KR20150013092A - 숙신산 생산능이 향상된 박테리아 세포 및 이를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

모세포에서의 활성에 비하여 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 경로 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 중 하나 이상의 활성이 증가되어 있는 유전적으로 조작된 박테리아 세포 및 이를 이용한 숙신산 생산 방법을 제공한다. 상기 박테리아 세포를 이용하여 숙신산을 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

숙신산 생산능이 향상된 박테리아 세포 및 이를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법{Bacterial cell having enhanced succinic acid production and a method for producing the succinic acid using the same}
숙신산 생산능이 향상된 유전적으로 조작된 박테리아 세포 및 이를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 속 미생물은 그람 양성 균주로서, 글루타메이트, 리신, 트레오닌과 같은 아미노산을 생산하는 용도로 널리 이용되고 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 생장 조건이 단순하고, 유전체 구조가 안정적이며, 환경 유해성이 없어 산업용 균주로서의 장점을 갖추고 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 호기 세균으로, 산소 공급이 중단되거나 부족한 혐기 조건 하에서 최소한의 생존을 위한 에너지를 생산하는 외의 대사 과정이 중단되고, 에너지 생산을 위해 젖산, 아세트산, 숙신산 등을 생산하여 배출한다.
트리카르복실산(TCA) 회로는 코리네박테리움과 같은 생물 종에서 에너지 및 중간 대사 산물을 생성하는 대사 과정이다. TCA 회로의 중간 대사 산물은 세포 내 여러 대사 과정을 통해 유용한 화학물질로 합성된다. 숙신산(succinic acid)은 생분해성 고분자, 의약, 식품 및 화장품의 원료물질 등으로 사용되는 디카르복실산의 일종이다. 산업적으로 사용되는 대부분의 숙신산은 원유나 액화천연가스에서 유래한 n-부탄 및 아세틸렌으로부터 합성된다. 의약품, 식품 등 특수한 용도로 사용되는 소량의 숙신산만이 미생물을 이용한 발효 공정에 의해 생산되고 있다.
일반적으로 화학적 합성 공정은 유해 물질을 다량 배출하고, 자원의 고갈 가능성이 높은 화석원료를 기초물질로 사용한다. 따라서, 종래 기술에 의하더라도, 숙신산을 효율적으로 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용한 숙신산 생산 방법이 요구된다.
일 양상은 모세포에서의 활성에 비하여 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 경로(pathway) 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 중 하나 이상의 활성이 증가되어 있는 유전적으로 조작된 박테리아 세포를 제공한다.
다른 양상은 모세포에서의 활성에 비하여 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 경로(pathway) 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 중 하나 이상을 코딩하는 유전자의 카피수가 증가되거나 그 발현이 증가되도록 변형된 것인 유전적으로 조작된 박테리아 세포를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 박테리아 세포를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 모세포에서의 활성에 비하여 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 경로의 세포에서의 활성 및 세포에서 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제(SSADH)의 활성 중 하나 이상의 활성이 증가되어 있는, 유전적으로 조작된 박테리아 세포로서, 상기 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 경로는 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드로 전환시키는 것을 촉매하는 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 (KGDC); 글루타메이트:숙시네이트 세미알데히드 트란스아미나제 (glutamate: succinate semialdehyde transaminase: GSST) 및 글루타메이트 데카르복실라제 (glutamate decarboxylase:GDC); 또는 이들의 조합을 포함하는 것이고, 상기 SSADH는 숙시닐 세미알데히드를 숙신산으로 전환시키는 것을 촉매하는 것인 세포를 제공한다.
상기 GSST는 4-아미노부타노에이트 (4-aminobutanoate)+ 2-옥수글루타레이트 (2-oxoglutarate) -> SSA+ 글루타메이트의 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 GSST는 EC 2.6.1.19에 속하는 효소일 수 있다. GSST는 대장균 유래의 gabT (서열번호 67) 또는 S. cerevisiae 유래의 것일 수 있다. GDC는 글루타메이트를 CO2와 4-아미노부타노에이트로 전환하는 것을 촉매하는 것일 수 있다. GDC는 EC 4.1.1.15에 속하는 것일 수 있다. GDC는 대장균 유래의 GDC alpha (서열번호 68) 또는 GDC beta (서열번호 69), 또는 S. cerevisiae 유래의 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 세포, 경로, 효소 또는 폴리펩티드의 "활성 증가 (increasein activity)" 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 그 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increasein activity)" 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 또한, 비교가능한 동일 타입의 세포, 경로, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 특정 변형을 갖지 않는 세포, 경로, 단백질, 또는 효소 (예, 원래, 또는 모 (parent) 또는 야생 (wild-type) 세포, 경로, 단백질 또는 효소)에 비하여, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 경로, 단백질, 또는 효소의 활성 수준을 나타낼 수 있다. 상기 비교가능한 세포는 상기 유전적으로 조작된 세포를 생산했던 특정 유전적 변이를 갖지 않는 변형되지 않은 모세포일 수 있다. 예를 들면, 상기 세포, 경로, 효소 또는 단백질의 활성은 변형되지 않은 세포, 경로, 효소 또는 단백질의 활성에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포, 경로, 효소 또는 단백질의 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 경로의 “활성 증가” 또는 “증가된 활성”은 그에 관계된 효소 또는 폴리펩티드의 활성의 증가에 의하여 야기된 것일 수 있다.
상기 효소 또는 폴리펩티드의 활성 증가는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 증가에 의하여 얻을 수 있다. 상기 발현 증가는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 세포 내 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 숙주 세포 게놈으로 도입 (integration)되는 등의 숙주 세포 내로 유전자가 도입되는 것을 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 경로, 효소 또는 폴리펩티드의 "활성의 증가" 또는 “증가된 활성”은 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 활성을 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
용어 "유전자 (gene)"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열(5'-non coding 서열)과 3'-비코딩 서열(3'-non coding 서열) 등의 조절(regulatory) 서열을 포함할 수 있다.
"이종성 (heterologous)"은 천연(native)이 아닌 외인성(foreign)을 의미한다.
"분비"는 물질이 세포 내부에서 주변세포질공간 (periplasmic space)이나 세포 외 환경으로 이동되는 것을 의미한다.
"세포", "균주", 또는 "미생물"은 교체 사용이 가능한 것으로서, 박테리아를 포함한다.
세포, 경로, 효소 또는 폴리펩티드 (예, 변형된 또는 유전적으로 조작된 세포, 경로, 효소 또는 폴리펩티드)의 "활성의 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성(decreased activity)"은, 비교가능한 세포, 경로, 효소 또는 폴리펩티드 (예, 상기한 변형 또는 유전적 조작을 포함하지 않은 동일 종류의 세포, 경로, 효소 또는 폴리펩티드)에서 측정된 활성 수준 보다 낮은 활성 수준, 또는 활성이 없는 것을 나타낸다. 예를 들면, 변형된 또는 유전적으로 조작된 세포, 경로, 효소 또는 폴리펩티드의 활성은 변형되지 않은 동일한 타입의 세포, 경로, 효소 또는 폴리펩티드에 비하여, 약 20%이상, 약 30%이상, 약 40%이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 상기 감소된 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 활성의 감소는 효소 또는 폴리펩티드 유전자가 돌연변이 되어 발현되더라도 활성이 없거나 감소된 경우, 또는, 변형되지 않은 세포에서 동일한 타입의 유전자의 발현을 포함한, 변형되지 않은 동일 타입의 효소 또는 폴리펩티드의 발현에 비하여 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 발현량이 감소된 경우를 포함한다.
상기 효소의 활성이 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴에 의한 것일 수 있다. 유전자의 "제거 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것을 말한다. 상기 유전자의 제거 또는 파괴는 상동재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자(paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 파괴될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
상기 세포는 숙신산 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 세포는, 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드 (SSA)로 전환시키는 경로 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 중 하나 이상의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작됨으로써, 모세포 (예, 조작되지 않은 세포)에 비하여 증가된 숙신산 생산능을 가질 수 있다.
상기 세포는 호기, 혐기 또는 미호기성 조건에서 숙신산 생산능을 가질 수 있다. 미호기성 (microaerobic) 조건은 대기 중 산소 농도 보다 낮은 수준의 산소가 배지 중으로 용해되는 배양 조건을 의미할 수 있다. 상기 낮은 수준의 산소는 대기 중 산소 농도의 0.1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 2% 내지 8%, 3% 내지 7%, 또는 4% 내지 6%일 수 있다. 상기 세포는 환원적 TCA 회로뿐 아니라, 산화적 TCA 회로를 통해서도 숙신산을 생성할 수 있다. 상기 효소의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 세포는 산화적 TCA 회로를 통한 숙신산 생산이 효율적으로 이루어짐으로써, 조작되지 않은 세포에 비하여 증가된 숙신산 생산능을 가질 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 세포는 예를 들면, 미호기성 조건에서 산화적 TCA 회로를 통한 숙신산 생산이 효율적으로 이루어짐으로써, 조작되지 않은 세포에 비하여 증가된 숙신산 생산능을 가질 수 있다.
상기 세포는 코리네박테리움 속일 수 있다. 상기 세포는 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 또는 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)일 수 있다.
상기 활성의 증가는 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드로 전환시키는 경로에 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 카피 수 증가에 의한 것일 수 있다. 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드로 전환시키는 경로에 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 알파-케토글루타레이트(AKG)를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 것을 촉매하는 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 (KGDC)를 코딩하는 유전자; GSST를 코딩하는 유전자, GDC를 코딩하는 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 유전적으로 조작된 세포에서의 "카피 수 증가"는 모세포( 예, 조작되지 않은 세포)에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 카피 수의 증가는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있다. 상기 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 염색체에 통합되지 않은 임시적(transient) 도입 또는 염색체에 삽입된 도입일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 또는 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 염색체로 통합됨으로써 이루어질 수 있다. 상기 유전자는 단백질을 코딩하는 서열 외에 조절 서열을 포함할 수 있다. 상기 유전자는 내재적 유전자 또는 외인성 유전자일 수 있다.
또한, 상기 활성의 증가는 상기 유전자들 중 하나 이상의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 상기 유전자 발현을 위한 프로모터 서열 또는 전사 종결자 서열일 수 있다. 상기 프로모터는 P180 프로모터, 또는 P45 프로모터일 수 있다. 상기 전사 종결자는 대장균 유래의 rrnBR 종결자일 수 있다. 상기 변형은 내재적 프로모터 또는 종결자를 외인성 프로모터 또는 종결자로 치환하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열(adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.
또한, 상기 활성의 증가는 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드로 전환시키는 경로에 사용되는 폴리펩티드 및/또는 그 유전자 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 및/또는 그 유전자 중 하나 이상의 돌연변이에 의한 변형에 의해 유발되는 것일 수 있다. 상기 변형은 단백질 코딩 영역에서 뉴클레오티드 서열의 제거, 삽입, 치환, 부가 또는 그 조합에 의해 생성된 아미노산 서열의 변형일 수 있다. 상기 변형은 예를 들면, 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드로 전환시키는 경로 효소 또는 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 효소의 기질 친화력을 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 변형에 의해 효소 자체의 비활성(specific acitivity)이 증가될 수 있다.
상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제는 EC.4.1.1.71로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제는 예를 들면, 코리네박테리움 속, 로도코쿠스 속(Rhodococcus sp.), 미코박테리움 속, 또는 에세리키아 (Escherichia) 속 유래일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자는 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 칼누에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 에피션스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium ulcerans), 코리네박테리움 할로토레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 슈도튜버쿨로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis), 코리네박테리움 두룸(Corynebacterium durum), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 로도코쿠스 피리디니보란스(Rhodococcus pyridinivorans), 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 미코박테리움 아베세수스(Mycobacterium abscessus), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 대장균(Escherichia coli), 에세리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 또는 그 조합 유래일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자는 예를 들면, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자는 예를 들면, 서열번호 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을을 가질 수 있다.
상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제(SSADH)는 EC 1.2.1.24, EC 1.2.1.79 또는 EC.1.2.1.16으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제는 NAD+, NADP+, 또는 둘다 의존성일 수 있다. 상기 SSADH는 CoA 비의존성 (CoA independent)일 수 있다. 상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제는 예를 들면, 코리네박테리움 속, 로도코쿠스 속, 고르도니아 속(Gordonia sp.), 미코박테리움 속, 안트로박터 속, 또는 에세리카아 속 유래일 수 있다. 상기 SSADH는 대장균 유래의 gabD1, gabD2 또는 gabD3일 수 있다. 상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 예를 들면, 서열번호 5 (gabD2), 63 (gabD1), 및 64 (gabD3)의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 예를 들면, 서열번호 6 (gabD2), 65 (gabD1), 및 66 (gabD3)의 뉴클레오티드 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
상기 세포는 숙신산을 숙시닐-CoA로 전환시키는 것을 촉매하는 숙시닐-CoA 신테타제(succinyl-CoA synthetase, SucCD)를 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다. 상기 숙시닐-CoA 신테타제는 EC.6.2.1.5로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 숙시닐-CoA 신테타제를 코딩하는 유전자는 예를 들면, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 L-락테이트 데히드로게나제(lactate dehydrogenase, LDH)를 코딩하는 유전자, 피루베이트를 아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 옥시다제(pyruvate oxidase, PoxB)를 코딩하는 유전자, 아세틸-CoA를 아세틸 포스페이트로 전환시키는 것을 촉매하는 포스포트란스아세틸라제(phosphotransacetylase, PTA)를 코딩하는 유전자, 아세틸 포스페이트를 아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 아세테이트 키나제(acetate kinase, AckA)를 코딩하는 유전자, 아세테이트를 아세틸 CoA로 전환시키는 것을 촉매하는 아세테이트 CoA 트란스퍼라제(acetate coenzyme A transferase, ActA)를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다. 상기 LDH는 EC.1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 LDH는 예를 들면, 서열번호 9의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 PoxB는 EC.1.2.5.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 PoxB는 예를 들면, 서열번호 10의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 PTA는 EC.2.3.1.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 PTA는 예를 들면, 서열번호 11의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 AckA는 EC.2.7.2.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 AckA는 예를 들면, 서열번호 12의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 ActA는 EC.2.8.3.9로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 ActA는 예를 들면, 서열번호 13의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 유전자 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄되면 세포 내의, 피루베이트를 락테이트로 전환시키는 활성, 피루베이트를 아세테이트로 전환시키는 활성 또는 그 조합이 상실되거나 감소될 수 있다.
용어 "불활성화(inactivation)" 또는 "불활성화된(inactivated)"란 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감쇄 (attenuation)" 또는 "감쇄된 (attenuated)"는 유전자의 발현이 야생 균주, 조작되지 않은 균주, 또는 모 균주에서 동일 타입 유전자의 발현 수준에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 감소되어 있는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 유전적 변형, 예를 들면, 상기 유전자의 일부 또는 전부의 치환, 부가, 또는 결실에 의하여 야기될 수 있다. 상기 변형은 상동 재조합에 의해 야기될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 예를 들면, 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내재적 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선발 마커에 의해 선발함으로써 이루어질 수 있다.
상기 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase, PYC) 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 활성의 증가는 예를 들면, 피루베이트 카르복실라제의 변이에 의하여 비활성이 증가된 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자의 도입에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 변이는 피루베이트 카르복실라제의 아미노산 서열의 치환, 부가, 결실 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 치환은 예를 들면, 서열번호 14의 458번째 프롤린의 세린으로의 치환일 수 있다. 상기 세포는 예를 들면, 무작위적인 돌연변이 또는 유전공학적인 조작을 통해 증가된 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 세포의 일 구체예는, 조작되지 않은 세포에 비하여 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 경로에 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 카피수가 증가되거나 상기 유전자의 발현이 증가되도록 유전적으로 조작된 박테리아 세포로서, 상기 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 경로는 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드로 전환시키는 것을 촉매하는 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제(KGDC); GSST 및 GDC; 또는 이들의 조합을 포함하는 것이고, 상기 숙시닐 세미알데히드로 데히드로게나제는 숙시닐 세미알데히드를 숙신산으로 전환시키는 것을 촉매하는 것인 세포일 수 있다. 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 경로를 코딩하는 유전자는 알파-케토글루타레이트를 숙신산 세미알데히드로 전환시키는 것을 촉매하는 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제(KGDC)를 코딩하는 유전자; GSST 를 코딩하는 유전자 및 GDC 를 코딩하는 유전자; 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 세포는 코리네박테리움 속일 수 있다. 상기 세포는 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 써모아미노게네스, 브레비박테리움 플라붐 또는 브레비박테리움 락토페르멘툼일 수 있다.
상기 카피 수 증가는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 도입에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 도입되는 유전자는 내재적 유전자 또는 외인성 유전자일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자는 EC.4.1.1.71로 분류되는 효소를 코딩하는 것일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자는 코리네박테리움 속 또는 대장균을 포함한 에세리키아 속 유래의 유전자일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 EC.1.2.1.16으로 분류되는 효소를 코딩하는 것일 수 있다. 상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 예를 들면, 코리네박테리움 속, 로도코쿠스 속, 고르도니아 속, 미코박테리움 속, 안트로박터 속, 또는 에세리카아 속 유래의 유전자일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 5 (gabD2), 63 (gabD1), 및 64 (gabD3) 의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 6 (gabD2), 65 (gabD1), 및 66 (gabD3)의 뉴클레오티드 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 발현 증가는 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것일 수 있다. 상기 조절 서열에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 세포는 숙시닐-CoA 신테타제를 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다. 상기 세포는 L-락테이트 데히드로게나제 유전자, 피루베이트 옥시다제 유전자, 포스포트란스아세틸라제 유전자, 아세테이트 키나제 유전자, 아세테이트 CoA 트란스퍼라제 유전자, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다. 상기 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 카르복실라제 활성이 증가된 것일 수 있다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
또 다른 양상은, 상기에서 설명한 유전적으로 조작된 박테리아 세포를 배양하여 숙신산을 생산하는 단계; 및 상기 배양물로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는, 숙신산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 유전적으로 조작된 세포에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 예를 들면, 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기 세포는 호기, 미호기, 또는 혐기 조건에서 배양될 수 있다. 상기 미호기 조건은 대기 중 산소의 수준보다 낮은 수준의 산소가 배지 중으로 용해되는 배양 조건을 의미한다. 상기 낮은 수준의 산소는 예를 들면, 0.1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 2% 내지 8%, 3% 내지 7%, 또는 4 내지 6%일 수 있다. 또한, 미호기 조건은 예를 들면, 배지 중의 용존 산소 농도가 0.9 ppm에서 3.6 ppm, 예를 들면, 0.9 ppm에서 2.6 ppm, 0.9 ppm에서 1.6 ppm, 1.0 ppm에서 3.6 ppm, 2.0 ppm에서 3.6 ppm,또는 3.0 ppm에서 3.6 ppm인 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들면, 20℃ 내지 45℃ 또는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 목적 숙신산이 원하는 만큼 얻어질 때까지 지속될 수 있다.
상기 숙신산의 회수는 통상적으로 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 또는 그 조합에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 배양물을 원심분리하여 바이오매스를 제거하고, 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
다른 양상은 박테리아 세포에 의한 숙신산 생산을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 박테리아 세포에서 SSADH, KGDC, GSST, GDC, 또는 그 조합의 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 방법은 박테리아 세포에서 SSADH, KGDC, GSST, GDC, 또는 그 조합을 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 숙시닐-CoA 신테타제를 코딩하는 유전자는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 박테리아 세포에 의한 숙신산 생산을 개선하는 방법에서, 설명되지 않은 용어로서, 상기에서 설명한 "유전적으로 조작된 박테리아 세포" 및 그를 이용하여 "숙신산을 생산하는 방법"에서 언급된 것과 동일한 용어는 해당 부분분에서 설명한 바와 동일한 의미로서 사용되며, 반복을 회피하기 위하여 설명을 생략한다.
일 양상에 따른 세포를 이용하여 숙신산을 효율적으로 생산할 수 있다.
다른 양상에 따른 숙신산 제조방법을 통해 숙신산을 효율적으로 생산할 수 있다.
다른 양상에 따른 박테리아 세포에 의한 숙신산 생산을 개선하는 방법에 의하면, 박테리아 세포에 의한 숙신산 생산을 효율적으로 개선할 수 있다.
도 1은 pGSK+ 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 pGS-Term 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 3은 pGS-EX4 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 4는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 유전자의 도입에 사용된 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 5는 일 구체예에 따른 박테리아 세포의 숙신산 생산성를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 락테이트 및 아세테이트 합성 경로를 제거한 균주의 제조
(1) 치환 벡터( replacement vector )의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum, CGL) ATCC 13032의 L-락테이트 데히드로게나제(ldh), 피루베이트 옥시다제(poxB), 포스포트란스아세틸라제(pta), 아세테이트 키나제(ackA), 및 아세테이트 CoA 트란스퍼라제(actA) 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다. 상기 유전자들을 불활성화시키기 위한 벡터로 pK19 mobsacB (ATCC 87098) 벡터를 사용하였으며, 재조합에 사용될 두 상동 부위는 주형으로 CGL ATCC 13032의 게놈 DNA를 사용한 PCR을 통한 증폭에 의하여 얻었다.
ldh 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류(upstream) 및 하류(downstream) 부위로서, 각각 ldhA_5'_HindIII(서열번호 15) 및 ldhA_up_3'_XhoI(서열번호 16)의 프라이머 세트와, ldhA_dn_5'_XhoI(서열번호 17) 및 ldhA_3'_EcoRI(서열번호 18)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. PCR 증폭은 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장단계를 30회 반복함으로써 수행하였다. 이하 모든 PCR 증폭은 이와 동일한 조건으로 수행하였다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 EcoRI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δldh 벡터를 제작하였다.
poxB 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, 각각 poxB 5' H3(서열번호 19) 및 DpoxB_up 3'(서열번호 20)의 프라이머 세트와, DpoxB_dn 5'(서열번호 21) 및 poxB 3' E1(서열번호 22)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 EcoRI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_ΔpoxB 벡터를 제작하였다.
pta-ackA 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, 각각 pta 5' H3(서열번호 23) 및 Dpta_up_R1 3'(서열번호 24)의 프라이머 세트와, DackA_dn_R1 5'(서열번호 25) 및 ackA 3' Xb(서열번호 26)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 XbaI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δpta_ackA 벡터를 제작하였다.
actA 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, 각각 actA 5' Xb(서열번호 27) 및 DactA_up_R4 3'(서열번호 28)의 프라이머 세트와, DactA_dn_R4 5'(서열번호 29) 및 actA 3' H3(서열번호 30)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 XbaI 및 HindIII 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_ΔactA 벡터를 제작하였다.
(2) CGL (Δ ldh , Δ poxB , Δ pta - ackA , Δ actA ) 제조
C. glutamicum ATCC13032에 전기천공(electroporation)을 통해 상기 치환 벡터들을 함께 도입하였다. 도입된 균주를 25 ㎍/ml의 카나마이신을 함유한 LBHIS 아가 플레이트(agar plate)에 도말하여 30℃에서 배양하였다. LBHIS 아가 플레이트는 Difco LBTM broth 25 g/L, 뇌-심장 침출배지(brain-heart infusion broth) 18.5 g/L, D-솔비톨(sorbitol) 91 g/L, 및 아가 15 g/L를 포함한다. 이하 LBHIS 배지의 조성은 이와 동일하다. 형성된 콜로니를 brain heart infusion powder 37 g/L 및 D-솔비톨 91 g/L를 포함하는 BHIS 배지(pH 7.0)에서 30℃에서 배양한 후, 배양액을 LB/Suc10 아가 플레이트에 도말하고 30℃에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. LB/Suc10 아가 플레이트는 Difco LBTM broth 25 g/L, 아가 15 g/L 및 수크로스 100 g/L를 포함한다.
선별된 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 유전자들의 결손 여부를 확인하였다. ldh 유전자의 결손 확인을 위해 ldhA_5'_HindIII 및 ldhA_3'_EcoRI의 프라이머 세트를 사용하였고, poxB 유전자의 결손 확인을 위해 poxB_up_for(서열번호 31) 및 poxB_dn_rev(서열번호 32)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 통해 유전자 결손 여부를 확인하였다. 또한, pta-ackA 유전자의 결손 확인을 위해 pta_up_for(서열번호 33) 및 ackA_dn_rev(서열번호 34)의 프라이머 세트를 사용하였고, actA 유전자의 결손 확인을 위해 actA_up_for(서열번호 35) 및 actA_dn_rev(서열번호 36)의 프라이머 세트를 각각 사용하여 PCR을 통해 유전자 결손 여부를 확인하였다.
실시예 2. CGL (Δ ldh , Δ poxB , Δ pta - ackA , Δ actA , pyc P458S ) 제조
C. glutamicum ATCC 13032의 피루베이트 카르복실라제 (서열번호 14)의 458번 프롤린이 세린으로 치환된 변이체(이하 'PYCP458S'라 함)를 제조하였다.
상기 변이체는 중첩 연장(overlap extension) PCR 방법에 의해 PYC 아미노산 서열 중 458번 프롤린을 암호화하는 코돈 CCG를 TCG로 치환하여 제조하였다.
CGL ATCC 13032의 게놈 DNA로부터, pyc-F1(서열번호 37) 및 pyc-R1(서열번호 38)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 산물을 얻고, pyc-F2(서열번호 39) 및 pyc-R2(서열번호 40)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 두 PCR 산물을 주형으로 pyc-F1 및 pyc-R2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 산물을 얻었다. 최종적으로 얻어진 PCR 산물을 pK19mobsacB 벡터의 XbaI 제한효소 위치로 클로닝하여 pK19mobsacB-pyc* 벡터를 제작하였다.
실시예 1의 CGL (Δldh, ΔpoxB, Δpta-ackA, ΔactA)에 상기 pK19mobsacB-pyc* 벡터를 도입하였다. pyc-F1 및 pyc-R2의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 수행하고, PCR 산물을 서열분석하여 pyc 유전자의 치환 여부를 확인하였다.
실시예 3: 알파- 케토글루타레이트 데카르복실라제 ( KGDC ) 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 ( SSADH ) 발현 균주의 제조
(1) pGS _ Ptuf :: sucA : NC히463의 제작
대장균의 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 (KGDC) 유전자 (sucA, 서열번호 4) 및 코리네박테리움 글루타미쿰의 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 유전자 (NC히463, 서열번호 65)를 tuf 프로모터 하에서 발현시키기 위하여, 다음과 같이 pGS_Ptuf::sucA:NC히463 벡터를 제작하였다.
1) pGS _ EX4 의 제작
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, cat.# M0530)를 사용하여 다음 4개의 PCR 산물을 얻었다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 프로모터 스크리닝용 벡터인 pET2(GenBank accession number: AJ885178.1)를 주형으로 하여 MD-616(서열번호 41) 및 MD-618(서열번호 42) 프라이머 세트와, MD-615(서열번호 43) 및 MD-617(서열번호 44) 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 또한, pEGFP-C1(Clontech)를 주형으로 MD-619(서열번호 45) 및 MD-620(서열번호 46) 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였고, pBluescriptII SK+를 주형으로 LacZa-NR(서열번호 47) 및 MD-404(서열번호 48) 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR 산물인 3010 bp, 854 bp, 809 bp, 및 385 bp 단편을 In-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit (Clontech, cat.# 639690) 방법에 따라 원형의 플라스미드로 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 One Shot TOP10 Chemically Competent Cell (Invitrogen, cat.# C4040-06)에 형질도입하고 25 mg/L 카나마이신이 포함된 LB배지에서 배양한 후 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 벡터를 회수하여 전장 서열 분석을 통해 벡터 서열을 확인하였다. 상기 벡터를 pGSK+(도 1)로 명명하였다.
또한, 상기 pGSK+ 벡터에 C.glutamicum gltA (NCgl0795)의 3'-UTR 및 E.coli rrnB의 rho-독립성 전사종결인자(rho-independent terminator)를 다음과 같은 방법으로 삽입하였다. C.glutamicum (ATCC13032) 게놈 DNA를 주형으로 MD-627(서열번호 49) 및 MD-628(서열번호 50)의 프라이머 세트로 PCR 하여 gltA 3'-UTR의 108 bp PCR 단편을 얻었다. 또한, E.coli (MG1655) 게놈 DNA을 주형으로 MD-629(서열번호 51) 및 MD-630(서열번호 52) 프라이머 세트를 사용하여 rrnB 전사종결인자 292 bp PCR 산물을 얻었다. 상기 2개의 증폭된 단편을 In-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit (Clontech, cat.# 639690)를 사용하여 SacI으로 절단된 pGSK+에 삽입하였다. 클로닝된 벡터를 One Shot TOP10 Chemically Competent Cell (Invitrogen, cat.# C4040-06)에 형질도입하고 25 mg/L 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 배양한 후 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 벡터를 회수하여 전장 서열 분석을 통해 벡터 서열을 확인하였다. 상기 벡터를 pGS-Term(도 2)으로 명명하였다.
또한, C.glutamicum ATCC 13032의 게놈 DNA를 주형으로 하고, Tuf-F(서열번호 53) 및 Tuf-R(서열번호 54)의 프라이머 세트를 사용하여 Ptuf 단편을 얻었다. Ptuf는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 tuf 유전자(NCgl0480)의 프로모터이다. 얻어진 Ptuf 단편을 상기 pGS-Term 벡터의 KpnI 위치에 In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech 639648)를 이용하여 클로닝하여 pGS_EX4 벡터를 얻었다(도 3).
2) pGS _ Ptuf :: sucA : gabD1 의 제작
대장균 K12에 속하는 MG1655의 게놈 DNA를 주형으로 하고, sucA-F(서열번호 55) 및 sucA-R(서열번호 56)의 프라이머 세트를 사용하여 sucA 유전자를 증폭하였다. 또한, C.glutamicum ATCC 13032의 게놈 DNA를 주형으로 하여 NCgl0463_RBS-F(서열번호 57) 및 NCgl0463-R (서열번호 58)의 프라이머 세트를 이용하여 gabD1 유전자 (NCgl0463)를 증폭하였다. 각 증폭 산물을 pGS_EX4 벡터의 HindIII 및 XbaI 제한효소 위치로 클로닝하여 pGS_Ptuf::sucA:NCgl0463 벡터를 얻었다(도 4).
도 4는 pGS_Ptuf::sucA:NCgl0463 벡터의 개열지도를 나타낸다.
(2) CGL (Δ ldh , Δ poxB , Δ pta - ackA , Δ actA , pyc P458S , pGS _ Ptuf :: sucA : NC 히4 63 ) 제조
벡터 pGS_Ptuf::sucA:NCgl0463을 실시예 2에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Δldh, ΔpoxB, Δpta-ackA, ΔactA, pycP458S) 균주에 전기천공을 통해 도입하였다. 25 ㎍/ml의 카나마이신을 함유한 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 카나마이신 내성을 갖는 균주를 선별함으로써, CGL (Δldh, ΔpoxB, Δpta-ackA, ΔactA, pycP458S, pGS_Ptuf::sucA:NCgl0463)을 얻었다.
SucA-RTF(서열번호 59) 및 SucA-RTR(서열번호 60)의 프라이머 세트와, NCgl0463-RTF(서열번호 61) 및 NCgl0463-RTR(서열번호 62)를 이용한 RT-PCR을 통하여 sucA 및 NCgl0463의 발현 여부를 확인하였다. RT-PCR은 95℃에서 15초간 변성, 60℃에서 15초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장단계를 40회 반복함으로써 수행하였다
그 결과, sucA 및 NCgl0463가 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 실시예 3 균주의 배양 및 숙신산의 생산
CGL (Δldh, ΔpoxB, Δpta-ackA, ΔactA, pycP458S, pGS_Ptuf::sucA: NCgl0463)의 숙신산 생산성을 평가하였다.
종 배양 (seed culture)을 위해 각 균주를 5g/L의 효모 추출물, 10g/L의 육류 추출물 (beef extract), 10 g/L의 폴리펩톤, 5 g/L의 NaCl 및 20 g/L의 아가 (agar)가 포함된 활성 플레이트에 도말(streaking)한 후, 30℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 BHIS 배지 (뇌-심장 침출배지 37 g/L, D-솔비톨 91 g/L, pH 7.0) 5 ml에 접종하고 30℃에서 OD600 값이 5.0가 될 때까지 배양하였다.
얻어진 배양액 1 ml을 25 ml의 BHIS배지가 들어있는 250 ml 플라스크에 접종하였다. 배양액을 원심분리하여 상등액을 버리고 미생물만 수거하여 CGXII 최소배지로 세척하였다. CGXII 배지는 (NH4)2SO4 (20 g/L), 우레아 (5 g/L), KH2PO4 (1 g/L), K2HPO4 (1 g/L), MgSO4·7H2O (0.25 g/L), CaCl2 (10 mg/L), FeSO4·7H2O (10 mg/L), MnSO4·H2O (0.1 mg/L), ZnSO4·7H2O (1 mg/L), CuSO4·5H2O(0.2 mg/L), NiCl2·6H2O (20 mg/L), 비오틴 (0.2 mg/L), 3-모르폴리노프로판설폰산(MOPS) (42 g/L) 및 4%(w/v) 포도당을 포함한다.
그 후, 세포 농도가 OD = 20이 될 때까지, 최소배지 CGXII 20 ml이 들어있는, 뚜껑을 씌우고 밀폐시키지 않은 1-well 플레이트에 세척된 배양 세포를 넣었다. 상기 플레이트를 산소 농도가 제어되는 인큐베이터(STX 40; Liconic instruments) 내에 두고 배지와 접촉하는 산소 농도를 5%로 유지하면서 16시간 동안 30℃에서 배양하였다. 이 경우, 배지 중 용존 산소 농도는 1.0 ppm이었다. 시료를 채취하여 원심분리한 후, 상층액의 숙신산 및 글루코스의 농도를 HPLC로 분석하였다. 표 1은 분석 결과를 나타낸 표이다.
균주 포도당 소모량 (g/L) 숙신산 생산량(g/L)
S006/pGSEx4 39.9±0.6 0.36±0.08
S006/Ptuf::sucA:gabD1 60.7±0.3 1.06±0.24
표 1에서, S006/pGSEx4는 ATCC 13032 (Δldh, ΔpoxB, Δpta-ackA, ΔactA, pycP458S) 균주에 pGSEx4를 도입한 대조군 균주를 나타내고, S006/Ptuf::sucA:gabD1는 동일한 균주에 Ptuf::sucA:gabD1 벡터를 도입한 실험군 균주를 나타낸다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 pGS_Ptuf::sucA:gabD1가 도입된 균주는 대조군인 pGS_EX4가 도입된 균주에 비하여 숙신산 생산량이 약 3배 이상 증가하였다. 따라서, 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제의 과발현에 의해, 미호기 조건에서 숙신산 생산성이 크게 향상될 수 있음을 확인하였다.
<110> SAMSUNG ELECTORNICS CO., LTD. <120> Bacteria cell having enhanced succinic acid production and a method for producing the succinic acid using the same <130> PN106232KR <160> 69 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 543 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Met Ser Ser Thr Pro Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ala Val Ile Asp Ser 1 5 10 15 Leu Ala Pro His Val Thr Asp Val Val Leu Cys Pro Gly Ser Arg Asn 20 25 30 Ser Pro Leu Ser Leu Glu Leu Leu Ala Arg Gln Asp Leu Arg Val His 35 40 45 Val Arg Ile Asp Glu Arg Ser Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ser Leu Ala 50 55 60 Arg Thr Gln Ala Arg Pro Val Ala Val Val Met Thr Ser Gly Thr Ala 65 70 75 80 Val Ala Asn Cys Leu Pro Ala Val Ala Glu Ala Ala His Ala His Ile 85 90 95 Pro Leu Ile Val Leu Ser Ala Asp Arg Pro Ala His Leu Val Gly Thr 100 105 110 Gly Ala Ser Gln Thr Ile Asn Gln Thr Gly Ile Phe Gly Asp Leu Ala 115 120 125 Pro Thr Val Gly Ile Thr Glu Leu Asp Gln Val Ala Gln Ile Ala Glu 130 135 140 Ser Leu Ala Gln Gly Ala Ser Gln Ile Pro Arg His Phe Asn Leu Ala 145 150 155 160 Leu Asp Val Pro Leu Val Ala Pro Glu Leu Pro Glu Leu His Gly Glu 165 170 175 Ala Val Gly Ala Ser Trp Thr His Arg Trp Ile Asn His Gly Glu Val 180 185 190 Thr Val Asp Leu Gly Glu His Thr Leu Val Ile Ala Gly Asp Glu Ala 195 200 205 Trp Glu Val Glu Gly Leu Glu Asp Val Pro Thr Ile Ala Glu Pro Thr 210 215 220 Ala Pro Lys Pro Tyr Asn Pro Val His Pro Leu Ala Ala Glu Ile Leu 225 230 235 240 Leu Lys Glu Gln Val Ser Ala Glu Gly Tyr Val Val Asn Thr Arg Pro 245 250 255 Asp His Val Ile Val Val Gly His Pro Thr Leu His Arg Gly Val Leu 260 265 270 Lys Leu Met Ser Asp Pro Gly Ile Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg Thr 275 280 285 Asp Ile Ile Thr Asp Pro Gly Arg His Ala Asp Gln Val Gly Ser Thr 290 295 300 Val Lys Val Thr Gly Thr Gln Glu Lys Gln Trp Leu Lys Ile Cys Ser 305 310 315 320 Ala Ala Ser Glu Leu Ala Ala Asp Gly Val Arg Asp Val Leu Asp Asn 325 330 335 Gln Glu Phe Gly Phe Thr Gly Leu His Val Ala Ala Ala Val Ala Asp 340 345 350 Thr Leu Gly Thr Gly Asp Thr Leu Phe Ala Ala Ala Ser Asn Ser Ile 355 360 365 Arg Asp Leu Ser Leu Val Gly Met Pro Phe Asp Gly Val Asp Thr Phe 370 375 380 Ser Pro Arg Gly Val Ala Gly Ile Asp Gly Ser Val Ala Gln Ala Ile 385 390 395 400 Gly Thr Ser Leu Ala Val Gln Ser Arg His Pro Asp Glu Ile Arg Ala 405 410 415 Pro Arg Thr Val Ala Leu Leu Gly Asp Leu Ser Phe Leu His Asp Ile 420 425 430 Gly Gly Leu Leu Ile Gly Pro Asp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Leu Thr 435 440 445 Ile Val Val Ser Asn Asp Asn Gly Gly Gly Ile Phe Glu Leu Leu Glu 450 455 460 Thr Gly Ala Asp Gly Leu Arg Pro Asn Phe Glu Arg Ala Phe Gly Thr 465 470 475 480 Pro His Asp Ala Ser Ile Ala Asp Leu Cys Ala Gly Tyr Gly Ile Glu 485 490 495 His Gln Val Val Asp Asn Leu Gln Asp Leu Ile Ile Ala Leu Val Asp 500 505 510 Thr Thr Glu Val Ser Gly Phe Thr Ile Ile Glu Ala Ser Thr Val Arg 515 520 525 Asp Thr Arg Arg Ala Gln Gln Gln Ala Leu Met Asp Thr Val His 530 535 540 <210> 2 <211> 933 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Gln Asn Ser Ala Leu Lys Ala Trp Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Asn Gln Ser Trp Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr 20 25 30 Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Asn Trp Arg Ser Thr Phe Gln Gln Leu 35 40 45 Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Asp Gln Phe His Ser Gln Thr Arg Glu 50 55 60 Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ile 65 70 75 80 Ser Asp Pro Asp Thr Asn Val Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile 85 90 95 Asn Ala Tyr Arg Phe Arg Gly His Gln His Ala Asn Leu Asp Pro Leu 100 105 110 Gly Leu Trp Gln Gln Asp Lys Val Ala Asp Leu Asp Pro Ser Phe His 115 120 125 Asp Leu Thr Glu Ala Asp Phe Gln Glu Thr Phe Asn Val Gly Ser Phe 130 135 140 Ala Ser Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Gly Glu Leu Leu Glu Ala Leu 145 150 155 160 Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Pro Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Thr 165 170 175 Ser Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Arg 180 185 190 Ala Thr Phe Asn Ser Glu Glu Lys Lys Arg Phe Leu Ser Glu Leu Thr 195 200 205 Ala Ala Glu Gly Leu Glu Arg Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly Ala 210 215 220 Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ile Pro Met Leu Lys 225 230 235 240 Glu Met Ile Arg His Ala Gly Asn Ser Gly Thr Arg Glu Val Val Leu 245 250 255 Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Val Asn Val Leu Gly 260 265 270 Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ala Gly Lys His Lys Glu 275 280 285 His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp 290 295 300 Phe Gln Thr Asp Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro 305 310 315 320 Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala 325 330 335 Arg Leu Asp Arg Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile 340 345 350 Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Thr Gly Gln Gly Val Val Gln Glu 355 360 365 Thr Leu Asn Met Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val 370 375 380 Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu 385 390 395 400 Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gln 405 410 415 Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe 420 425 430 Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val 435 440 445 Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp 450 455 460 Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His 465 470 475 480 Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gln Glu Lys Val 485 490 495 Ala Thr Leu Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala 500 505 510 Leu Asp Ala Gly Asp Cys Val Val Ala Glu Trp Arg Pro Met Asn Met 515 520 525 His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Glu 530 535 540 Tyr Pro Asn Lys Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg 545 550 555 560 Ile Ser Thr Val Pro Glu Ala Val Glu Met Gln Ser Arg Val Ala Lys 565 570 575 Ile Tyr Gly Asp Arg Gln Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp 580 585 590 Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly 595 600 605 Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe 610 615 620 His Arg His Ala Val Ile His Asn Gln Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Thr 625 630 635 640 Pro Leu Gln His Ile His Asn Gly Gln Gly Ala Phe Arg Val Trp Asp 645 650 655 Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala 660 665 670 Thr Ala Glu Pro Arg Thr Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp 675 680 685 Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser Gly 690 695 700 Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro His 705 710 715 720 Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg 725 730 735 Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro Ser 740 745 750 Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg Gly 755 760 765 Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg His 770 775 780 Pro Leu Ala Val Ser Ser Leu Glu Glu Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu 785 790 795 800 Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Glu Leu Asp Pro Lys Gly Val Lys Arg 805 810 815 Val Val Met Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg 820 825 830 Arg Lys Asn Asn Gln His Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu 835 840 845 Tyr Pro Phe Pro His Lys Ala Met Gln Glu Val Leu Gln Gln Phe Ala 850 855 860 His Val Lys Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln Gly 865 870 875 880 Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Glu Val Ile Pro Phe Gly 885 890 895 Ala Ser Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala Val 900 905 910 Gly Tyr Met Ser Val His Gln Lys Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn Asp 915 920 925 Ala Leu Asn Val Glu 930 <210> 3 <211> 1632 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 atgtccagca cgccagctca agatcttgcc cgcgccgtta ttgattccct cgcaccacac 60 gtcactgacg tggtgttatg cccaggatcc aggaactcac cgttgtcgct tgagttgctg 120 gcgcggcagg atctgcgtgt ccatgtgcgt atcgacgagc gcagcgcctc atttttggcg 180 ctgtccctag cgcgtaccca ggcccggccg gtggctgtgg tgatgacctc cggcacggct 240 gtagctaact gcctgcctgc tgttgctgaa gctgcgcatg cccatatccc gttgattgtg 300 ctctctgctg accgtcctgc acatttggtg ggaacggggg cgagccaaac gattaaccag 360 accggtattt ttggtgatct tgcaccgacg gtcggtatca ctgagctgga tcaggtagcg 420 cagattgctg aaagccttgc tcagggggct tcccagattc cgcgtcattt caatcttgca 480 cttgatgttc ctttggttgc tcctgaactg ccagagcttc atggtgaggc agttggagca 540 tcatggacgc atcgctggat caaccacggt gaggtgaccg tggacctggg ggagcacacc 600 ctcgtgattg ccggtgatga agcatgggaa gtggaagggc tggaagatgt gcccaccatc 660 gctgaaccta ctgcaccaaa gccttataat ccggtgcacc cactggctgc tgaaatcttg 720 ctgaaggagc aggtctccgc ggaaggctat gtggtaaaca ccaggcctga tcatgtgatc 780 gtggtgggac accccacgct gcaccgcgga gtgttgaagt tgatgtcaga tcctggcatt 840 aaattaactg tgctttcacg caccgatatc atcactgatc ccggccgcca tgccgatcag 900 gtgggcagca cagtgaaagt caccggcacc caggaaaagc agtggctaaa gatctgttcg 960 gcagcatcag aacttgcggc cgatggtgtg cgtgacgtcc tggacaacca agaattcggt 1020 ttcaccggcc tccatgttgc cgcagccgtg gcggatacct taggcaccgg cgatactctc 1080 tttgctgcag catccaactc aatccgtgac ctctccctgg tgggtatgcc ttttgatggc 1140 gtggatacct tctccccacg aggtgtcgca ggcattgatg gttctgttgc tcaagcaatc 1200 ggcacttcac ttgctgtgca gtcccgccac cccgatgaaa tccgcgcgcc acgcactgtg 1260 gcccttctgg gcgatctgtc gttccttcac gatattggcg gactgctcat cggccctgat 1320 gaaccacgcc 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ggagcactcc tccgcgcgtc tggaacgtta tctgcaactt 2220 tgcgctgagc aaaacatgca ggtttgcgta ccttctaccc cggcacaggt ttaccacatg 2280 ctgcgtcgtc aggcgttgcg cgggatgcgt cgtccactgg tcgtgatgtc gccgaaatcc 2340 ctgctgcgtc atccgctggc ggtatccagc ctcgaagaac tggcgaacgg caccttcctg 2400 ccagccatcg gtgaaatcga cgagcttgat ccgaagggcg tgaagcgcgt agtgatgtgt 2460 tctggtaagg tttattacga cctgctggaa caacgtcgta agaacaatca acacgatgtc 2520 gccattgtgc gtatcgagca actctacccg ttcccgcata aagcgatgca ggaagtgttg 2580 cagcagtttg ctcacgtcaa ggattttgtc tggtgccagg aagagccgct caaccagggc 2640 gcatggtact gcagccagca tcatttccgt gaagtgattc cgtttggggc ttctctgcgt 2700 tatgcaggcc gcccagcctc cgcctctccg gcggtagggt atatgtccgt tcaccagaaa 2760 cagcaacaag atctggttaa tgacgcgctg aacgtcgaat aa 2802 <210> 5 <211> 453 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 Met Ser Leu Thr Phe Pro Val Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ile 1 5 10 15 Thr Glu Leu Glu Asn His Asp Ser Thr Gln Trp Met Ser Ala Leu Ser 20 25 30 Asp Ala Val Ala Ala Gly Pro Ser Trp Ala Ala 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Corynebacterium glutamicum <400> 6 gtgtctttga ccttcccagt aatcaacccc agcgatggct ccaccatcac cgagctagaa 60 aaccacgatt ccacccagtg gatgtccgcg ctctctgatg cagttgcagc tggtccttca 120 tgggctgcga aaactccccg cgaaagatcc gtggtactca ccgcaatctt cgaagcactg 180 accgaacgcg cccaagaact tgcagagatc atccacctgg aagctggaaa atccgttgca 240 gaagctcttg gtgaagtcgc ttatggtgca gaatacttcc gttggtttgc ggaagaagca 300 gtgcgcctgc ccggccgcta cggacagtca ccttccggaa tcggtcacat cgccgtcacc 360 cgcgcacccg tgggaccagt gctggcgatc accccatgga atttccccat cgccatggcc 420 acccgcaaaa tcgccccagc cctggccgct ggttgccccg tgttggtgaa acctgcttcc 480 gaaaccccac tgaccatggt caaagtgggg gagatcatcg cctccgtctt tgataccttt 540 aatatcccgc agggcttggt ctcaatcatc accaccactc gagatgcaga gctatcggca 600 gaactcatgg ctgatcctcg cttggctaaa gtcaccttca ctggatcaac caacgtggga 660 cgcatcctgg tccgccaatc cgcggaccga ctgctgcgca cctccatgga actcggcgga 720 aatgcagctt ttgttatcga cgaagccgca gacctcgacg aagccgtatc cggtgccatc 780 gccgcaaaac tccgcaacgc cggccaagta tgcatcgcag ctaaccgttt cttggttcat 840 gaatcccgcg ctgccgaatt cacctcaaag ctggcgacag ccatgcagaa cactcccatt 900 gggccggtga tttctgcccg ccaacgcgac cggatcgcag cactagtgga tgaagccatc 960 accgacggcg cccgcctcat catcggtggg gaggtccccg acggctccgg cttcttctat 1020 ccagccacca tcttggccga tgtccctgca cagtcacgga ttgtgcatga ggaaatcttc 1080 ggacctgtgg ccaccattgc cactttcacc gacttggccg aaggcgttgc acaagcaaat 1140 tccaccgaat tcggcctcgc agcctacgga ttcagcaaca atgtgaaagc aacacagtac 1200 atggcggaac acttggaagc cggaatggtc ggaatcaaca gaggcgccat ctctgaccca 1260 gcagcacctt ttggcggcat cggacaatcc ggcttcggca gagaaggcgg aaccgaagga 1320 atcgaagaat atctctccgt gcgttacctc gctttgccgt ga 1362 <210> 7 <211> 294 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 7 Met Ser Ile Phe Leu Asn Ser Asp Ser Arg Ile Ile Ile Gln Gly Ile 1 5 10 15 Thr Gly Ser Glu Gly Ser Glu His Ala Arg Arg Ile Leu Ala Ser Gly 20 25 30 Ala Lys Leu Val Gly Gly Thr Asn Pro Arg Lys Ala Gly Gln Thr Ile 35 40 45 Leu Ile Asn Asp Thr Glu Leu Pro Val Phe Gly Thr Val Lys Glu Ala 50 55 60 Met 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Phe Gly Arg Arg Phe Ala Ala Arg Leu Glu Glu Gln 305 310 315 320 Val Leu Gly Asn Gly Leu Asp Glu Gly Val Thr Val Gly Pro Leu Val 325 330 335 Glu Glu Lys Ala Arg Asp Ser Val Ala Ser Leu Val Asp Ala Ala Val 340 345 350 Ala Glu Gly Ala Thr Val Leu Thr Gly Gly Lys Ala Gly Thr Gly Ala 355 360 365 Gly Tyr Phe Tyr Glu Pro Thr Val Leu Thr Gly Val Ser Thr Asp Ala 370 375 380 Ala Ile Leu Asn Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Ala Pro Ile Val Thr 385 390 395 400 Phe Gln Thr Glu Glu Glu Ala Leu Arg Leu Ala Asn Ser Thr Glu Tyr 405 410 415 Gly Leu Ala Ser Tyr Val Phe Thr Gln Asp Thr Ser Arg Ile Phe Arg 420 425 430 Val Ser Asp Gly Leu Glu Phe Gly Leu Val Gly Val Asn Ser Gly Val 435 440 445 Ile Ser Asn Ala Ala Ala Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Met 450 455 460 Gly Arg Glu Gly Gly Leu Glu Gly Ile Glu Glu Tyr Thr Ser Val Gln 465 470 475 480 Tyr Ile Gly Ile Arg Asp Pro Tyr Ala Gly 485 490 <210> 64 <211> 521 <212> PRT <213> E.coli gabD3 <400> 64 Met Ile Lys Arg Leu Pro Leu Gly Pro Leu Pro Lys Glu Leu His Gln 1 5 10 15 Thr Leu Leu Asp Leu Thr Ala Asn Ala Gln Asp Ala Ala Lys Val Glu 20 25 30 Val Ile Ala Pro Phe Thr Gly Glu Thr Leu Gly Phe Val Phe Asp Gly 35 40 45 Asp Glu Gln Asp Val Glu His Ala Phe Ala Leu Ser Arg Ala Ala Gln 50 55 60 Lys Lys Trp Val His Thr Thr Ala Val Glu Arg Lys Lys Ile Phe Leu 65 70 75 80 Lys Phe His Asp Leu Val Leu Lys Asn Arg Glu Leu Leu Met Asp Ile 85 90 95 Val Gln Leu Glu Thr Gly Lys Asn Arg Ala Ser Ala Ala Asp Glu Val 100 105 110 Leu Asp Val Ala Ile Thr Thr Arg Phe Tyr Ala Asn Asn Ala Gly Lys 115 120 125 Phe Leu Asn Asp Lys Lys Arg Pro Gly Ala Leu Pro Ile Ile Thr Lys 130 135 140 Asn Thr Gln Gln Tyr Val Pro Lys Gly Val Val Gly Gln Ile Thr Pro 145 150 155 160 Trp Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Gly Val Ser Asp Ala Val Pro Ala Leu 165 170 175 Leu Ala Gly Asn Ala Val Val Ala Lys Pro Asp Leu Ala Thr Pro Phe 180 185 190 Ser Cys Leu Ile Met Val His Leu Leu Ile Glu Ala Gly Leu Pro Arg 195 200 205 Asp Leu Met Gln Val Val Thr Gly Pro Gly Asp Ile Val Gly Gly Ala 210 215 220 Ile Ala Ala Gln Cys Asp Phe Leu Met Phe Thr Gly Ser Thr Ala Thr 225 230 235 240 Gly Arg Ile Leu Gly Arg Thr Met Gly Glu Arg Leu Val Gly Phe Ser 245 250 255 Ala Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Leu Ile Val Ala Lys Asp Ala Asp 260 265 270 Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Leu Pro Gln Ala Cys Phe Ser Asn Ser 275 280 285 Gly Gln Leu Cys Val Ser Thr Glu Arg Ile Tyr Val Glu Glu Asp Val 290 295 300 Tyr Glu Glu Val Ile Ala Arg Phe Ser Lys Ala Ala Lys Ala Met Ser 305 310 315 320 Ile Gly Ala Gly Phe Glu Trp Lys Tyr Glu Met Gly Ser Leu Ile Asn 325 330 335 Gln Ala Gln Leu Asp Arg Val Ser Thr Phe Val Asp Gln Ala Lys Ala 340 345 350 Ala Gly Ala Thr Val Leu Cys Gly Gly Lys Ser Arg Pro Asp Ile Gly 355 360 365 Pro Phe Phe Tyr Glu Pro Thr Val Leu Ala Asp Val Pro Glu Gly Thr 370 375 380 Pro Leu Leu Thr Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Val Phe Ile Glu Lys 385 390 395 400 Val Ala Thr Leu Glu Glu Ala Val Asp Lys Ala Asn Gly Thr Pro Tyr 405 410 415 Gly Leu Asn Ala Ser Val Phe Gly Ser Ser Glu Thr Gly Asn Leu Val 420 425 430 Ala Gly Gln Leu Glu Ala Gly Gly Ile Gly Ile Asn Asp Gly Tyr Ala 435 440 445 Ala Thr Trp Ala Ser Val Ser Thr Pro Leu Gly Gly Met Lys Gln Ser 450 455 460 Gly Leu Gly His Arg His Gly Ala Glu Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Glu 465 470 475 480 Ile Arg Asn Ile Ala Glu Gln Arg Trp Met Ser Met Arg Gly Pro Ala 485 490 495 Lys Met Pro Arg Lys Val Tyr Ser Asp Thr Val Ala Thr Ala Leu Lys 500 505 510 Leu Gly Lys Ile Phe Lys Val Leu Pro 515 520 <210> 65 <211> 1473 <212> DNA <213> E.coli gabD1 <400> 65 atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 60 tcctgggtgg aagcatccga cggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 120 acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca 180 tgcgctgttc aggccgagtg ggctaggatg ccagcgcgcg agcgttctaa tattttacgc 240 cgcggttttg agctcgtagc agaacgtgca gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa 300 atgggcaagc ctttggctga agctcgcggc gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc 360 tggttctctg aggaagcagt tcgtctgtat ggccgttacg gaaccacacc agaaggcaac 420 ttgcggatgc tgaccgccct caagccagtt ggcccgtgcc tcctgatcac cccatggaac 480 ttcccactag caatggctac ccgcaaggtc gcacctgcga tcgctgcagg ttgtgtcatg 540 gtgctcaagc cagctcgact taccccgctg acctcccagt attttgctca gaccatgctt 600 gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt 660 tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt cgtaaagtct ccttcaccgg ctccacccca 720 gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc gataaagttc tgcgcacctc catggaactt 780 ggtggcaacg cacctttcat tgtcttcgag gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt 840 gccatgggtg ccaaaatgcg caacatcggc gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttctta 900 gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc cgtcgcttcg ctgcccgcct tgaagagcaa 960 gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc accgtgggcc ccctggttga ggaaaaagca 1020 cgagacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc gccgtcgccg aaggtgccac cgtcctcacc 1080 ggcggcaagg ccggcacagg tgcaggctac ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt 1140 tcaacagatg cggctatcct gaacgaagag atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc 1200 ttccaaaccg aggaagaagc cctgcgtcta gccaactcca ccgaatacgg actggcctcc 1260 tatgtgttca cccaggacac ctcacgtatt ttccgcgtct ccgatggtct cgagttcggc 1320 ctagtgggcg tcaattccgg tgtcatctct aacgctgctg caccttttgg tggcgtaaaa 1380 caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc gaaggaatcg aggagtacac ctccgtgcag 1440 tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc tag 1473 <210> 66 <211> 1566 <212> DNA <213> E.coli gabD3 <400> 66 atgatcaaac gtcttccttt aggtccgctg cctaaagaac ttcatcagac tctgcttgat 60 ctgaccgcaa atgcccaaga tgcggcgaaa gtggaggtta tagcgccatt tactggcgag 120 accctcggat ttgtttttga tggtgatgag caagacgtcg agcatgcttt tgcactttca 180 agggcagccc agaaaaagtg ggtgcacacc acggcagtgg aacggaagaa gatcttcctg 240 aagtttcatg atctggtatt gaaaaaccgt gagctgctca tggacatcgt gcagttggaa 300 acaggcaaaa atcgagcatc ggctgccgat gaggtgttgg acgttgcgat caccacccgc 360 ttctacgcaa acaatgcagg aaagttttta aatgacaaga aacgccccgg cgcgcttccg 420 atcatcacga aaaacacaca acagtatgtg cccaagggag tggtcgggca gatcacgccg 480 tggaattacc ctttaacttt gggagtatct gatgctgttc cggcgctgct ggcaggaaac 540 gcagtggtgg ctaaacctga cctcgcgaca cctttctcct gcttgatcat ggtgcacctg 600 ctcattgaag ccggtctgcc gcgtgatttg atgcaggttg tcaccggccc tggcgatatt 660 gttggcggtg cgattgcagc tcagtgtgat ttcctcatgt tcactggatc cacggccacg 720 ggccggatct tgggtcggac aatgggtgag cgtttggtgg gtttctctgc ggaattaggc 780 ggaaagaacc ctcttattgt ggccaaggat gcagatctgg acaaggtgga agctgagctt 840 ccgcaggcgt gtttttccaa ctcggggcaa ttgtgtgtct ccactgaacg tatttatgtc 900 gaggaagacg tgtacgagga ggtgattgca cggtttagca aggcggcgaa agccatgtcc 960 attggtgccg gatttgagtg gaaatatgag atgggttcgt tgatcaatca ggcgcagctg 1020 gatcgggtga gcacctttgt tgatcaggct aaagctgcgg gcgccacggt gctgtgcggt 1080 ggcaagtcac gccctgatat tggtcccttc ttctatgagc ccacggtatt ggcggatgtc 1140 ccagagggca ccccactgct cacggaggaa gtcttcgggc cggtggtgtt catcgaaaag 1200 gtagccacac tggaagaagc cgtcgataag gcaaatggca cgccctacgg cctgaatgcg 1260 tccgtctttg ggtcgtcgga aaccggcaat cttgttgcag gccagctgga agctggcggt 1320 atcggtatta atgatggcta cgccgcgacg tgggcgagcg tgtccacgcc tctgggtggc 1380 atgaagcagt cggggctggg gcaccgccat ggtgcggagg gaattacaaa atatgcggag 1440 atccgaaaca tcgcggagca gcgctggatg tctatgcgtg ggccggccaa aatgccgcga 1500 aaggtgtact cagacaccgt ggccacagcg ctaaagctgg gcaaaatctt taaagttttg 1560 ccgtag 1566 <210> 67 <211> 426 <212> PRT <213> E.coli gabT <400> 67 Met Asn Ser Asn Lys Glu Leu Met Gln Arg Arg Ser Gln Ala Ile Pro 1 5 10 15 Arg Gly Val Gly Gln Ile His Pro Ile Phe Ala Asp Arg Ala Glu Asn 20 25 30 Cys Arg Val Trp Asp Val Glu Gly Arg Glu Tyr Leu Asp Phe Ala Gly 35 40 45 Gly Ile Ala Val Leu Asn Thr Gly His Leu His Pro Lys Val Val Ala 50 55 60 Ala Val Glu Ala Gln Leu Lys Lys Leu Ser His Thr Cys Phe Gln Val 65 70 75 80 Leu Ala Tyr Glu Pro Tyr Leu Glu Leu Cys Glu Ile Met Asn Gln Lys 85 90 95 Val Pro Gly Asp Phe Ala Lys Lys Thr Leu Leu Val Thr Thr Gly Ser 100 105 110 Glu Ala Val Glu Asn Ala Val Lys Ile Ala Arg Ala Ala Thr Lys Arg 115 120 125 Ser Gly Thr Ile Ala Phe Ser Gly Ala Tyr His Gly Arg Thr His Tyr 130 135 140 Thr Leu Ala Leu Thr Gly Lys Val Asn Pro Tyr Ser Ala Gly Met Gly 145 150 155 160 Leu Met Pro Gly His Val Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Cys Pro Leu His 165 170 175 Gly Ile Ser Glu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Ile His Arg Ile Phe Lys 180 185 190 Asn Asp Ala Ala Pro Glu Asp Ile Ala Ala Ile Val Ile Glu Pro Val 195 200 205 Gln Gly Glu Gly Gly Phe Tyr Ala Ser Ser Pro Ala Phe Met Gln Arg 210 215 220 Leu Arg Ala Leu Cys Asp Glu His Gly Ile Met Leu Ile Ala Asp Glu 225 230 235 240 Val Gln Ser Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Leu Phe Ala Met Glu Gln 245 250 255 Met Gly Val Ala Pro Asp Leu Thr Thr Phe Ala Lys Ser Ile Ala Gly 260 265 270 Gly Phe Pro Leu Ala Gly Val Thr Gly Arg Ala Glu Val Met Asp Ala 275 280 285 Val Ala Pro Gly Gly Leu Gly Gly Thr Tyr Ala Gly Asn Pro Ile Ala 290 295 300 Cys Val Ala Ala Leu Glu Val Leu Lys Val Phe Glu Gln Glu Asn Leu 305 310 315 320 Leu Gln Lys Ala Asn Asp Leu Gly Gln Lys Leu Lys Asp Gly Leu Leu 325 330 335 Ala Ile Ala Glu Lys His Pro Glu Ile Gly Asp Val Arg Gly Leu Gly 340 345 350 Ala Met Ile Ala Ile Glu Leu Phe Glu Asp Gly Asp His Asn Lys Pro 355 360 365 Asp Ala Lys Leu Thr Ala Glu Ile Val Ala Arg Ala Arg Asp Lys Gly 370 375 380 Leu Ile Leu Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Tyr Asn Val Leu Arg Ile Leu 385 390 395 400 Val Pro Leu Thr Ile Glu Asp Ala Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Ile 405 410 415 Ile Ser Gln Cys Phe Asp Glu Ala Lys Gln 420 425 <210> 68 <211> 466 <212> PRT <213> E.coli Glutamate decarboxylase alpha <400> 68 Met Asp Gln Lys Leu Leu Thr Asp Phe Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Phe Gly Ala Lys Ala Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe 20 25 30 Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp 35 40 45 Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys 50 55 60 Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile 65 70 75 80 Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile 85 90 95 Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala 100 105 110 Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu 115 120 125 Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg 130 135 140 Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly 145 150 155 160 Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu 165 170 175 Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys 180 185 190 Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr 195 200 205 Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His 210 215 220 Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met 225 230 235 240 His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro 245 250 255 Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala 260 265 270 Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile 275 280 285 Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp 290 295 300 Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro 305 310 315 320 Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg 325 330 335 Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr 340 345 350 Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr 355 360 365 Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp 370 375 380 Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg 385 390 395 400 Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr 405 410 415 Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp 420 425 430 Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu 435 440 445 Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys 450 455 460 His Thr 465 <210> 69 <211> 466 <212> PRT <213> E.coli Glutamate decarboxylase beta (gadB) <400> 69 Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe 20 25 30 Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp 35 40 45 Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys 50 55 60 Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile 65 70 75 80 Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile 85 90 95 Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala 100 105 110 Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu 115 120 125 Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg 130 135 140 Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly 145 150 155 160 Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu 165 170 175 Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys 180 185 190 Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr 195 200 205 Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His 210 215 220 Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met 225 230 235 240 His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro 245 250 255 Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala 260 265 270 Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile 275 280 285 Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp 290 295 300 Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro 305 310 315 320 Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg 325 330 335 Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr 340 345 350 Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr 355 360 365 Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp 370 375 380 Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg 385 390 395 400 Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr 405 410 415 Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp 420 425 430 Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu 435 440 445 Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys 450 455 460 His Thr 465

Claims (22)

  1. 모세포 (parent cell)에서의 활성에 비하여 알파-케토글루타레이트(AKG)를 숙신산 세미알데히드(SSA)로 전환시키는 세포에서의 경로(pathway)의 활성 및 세포에서의 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 (SSDH) 중 하나 이상의 활성이 증가되어 있는, 유전적으로 조작된 박테리아 세포로서, 상기 AKG를 SSA로 전환시키는 경로는 AKG를 SSA로 전환시키는 것을 촉매하는 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 (KGDC); 글루타메이트: 숙시네이트 트란스아미나제 (glutamate: succinate semialdehyde transaminase: GSST) 및 글루타메이트 데카르복실라제 (glutamate decarboxylase: GDC), 또는 이들의 조합을 포함하는 것이고, 상기 SSADH는 SSA를 숙신산(SUC)으로 전환시키는 것을 촉매하는 것인 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 숙신산 생산능을 갖는 것인 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 미호기성 조건에서 숙신산 생산능을 갖는 것인 세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 코리네박테리움 속 세포인 것인 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 증가는 모세포에 비하여 KGDC를 코딩하는 유전자, GSST를 코딩하는 유전자; GDC를 코딩하는 유전자; 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합 중 하나 이상의 카피 수 증가, 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것인 세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 증가는 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제, GSST, GDC 및 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제 중 하나 이상의 돌연변이에 의한 변형에 의한 것인 세포.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 세포는 KGDC를 코딩하는 외인성 유전자, GSST를 코딩하는 외인성 유전자, GDC를 코딩하는 외인성 유전자, 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합을 포함하는 것인 세포.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제는 코리네박테리움 속, 로도코쿠스 속 (Rhodococcus sp.), 미코박테리움 속, 또는 에세리키아 (Escherichia) 속 유래의 것인 세포.
  9. 청구항 5에 있어서, 상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제는 코리네박테리움 속, 로도코쿠스 속, 고르도니아 속(Gordonia sp.), 미코박테리움 속, 또는 에세리키아 속 유래의 것인 세포.
  10. 청구항 5에 있어서, 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 세포.
  11. 청구항 5에 있어서, 상기 숙시닐 세미알데히드 데히드로게나제는 서열번호 5의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 63의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 64의 아미노산 서열과 95%이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 것인 세포.
  12. 청구항 1에 있어서, 숙시닐-CoA 신테타제를 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄된 것인 세포.
  13. 청구항 1에 있어서, L-락테이트 데히드로게나제 유전자, 피루베이트 옥시다제 유전자, 포스포트란스아세틸라제 유전자, 아세테이트 키나제 유전자, 아세테이트 CoA 트란스퍼라제 유전자, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄된 것인 세포.
  14. 청구항 1에 있어서, 모세포에 비하여 상기 세포에서 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 카르복실라제 활성이 증가된 것인 세포.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제는 P458S 치환을 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것인 세포.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 카피 수 증가는 내재적 유전자의 증폭에 의한 것인 세포.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 발현 증가는 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것인 세포.
  18. 청구항 1의 세포를 배양하여 숙신산을 생산하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는, 숙신산을 생산하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 배양은 미호기 조건에서 이루어지는 것인 방법.
  20. 박테리아 세포에 의한 숙신산 생산을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 박테리아 세포에서 SSADH, KGDC, GSST, GDC, 또는 그 조합의 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 방법은 박테리아 세포에서 SSADH, KGDC, GSST, GDC, 또는 그 조합을 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 12에 있어서, 상기 숙시닐-CoA 신테타제를 코딩하는 유전자는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포.
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