方式生产烟酸的方法中，生产烟酸的途径。 
发明方法 
本发明将参照下面的实施例进行进一步详细说明。这些实施例仅用于说明目的，并不意欲限制本发明的范围。 
实施例1.制备解除NAD反馈调节的L-天冬氨酸氧化酶变体 
<1-1>构建表达L-天冬氨酸氧化酶的质粒 
为制备L-天冬氨酸氧化酶变体，将编码野生型L-天冬氨酸氧化酶的源自大肠杆菌的nadB基因克隆至表达载体中。为此目的，大肠杆菌K12 W3110菌株的染色体被用作模板。该菌株购自American Type Culture Collection(ATCC No.23257)。基于获自美国国立卫生研究院的GenBank(NIH  GenBank)的由SEQ ID NO：24表示的nadB基因的核苷酸序列(NCBI登记号“GI：89109380”)，构建具有限制酶NdeI和BamHI的识别位点的SEQ ID NO：2和3的引物，以扩增nadB基因的ORF区域，用于基因克隆。 
[表1] 
核苷酸序列 SEQ ID NO
5′AATTCATATGAATACTCTCCCTGAACATT 3′ 2
5′AATTGGATCCCTATACCACTACGCTTGATCAC 3′ 3
使用大肠杆菌K12 W3110的染色体DNA作为模板和由SEQ ID NO：2和3表示的寡核苷酸作为引物，进行PCR。使用的聚合酶是PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene，U.S.A)，且通过重复30次下述循环进行PCR，所述循环包括：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒，并在72℃延伸2分钟。通过PCR，得到约1.9kb的包括nadB ORF基因和限制酶NdeI和BamHI的识别位点的扩增基因。 
通过PCR获得的nadB基因通过琼脂糖凝胶洗脱回收，然后用限制酶NdeI和BamHI处理，随后连接至经限制酶NdeI和BamHI处理的pProLar载体(Clonetech，U.S.A.)，以便从连接于pPro启动子的nadB基因表达L-天冬氨酸氧化酶。所得载体被命名为“pPro-nadB载体”。 
<1-2>构建L-天冬氨酸氧化酶变体的质粒库 
为获得L-天冬氨酸氧化酶变体，使用<1-1>中获得的pPro-nadB载体作为模板，通过在dGTP和MnSO4的存在下易错PCR(error-prone PCR)，构建nadB基因变体库。 
在使用pPro-nadB重组载体作为模板的易错PCR中，使用引物4和5，PCR混合物中的dGTP和硫酸锰(其被用来控制GC率和错误率)的浓度分别为2mM和8mM，且使用的聚合酶是PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene，U.S.A)。通过重复30次下述循环进行PCR，所述循环包括：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒，并在72℃延伸2分钟。通过PCR，获得约1.9kb的DNA片段。将该DNA片段通过琼脂糖凝胶洗脱纯化，用限制酶Dpnl(NEB，U.S.A.)处理约1小时，然后通过CaCl2方法转化到大肠杆菌DH5α菌株(Invitrogen，U.S.A.)中。将转化的大肠杆菌DH5α菌株涂抹在Luria-Bertani(LB)-卡那霉素(Km)(酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L、胰蛋白 胨10克/升、卡那霉素25μg/L)的平板培养基上，并在37℃培养过夜，以获得卡那霉素抗性菌落。随机从中选取10个克隆，随后测序。结果，nadB基因的错误率估计为约4.5核苷酸/1kb。得到的带有nadB基因变体的菌株的数量约为3x105或更多。 
[表2] 
核苷酸序列 SEQ ID NO
5′CTCGAGCATAGCATTTTTATCC 3′ 4
5′CAGTGAGCGAGGAAGCGG 3′ 5
<1-3>选择显示解除的NAD-反馈调节的L-天冬氨酸氧化酶变体 
<1-3-1>构建L-天冬氨酸氧化酶缺陷型菌株 
在NAD的反馈调节下，该nadB基因对喹啉酸的生产具有负面影响(JBiol Chem.1982Jan 25；257(2)：626-32.)。出于这个原因，发现其中解除由NAD导致的反馈调节的nadB基因是重要的。为了有效选择更好的nadB的基因变体，需从菌株中除去内源性nadB基因。基于源于美国国立卫生研究院的GenBank(NIH GenBank)的由SEQ ID NO：24表示的nadB基因的核苷酸序列(NCBI登记号“GI：89109380”)，构建能够扩增nadB基因的下游区的SEQ ID NO：6和7的引物、能够扩增nadB基因的上游区的SEQ ID NO：8和9的引物和能够扩增loxpCm的SEQ ID NO：10和11的引物。 
[表3] 
核苷酸序列 SEQ ID NO
5′CATTATACGAACGGTACCCCAAAGCCTGGGTCAGCGCCGT 3′ 6
5′GGCGGATATTCAGCAGTGG 3′ 7
5′CCCAAACCAAATTTCCACG 3′ 8
5′CGGTAGGTACCGAGCTCGAATTTCTTTGTTTAATTTACTA 3′ 9
5′TAGTAAATTAAACAAAGAAATTCGAGCTCGGTACCTACCG 3′ 10
5′ACGGCGCTGACCCAGGCTTTGGGGTACCGTTCGTATAATG 3′ 11
使用大肠杆菌K12 W3110(ATCC NO.23257)的染色体DNA作为模板进行PCR，分别使用SEQ ID NO：6和7的寡聚核酸作为引物扩增0.4kb的nadB基因的上游区，和使用SEQ ID NO：8和9的寡聚核酸作为引物扩增0.4kb的nadB基因的下游区。此外，使用含有loxpCm、pLoxpCat2载体的质粒载体 作为模板，使用SEQ ID NO.10和11的寡核苷酸作为引物，进行PCR，以扩增具有在1.0kb的两端与nadB基因同源的序列的loxpCm基因。使用的聚合酶是PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene，U.S.A.)，且通过重复30次下述循环进行PCR，所述循环包括：在96℃变性30秒，在53℃退火30秒，并在72℃延伸1分钟。然后通过琼脂糖凝胶洗脱，以得到nadB上游片段、nadB下游片段和loxpCm片段。使用这些得到的片段作为模板在如下PCR条件下进行PCR：重复10次下述循环，所述循环包括：在96℃变性60秒，在50℃退火60秒，并在72℃延伸1分钟。加入作为引物的SEQ ID NO.7和8后，重复该循环20次。结果，得到含有1.8kb的nadB基因上游区-loxpCm-nadB基因下游区的nadB缺陷型盒。 
将含有pKD46作为λRed重组酶表达载体的大肠杆菌K12 W3110菌株通过电穿孔法用该nadB缺陷型盒转化，然后将菌株涂抹在含有氯霉素作为选择标记的LB平板培养基(胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化钠10克、氯霉素15μg/L和琼脂1.5％)上。然后在37℃过夜培养以选择表现出氯霉素抗性的微生物菌株。 
在相同条件下，直接用选择的菌株作为模板，使用SEQ ID NO.7和8作为引物，进行PCR。在1.0％琼脂糖凝胶上，野生型菌株和nadB缺陷型菌株的基因大小分别被确定为2.4kb和0.8kb，从而确认在大肠杆菌K12 W3110中缺失nadB基因。完成了该nadB缺陷型菌株的构建，命名为W3110-△nadB。 
<1-3-2>选择L-天冬氨酸氧化酶变体 
为找到NAD反馈调节被解除的nadB基因，使用6-氨基吡啶-3-羧酸(6-NA，购自Aldrich，U.S.A)作为烟酸类似物，使用6-氨基烟酰胺(6-Nm，购自Aldrich，U.S.A)作为烟酰胺类似物。尽管应当使用6-NAD类似物，但由于NAD与烟酸和烟酰胺的结构相似性，故使用烟酸类似物和烟酰胺类似物初步选择抗性nadB基因变体，然后确认每种选出的nadB基因变体的NAD-反馈调节被解除(参见Journal of bacteriology，June 1983，p.1126-1136)。通过CaCl2方法，在实施例1的<1-2>中构建的L-天冬氨酸氧化酶变体质粒库被转化至W3110-△nadB菌株中。 
将转化的W3110-△nadB菌株涂抹在M9-(6，NA)-(6，Nm)平板培养基(NaHPO4-7H2O 12.8g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、NH4Cl 1g、MgSO4 2mM、 CaCl2 0.1mM、酪蛋白氨基酸1g、6-氨基吡啶-3-羧酸(6-NA)0.3g/L、6-氨基烟酰胺(6-Nm)0.3g/L)上以选择相比于野生型nadB具有更高生长速率的菌落。共筛选了1x 107个菌落，选择其中的3个，将其分别命名为pPro-nadB64、pPro-nadB67和pPro-nadB110。将选择出的三个菌株接种和培养在M9-(6，NA)-(6，Nm)液体培养基(NaHPO4-7H2O 12.8g、KH2PO43g、NaCl 0.5g、NH4Cl 1g、MgSO4 2mM、CaCl2 0.1mM、酪蛋白氨基酸1g、6-氨基吡啶-3-羧酸(6-NA)0.3g/L、6-氨基烟酰胺(6-Nm)0.3g/L)中，然后比较其光密度(OD)。结果发现，在包含6-NA和6-Nm的培养基中，pPro-nadB67的生长速率比pPro-nadB64和pPro-nadB72的生长速率高，如表4所示。相应的，选择出pPro-nadB67并鉴定其序列。结果发现，pPro-nadB67包含作为赖氨酸的取代物的精氨酸，所述赖氨酸为从起始氨基酸甲硫氨酸算起的第302位氨基酸。 
将含有nadC基因缺陷的并含有通过使用pProlar载体作为nadB基因变体的表达载体的pPro-nadB67(Lys302Arg)-pCJ-nadA的大肠杆菌K12 W3110，命名为CV01-0518。然后于2013年6月20日，依据布达佩斯条约保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)中，登记号为KCCM11434P。 
[表4]三种nadB变体在包含6-NA和6-Nm的液体培养基中的生长速率比较 
nadB名称 OD(4hr) OD(12hr)
pPro nadB 0.24 1.06
pPro nadB64 0.44 1.12
pPro nadB67 0.62 1.30
pPro nadB72 0.46 1.18
实施例2.nadB基因变体之间的喹啉酸产率比较 
<2-1>构建喹啉酸磷酸核糖基转移酶-缺陷型菌株 
使用大肠杆菌K12 W3110的染色体DNA作为模板进行PCR，以获得涉及喹啉酸分解途径的nadC基因。基于获自美国国立卫生研究院的GenBank(NIH GenBank)的表示为SEQ ID NO：25的nadC基因的核苷酸序列(NCBI登记号"GI：89106990″)，构建由可以扩增nadC基因的下游区的SEQ  ID NO：12和13所表示的引物，构建可以扩增nadC基因的上游区和下游区和loxpCm基因的SEQ ID NO：14和15的引物，构建可以扩增nadC基因的上游区的SEQ ID NO：16和17的引物。 
[表5] 
使用大肠杆菌K12 W3110的染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：12和13、16和17的寡聚核酸作为引物，进行PCR，分别扩增nadC基因的0.5kb和0.3kb的上游区和下游区。此外，使用包括loxpCm、pLoxpCat2载体的质粒载体作为模板，使用SEQ ID NO.14和15的寡核苷酸作为引物，进行PCR，以扩增具有在1.0kb的两端与nadC基因同源的序列的loxpCm基因。使用的聚合酶是PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene，U.S.A.)，且通过重复30次下述循环进行PCR，所述循环包括：在96℃变性30秒，在53℃退火30秒，并在72℃延伸1分钟。结果，得到nadC上游片段、nadC下游片段和loxpCm片段。使用这些从上述PCR得到的片段作为模板在如下PCR条件下进行PCR：重复10次下述循环，所述循环包括：在96℃变性60秒，在50℃退火60秒，并在72℃延伸1分钟。加入作为引物的SEQ ID NO.12和17后，重复该循环20次。结果，得到含有1.8kb的nadC基因上游区-loxpCm-nadC基因下游区的nadC缺陷型盒。 
将含有pKD46作为λRed重组酶表达载体的大肠杆菌K12 W3110菌株通过电穿孔法用该nadC缺陷型盒转化，然后将菌株涂抹在含有氯霉素作为选择标记的LB平板培养基(胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化钠10克和琼脂1.5％)上。然后在37℃过夜培养以选择表现出氯霉素抗性的微生物菌株。 
在相同条件下，直接用选择的菌株作为模板，使用SEQ ID NO.13和16作为引物，进行PCR。在1.0％琼脂糖凝胶上，野生型菌株和nadC缺陷型菌株的基因大小分别被确定为1.6kb和1.3kb，从而确认在大肠杆菌K12W3110中缺失nadC基因。完成了该nadC缺陷型菌株的构建，命名为W3110-△nadC。 
<2-2>构建用于表达天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的质粒 
生产喹啉酸需要两种酶，天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶。相应地，构建能够同时表达编码两种酶的nadB和nadA基因的质粒。首先，使用大肠杆菌W3110的染色体DNA，进行PCR，以获得编码喹啉酸合成酶的nadA基因。基于获自美国国立卫生研究院的GenBank(NIH GenBank)的由SEQ ID NO：26表示的nadA基因的核苷酸序列(NCBI登记号“GI：89107601”)，合成SEQ ID NO：18和19的引物，所述引物能够扩增包括ATG和TAA区域的nadA基因的ORF区域，并具有限制酶ApaI和NotI的识别位点。 
[表6] 
核苷酸序列 SEQ ID NO
5′AATTGGGCCCATGAGCGTAATGTTTGATCCA 3′ 18
5′AATTGCGGCCGCTCGTGCCTACCGCTTCG 3′ 19
使用大肠杆菌K12 W3110的染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：18和19的寡聚核酸作为引物，进行PCR。使用的聚合酶是PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene，U.S.A.)，且通过重复30次下述循环进行PCR，所述循环包括：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒，并在72℃延伸1分钟。结果，获得约1.0kb的扩增基因，其包括nadA基因和限制酶ApaI和NotI的识别位点。 
基于韩国公开专利号为10-2006-0068505的公开内容，使用包括pCJ1启动子的质粒作为模板，通过PCR获得pCJ1启动子。构建具有限制酶BamHI和ApaI的识别位点的由SEQ ID NO：20和21表示的引物，用于连接pCJ1启动子和扩增的nadA基因。 
[表7] 
核苷酸序列 SEQ ID NO
5′CCGCGGATCCCACCGCGGGCTTATTCCATTAC 3′ 20
5′GATGGGCCCATCTTAATCTCCTAGATTGGGTTTC 3′ 21
[0127] 使用大肠杆菌K12 W3110的染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：20和21的寡聚核酸作为引物，进行PCR。使用的聚合酶是PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene，U.S.A.)，且通过重复30次下述循环进行PCR，所述循环包括：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒，并在72℃延伸1分钟。结果，获得约0.3kb的扩增片段，其包括pCJ1启动子和限制酶BamHI和ApaI的识别位点。 
用限制酶ApaI和NotI处理通过PCR得到的nadA基因，用限制酶ApaI和BamHI处理扩增的pCJ1启动子片段。通过连接至用限制酶NotI和BamHI处理过的<1-1>中得到的pPro-nadB载体，分别克隆用限制酶处理的NadA基因和pCJ1启动子片段。最终，构建5.9kb的pPro-nadB-pCJ1-nadA重组载体，其中nadB基因的表达通过pPro启动子作为组成型启动子进行调控，且nadA基因表达通过pCJ1启动子调控。构建的pPro-nadB-pCJ1-nadA具有SEQ ID NO：27表示的序列。此外，通过上述方法，还构建重组载体pPro-nadB67-pCJ1-nadA，其包括nadB变体和野生型nadA基因。构建的pPro-nadB67-pCJ1-nadA具有SEQ ID NO：28表示的序列。 
<2-2-1>构建pPro-nadB67-pCJ1-nadA的nadB基因的第302位氨基酸被除赖氨酸和精氨酸以外的氨基酸取代的载体 
为了确认nadB67基因变体(该基因变体包括精氨酸替代赖氨酸作为从L-天冬氨酸氧化酶的甲硫氨酸开始的第302位氨基酸)的NAD-反馈调节被解除，nadB基因的第302位氨基酸被除了赖氨酸和精氨酸以外的18种不同氨基酸的每一种取代。使用重组载体pPro-nadB67-pCJ1-nadA作为模板，进行快速诱变。使用的聚合酶是PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene，U.S.A.)，且通过重复18次下述循环进行PCR，所述循环包括：在96℃变性30秒，在55℃退火30秒，并在68℃延伸15分钟。得到的PCR产物用限制酶DpnI(NEB，U.S.A)处理，然后通过CaCl2方法将其转化至大肠杆菌DH5α菌株(Invitrogen，U.S.A.)中。将经转化的大肠杆菌DH5α菌株涂抹在LB-Km平板培养基(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、卡那霉素25μg/L)，在37℃培养过夜，以选择卡那霉素抗性菌落。获得的菌落经过质粒提取和测序以确定其第302位氨基酸被18种不同氨基酸的取代。得到的18种作为质粒的nadB变体被命名在表2中。 
[表8]第302位氨基酸被其他氨基酸取代的L-天冬氨酸氧化酶变体 
<2-3>评估野生型nadB和nadB67变体就NAD浓度而言生产喹啉酸的能力 
为了比较野生型nadB基因和nadB基因变体就NAD浓度而言生产喹啉酸的能力，进行喹啉酸滴定度测定。在实施例2的<2-1>中得到的生产喹啉酸的菌株(W3110-△nadC)通过实施例2的<2-2>中构建的质粒pPro-nadB67-pCJq1-nadA转化后，通过CaCl2方法，在构建实施例2的<2-2-1> 中构建nadB67变体的18种类型的每一个。将转化的菌株在37℃分批培养在LB-Km平板培养基上培养过夜以获得单一菌落，然后用一个铂池(platinum pool)将单一菌落接种到25ml培养基上，用于喹啉酸效价测定，然后在37℃，250rpm振荡培养24小时至72小时。表9显示了用于生产喹啉酸的培养基的组成。为了鉴别nadB67变体的NAD反馈调节被解除，将不同浓度的烟酸(NA)加至培养基，然后比较喹啉酸的生产量。 
[表9]用于喹啉酸效价测定的培养基的组成 
组成 浓度(每升)
葡萄糖 70g
硫酸铵 17g
KH2PO4 1.0g
MgSO4·7H2O 0.5g
FeSO4·7H2O 5mg
MnSO4·8H2O 5mg
ZnSO4 5mg
碳酸钙 30g
酵母提取物 2g
每种培养溶液中的喹啉酸(喹啉酸，QA)的量通过高效液相色谱(HPLC)分析。结果显示在表10中。表10显示了就NAD浓度而言nadB67变体生产喹啉酸的能力。 
[表10]就NAD浓度而言喹啉酸的生产量 
[表11]就NAD浓度而言喹啉酸的相对产率 
对于包括质粒pPro-nadB67(D)-pCJ-nadA和pPro-nadB67(E)-pCJ-nadA的两种生产喹啉酸的变体，nadB基因被破坏并丧失活性。结果，该生产喹啉酸的变体大部分具有很低的喹啉酸(QA)水平，该水平被转化为以百分数形式(％)表示的残余相对产率(residual relative yield)。这是基于，当烟酸(NA)为0uM时，生产的QA水平为100％。 
参考表11，当使用包括野生型nadB基因的pPro-nadB-pCJ-nadA质粒且培养基包含超过5uM或更多的烟酸时，喹啉酸的产率低于50％。然而当使用包括nadB基因变体的pPro-nadB67-pCJ-nadA质粒和第302位变体重组体质粒时，喹啉酸的产率为70％或更高。W3110-△nadC菌株是NAD营养缺陷型，为了生长其需要外部NAD供应。W3110-△nadC菌株不能直接接受NAD，而使用异源烟酸(NA)或烟酰胺(Nm)来生产NAD。当细胞内NAD的量为1mM或更多，nadB基因受反馈调控以保持细胞内NAD的量恒定。 相应地，QA的生产可通过被反馈调控的nadB基因限制。将NA加入到培养基中意味着菌株内的NAD的增加。相应地，比较将不同浓度的NA加入到培养基中的菌株之间的QA生产量，以鉴别nadB基因变体中就NAD浓度而言的反馈调节程度。结果发现，第302位氨基酸被取代的nadB基因变体中由NAD导致的反馈调节被解除。 
<2-4>通过脱羧反应生产烟酸 
为鉴别导入nadB变体的生产喹啉酸的菌株的生产烟酸的能力，使用表10中喹啉酸的产率。本文使用的烟酸生产方法为在高温高压条件下将含有喹啉酸的培养溶液脱羧，从而将喹啉酸转化为烟酸，这基于韩国专利No.10-1223904的公开内容。为从含有喹啉酸的培养溶液中除去细胞，在约3000rpm至约4000rpm实施离心约10分钟至约30分钟。分离通过离心获得的含有喹啉酸的上清液，并将其用作脱羧反应的样品。 
在约135℃，约0.2MPa，实施脱羧反应约3小时。使用的样品显示在表12中。使用喹啉酸在去离子水中的水溶液(Sigma-Aldrich Co.的标准产品)作为对照组。喹啉酸水溶液的每一个样品用氢氧化钠、氨水、盐酸或硫酸滴定，具体地喹啉酸在pH为2时转化为烟酸。表12显示，通过高温高压反应，从表10的喹啉酸转化成的烟酸的生产量。 
[表12] 
在水溶液(去离子水)中，将喹啉酸转化成烟酸的实验在135℃并在0.2MPa进行约3小时，这公开在现有参考文献中国专利No.101353322。在现有的参考文献中，温度和压力水平分别低于150℃至250℃。其结果示于表12。 
实施例3：确认L-天冬氨酸氧化酶变体的NAD反馈调节被解除 
<3-1>构建L-天冬氨酸氧化酶过表达质粒 
为了进一步阐明L-天冬氨酸氧化酶变体的NAD反馈调节被解除，评估了选自<实施例1-3-2>的nadB67变体编码的L-天冬氨酸氧化酶变体的NAD反馈调节如何被解除。为了将野生型nadB和nadB变体克隆到含有组氨酸(His)标签的pCDF双重载体中，使用野生型pPro-nadB质粒和重组体pPro-nadB67作为模板，分别进行PCR。为了用于PCR，构建SEQ ID NO：22和23的引物，该引物能够扩增的野生型nadB和变体nadB67基因的包括ATG和TAA区域的ORF区，并具有限制酶BamHI和NdeI的识别位点。 
[表13] 
核苷酸序列 SEQ ID NO.
5′AATTGGATCCGATGAATACTCTCCCTGAACATT 3′ 22
5′AATTCATATGTTATCTGTTTATGTAATGATTGC 3′ 23
使用的聚合酶是PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene，U.S.A)，且通过重复30次下述循环进行PCR，所述循环包括：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒，并在72℃延伸2分钟。结果，得到约1.9kb的野生型nadB和nadB67变体的扩增基因，其包括限制酶BamHI和NdeI的识别位点。 
通过PCR得到的野生型nadB和nadB67变体的基因用限制酶BamHI和NdeI处理，然后通过连接到用限制酶BamHI和NdeI处理过的pCDF双重载体中克隆。最终，分别构建包括野生型nadB和nadB67变体的基因的重组载体，其中每个基因的表达都可受作为组成型启动子T7启动子的控制，且基因含有能够进行蛋白质纯化的His标签。构建的重组载体被分别命名为pT7-nadB和pT7-nadB67。使用相同的方法，构建野生型nadB的第302位氨基酸分别被缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和组氨酸取代的其他重组载体，并分别命名为pT7-nadB67(V)、pT7-nadB67(L)、pT7-nadB67(I)和pT7-nadB67(H)。 
<3-2>纯化L-天冬氨酸氧化酶 
在通过CaCl2方法，将重组载体pT7-nadB、pT7-nadB67、pT7-nadB67(V)、pT7-nadB67(L)、pT7-nadB67(I)或pT7-nadB67(H)转化到tuner菌株后，将转化的菌株涂抹在LB-SP(酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，胰蛋白胨10g/L和壮观霉素50μg/L)平板培养基上，并在37℃培养过夜以选择壮观霉素抗性菌落。从中选择一个菌落，并培养在LB-SP(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壮观霉素50μg/L)液体培养基中，然后当生长光密度(OD)值达到0.4时，将异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)衍生物加入培养基中，在18℃培养过夜。从培养基中回收包括过表达的野生型L-天冬氨酸氧化酶和L-天冬氨酸氧化酶变体的细胞，接着通过Ni-NTA spin试剂盒(Quiagen，U.S.A)，纯化来自于回收的细胞中的野生型L-天冬氨酸氧化酶和L-天冬氨酸氧化酶变体。回收的蛋白质为总蛋白质的50％，约2％的回收蛋白质是作为L-天冬氨酸氧化酶回收的。 
<3-3>L-天冬氨酸氧化酶变体的活性测试 
在作为辅助因子的FAD存在下，L-天冬氨酸氧化酶将作为底物的天冬氨酸转化为亚氨基天冬氨酸，且亚氨基天冬氨酸被转化为草酰乙酸。使用经 上述反应产生的过氧化氢(H2O2)鉴别nadB的活性。使用Amplex Red (Invitrogen，Korea)，测量H2O2与来自反应的产物的反应产物在560nm的吸光值以确定nadB的活性。本文中，添加不同浓度的NAD以形成竞争型抑制FAD的条件，来评估L-天冬氨酸氧化酶的通过NAD的反馈调节被解除。野生型L-天冬氨酸氧化酶的相对活性在NAD浓度为1mM的条件下，低于50％，而在相同NAD浓度时，L-天冬氨酸氧化酶变体的相对活性保持约70％或更高(表14)，这说明由NAD导致的反馈调节在L-天冬氨酸氧化酶变体中被解除。 
[表14]就NAD浓度而言，L-天冬氨酸氧化酶的活性比较 
工业实用性 
本发明涉及L-天冬氨酸氧化酶变体，其由烟酸或NAD导致的反馈调节被解除，并因此可有效生产喹啉酸。可通过培养包括本发明实施方案所述的L-天冬氨酸氧化酶变体的微生物，有效生产喹啉酸。还可以使用这样的微生物有效生产喹啉酸，该微生物中的喹啉酸合成酶的活性是额外增强的，或者喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性是额外减弱的。通过微生物的这类转化，可以改善喹啉酸或烟酸的产率，这在工业上非常有用。 
[登记号] 
保藏机构：韩国微生物培养中心(KCCM)(国际保藏机构) 
登记号：KCCM11434P 
交存日期：2013年6月20日 
参考示例性的实施方案特别的显示和描述了本发明，但应理解，可以在不脱离所附权利要求的精神和范围的条件下，对形式和细节进行多种改变。 

Claims (11)

1.L-天冬氨酸氧化酶变体，其具有在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列。
2.权利要求1的L-天冬氨酸氧化酶变体，其中所述其它氨基酸选自：精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸。
3.权利要求1的L-天冬氨酸氧化酶变体，其中了由烟酸或NAD导致的反馈调节被解除。
4.多核苷酸，其包含下述的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列。
5.载体，其包含与调控序列可操作地连接的权利要求4的多核苷酸。
6.包含权利要求4的多核苷酸的微生物。
7.权利要求6的微生物，其中该微生物属于埃希杆菌属(Escherichia)。
8.权利要求6的微生物，其中喹啉酸合成酶的活性是增强的。
9.权利要求6的微生物，其中内源性喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性是降低的。
10.生产喹啉酸的方法，该方法包括：
在培养基中培养权利要求6的微生物；和
从所述培养基中回收喹啉酸。
11.生产烟酸的方法，该方法包括：
在培养基中培养权利要求6的微生物；和
通过向所述培养基中添加酸，进行脱羧反应。
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