KR102097065B1 - 4-히드록시부티레이트 생산 균주 및 이를 이용한 4-히드록시부티레이트의 혐기적 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
일 측면은 4HB를 생산하는 균주에 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제 활성을 감쇄시키거나, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성을 감쇄시키거나, 알파-케토글루타레이트 신타제 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하거나, 피루베이트 카르복실라제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 4HB의 생산능을 향산시킨 것이다. 또한, 피루베이트 데히드로게나제, 포르메이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 생산능을 추가 향상 시킨 것이다. 상기와 같이 형질전환된 균주는 혐기발효를 통해 높은 수율로 4HB를 생산할 수 있으므로 이러한 균주는 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
Description
4-히드록시부티레이트를 생산하기 위해 최적화된 형질전환된 균주 및 이를 이용하여 4-히드록시부티레이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
생분해성 고분자 물질은 심각한 공해문제의 한 축을 이루는 합성고분자 소재를 대체할 수 있는 대안으로 제시되고 있다. 이에 따라 다양한 생분해성 고분자 물질이 개발되고 있다. 그 중 하나인, 폴리-베타-하이드록시부탄산(poly-β-hydroxybutyrate)은 영양불균형 상태에서 다양한 미생물들이 축적하는 생분해성 고분자 물질로서 생분해성, 내습성, 압전성 그리고 생체 적합성 등 우수한 특성을 갖고 있다. 그 중, 4HB(4-hydroxybutyrate)는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 대표적인 예이다. 4HB는 자연적으로는 와인, 소고기, 과일 등에서 소량으로 생성되는 백색 분말 형태의 물질이다. 또한, 4HB는 폴리에스테르와 유사한 특성을 지니고 있어, 결정질의 플라스틱으로부터 고탄성의 고무에 이르기까지 폭넓은 물성을 나타내므로, 미생물 분해성 플라스틱으로서 많은 연구가 진행중이다. 의약용으로 사용되는 4HB는 대부분 발효로 생산된다. 4HB를 이용하여 1,4-BDO를 생산할 수 있는 방법이 알려져 있으나, 아직 상업화단계까지 진행되지는 않았다.
또한, 미생물을 이용하여 4HB를 통한 1,4-BDO, GBL(γ-butyrolactone) 등의 C4 화학물질을 생산하는 기초 물질로 사용한 바 있다. 4HB는 1,4-부탄디올, 감마부티로락톤(gammabutyrolactone: GBL) 및 THF(Tetrahydrofuran) 등의 다양한 탄소수 4개의 화학물질로 쉽게 전환될 수 있다. 상기, 다양한 화학물질은 고분자, 솔벤트, 정밀화학 중간물질 등으로 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 쓰이고 있다.
현재 대부분의 탄소수 4개 화학물질은 1,4-부탄디올, 말레익 안히드라이드 등으로부터 유래되어 합성되고 있지만, 유가가 올라감에 따라 생산비용이 증대되고 있어 화학생산공정을 보완하거나 대체하는 공정의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이에, 상기 화학생산공정의 대안으로 생물학적 공정이 제시되고 있다. 그러나, 아직도 4HB를 생산하는 수율은 낮은 수준이다. 따라서, 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 사용되고 있는 탄소수 4개의 화학물질의 전구체인 4HB 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한 4HB의 생물학적 제조방법이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.
일 측면은 4-히드록시부티레이트를 포함한 4-히드록시부티레이트 화학물질을 생산하도록 유전자가 조작된 균주에 대한 것이다. 또 다른 측면은 제작된 균주를 이용하여 해당 4-히드록시부티레이트의 생산량을 증대시키는 것이다.
일 측면은 4-히드록시부티레이트를 생산하는 균주에 대한 것이다.
일 구체예는 4-히드록시부티레이트를 생산하는 균주에 있어서, 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제 활성이 제거 또는 감소되거나, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성이 제거 또는 감소되거나, 알파-케토글루타레이트 신타제 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 피루베이트 카르복실라제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 미생물을 제공한다.
또한, 상기 미생물은 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 피루베이트 데히드로게나제 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 포르메이트 데히드로게나제 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 균주는 루멘박테리아, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 일 수 있다. 특히 코리네박테리움 글루타미쿰은 생장 조건이 용이하고 고성장이 가능하다. 또한, 유전체 구조가 안정적이어서 돌연변이 발생이 적다. 또한, 비병원성 균주이고 포자를 만들지 않아 환경 유해성이 없다. 특히 대장균에 비해 4배 가량 고농도로 배양이 가능하기 때문에 산업상 활용성이 높다.
상기 4-히드록시부티레이트를 생산하는 균주는 락테이트 데히드로게나아제 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 또한, 상기 4-히드록시부티레이트를 생산하는 균주는 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제 또는 이의 변이체, 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 또는 이의 변이체 및 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
이때, 락테이트 데히드로게나제는 젖산 탈수소 효소, L-락테이트 데히드로게나아제 또는 L-lactate dehydrogenase라고도 하며, Ldh라고도 한다. 상기 효소는 피루베이트에서 락테이트로 전환을 촉매하는 활성을 갖는다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 EC.1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 미생물은 락테이트 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다. 또한, 상기 변이체는 락테이트 데히드로게나제와 동일한 촉매 활성을 갖지만, 서열이 야생형 락테이트 데히드로게나제의 아미노산 서열과 99% 이상 동일성이 있는 것을 의미한다. 또한, 상기 변이체는 락테이트 데히드로게나제와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상 동일성이 있는 효소일 수 있다.
상기 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제는 succinyl-CoA:coenzyme A transferase라고도 하며, Cat1이라고도 한다. 또한, 상기 효소는 숙시네이트를 숙시닐-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제은 EC.2.8.3.a로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 효소는 코리네박테리움 유래 또는 Clostridium kluyveri 유래 일 수 있다. 또한, 상기 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 변이체는 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제와 동일한 촉매 활성을 갖지만, 서열이 야생형 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제의 아미노산 서열과 99% 이상 동일성이 있는 것을 의미한다. 또한, 상기 변이체는 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상 동일성이 있는 효소일 수 있다.
이때, 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제는 succinate semialdehyde dehydrogenase라고도 하며, SucD라고도 한다. 상기 효소는 숙시닐 코에이를 숙시닐 세미알데히드로 전환을 촉매하는 활성을 갖는다. 이때 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제(서열번호 3)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코리네박테리움 유래 또는 Porphyromonas gingivalis 유래 일 수 있다. 상기 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 변이체는 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제와 동일한 촉매 활성을 갖지만, 서열이 야생형 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제의 아미노산 서열과 99% 이상 동일성이 있는 것을 의미한다. 또한, 상기 변이체는 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상의 동일성이 있는 효소일 수 있다.
이때, 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제는 4-hydroxybutyrate dehydrogenase라고도 하며, 4Hbd라고도 한다. 또한, 상기 효소는 숙시닐 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환을 촉매하는 활성을 갖는다. 이때 상기 효소는 코리네박테리움 유래 또는 Porphyromonas gingivalis 유래 일 수 있다. 또한, 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 변이체는 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제와 동일한 촉매 활성을 갖지만, 서열이 야생형 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제의 아미노산 서열과 99% 이상 동일성이 있는 것을 의미한다. 또한, 상기 변이체는 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상의 동일성이 있는 효소일 수 있다.
4-히드록시부티레이트를 생산하는 균주에 추가적으로 유전자가 도입되거나 유전자가 제거될 수 있다. 일 구체예로는 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제 활성이 감쇄된 것일 수 있다. 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제는 malate quinone oxidoreductase라고도 하며, Mqo라고도 한다. 상기 효소는 말레이트에서 옥살로아세테이트로 전환하는 것을 촉매하는 활성을 갖는다. 이때 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제는 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 효소일 수 있다. 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제 활성의 감소를 위해 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 부가, 치환, 또는 결실을 수행할 수 있다. 이때, 상동재조합 방법으로 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 또는 전부 결실시킬 수 있다. 또한, 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18의 핵산 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성이 감쇄된 것일 수 있다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제는 phosphoenolpyruvate carboxykinase라고도 하며, PckG라고도 한다. 상기 효소는 옥살로아세테이트에서 포스포에놀피루베이트로 전환하는 것을 촉매하는 활성을 갖는다. 이때 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 효소일 수 있다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성의 감소를 위해 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 부가, 치환, 또는 결실을 수행할 수 있다. 이때, 상동재조합 방법으로 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 유전자의 일부 또는 전부를 결실시킬 수 있다. 또한, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20의 핵산 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로는 알파-케토글루타레이트 신타제 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 알파-케토글루타레이트 신타제는 α-ketoglutarate synthase라고도 하며, SucA라고도 한다. 또한, 상기 효소는 알파-케토글루타레이트에서 숙시닐 세미알데히드로의 전환을 촉매하는 활성을 갖는다. 상기 효소는 코리네박테리움 유래 또는 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 유래일 수 있다. 또한, 상기 알파-케토글루타레이트 신타제는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 알파-케토글루타레이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 변이체는 알파-케토글루타레이트 신타제 와 동일한 촉매 활성을 갖지만, 서열이 야생형 알파-케토글루타레이트 신타제의 아미노산 서열과 99% 이상 동일성이 있는 것을 의미한다. 또한, 상기 변이체는 알파-케토글루타레이트 신타제와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상의 동일성이 있는 효소일 수 있다.
일 구체예로는 피루베이트 카르복실라제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 피루베이트 카르복실라제는 pyruvate carboxylase고도 하며, Pyc라고도 한다. 또한, 상기 효소는 피루베이트에서 옥살로아세테이트로 전환하는 것을 촉매하는 활성을 갖는다. 이때 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코리네박테리움 유래 또는 대장균 유래 일 수 있다. 이때, 피루베이트 카르복실라제는 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 변이체는 피루베이트 카르복실라제와 동일한 촉매 활성을 갖지만, 서열이 야생형 피루베이트 카르복실라제의 아미노산 서열과 99% 이상 동일성이 있는 것을 의미한다. 또한, 상기 변이체는 피루베이트 카르복실라제와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상 동일성이 있는 효소일 수 있다. 또한, 상기 효소의 변이체는 야생형 피루베이트 카르복실라제의 제458번 아미노산이 치환된 것을 나타낸다. 제458번 아미노산은 프로린일 수 있다. 이때 제458번 아미노산이 세린으로 치환된 것일 수 있다(서열번호 10). 상기 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로는 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제는 succinate semialdehyde dehydrogenase라고도 하며, SSADH라고도 한다. 상기 효소는 숙시닐 세미알데히드를 숙시네이트로 전환을 촉매하는 활성을 갖는다. 이때 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 효소일 수 있다. 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 활성의 감소를 위해 Ncgl0049, Ncgl0463 또는 Ncgl2619 유전자에 부가, 치환, 또는 결실을 수행할 수 있다. 이때, 상동재조합 방법으로 Ncgl0049 폴리뉴클레오티드를 일부 또는 전부 결실시킬 수 있다. 이때, Ncgl0049 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22의 핵산 서열을 가질 수 있다. 이때, Ncgl0463 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23의 핵산 서열을 가질 수 있다. 이때, Ncgl2619 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24의 핵산 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로는 피루베이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 피루베이트 데히드로게나제는 "피루베이트 데히드로게나제 복합체" 또는 "pyruvate dehydrogenase complex"를 의미한다. 또한, Pdh라고도 한다. 상기 피루베이트 데히드로게나제는 피루베이트(pyruvate)에서 아세틸-CoA로의 전환을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 상기 피루베이트 데히드로게나제는 피루베이트 데히드로게나제(E1), 디히드로리포일 트랜스아세틸라제(E2) 및 디히드로리포일 데히드로게나제(E3)로 구성되어 있다. 또한 상기 피루베이트 데히드로게나제는 미생물의 종류에 따라, E1은 AceE로 불리기도 하며, E2는 AceF로 불리기도 하며, E3는 lpd 또는 lpdA로 불리기도 한다.
따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 lpd, aceE, aceF 유전자를 포함한다. 이때 상기 유전자는 코리네박테리움 유래 또는 E.coli 유래 일 수 있다. 이때 lpd 유전자는 서열번호 12를 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이때 aceE 유전자는 서열번호 13을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이때 aceF 유전자는 서열번호 14를 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
일 구체예는 포르메이트 데히드로게나제 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 포르메이트 데히드로게나제는 Formate dehydrogenase라고도 하며, Fdh라고 한다. 또한, 상기 효소는 포르메이트를 중탄산염(bicarbonate)으로 전환을 촉매하는 활성을 갖는다. 이때, 상기 효소는 코리네박테리움 유래 또는 Mycobacterium vaccae 유래 일 수 있다. 또한, 상기 포르메이트 데히드로게나제는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 포르메이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 서열을 가질 수 있다.
상기에서 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입되어 균주내로 도입될 수 있다. 이때 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 서열로 프로모터, 터미네이터 또는 인핸서 등이 포함될 수 있다.
용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터 등이 사용될 수 있다. 발현용 벡터로서 작동을 하려면 복제원점, 프로모터, MCS, 선택 마커, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 복제원점은 플라스미드가 숙주 세포의 염색체와 별도로 복제할 수 있는 기능을 부여해 주고, 프로모터는 삽입되는 외래 유전자의 전사 과정에 작용을 하며, MCS는 다중 클로닝 사이트로서 외래 유전자가 다양한 제한효소 사이트를 통해 삽입될 수 있게 한다. 선택 마커는 벡터가 숙주 세포에 제대로 들어갔는지를 확인시켜 주는 역할을 한다. 선택 마커는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있고, 비용의 측면을 고려하여 앰피실린 또는 겐타마이신 내성 유전자가 있다
한편, 본 발명의 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 강한 프로모터, 예컨대 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터 등을 포함한다. 또한, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터 또는 T7 프로모터 일 수 있다. 이와 같은 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 연결되어 있다.
또한, 상기 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 본 명세서에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 전사조절인자 결합 위치의 어레이, 터미네이터 또는 인핸서)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 명세서에서 사용된 용어, '형질전환'이란 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 것이든 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 어느 것이든지 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주 세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
상기의 효소 활성의 감쇄는 내재적 유전자를 효소 활성이 약화 또는 결실되도록 변형된 유전자로 대체하는 방법, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법 또는 상기 유전자를 염색체로부터 결실시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이를 위해, 상동성 재조합(Homologous recombination)에 의해 효소를 코딩하는 유전자를 미생물의 유전체로부터 제거할 수 있다.
또 다른 측면은 상기에서 제작된 4HB를 생산하는 균주를 배양하는 단계; 및 배양물에서 C4 화학물질을 분리하는 단계를 포함하는 C4 화학물질 생산 방법에 대한 것이다. 상기 C4 화합물은 C4 화합물은 숙시네이트(succinate), 푸마르산(fumaric acid), 말릭산(malic acid), 또는 이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있다. 본 발명에 일례에 따르면, 본 발명의 미생물을 배양시 TCA 회로상의 C4 화합물 및 이로부터 유래한 물질의 생산을 증가시킬 수 있다. 또한, 숙시네이트로 유래한 물질은 4-히드록시부티레이트(4-HB), 1,4-부탄디올(1,4-BDO), γ-부티로락톤(γ-butyrolactone, GBL), 또는 이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기 배양은 혐기성 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 용어 "혐기성 조건"은 정상 대기상태보다 산소의 함량이 적은 상태를 의미한다. 혐기성 조건은 예를 들면, 이산화탄소 또는 질소를 약 0.1 내지 0.4 vvm (Volume per Volume per minute), 약 0.2 내지 0.3 vvm, 또는 약 0.25 vvm의 유속으로 공급하여 조성될 수 있다. 또한, 혐기성 조건은 통기 속도가 약 0 내지 0.4 vvm, 약 0.1 내지 0.3 vvm, 약 0.15 내지 0.25 vvm인 것일 수 있다.
이후, 배양물로부터 생산된 C4 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 생산된 C4 유기화합물을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 생산된 C4 화합물은 숙시네이트(succinate), 푸마르산(fumaric acid), 말릭산(malic acid), 또는 이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있다. 본 발명에 일례에 따르면, 4-히드록시부티레이트(4-HB), 1,4-부탄디올(1,4-BDO) 또는 이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있다. 일 구현예로, 상기 4-히드록시부티레이트의 회수는 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 또는 이들의 조합에 의하여 이루어질 수 있다. 이때 C4 화학물질, 예를 들어 4HB의 회수는 배양액의 여과 과정을 포함하는 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
또한, 회수한 생산된 C4 화합물을 다른 유기화합물으로 전환시켜 다양한 유기산을 수득하는 단계가 더 포함될 수 있다. 상기 방법에 의해 생산된 4-히드록시부티레이트를 화학적으로 전환함으로써 그와 구조적으로 관련된 기질을 합성할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 4-히드록시부티레이트를 강산 존재하에서 약 100℃ 내지 약 200℃에서 반응시킨 후, 증류에 의해 감마-부티로락톤(GBL)을 수득할 수 있다. 수득된 GBL은 아민화제, 예를 들면, 메틸아민을 이용한 아민화 반응에 의해 N-메틸피롤리돈(NMP)으로 전환될 수 있다. 또한, 수득된 GBL은 금속함유 촉매, 예를 들면, Ru 또는 Pd 등을 이용한 수소화 반응에 의해 테트라히드로퓨란(THF), 1,4-부탄디올 또는 부탄올로 선택적으로 전환될 수 있다.
또한, 상기 생산된 4-히드록시부티레이트를 생물학적으로 전환함으로써 폴리-4-히드록시부티레이트를 수득할 수 있다. 상기 생물학적 전환은 폴리히드록시알카노에이트 신테아제, 4HB-조효소 A:조효소 A 트란스퍼라제, 또는 그 조합에 의한 것일 수 있다.
또한, 상기 생산된 4-히드록시부티레이트를 생물학적으로 전환함으로써 폴리-4-히드록시부티레이트를 수득할 수 있다. 상기 생물학적 전환은 폴리히드록시알카노에이트 신테아제, 4HB-조효소 A:조효소 A 트란스퍼라제, 또는 그 조합에 의한 것일 수 있다.
4HB를 생산하는 균주에 추가적으로 유전자 조작을 통하여 4HB의 생산 수율을 향상시켰다. 특히, 여러 대사 경로에 관여하는 효소의 활성을 변화시켰고, 여러 유전자 변형의 조합을 통하여 최적의 수율로 4HB를 생산하는 균주를 개발하였다. 이러한 4HB 생산성이 증대된 균주는 혐기발효를 통해 높은 수율로 4HB를 생산할 수 있으므로 이러한 균주는 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 4-히드록시부티레이트 생산을 위한 균주의 내부 대사 과정과 해당과정에서 조작, 결실, 도입한 유전자를 나타낸 것이다.
도 2는 균주 제작에 사용된 벡터를 나타낸 것으로, 코리네박테리아 외인성 발현 벡터(Corynebacteria exogenous expression vector)인 pGSK+를 나타낸다.
도 3은 균주 제작에 사용된 벡터를 나타낸 것으로, 코리네박테리아 외인성 발현 벡터(Corynebacteria exogenous expression vector)인 pGST1을 나타낸다.
도 4는 균주 제작에 사용된 벡터를 나타낸 것이다. 도 2의 MD376 벡터는 대장균의 피루베이트 데히드로게나제 발현 벡터를 나타낸다.
도 5는 코리네박테리아 기본 균주와 유전자 조작된 균주에서의 4-히드록시부티레이트 생산 농도 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 균주 제작에 사용된 벡터를 나타낸 것으로, 코리네박테리아 외인성 발현 벡터(Corynebacteria exogenous expression vector)인 pGSK+를 나타낸다.
도 3은 균주 제작에 사용된 벡터를 나타낸 것으로, 코리네박테리아 외인성 발현 벡터(Corynebacteria exogenous expression vector)인 pGST1을 나타낸다.
도 4는 균주 제작에 사용된 벡터를 나타낸 것이다. 도 2의 MD376 벡터는 대장균의 피루베이트 데히드로게나제 발현 벡터를 나타낸다.
도 5는 코리네박테리아 기본 균주와 유전자 조작된 균주에서의 4-히드록시부티레이트 생산 농도 비교한 것을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 형질전환 균주의 제작
1.1.
CGL
(Δ
ldh
) 균주의 준비
(1) 치환 벡터(
replacement
vector
)의 제작
코리네박테리아의 자연형 균주(ATCC13032)에서 혐기발효시 lactate가 과량 쌓이는 현상을 막기 위하여 균주의 L-lactate dehydrogenase(NCgl2810)유전자(서열번호 42)를 제거하였다. 유전자 치환을 통해 해당유전자의 ORF 부분 230bp를 제거하였다. 제거된 부분 시퀀스는 서열번호 29와 같다.
ldhA 유전자의 처음 200bp에 대응하는 상류 영역은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA을 주형으로 하고 ldhA_up_5'(서열번호 25) 및 ldhA_up_3'(서열번호 26)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 하였다. ldhA의 마지막 200bp에 대응하는 하류 영역은 ldhA_down_5'(서열번호 27) 및 ldhA_down_3'(서열번호 28)의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다. PCR 증폭은 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장단계를 30회 반복함으로써 수행하였다. 이하 모든 PCR 증폭은 이와 동일한 조건으로 수행하였다. 그 후에, ldhA의 상류 및 하류의 플랭킹 영역(flanking region)은 올리고뉴클레오티드의 연장 부분과 겹치게 하여, 16bp의 In-Fusion® HD Cloning Kit (cat no. 639691 manufactured clontech)를 이용하여 연결하였다. ldhA 산물의 상류 및 하류의 연결된 영역은 BamHI 및 SalI 제한효소 사이트에서 pK19mobsacB에 라이게이션되었다. 이렇게 하여, pK19mobsacB-Δldh를 수득하였다.
(2)
CGL
(Δ
ldh
) 균주 제조
수득된 플라스미드 pK19mobsacB-ΔldhA 를 Schafer et al., 1994에 개시된 바와 같이 상동재조합에 의해 C. glutamicum 내의 대응하는 유전자를 결실시키기 위하여 활용되었다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기천공법(electroporation)을 통해 상기 pK19mobsacB-Δldh벡터를 도입하였다. 도입된 균주를 25 ㎍/ml의 카나마이신을 함유한 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. LBHIS 배지는 18.5 g/L 뇌-심장 침출배지(brain-heart infusion broth), 0.5 M 솔비톨(sorbitol), 5 g/L 박토-트립톤(bacto-tryptone), 2.5 g/L 박토-효모 추출물(bacto-yeast extract), 5 g/L NaCl 및 18 g/L 박토-아가(bacto-agar)를 포함한다. 이하 LBHIS 배지의 조성은 이와 동일하다. 형성된 콜로니를 LB-수크로스 배지에 도말하여 30℃에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. 유전자 결실이 성공적으로 되었는지 여부는 프라이머 세트(서열번호 25 및 서열번호 28)를 이용한 PCR을 통하여 확인하였다. 얻어진 균주를 CGL(Δldh)로 명명하였다.
서열번호 | 서열 |
25 | 5'-GCAGGCATGCAAGCTTCTAGTCTGGGGAGCGAAACC-3' |
26 | 5'-GAGCTCAGTCAGTCATGGACGCCACGAGGAAGATG-3' |
27 | 5'-TGACTGACTGAGCTCCTGGACAAAGACCCAGAGCT-3' |
28 | 5'-GGCCAGTGCCAAGCTTTTGCGGGCACCAACGTAATG-3' |
1.2. 4-
히드록시부티레이트를
생산하는 균주의 제작
실시예 1. 1)에서 준비된 CGL(Δldh) 균주에 4-히드록시부티레이트를 생산하도록 유전자를 더 조작하였다. Ncgl0049 유전자를 감쇄시키기 위하여, 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제, 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 및 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 45)를 Ncgl0049 유전자 위치에 치환하는 방식으로 균주에 도입하였다. pK19mobsacB 벡터(ATCC87098)를 이용하여 코리네박테리움에 상기 유전자를 도입하였다. 즉, Ncgl0049 유전자의 상류 및 하류 영역, cat1, sucD, 및 4hbd 유전자 영역의 서열(서열번호 45)을 합성하여 XbaI 및 NheI 제한효소 사이트에서 pK19mobsacB에 라이게이션되었다.
수득된 플라스미드를 Schafer et al., 1994에 개시된 바와 같이 상동재조합에 의해 Ncgl0049를 합성된 cat1, sucD, 4hbd 유전자로 치환시키기 위하여 활용하였다. Ncgl0049 결실 및 cat1, sucD, 4hbd 유전자 도입이 성공적으로 되었는지 여부는 프라이머 세트(서열번호 43 및 서열번호 44)를 이용한 PCR을 통하여 확인하였다. 얻어진 균주를 C011으로 명명하였다.
서열번호 | 서열 |
43 | 5'-ATT CGG TGA GGA ATC CGG CGG TG-3' |
44 | 5'-CTA TGA GAC AGT CGT CCT GTA CCC AT-3' |
1.3. 4-
히드록시부티레이트
효율적인 생산을 위한 유전자 결실 균주 제작
1.3.1.
말레이트
퀴논
옥시도리덕타제
유전자 결실
(1) 치환 벡터의 제작
말레이트 퀴논 옥시도리덕타제 유전자의 처음 200bp에 대응하는 상류 영역은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA을 주형으로 하고, 프라이머 세트(서열번호 30 및 서열번호 31)를 이용하여 PCR을 하였다. 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제 유전자의 마지막 200bp에 대응하는 하류 영역은 프라이머 세트(서열번호 32 및 서열번호 33)로 증폭하였다. 그 후에, 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제 유전자의 상류 및 하류의 플랭킹 영역은 올리고뉴클레오티드의 연장 부분과 겹치게 하여, 16bp의 In-Fusion® HD Cloning Kit (cat no. 639691 manufactured clontech)를 이용하여 연결하였다. 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제 산물의 상류 및 하류의 연결된 영역은 BamHI 및 SalI 제한효소 사이트에서 pK19mobsacB에 라이게이션되었다. 이렇게 하여, pK19mobsacB-Δmqo를 수득하였다.
(2)
CGL
(Δldh Δmqo) 균주 제조
실시예 1.2)에서 제작한 C011 균주에 추가적으로 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제의 발현을 억제하였다. 이를 위해 서열번호 18의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 상동 재조합 방법으로 결실시켰다. 수득된 플라스미드 pK19mobsacB-Δmqo를 Schafer et al., 1994에 개시된 바와 같이 상동재조합에 의해 C. glutamicum C011 내의 대응하는 유전자를 결실시키기 위하여 활용되었다. 유전자 결실이 성공적으로 되었는지 여부는 프라이머 세트(서열번호 28 및 서열번호 31)를 이용한 PCR을 통하여 확인하였다.
1.3.2.
포스포에놀피루베이트
카르복시키나제
유전자 결실
(1) 치환 벡터의 제작
포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 유전자의 처음 200bp에 대응하는 상류 영역은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA을 주형으로 하고 프라이머 세트(서열번호 34 및 서열번호 35)를 이용하여 PCR을 하였다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 유전자의 마지막 200bp에 대응하는 하류 영역은 프라이머 세트(서열버호 36 및 서열번호 37)로 증폭하였다. 그 후에, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 상류 및 하류의 플랭킹 영역은 올리고뉴클레오티드의 연장 부분과 겹치게 하여, 16bp의 In-Fusion® HD Cloning Kit (cat no. 639691 manufactured clontech)를 이용하여 연결하였다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 산물의 상류 및 하류의 연결된 영역은 BamHI 및 SalI 제한효소 사이트에서 pK19mobsacB에 라이게이션되었다. 이렇게 하여, pK19mobsacB-pckG를 수득하였다.
(2)
CGL
(Δldh ΔpckG) 균주 제조
서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 발현을 억제하였다. 이를 위해 서열번호 20의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 상동 재조합 방법으로 결실시켰다. 해당유전자의 결실을 위하여 상기에서 pK19mobsacB (ATCC 87098) 벡터를 이용하였다. 구체적으로, 상기에서 수득된 플라스미드 pK19mobsacB-ΔpckG 를 C011(Δmqo) 균주에 도입하여 Schafer et al., 1994에 개시된 바와 같이 상동재조합에 의해 pckG 유전자를 결실시켰다. 유전자 결실이 성공적으로 되었는지 여부는 프라이머 세트(서열번호 34 및 서열번호 37)를 이용한 PCR을 통하여 확인하였다. 얻어진 균주를 C011(ΔmqoΔpckG)라 명명하였다.
서열번호 | 서열 |
30 | 5'-CTGCAGGTCGACTCTAGAGAAGAAGTAGTCCGTCATGCCGTGAACC-3' |
31 | 5'-TAGAAGATTATTTTTGACTGACGCGTGGGGCG-3' |
32 | 5'-GTCAAAAATAATCTTCTAACTGCTTTCTTTAAAGCACCCG-3' |
33 | 5'-CTCGGTACCCGGGGATCCTCTTAAAGCCTGAGATAGCGAGTTCCA-3' |
34 | 5'-GCTCTAGAGTCATGTATTTAGGTAGGGC-3' |
35 | 5'-ATCTGAAAGCATGCATTTGCAACGACACCAAGT-3' |
36 | 5'-GTTGCAAATGCATGCTTTCAGATACAGAACTAG-3' |
37 | 5'-GCTCTAGACAGTCGTTGAACTCAGGT-3' |
1.4. 4-
히드록시부티레이트
효율적인 생산을 위한 유전자 도입 균주 제작
1.4.1.
피루베이트
카르복실라제
유전자 도입
실시예 1.2) 또는 1.3)에서 제작된 균주에 추가적으로 피루베이트 카르복실라제의 아미노산 서열 중 제458번 프롤린이 세린으로 치환하였다. 구체적으로 서열번호 38 내지 41의 프라이머를 사용하여 치환하였다.
피루베이트 카르복실라제 유전자의 프롤린 아미노산 위치로부터 처음 200bp에 대응하는 상류 영역은 프라이머 세트(서열번호 38 및 서열번호 39)를 이용하여 PCR을 하였다. 피루베이트 카르복실라제 유전자의 프롤린 아미노산 위치로부터 하류 영역은 프라이머 세트(서열번호 40 및 서열번호 41)로 증폭하였다. 그 후에, 피루베이트 카르복실라제 유전자의 프롤린을 세린으로 치환하는 상류 및 하류 영역은 올리고뉴클레오티드의 연장 부분과 겹치게 하여, 16bp의 In-Fusion® HD Cloning Kit (cat no. 639691 manufactured clontech)를 이용하여 연결하였다. 피루베이트 카르복실라제 산물의 상류 및 하류의 연결된 영역은 BamHI 및 SalI 제한효소 사이트에서 pK19mobsacB에 라이게이션되었다.
수득된 플라스미드 pK19mobsacB-mutated pycP458S를 C011(ΔmqoΔpckG) 균주에 Schafer et al., 1994에 개시된 바와 같이 상동재조합에 의해 유전자를 도입하였다. 유전자 도입이 성공적으로 되었는지 여부는 프라이머 세트(서열번호 38 및 서열번호 41)를 이용한 PCR을 통하여 확인하였다. 얻어진 균주를 C011(ΔmqoΔpckG pycP458S)라 명명하였다.
서열번호 | 서열 |
38 | 5'-GCTCTAGATTGAGCACACCGTGACT-3' |
39 | 5'-CCGGATTCATTGCCGATCAC T C-3' |
40 | 5'-GCTCTAGACTGTCCCACGGATCCTCAAA-3' |
41 | 5'-CTGAAGGAGGTGCG A GTGA-3' |
1.4.2. 알파-
케토글루타레이트
신타제
유전자의 도입
알파-케토글루타레이트 신타제 유전자 sucA를 도입하기 위하여 합성된 알파-케토글루타레이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 46)를 XbaI및 NheI로 절단된 pK19mobsacB (ATCC 87098) 벡터에 도입하여 pK19 mobsacB-sucA를 제작하였다. 수득된 플라스미드 pK19mobsacB-sucA를 C011(ΔmqoΔpckG pycP458S) 균주에 Schafer et al., 1994에 개시된 바와 같이 상동재조합에 의해 유전자를 도입하였다. 유전자 도입이 성공적으로 되었는지 여부는 프라이머 세트 (서열번호 54) 및 (서열번호 55)를 이용한 PCR을 통하여 확인하였다. 얻어진 균주를 C098이라 명명하였다.
1.4.3.
피루베이트
데히드로게나제
유전자의 도입
(1)
pGST1
벡터의 제작
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, cat.# M0530)를 사용하여 다음 4개의 PCR 산물을 얻었다: C.glutamicum promoter screening vector pET2(GenBank accession number: AJ885178.1)를 주형으로 하여 MD-616(서열번호 56) 및 MD-618(서열번호 57) 프라이머 서열 및 MD-615(서열번호 58) 및 MD-617(서열번호 59) 프라이머 서열을 사용하여 PCR 수행, mammalian fluorescence protein expression vector pEGFP-C1(Clonetech)를 주형으로 MD-619(서열번호 60) 및 MD-620(서열번호 61) 프라이머 서열을 사용하여 PCR 수행, 및 E.coli cloning vector pBluescriptII SK+를 주형으로 LacZa-NR(서열번호 62) 및 MD-404(서열번호 63) 프라이머 서열을 사용하여 PCR 수행. 각각의 PCR 산물인 3010 bp, 854 bp, 809 bp, and 385 bp을 In-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit (Clonetech, cat.# 639690) 방법에 따라 원형의 플라즈미드로 클로닝하였다.
상기 클로닝된 벡터를 One Shot TOP10 Chemically Competent Cell (Invitrogen, cat.# C4040-06)에 형질도입하고 25mg/L 카나마이신이 포함된 LB배지에서 배양한 후 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 벡터를 회수하여 전서열 분석을 통해 벡터 서열을 확인하였다. 상기 벡터를 pGSK+로 명명하였다. 전사 종결인자와 3' UTR(untranslated region)를 포함하는 C.glutamicum 셔틀 벡터를 제조하기 위하여, C.glutamicum gltA (NCgl0795)의 3' UTR 및 E.coli rrnB의 rho-독립성 전사종결인자(rho-independent terminator of rrnB)를 상기의 pGSK+ 벡터에 삽입하였다. C.glutamicum (ATCC13032) 게놈 DNA를 주형으로 MD-627(서열번호 64) 및 MD-628(서열번호 65) 프라이머 서열로 PCR 하여 gltA 3' UTR의 108bp PCR 단편을 얻었다.
또한, E.coli (MG1655) 게놈 DNA을 주형으로 MD-629(서열번호 66) 및 MD-630(서열번호 67) 프라이머 서열을 사용하여 rrnB 전사종결인자 292bp PCR 산물을 얻었다. 상기 2개의 증폭된 단편을 In-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit (Clonetech, cat.# 639690)를 사용하여 SacI으로 절단된 pGSK+에 삽입하였다. 상기 클로닝된 벡터를 One Shot TOP10 Chemically Competent Cell (Invitrogen, cat.# C4040-06)에 형질도입하고 25mg/L 카나마이신이 포함된 LB배지에서 배양한 후 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 벡터를 회수하여 전서열 분석을 통해 벡터 서열을 확인하였다. 상기 벡터를 pGST1으로 명명하였다.
(2)
MD0376
벡터의 제작
E.coli Pdh complex의 각 유전자가 NCgl1929 promoter 하에 과발현되는 C.glutamicum 되는 셔틀 벡터를 제작하였다. C.glutamicum NCgl1929의 프로모터, 천연 리보좀 결합부위 다음의 E.coli dehydrolipoamide dehydrogenase(서열번호 52)를 코딩하는 Ec.lpd open reading frame (서열번호 53), 천연 리보좀 결합부위 다음의 E.coli pyruvate dehydrogenase(서열번호 48)를 코딩하는 Ec.aceE open reading frame(서열번호 49), 천연 리보좀 결합부위 다음의 E.coli dihydrolipoamide acetyltransferase(서열번호 50)를 코딩하는 Ec.aceF open reading frame(서열번호 51)에 대하여, 각각 J0180(서열번호 68) 및 MD-1081(서열번호 69), MD-1082(서열번호 70) 및 MD-1083(서열번호 71), MD-1084(서열번호 72 : aagaagtagg aggaataacc catgtcagaa cgtttcc) 및 MD-1085(서열번호 73: ttttacctcc tacgccagac gc), 및 MD-1086(서열번호 74 : tctggcgtag gaggtaaaag aataat) 및 MD-1087(서열번호 75: ggtggcggcc gctctagatt acatcaccag acggcgaatg tca) 프라이머로 PCR을 수행하여 206, 1454, 2694, 및 1935bp DNA 단편을 얻었다.
이를 In-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit (Clonetech, cat.# 639690)를 이용하여 KpnI/XbaI digested pGST1 벡터에 리게이션하였다. 클로닝된 벡터를 One Shot TOP10 Chemically Competent Cell (Invitrogen, cat.# C4040-06)에 형질도입하고 25mg/L 카나마이신이 포함된 LB배지에서 배양하였다. 형성된 콜로니로부터 벡터를 회수하여 전 서열분석을 통해 벡터제작을 확인하였고, 이 벡터를 MD0376이라고 명명하였다. 상기 MD0376 벡터를 C098 균주에 벡터 형태로 형질도입하여 C158 균주를 얻었다.
1.4.4.
포르메이트
데히드로게나제
유전자의 도입
포르메이트 데히드로게나제 유전자를 도입하기 위하여 합성된 포르메이트 데히드로게나제 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 47)를 BamHI 및 EcoRI로 절단된 pK19mobsacB (ATCC87098) 벡터에 도입하여 pK19 mobsacB-fdh를 제작하였다. 이를 C098 균주에 도입하였다. 수득된 플라스미드 pK19mobsacB-fdh를 C098 균주에 Schafer et al., 1994에 개시된 바와 같이 상동재조합에 의해 유전자를 도입하였다. 유전자 도입이 성공적으로 되었는지 여부는 프라이머 세트 (서열번호 76 및 서열번호 77)를 통하여 확인하였다. 언어진 균주를 C209로 명명하였다.
균주명 | 유전형 |
CGL(Δldh) | ATCC13032 Δldh |
C011 | ATCC13032 Δldh, ΔNcgl0049, cat1, sucD, 4hbD |
C098 | ATCC13032 Δldh ΔNcgl0049, cat1, sucD, 4hbD, Δmqo, ΔpckG, pycP458S, sucA |
C158 | ATCC13032 Δldh, ΔNcgl0049, cat1, sucD, 4hbD, Δmqo, ΔpckG, pycP458S , sucA, MD0376 |
C209 | ATCC13032 Δldh, ΔNcgl0049, cat1, sucD, 4hbD, Δmqo, ΔpckG, pycP458S , sucA, fdh |
실시예
2. 형질전환된 균주에 따른 4
HB
생산성 평가
실시예 1에서 다양하게 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰을 30℃의 배양기에서 배양하였다. 탄소원으로는 글루코오스를 사용하였다. 또한, 또한, 4-HB 생산을 위하여 혐기적 조건하에서 배양하였다. 구체적으로, Fed-betch 발효를 수행하였다. 배양 배지는 글루코오즈 50g/L, 옥수수 침지액 10 g/L, (NH4)2SO4 45 g/L, UREA 4.5 g/L, KH2PO4 0.5g/L, MgSO4/7H2O 0.5 g/L, FeSO4/7H2O(10 g/L) stock 1mL, MnSO4/4H2O(10 g/L) stock 1 mL, beta-ALANIN(5 g/L) stock 1 mL, 니코틴산(5 g/L) stock 1 mL, THIAMINE-HCl(5 g/L) stock 1 mL, D-Biotin(0.3 g/L) stock 1 mL로 구성되었다. 또한, 산소를 공급하면서 OD600 80까지 키운 후 산소공급을 차단하여 100시간 발효하였다.
이러한 조건에서 상기 균주의 4HB 생산량을 확인하였다. 기본 균주인 C011은 4.0 g/L의 4HB를 생산함을 확인하였다. 그러나, 추가적으로 형질전환시킨 C098의 경우에는 C011과 동일한 조건에서 발효한 결과, 4HB 생산량이 28.4g/L로 7.1배 증가되었다(표 6 및 도 3 참조). 또한, C158 균주의 경우에는 4HB 생산량이 40.5g/L임을 확인하였다. 이는 C011 균주 및 C098 균주 대비 4HB 생산량이 각각 10.1배, 1.4배 증가한 것이다(표 6 및 도 3 참조). 또한, C209 균주의 경우에는 4HB 생산량이 45.7g/L임을 확인하였다. 이는 C011 균주 및 C098 균주 대비 4HB 생산량이 각각 11.4배, 1.6배 증가한 것이다(표 6 및 도 3 참조)
균주 | 4 HB 생산량 (g/L) |
Δldh | 0 |
C011 | 4 |
C098 | 28.4 |
C158 | 40.5 |
C209 | 45.7 |
혐기조건에서 4HB를 고효율로 생산할 수 있는 균주는 4HB의 생산에 효과적으로 활용될 수 있다. 4HB는 산업적으로 활용도가 높은 화합물이므로 균주의 생산 효율성 증가는 4HB의 생산 단가를 낮추어 4HB의 활용도를 높일 수 있다. 따라서, 이러한 형질전환된 미생물은 산업적으로 매우 유용하게 활용될 수 있다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd
<120> A microorganism producing 4-hydroxybutyrate and a method for
producing 4-hydroxybutyrate using the same
<130> PN099034
<160> 77
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 538
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cat1 enzyme
<400> 1
Met Ser Lys Gly Ile Lys Asn Ser Gln Leu Lys Lys Lys Asn Val Lys
1 5 10 15
Ala Ser Asn Val Ala Glu Lys Ile Glu Glu Lys Val Glu Lys Thr Asp
20 25 30
Lys Val Val Glu Lys Ala Ala Glu Val Thr Glu Lys Arg Ile Arg Asn
35 40 45
Leu Lys Leu Gln Glu Lys Val Val Thr Ala Asp Val Ala Ala Asp Met
50 55 60
Ile Glu Asn Gly Met Ile Val Ala Ile Ser Gly Phe Thr Pro Ser Gly
65 70 75 80
Tyr Pro Lys Glu Val Pro Lys Ala Leu Thr Lys Lys Val Asn Ala Leu
85 90 95
Glu Glu Glu Phe Lys Val Thr Leu Tyr Thr Gly Ser Ser Thr Gly Ala
100 105 110
Asp Ile Asp Gly Glu Trp Ala Lys Ala Gly Ile Ile Glu Arg Arg Ile
115 120 125
Pro Tyr Gln Thr Asn Ser Asp Met Arg Lys Lys Ile Asn Asp Gly Ser
130 135 140
Ile Lys Tyr Ala Asp Met His Leu Ser His Met Ala Gln Tyr Ile Asn
145 150 155 160
Tyr Ser Val Ile Pro Lys Val Asp Ile Ala Ile Ile Glu Ala Val Ala
165 170 175
Ile Thr Glu Glu Gly Asp Ile Ile Pro Ser Thr Gly Ile Gly Asn Thr
180 185 190
Ala Thr Phe Val Glu Asn Ala Asp Lys Val Ile Val Glu Ile Asn Glu
195 200 205
Ala Gln Pro Leu Glu Leu Glu Gly Met Ala Asp Ile Tyr Thr Leu Lys
210 215 220
Asn Pro Pro Arg Arg Glu Pro Ile Pro Ile Val Asn Ala Gly Asn Arg
225 230 235 240
Ile Gly Thr Thr Tyr Val Thr Cys Gly Ser Glu Lys Ile Cys Ala Ile
245 250 255
Val Met Thr Asn Thr Gln Asp Lys Thr Arg Pro Leu Thr Glu Val Ser
260 265 270
Pro Val Ser Gln Ala Ile Ser Asp Asn Leu Ile Gly Phe Leu Asn Lys
275 280 285
Glu Val Glu Glu Gly Lys Leu Pro Lys Asn Leu Leu Pro Ile Gln Ser
290 295 300
Gly Val Gly Ser Val Ala Asn Ala Val Leu Ala Gly Leu Cys Glu Ser
305 310 315 320
Asn Phe Lys Asn Leu Ser Cys Tyr Thr Glu Val Ile Gln Asp Ser Met
325 330 335
Leu Lys Leu Ile Lys Cys Gly Lys Ala Asp Val Val Ser Gly Thr Ser
340 345 350
Ile Ser Pro Ser Pro Glu Met Leu Pro Glu Phe Ile Lys Asp Ile Asn
355 360 365
Phe Phe Arg Glu Lys Ile Val Leu Arg Pro Gln Glu Ile Ser Asn Asn
370 375 380
Pro Glu Ile Ala Arg Arg Ile Gly Val Ile Ser Ile Asn Thr Ala Leu
385 390 395 400
Glu Val Asp Ile Tyr Gly Asn Val Asn Ser Thr His Val Met Gly Ser
405 410 415
Lys Met Met Asn Gly Ile Gly Gly Ser Gly Asp Phe Ala Arg Asn Ala
420 425 430
Tyr Leu Thr Ile Phe Thr Thr Glu Ser Ile Ala Lys Lys Gly Asp Ile
435 440 445
Ser Ser Ile Val Pro Met Val Ser His Val Asp His Thr Glu His Asp
450 455 460
Val Met Val Ile Val Thr Glu Gln Gly Val Ala Asp Leu Arg Gly Leu
465 470 475 480
Ser Pro Arg Glu Lys Ala Val Ala Ile Ile Glu Asn Cys Val His Pro
485 490 495
Asp Tyr Lys Asp Met Leu Met Glu Tyr Phe Glu Glu Ala Cys Lys Ser
500 505 510
Ser Gly Gly Asn Thr Pro His Asn Leu Glu Lys Ala Leu Ser Trp His
515 520 525
Thr Lys Phe Ile Lys Thr Gly Ser Met Lys
530 535
<210> 2
<211> 1617
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotides coding Cat1 enzyme
<400> 2
atgagtaaag ggataaagaa ttcacaattg aaaaaaaaga atgtaaaggc tagtaatgtg 60
gcagaaaaga ttgaagagaa agttgaaaaa acagataagg ttgttgaaaa ggcagctgag 120
gttacagaaa aacgaattag aaacttgaag cttcaggaaa aagttgtaac agcagatgtg 180
gcagctgata tgatagaaaa cggtatgatt gttgcaatta gcggatttac tccttccggg 240
tatcctaaag aagtacctaa agcattgact aaaaaagtta atgccttaga ggaagaattc 300
aaggtaacac tttatacagg ttcatctaca ggagccgata tagacggaga atgggcaaaa 360
gcaggaataa tagaaagaag aattccatat cagacaaatt ctgatatgag gaaaaaaata 420
aatgatggtt ctattaagta tgctgatatg catttaagcc atatggctca atatattaat 480
tattctgtaa ttcctaaagt agatatagct ataatagagg cagtagctat tacagaagaa 540
ggggatatta ttccttcaac aggaattgga aatacagcta cttttgtgga aaatgcagat 600
aaggtaatag tggaaattaa tgaggctcaa ccgcttgaat tggaaggtat ggcagatata 660
tatacattaa aaaaccctcc aagaagagag cccataccta tagttaatgc aggcaatagg 720
atagggacca catatgtgac ctgtggttct gaaaaaatat gcgctatagt gatgacaaat 780
acccaggata aaacaagacc tcttacagaa gtgtctcctg tatctcaggc tatatccgat 840
aatcttatag gatttttaaa taaagaggtt gaagagggaa aattacctaa gaacctgctt 900
cctatacagt caggagttgg aagtgtagca aatgcagttt tggccggact ttgtgaatca 960
aattttaaaa atttgagttg ttatacagaa gttatacagg attctatgct gaagcttata 1020
aaatgtggta aagcagatgt ggtgtcaggc acttccataa gtccttcacc ggagatgttg 1080
cctgagttca taaaggacat aaatttcttt agagaaaaga tagtattaag accacaggaa 1140
ataagtaata atccagagat agcaagaaga ataggagtta tatccataaa cactgctttg 1200
gaagtagata tatatggtaa tgtaaactcc actcatgtta tgggaagcaa aatgatgaat 1260
ggtataggcg gttctggaga ctttgccaga aatgcatatt tgactatatt cactacagag 1320
tctatcgcca aaaaaggaga tatatcatct atagttccta tggtatccca tgtggatcat 1380
acagaacatg atgtaatggt aattgttaca gaacagggag tagcagattt aagaggtctt 1440
tctcctaggg aaaaggccgt ggctataata gaaaattgtg ttcatcctga ttacaaggat 1500
atgcttatgg aatattttga agaggcttgt aagtcatcag gtggaaatac accacataat 1560
cttgaaaaag ctctttcctg gcatacaaaa tttataaaaa ctggtagtat gaaataa 1617
<210> 3
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SUCD enzyme
<400> 3
Met Glu Ile Lys Glu Met Val Ser Leu Ala Arg Lys Ala Gln Lys Glu
1 5 10 15
Tyr Gln Ala Thr His Asn Gln Glu Ala Val Asp Asn Ile Cys Arg Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Val Ile Tyr Glu Asn Ala Ala Ile Leu Ala Arg Glu Ala
35 40 45
Val Asp Glu Thr Gly Met Gly Val Tyr Glu His Lys Val Ala Lys Asn
50 55 60
Gln Gly Lys Ser Lys Gly Val Trp Tyr Asn Leu His Asn Lys Lys Ser
65 70 75 80
Ile Gly Ile Leu Asn Ile Asp Glu Arg Thr Gly Met Ile Glu Ile Ala
85 90 95
Lys Pro Ile Gly Val Val Gly Ala Val Thr Pro Thr Thr Asn Pro Ile
100 105 110
Val Thr Pro Met Ser Asn Ile Ile Phe Ala Leu Lys Thr Cys Asn Ala
115 120 125
Ile Ile Ile Ala Pro His Pro Arg Ser Lys Lys Cys Ser Ala His Ala
130 135 140
Val Arg Leu Ile Lys Glu Ala Ile Ala Pro Phe Asn Val Pro Glu Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Ile Ile Glu Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Gln Glu Leu
165 170 175
Met Gly Ala Val Asp Val Val Val Ala Thr Gly Gly Met Gly Met Val
180 185 190
Lys Ser Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ser Phe Gly Val Gly Ala Gly
195 200 205
Asn Val Gln Val Ile Val Asp Ser Asn Ile Asp Phe Glu Ala Ala Ala
210 215 220
Glu Lys Ile Ile Thr Gly Arg Ala Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Ser
225 230 235 240
Gly Glu Gln Ser Ile Ile Tyr Asn Glu Ala Asp Lys Glu Ala Val Phe
245 250 255
Thr Ala Phe Arg Asn His Gly Ala Tyr Phe Cys Asp Glu Ala Glu Gly
260 265 270
Asp Arg Ala Arg Ala Ala Ile Phe Glu Asn Gly Ala Ile Ala Lys Asp
275 280 285
Val Val Gly Gln Ser Val Ala Phe Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ile Asn
290 295 300
Ile Pro Glu Gly Thr Arg Ile Leu Val Val Glu Ala Arg Gly Val Gly
305 310 315 320
Ala Glu Asp Val Ile Cys Lys Glu Lys Met Cys Pro Val Met Cys Ala
325 330 335
Leu Ser Tyr Lys His Phe Glu Glu Gly Val Glu Ile Ala Arg Thr Asn
340 345 350
Leu Ala Asn Glu Gly Asn Gly His Thr Cys Ala Ile His Ser Asn Asn
355 360 365
Gln Ala His Ile Ile Leu Ala Gly Ser Glu Leu Thr Val Ser Arg Ile
370 375 380
Val Val Asn Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Gly Gly His Ile Gln Asn
385 390 395 400
Gly Leu Ala Val Thr Asn Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp Gly Asn Asn
405 410 415
Ser Ile Ser Glu Asn Phe Thr Tyr Lys His Leu Leu Asn Ile Ser Arg
420 425 430
Ile Ala Pro Leu Asn Ser Ser Ile His Ile Pro Asp Asp Lys Glu Ile
435 440 445
Trp Glu Leu
450
<210> 4
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotides coding SUCD enzyme
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4HBD enzyme
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Met Gln Leu Phe Lys Leu Lys Ser Val Thr His His Phe Asp Thr Phe
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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Ile Pro Leu Ile Lys Glu Lys Glu Leu Ile Ile Val Pro Thr Thr Cys
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130 135 140
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Ala Ile Ile Ile Pro Glu Leu Leu Lys Ser Leu Pro Phe His Phe Tyr
165 170 175
Ala Cys Ser Ala Ile Asp Ala Leu Ile His Ala Ile Glu Ser Tyr Val
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Ser Pro Lys Ala Ser Pro Tyr Ser Arg Leu Phe Ser Glu Ala Ala Trp
195 200 205
Asp Ile Ile Leu Glu Val Phe Lys Lys Ile Ala Glu His Gly Pro Glu
210 215 220
Tyr Arg Phe Glu Lys Leu Gly Glu Met Ile Met Ala Ser Asn Tyr Ala
225 230 235 240
Gly Ile Ala Phe Gly Asn Ala Gly Val Gly Ala Val His Ala Leu Ser
245 250 255
Tyr Pro Leu Gly Gly Asn Tyr His Val Pro His Gly Glu Ala Asn Tyr
260 265 270
Gln Phe Phe Thr Glu Val Phe Lys Val Tyr Gln Lys Lys Asn Pro Phe
275 280 285
Gly Tyr Ile Val Glu Leu Asn Trp Lys Leu Ser Lys Ile Leu Asn Cys
290 295 300
Gln Pro Glu Tyr Val Tyr Pro Lys Leu Asp Glu Leu Leu Gly Cys Leu
305 310 315 320
Leu Thr Lys Lys Pro Leu His Glu Tyr Gly Met Lys Asp Glu Glu Val
325 330 335
Arg Gly Phe Ala Glu Ser Val Leu Lys Thr Gln Gln Arg Leu Leu Ala
340 345 350
Asn Asn Tyr Val Glu Leu Thr Val Asp Glu Ile Glu Gly Ile Tyr Arg
355 360 365
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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290 295 300
Ala Glu Ser Gly Asp Phe Leu Arg Thr Ile His Glu Leu Leu Leu Ser
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Asp Gly Phe Trp Asp Glu Val Phe Arg Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Leu
325 330 335
Pro Val Arg Trp Ser Thr Asp Asn Pro Asp Ser Ile Val Asp Lys Asn
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Asp Arg Val Phe Lys Val Asp Gly Phe Ala Gly Ala Gln Tyr Lys Lys
405 410 415
Leu Arg Asp Val Leu Gly Leu Leu Arg Asp Ala Tyr Cys Arg His Ile
420 425 430
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435 440 445
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<213> Artificial Sequence
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<211> 1140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pyruvate carboxylase
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325 330 335
Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile
340 345 350
Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile
355 360 365
Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala
370 375 380
Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val
385 390 395 400
Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala
405 410 415
Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile
420 425 430
Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg
435 440 445
Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro
450 455 460
Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val
465 470 475 480
Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro
485 490 495
Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser
500 505 510
Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu
515 520 525
Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala
530 535 540
His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro
545 550 555 560
Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu
565 570 575
Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu
580 585 590
Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val
595 600 605
Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro
610 615 620
Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser
625 630 635 640
Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln
645 650 655
Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala
660 665 670
Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys
675 680 685
Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys
690 695 700
Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg
705 710 715 720
Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp
725 730 735
Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala
740 745 750
Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala
755 760 765
Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile
770 775 780
Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu
785 790 795 800
Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr
805 810 815
Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg
820 825 830
His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr
835 840 845
Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala
850 855 860
Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser
865 870 875 880
Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp
885 890 895
Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser
900 905 910
Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp
915 920 925
Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys
930 935 940
Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala
945 950 955 960
Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro
965 970 975
Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr
980 985 990
Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val
1025 1030 1035 1040
Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser
1045 1050 1055
Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys
1060 1065 1070
Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala
1075 1080 1085
Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala Ile Ile Glu Ala
1090 1095 1100
Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp
1105 1110 1115 1120
Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile
1125 1130 1135
Val Val Val Ser
1140
<210> 10
<211> 1140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pyruvate carboxylase
<400> 10
Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu
1 5 10 15
Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu
20 25 30
Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly
35 40 45
Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu
50 55 60
Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala
65 70 75 80
Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu
85 90 95
Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr
100 105 110
Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser
115 120 125
Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu
130 135 140
Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly
145 150 155 160
Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg
165 170 175
Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr
180 185 190
Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr
195 200 205
Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu
210 215 220
Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser
225 230 235 240
Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His
245 250 255
Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val
275 280 285
Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln
290 295 300
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305 310 315 320
Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu
325 330 335
Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile
340 345 350
Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile
355 360 365
Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala
370 375 380
Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val
385 390 395 400
Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala
405 410 415
Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile
420 425 430
Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg
435 440 445
Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Ser His Leu Leu Gln Ala Pro
450 455 460
Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val
465 470 475 480
Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro
485 490 495
Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser
500 505 510
Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu
515 520 525
Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala
530 535 540
His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro
545 550 555 560
Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu
565 570 575
Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu
580 585 590
Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val
595 600 605
Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro
610 615 620
Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser
625 630 635 640
Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln
645 650 655
Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala
660 665 670
Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys
675 680 685
Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys
690 695 700
Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg
705 710 715 720
Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp
725 730 735
Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala
740 745 750
Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala
755 760 765
Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile
770 775 780
Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu
785 790 795 800
Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr
805 810 815
Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg
820 825 830
His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr
835 840 845
Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala
850 855 860
Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser
865 870 875 880
Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp
885 890 895
Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser
900 905 910
Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp
915 920 925
Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys
930 935 940
Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala
945 950 955 960
Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro
965 970 975
Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr
980 985 990
Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg
995 1000 1005
Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg
1010 1015 1020
Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val
1025 1030 1035 1040
Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser
1045 1050 1055
Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys
1060 1065 1070
Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala
1075 1080 1085
Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala Ile Ile Glu Ala
1090 1095 1100
Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp
1105 1110 1115 1120
Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile
1125 1130 1135
Val Val Val Ser
1140
<210> 11
<211> 3423
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide coding pyruvate carboxylase
<400> 11
gtgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60
ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120
atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180
attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240
gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300
cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360
cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420
gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480
cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540
gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600
gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660
gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720
ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780
ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840
gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900
ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960
gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020
atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080
ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140
cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200
aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260
gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320
gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380
cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440
accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500
cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560
ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620
ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680
gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740
gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800
ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860
ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920
ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980
atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040
gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100
gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160
ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220
gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280
ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340
ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400
gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460
tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520
tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580
gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640
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gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760
cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820
tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880
gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940
gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000
ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060
ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120
gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180
accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240
ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300
atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360
cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420
taa 3423
<210> 12
<211> 1425
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotides coding lpd(lipoamide dehydrogenase)
<400> 12
atgagtactg aaatcaaaac tcaggtcgtg gtacttgggg caggccccgc aggttactcc 60
gctgccttcc gttgcgctga tttaggtctg gaaaccgtaa tcgtagaacg ttacaacacc 120
cttggcggtg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcta aagcactgct gcacgtagca 180
aaagttatcg aagaagccaa agcgctggct gaacacggta tcgtcttcgg cgaaccgaaa 240
accgatatcg acaagattcg tacctggaaa gagaaagtga tcaatcagct gaccggtggt 300
ctggctggta tggcgaaagg ccgcaaagtc aaagtggtca acggtctggg taaattcacc 360
ggggctaaca ccctggaagt tgaaggtgag aacggcaaaa ccgtgatcaa cttcgacaac 420
gcgatcattg cagcgggttc tcgcccgatc caactgccgt ttattccgca tgaagatccg 480
cgtatctggg actccactga cgcgctggaa ctgaaagaag taccagaacg cctgctggta 540
atgggtggcg gtatcatcgg tctggaaatg ggcaccgttt accacgcgct gggttcacag 600
attgacgtgg ttgaaatgtt cgaccaggtt atcccggcag ctgacaaaga catcgttaaa 660
gtcttcacca agcgtatcag caagaaattc aacctgatgc tggaaaccaa agttaccgcc 720
gttgaagcga aagaagacgg catttatgtg acgatggaag gcaaaaaagc acccgctgaa 780
ccgcagcgtt acgacgccgt gctggtagcg attggtcgtg tgccgaacgg taaaaacctc 840
gacgcaggca aagcaggcgt ggaagttgac gaccgtggtt tcatccgcgt tgacaaacag 900
ctgcgtacca acgtaccgca catctttgct atcggcgata tcgtcggtca accgatgctg 960
gcacacaaag gtgttcacga aggtcacgtt gccgctgaag ttatcgccgg taagaaacac 1020
tacttcgatc cgaaagttat cccgtccatc gcctataccg aaccagaagt tgcatgggtg 1080
ggtctgactg agaaagaagc gaaagagaaa ggcatcagct atgaaaccgc caccttcccg 1140
tgggctgctt ctggtcgtgc tatcgcttcc gactgcgcag acggtatgac caagctgatt 1200
ttcgacaaag aatctcaccg tgtgatcggt ggtgcgattg tcggtactaa cggcggcgag 1260
ctgctgggtg aaatcggcct ggcaatcgaa atgggttgtg atgctgaaga catcgcactg 1320
accatccacg cgcacccgac tctgcacgag tctgtgggcc tggcggcaga agtgttcgaa 1380
ggtagcatta ccgacctgcc gaacccgaaa gcgaagaaga agtaa 1425
<210> 13
<211> 2664
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotides coding aceE(pyruvate dehydrogenase)
<400> 13
atgtcagaac gtttcccaaa tgacgtggat ccgatcgaaa ctcgcgactg gctccaggcg 60
atcgaatcgg tcatccgtga agaaggtgtt gagcgtgctc agtatctgat cgaccaactg 120
cttgctgaag cccgcaaagg cggtgtaaac gtagccgcag gcacaggtat cagcaactac 180
atcaacacca tccccgttga agaacaaccg gagtatccgg gtaatctgga actggaacgc 240
cgtattcgtt cagctatccg ctggaacgcc atcatgacgg tgctgcgtgc gtcgaaaaaa 300
gacctcgaac tgggcggcca tatggcgtcc ttccagtctt ccgcaaccat ttatgatgtg 360
tgctttaacc acttcttccg tgcacgcaac gagcaggatg gcggcgacct ggtttacttc 420
cagggccaca tctccccggg cgtgtacgct cgtgctttcc tggaaggtcg tctgactcag 480
gagcagctgg ataacttccg tcaggaagtt cacggcaatg gcctctcttc ctatccgcac 540
ccgaaactga tgccggaatt ctggcagttc ccgaccgtat ctatgggtct gggtccgatt 600
ggtgctattt accaggctaa attcctgaaa tatctggaac accgtggcct gaaagatacc 660
tctaaacaaa ccgtttacgc gttcctcggt gacggtgaaa tggacgaacc ggaatccaaa 720
ggtgcgatca ccatcgctac ccgtgaaaaa ctggataacc tggtcttcgt tatcaactgt 780
aacctgcagc gtcttgacgg cccggtcacc ggtaacggca agatcatcaa cgaactggaa 840
ggcatcttcg aaggtgctgg ctggaacgtg atcaaagtga tgtggggtag ccgttgggat 900
gaactgctgc gtaaggatac cagcggtaaa ctgatccagc tgatgaacga aaccgttgac 960
ggcgactacc agaccttcaa atcgaaagat ggtgcgtacg ttcgtgaaca cttcttcggt 1020
aaatatcctg aaaccgcagc actggttgca gactggactg acgagcagat ctgggcactg 1080
aaccgtggtg gtcacgatcc gaagaaaatc tacgctgcat tcaagaaagc gcaggaaacc 1140
aaaggcaaag cgacagtaat ccttgctcat accattaaag gttacggcat gggcgacgcg 1200
gctgaaggta aaaacatcgc gcaccaggtt aagaaaatga acatggacgg tgtgcgtcat 1260
atccgcgacc gtttcaatgt gccggtgtct gatgcagata tcgaaaaact gccgtacatc 1320
accttcccgg aaggttctga agagcatacc tatctgcacg ctcagcgtca gaaactgcac 1380
ggttatctgc caagccgtca gccgaacttc accgagaagc ttgagctgcc gagcctgcaa 1440
gacttcggcg cgctgttgga agagcagagc aaagagatct ctaccactat cgctttcgtt 1500
cgtgctctga acgtgatgct gaagaacaag tcgatcaaag atcgtctggt accgatcatc 1560
gccgacgaag cgcgtacttt cggtatggaa ggtctgttcc gtcagattgg tatttacagc 1620
ccgaacggtc agcagtacac cccgcaggac cgcgagcagg ttgcttacta taaagaagac 1680
gagaaaggtc agattctgca ggaagggatc aacgagctgg gcgcaggttg ttcctggctg 1740
gcagcggcga cctcttacag caccaacaat ctgccgatga tcccgttcta catctattac 1800
tcgatgttcg gcttccagcg tattggcgat ctgtgctggg cggctggcga ccagcaagcg 1860
cgtggcttcc tgatcggcgg tacttccggt cgtaccaccc tgaacggcga aggtctgcag 1920
cacgaagatg gtcacagcca cattcagtcg ctgactatcc cgaactgtat ctcttacgac 1980
ccggcttacg cttacgaagt tgctgtcatc atgcatgacg gtctggagcg tatgtacggt 2040
gaaaaacaag agaacgttta ctactacatc actacgctga acgaaaacta ccacatgccg 2100
gcaatgccgg aaggtgctga ggaaggtatc cgtaaaggta tctacaaact cgaaactatt 2160
gaaggtagca aaggtaaagt tcagctgctc ggctccggtt ctatcctgcg tcacgtccgt 2220
gaagcagctg agatcctggc gaaagattac ggcgtaggtt ctgacgttta tagcgtgacc 2280
tccttcaccg agctggcgcg tgatggtcag gattgtgaac gctggaacat gctgcacccg 2340
ctggaaactc cgcgcgttcc gtatatcgct caggtgatga acgacgctcc ggcagtggca 2400
tctaccgact atatgaaact gttcgctgag caggtccgta cttacgtacc ggctgacgac 2460
taccgcgtac tgggtactga tggcttcggt cgttccgaca gccgtgagaa cctgcgtcac 2520
cacttcgaag ttgatgcttc ttatgtcgtg gttgcggcgc tgggcgaact ggctaaacgt 2580
ggcgaaatcg ataagaaagt ggttgctgac gcaatcgcca aattcaacat cgatgcagat 2640
aaagttaacc cgcgtctggc gtag 2664
<210> 14
<211> 1893
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotides coding aceF(dihydrolipoamide acetyltransferase)
<400> 14
atggctatcg aaatcaaagt accggacatc ggggctgatg aagttgaaat caccgagatc 60
ctggtcaaag tgggcgacaa agttgaagcc gaacagtcgc tgatcaccgt agaaggcgac 120
aaagcctcta tggaagttcc gtctccgcag gcgggtatcg ttaaagagat caaagtctct 180
gttggcgata aaacccagac cggcgcactg attatgattt tcgattccgc cgacggtgca 240
gcagacgctg cacctgctca ggcagaagag aagaaagaag cagctccggc agcagcacca 300
gcggctgcgg cggcaaaaga cgttaacgtt ccggatatcg gcagcgacga agttgaagtg 360
accgaaatcc tggtgaaagt tggcgataaa gttgaagctg aacagtcgct gatcaccgta 420
gaaggcgaca aggcttctat ggaagttccg gctccgtttg ctggcaccgt gaaagagatc 480
aaagtgaacg tgggtgacaa agtgtctacc ggctcgctga ttatggtctt cgaagtcgcg 540
ggtgaagcag gcgcggcagc tccggccgct aaacaggaag cagctccggc agcggcccct 600
gcaccagcgg ctggcgtgaa agaagttaac gttccggata tcggcggtga cgaagttgaa 660
gtgactgaag tgatggtgaa agtgggcgac aaagttgccg ctgaacagtc actgatcacc 720
gtagaaggcg acaaagcttc tatggaagtt ccggcgccgt ttgcaggcgt cgtgaaggaa 780
ctgaaagtca acgttggcga taaagtgaaa actggctcgc tgattatgat cttcgaagtt 840
gaaggcgcag cgcctgcggc agctcctgcg aaacaggaag cggcagcgcc ggcaccggca 900
gcaaaagctg aagccccggc agcagcacca gctgcgaaag cggaaggcaa atctgaattt 960
gctgaaaacg acgcttatgt tcacgcgact ccgctgatcc gccgtctggc acgcgagttt 1020
ggtgttaacc ttgcgaaagt gaagggcact ggccgtaaag gtcgtatcct gcgcgaagac 1080
gttcaggctt acgtgaaaga agctatcaaa cgtgcagaag cagctccggc agcgactggc 1140
ggtggtatcc ctggcatgct gccgtggccg aaggtggact tcagcaagtt tggtgaaatc 1200
gaagaagtgg aactgggccg catccagaaa atctctggtg cgaacctgag ccgtaactgg 1260
gtaatgatcc cgcatgttac tcacttcgac aaaaccgata tcaccgagtt ggaagcgttc 1320
cgtaaacagc agaacgaaga agcggcgaaa cgtaagctgg atgtgaagat caccccggtt 1380
gtcttcatca tgaaagccgt tgctgcagct cttgagcaga tgcctcgctt caatagttcg 1440
ctgtcggaag acggtcagcg tctgaccctg aagaaataca tcaacatcgg tgtggcggtg 1500
gataccccga acggtctggt tgttccggta ttcaaagacg tcaacaagaa aggcatcatc 1560
gagctgtctc gcgagctgat gactatttct aagaaagcgc gtgacggtaa gctgactgcg 1620
ggcgaaatgc agggcggttg cttcaccatc tccagcatcg gcggcctggg tactacccac 1680
ttcgcgccga ttgtgaacgc gccggaagtg gctatcctcg gcgtttccaa gtccgcgatg 1740
gagccggtgt ggaatggtaa agagttcgtg ccgcgtctga tgctgccgat ttctctctcc 1800
ttcgaccacc gcgtgatcga cggtgctgat ggtgcccgtt tcattaccat cattaacaac 1860
acgctgtctg acattcgccg tctggtgatg taa 1893
<210> 15
<211> 401
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> formate dehydrogenase
<400> 15
Met Ala Lys Val Leu Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro
20 25 30
Gly Gly Gln Ile Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly
35 40 45
Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Glu Tyr Leu
50 55 60
Glu Ser Asn Gly His Thr Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Phe Glu Arg Glu Leu Val Asp Ala Asp Val Val Ile Ser
85 90 95
Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Pro Glu Arg Ile Ala Lys Ala
100 105 110
Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val
115 120 125
Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Asn Val Thr Val Ala Glu Val Thr
130 135 140
Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu
145 150 155 160
Ser Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Glu Trp Ala Arg Lys Gly
165 170 175
Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser His Ala Tyr Asp Leu Glu Ala
180 185 190
Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu
195 200 205
Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val His Leu His Tyr Thr Asp Arg His
210 215 220
Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr Trp His Ala
225 230 235 240
Thr Arg Glu Asp Met Tyr Pro Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys
245 250 255
Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Glu Thr Leu Lys
260 265 270
Leu Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu
275 280 285
Cys Asp Arg Asp Ala Val Ala Arg Ala Leu Glu Ser Gly Arg Leu Ala
290 295 300
Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His
305 310 315 320
Pro Trp Arg Thr Met Pro Tyr Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly
325 330 335
Thr Thr Leu Thr Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile
340 345 350
Leu Glu Cys Phe Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile
355 360 365
Val Gln Gly Gly Ala Leu Ala Gly Thr Gly Ala His Ser Tyr Ser Lys
370 375 380
Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Lys Ala
385 390 395 400
Val
<210> 16
<211> 1206
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotides coding formate dehydrogenase
<400> 16
atggctaagg tcctgtgcgt tctttacgat gatccagttg acggctaccc taagacctac 60
gcccgcgacg atcttccaaa gatcgaccac taccctggcg gccagatcct cccaacccca 120
aaggccatcg acttcacccc tggccagctc ctcggctccg tctccggcga actcggcctg 180
cgcgaatacc tcgaatccaa cggccacacc ctggtcgtta cctccgacaa ggacggccca 240
gactccgttt tcgagcgcga gctggtcgat gcagatgtcg tcatctccca gccattctgg 300
ccagcctacc tgaccccaga gcgcatcgcc aaggctaaga acctgaagct cgctctcacc 360
gctggcatcg gttccgacca cgtcgatctt cagtccgcta tcgaccgcaa cgtcaccgtt 420
gcagaagtca cctactgcaa ctccatcagc gtcgccgagc acgtggttat gatgatcctg 480
tccctggttc gcaactacct gccttcccac gaatgggcgc gcaagggcgg ctggaacatc 540
gccgactgcg tctcccacgc ctacgacctc gaagctatgc acgtcggcac cgttgctgcc 600
ggccgcatcg gtctcgcagt tctgcgccgt ctggcaccat tcgacgttca cctgcactac 660
accgaccgtc accgcctgcc tgaatccgtc gagaaggaac tcaacctcac ctggcacgca 720
acccgcgagg acatgtaccc agtttgcgac gtggttaccc tgaactgccc actgcaccca 780
gaaaccgagc acatgatcaa tgacgagacc ctgaagctgt tcaagcgtgg cgcctacatc 840
gtcaacaccg cacgcggcaa gctgtgcgac cgcgatgctg ttgcacgtgc tctcgaatcc 900
ggccgcctgg ccggctacgc cggcgacgtt tggttcccac agcctgcacc aaaggaccac 960
ccatggcgca ccatgccata caacggcatg accccacaca tctccggcac caccctgacc 1020
gcacaggcac gttacgcagc aggcacccgc gagatcctgg agtgcttctt cgagggccgt 1080
cctatccgcg acgaatacct catcgttcag ggcggcgctc ttgctggcac cggcgcacat 1140
tcctactcca agggcaatgc caccggcggt tccgaagagg ccgctaagtt caagaaggca 1200
gtctga 1206
<210> 17
<211> 500
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MQO malate:quinone oxidoreductase
<400> 17
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1 5 10 15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
20 25 30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
50 55 60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65 70 75 80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
85 90 95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp
100 105 110
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
115 120 125
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
130 135 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145 150 155 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
165 170 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
180 185 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
195 200 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
210 215 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225 230 235 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
245 250 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
260 265 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
275 280 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
290 295 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305 310 315 320
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
325 330 335
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
340 345 350
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
355 360 365
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
370 375 380
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385 390 395 400
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
405 410 415
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
420 425 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
435 440 445
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
450 455 460
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465 470 475 480
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
485 490 495
Leu Glu Glu Ala
500
<210> 18
<211> 1503
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MQO malate:quinone oxidoreductase
<400> 18
atgtcagatt ccccgaagaa cgcaccgagg attaccgatg aggcagatgt agttctcatt 60
ggtgccggta tcatgagctc cacgctgggt gcaatgctgc gtcagctgga gccaagctgg 120
actcagatcg tcttcgagcg tttggatgga ccggcacaag agtcgtcctc cccgtggaac 180
aatgcaggaa ccggccactc tgctctatgc gagctgaact acaccccaga ggttaagggc 240
aaggttgaaa ttgccaaggc tgtaggaatc aacgagaagt tccaggtttc ccgtcagttc 300
tggtctcacc tcgttgaaga gggagtgctg tctgatccta aggaattcat caaccctgtt 360
cctcacgtat ctttcggcca gggcgcagat caggttgcat acatcaaggc tcgctacgaa 420
gctttgaagg atcacccact cttccagggc atgacctacg ctgacgatga agctaccttc 480
accgagaagc tgcctttgat ggcaaagggc cgtgacttct ctgatccagt agcaatctct 540
tggatcgatg aaggcaccga catcaactac ggtgctcaga ccaagcagta cctggatgca 600
gctgaagttg aaggcactga aatccgctat ggccacgaag tcaagagcat caaggctgat 660
ggcgcaaagt ggatcgtgac cgtcaagaac gtacacactg gcgacaccaa gaccatcaag 720
gcaaacttcg tgttcgtcgg cgcaggcgga tacgcactgg atctgcttcg cagcgcaggc 780
atcccacagg tcaagggctt cgctggattc ccagtatccg gcctgtggct tcgttgcacc 840
aacgaggaac tgatcgagca gcacgcagcc aaggtatatg gcaaggcatc tgttggcgct 900
cctccaatgt ctgttcctca ccttgacacc cgcgttatcg agggtgaaaa gggtctgctc 960
tttggacctt acggtggctg gacccctaag ttcttgaagg aaggctccta cctggacctg 1020
ttcaagtcca tccgcccaga caacattcct tcctaccttg gcgttgctgc tcaggaattt 1080
gatctgacca agtaccttgt cactgaagtt ctcaaggacc aggacaagcg tatggatgct 1140
cttcgcgagt acatgccaga ggcacaaaac ggcgattggg agaccatcgt tgccggacag 1200
cgtgttcagg ttattaagcc tgcaggattc cctaagttcg gttccctgga attcggcacc 1260
accttgatca acaactccga aggcaccatc gccggattgc tcggtgcttc ccctggagca 1320
tccatcgcac cttccgcaat gatcgagctg cttgagcgtt gcttcggtga ccgcatgatc 1380
gagtggggcg acaagctgaa ggacatgatc ccttcctacg gcaagaagct tgcttccgag 1440
ccagcactgt ttgagcagca gtgggcacgc acccagaaga ccctgaagct tgaggaagcc 1500
taa 1503
<210> 19
<211> 610
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCKG phosphoenolpyruvate carboxykinase
<400> 19
Met Thr Thr Ala Ala Ile Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys
1 5 10 15
Asn Lys Glu Leu Leu Asn Trp Ile Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln
20 25 30
Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg
35 40 45
Met Ala Glu Asp Leu Val Glu Ala Gly Thr Leu Ile Lys Leu Asn Glu
50 55 60
Glu Lys Arg Pro Asn Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val
65 70 75 80
Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe Ile Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp
85 90 95
Ala Gly Pro Thr Asn Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu
100 105 110
Met Ser Lys His Tyr Ala Gly Ser Met Lys Gly Arg Thr Met Tyr Val
115 120 125
Val Pro Phe Cys Met Gly Pro Ile Ser Asp Pro Asp Pro Lys Leu Gly
130 135 140
Val Gln Leu Thr Asp Ser Glu Tyr Val Val Met Ser Met Arg Ile Met
145 150 155 160
Thr Arg Met Gly Ile Glu Ala Leu Asp Lys Ile Gly Ala Asn Gly Ser
165 170 175
Phe Val Arg Cys Leu His Ser Val Gly Ala Pro Leu Glu Pro Gly Gln
180 185 190
Glu Asp Val Ala Trp Pro Cys Asn Asp Thr Lys Tyr Ile Thr Gln Phe
195 200 205
Pro Glu Thr Lys Glu Ile Trp Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Asn
210 215 220
Ala Ile Leu Ala Lys Lys Cys Tyr Ala Leu Arg Ile Ala Ser Val Met
225 230 235 240
Ala Arg Glu Glu Gly Trp Met Ala Glu His Met Leu Ile Leu Lys Leu
245 250 255
Ile Asn Pro Glu Gly Lys Ala Tyr His Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ser
260 265 270
Ala Cys Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met Ile Thr Pro Thr Ile Pro Gly
275 280 285
Trp Thr Ala Gln Val Val Gly Asp Asp Ile Ala Trp Leu Lys Leu Arg
290 295 300
Glu Asp Gly Leu Tyr Ala Val Asn Pro Glu Asn Gly Phe Phe Gly Val
305 310 315 320
Ala Pro Gly Thr Asn Tyr Ala Ser Asn Pro Ile Ala Met Lys Thr Met
325 330 335
Glu Pro Gly Asn Thr Leu Phe Thr Asn Val Ala Leu Thr Asp Asp Gly
340 345 350
Asp Ile Trp Trp Glu Gly Met Asp Gly Asp Ala Pro Ala His Leu Ile
355 360 365
Asp Trp Met Gly Asn Asp Trp Thr Pro Glu Ser Asp Glu Asn Ala Ala
370 375 380
His Pro Asn Ser Arg Tyr Cys Val Ala Ile Asp Gln Ser Pro Ala Ala
385 390 395 400
Ala Pro Glu Phe Asn Asp Trp Glu Gly Val Lys Ile Asp Ala Ile Leu
405 410 415
Phe Gly Gly Arg Arg Ala Asp Thr Val Pro Leu Val Thr Gln Thr Tyr
420 425 430
Asp Trp Glu His Gly Thr Met Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Gln
435 440 445
Thr Ala Ala Ser Ala Glu Ala Lys Val Gly Thr Leu Arg His Asp Pro
450 455 460
Met Ala Met Leu Pro Phe Ile Gly Tyr Asn Ala Gly Glu Tyr Leu Gln
465 470 475 480
Asn Trp Ile Asp Met Gly Asn Lys Gly Gly Asp Lys Met Pro Ser Ile
485 490 495
Phe Leu Val Asn Trp Phe Arg Arg Gly Glu Asp Gly Arg Phe Leu Trp
500 505 510
Pro Gly Phe Gly Asp Asn Ser Arg Val Leu Lys Trp Val Ile Asp Arg
515 520 525
Ile Glu Gly His Val Gly Ala Asp Glu Thr Val Val Gly His Thr Ala
530 535 540
Lys Ala Glu Asp Leu Asp Leu Asp Gly Leu Asp Thr Pro Ile Glu Asp
545 550 555 560
Val Lys Glu Ala Leu Thr Ala Pro Ala Glu Gln Trp Ala Asn Asp Val
565 570 575
Glu Asp Asn Ala Glu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Pro Arg Val Pro Ala
580 585 590
Glu Val His Ser Gln Phe Asp Ala Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ala
595 600 605
His Ala
610
<210> 20
<211> 1833
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCKG phosphoenolpyruvate carboxykinase
<400> 20
atgactactg ctgcaatcag gggccttcag ggcgaggcgc cgaccaagaa taaggaactg 60
ctgaactgga tcgcagacgc cgtcgagctc ttccagcctg aggctgttgt gttcgttgat 120
ggatcccagg ctgagtggga tcgcatggcg gaggatcttg ttgaagccgg taccctcatc 180
aagctcaacg aggaaaagcg tccgaacagc tacctagctc gttccaaccc atctgacgtt 240
gcgcgcgttg agtcccgcac cttcatctgc tccgagaagg aagaagatgc tggcccaacc 300
aacaactggg ctccaccaca ggcaatgaag gacgaaatgt ccaagcatta cgctggttcc 360
atgaaggggc gcaccatgta cgtcgtgcct ttctgcatgg gtccaatcag cgatccggac 420
cctaagcttg gtgtgcagct cactgactcc gagtacgttg tcatgtccat gcgcatcatg 480
acccgcatgg gtattgaagc gctggacaag atcggcgcga acggcagctt cgtcaggtgc 540
ctccactccg ttggtgctcc tttggagcca ggccaggaag acgttgcatg gccttgcaac 600
gacaccaagt acatcaccca gttcccagag accaaggaaa tttggtccta cggttccggc 660
tacggcggaa acgcaatcct ggcaaagaag tgctacgcac tgcgtatcgc atctgtcatg 720
gctcgcgaag aaggatggat ggctgagcac atgctcatcc tgaagctgat caacccagag 780
ggcaaggcgt accacatcgc agcagcattc ccatctgctt gtggcaagac caacctcgcc 840
atgatcactc caaccatccc aggctggacc gctcaggttg ttggcgacga catcgcttgg 900
ctgaagctgc gcgaggacgg cctctacgca gttaacccag aaaatggttt cttcggtgtt 960
gctccaggca ccaactacgc atccaaccca atcgcgatga agaccatgga accaggcaac 1020
accctgttca ccaacgtggc actcaccgac gacggcgaca tctggtggga aggcatggac 1080
ggcgacgccc cagctcacct cattgactgg atgggcaacg actggacccc agagtccgac 1140
gaaaacgctg ctcaccctaa ctcccgttac tgcgtagcaa tcgaccagtc cccagcagca 1200
gcacctgagt tcaacgactg ggaaggcgtc aagatcgacg caatcctctt cggtggacgt 1260
cgcgcagaca ccgtcccact ggttacccag acctacgact gggagcacgg caccatggtt 1320
ggtgcactgc tcgcatccgg tcagaccgca gcttccgcag aagcaaaggt cggcacactc 1380
cgccacgacc caatggcaat gctcccattc attggctaca acgctggtga atacctgcag 1440
aactggattg acatgggtaa caagggtggc gacaagatgc catccatctt cctggtcaac 1500
tggttccgcc gtggcgaaga tggacgcttc ctgtggcctg gcttcggcga caactctcgc 1560
gttctgaagt gggtcatcga ccgcatcgaa ggccacgttg gcgcagacga gaccgttgtt 1620
ggacacaccg ctaaggccga agacctcgac ctcgacggcc tcgacacccc aattgaggat 1680
gtcaaggaag cactgaccgc tcctgcagag cagtgggcaa acgacgttga agacaacgcc 1740
gagtacctca ctttcctcgg accacgtgtt cctgcagagg ttcacagcca gttcgatgct 1800
ctgaaggccc gcatttcagc agctcacgct taa 1833
<210> 21
<211> 490
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GABD3 NAD-dependent aldehyde dehydrogenase
<400> 21
Met Thr Ile Asn Val Ser Glu Leu Leu Ala Lys Val Pro Thr Gly Leu
1 5 10 15
Leu Ile Gly Asp Ser Trp Val Glu Ala Ser Asp Gly Gly Thr Phe Asp
20 25 30
Val Glu Asn Pro Ala Thr Gly Glu Thr Ile Ala Thr Leu Ala Ser Ala
35 40 45
Thr Ser Glu Asp Ala Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Cys Ala Val Gln
50 55 60
Ala Glu Trp Ala Arg Met Pro Ala Arg Glu Arg Ser Asn Ile Leu Arg
65 70 75 80
Arg Gly Phe Glu Leu Val Ala Glu Arg Ala Glu Glu Phe Ala Thr Leu
85 90 95
Met Thr Leu Glu Met Gly Lys Pro Leu Ala Glu Ala Arg Gly Glu Val
100 105 110
Thr Tyr Gly Asn Glu Phe Leu Arg Trp Phe Ser Glu Glu Ala Val Arg
115 120 125
Leu Tyr Gly Arg Tyr Gly Thr Thr Pro Glu Gly Asn Leu Arg Met Leu
130 135 140
Thr Ala Leu Lys Pro Val Gly Pro Cys Leu Leu Ile Thr Pro Trp Asn
145 150 155 160
Phe Pro Leu Ala Met Ala Thr Arg Lys Val Ala Pro Ala Ile Ala Ala
165 170 175
Gly Cys Val Met Val Leu Lys Pro Ala Arg Leu Thr Pro Leu Thr Ser
180 185 190
Gln Tyr Phe Ala Gln Thr Met Leu Asp Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val
195 200 205
Leu Asn Val Val Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ile Ser Asn Pro Ile
210 215 220
Met Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Val Ser Phe Thr Gly Ser Thr Pro
225 230 235 240
Val Gly Gln Gln Leu Leu Lys Lys Ala Ala Asp Lys Val Leu Arg Thr
245 250 255
Ser Met Glu Leu Gly Gly Asn Ala Pro Phe Ile Val Phe Glu Asp Ala
260 265 270
Asp Leu Asp Leu Ala Ile Glu Gly Ala Met Gly Ala Lys Met Arg Asn
275 280 285
Ile Gly Glu Ala Cys Thr Ala Ala Asn Arg Phe Leu Val His Glu Ser
290 295 300
Val Ala Asp Glu Phe Gly Arg Arg Phe Ala Ala Arg Leu Glu Glu Gln
305 310 315 320
Val Leu Gly Asn Gly Leu Asp Glu Gly Val Thr Val Gly Pro Leu Val
325 330 335
Glu Glu Lys Ala Arg Asp Ser Val Ala Ser Leu Val Asp Ala Ala Val
340 345 350
Ala Glu Gly Ala Thr Val Leu Thr Gly Gly Lys Ala Gly Thr Gly Ala
355 360 365
Gly Tyr Phe Tyr Glu Pro Thr Val Leu Thr Gly Val Ser Thr Asp Ala
370 375 380
Ala Ile Leu Asn Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Ala Pro Ile Val Thr
385 390 395 400
Phe Gln Thr Glu Glu Glu Ala Leu Arg Leu Ala Asn Ser Thr Glu Tyr
405 410 415
Gly Leu Ala Ser Tyr Val Phe Thr Gln Asp Thr Ser Arg Ile Phe Arg
420 425 430
Val Ser Asp Gly Leu Glu Phe Gly Leu Val Gly Val Asn Ser Gly Val
435 440 445
Ile Ser Asn Ala Ala Ala Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Met
450 455 460
Gly Arg Glu Gly Gly Leu Glu Gly Ile Glu Glu Tyr Thr Ser Val Gln
465 470 475 480
Tyr Ile Gly Ile Arg Asp Pro Tyr Ala Gly
485 490
<210> 22
<211> 1473
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum(Ncgl0049)
<400> 22
atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 60
tcctgggtgg aagcatccga cggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 120
acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca 180
tgcgctgttc aggccgagtg ggctaggatg ccagcgcgcg agcgttctaa tattttacgc 240
cgcggttttg agctcgtagc agaacgtgca gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa 300
atgggcaagc ctttggctga agctcgcggc gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc 360
tggttctctg aggaagcagt tcgtctgtat ggccgttacg gaaccacacc agaaggcaac 420
ttgcggatgc tgaccgccct caagccagtt ggcccgtgcc tcctgatcac cccatggaac 480
ttcccactag caatggctac ccgcaaggtc gcacctgcga tcgctgcagg ttgtgtcatg 540
gtgctcaagc cagctcgact taccccgctg acctcccagt attttgctca gaccatgctt 600
gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt 660
tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt cgtaaagtct ccttcaccgg ctccacccca 720
gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc gataaagttc tgcgcacctc catggaactt 780
ggtggcaacg cacctttcat tgtcttcgag gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt 840
gccatgggtg ccaaaatgcg caacatcggc gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttctta 900
gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc cgtcgcttcg ctgcccgcct tgaagagcaa 960
gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc accgtgggcc ccctggttga ggaaaaagca 1020
cgagacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc gccgtcgccg aaggtgccac cgtcctcacc 1080
ggcggcaagg ccggcacagg tgcaggctac ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt 1140
tcaacagatg cggctatcct gaacgaagag atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc 1200
ttccaaaccg aggaagaagc cctgcgtcta gccaactcca ccgaatacgg actggcctcc 1260
tatgtgttca cccaggacac ctcacgtatt ttccgcgtct ccgatggtct cgagttcggc 1320
ctagtgggcg tcaattccgg tgtcatctct aacgctgctg caccttttgg tggcgtaaaa 1380
caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc gaaggaatcg aggagtacac ctccgtgcag 1440
tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc tag 1473
<210> 23
<211> 1362
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum(Ncgl0463)
<400> 23
gtgtctttga ccttcccagt aatcaacccc agcgatggct ccaccatcac cgagctagaa 60
aaccacgatt ccacccagtg gatgtccgcg ctctctgatg cagttgcagc tggtccttca 120
tgggctgcga aaactccccg cgaaagatcc gtggtactca ccgcaatctt cgaagcactg 180
accgaacgcg cccaagaact tgcagagatc atccacctgg aagctggaaa atccgttgca 240
gaagctcttg gtgaagtcgc ttatggtgca gaatacttcc gttggtttgc ggaagaagca 300
gtgcgcctgc ccggccgcta cggacagtca ccttccggaa tcggtcacat cgccgtcacc 360
cgcgcacccg tgggaccagt gctggcgatc accccatgga atttccccat cgccatggcc 420
acccgcaaaa tcgccccagc cctggccgct ggttgccccg tgttggtgaa acctgcttcc 480
gaaaccccac tgaccatggt caaagtgggg gagatcatcg cctccgtctt tgataccttt 540
aatatcccgc agggcttggt ctcaatcatc accaccactc gagatgcaga gctatcggca 600
gaactcatgg ctgatcctcg cttggctaaa gtcaccttca ctggatcaac caacgtggga 660
cgcatcctgg tccgccaatc cgcggaccga ctgctgcgca cctccatgga actcggcgga 720
aatgcagctt ttgttatcga cgaagccgca gacctcgacg aagccgtatc cggtgccatc 780
gccgcaaaac tccgcaacgc cggccaagta tgcatcgcag ctaaccgttt cttggttcat 840
gaatcccgcg ctgccgaatt cacctcaaag ctggcgacag ccatgcagaa cactcccatt 900
gggccggtga tttctgcccg ccaacgcgac cggatcgcag cactagtgga tgaagccatc 960
accgacggcg cccgcctcat catcggtggg gaggtccccg acggctccgg cttcttctat 1020
ccagccacca tcttggccga tgtccctgca cagtcacgga ttgtgcatga ggaaatcttc 1080
ggacctgtgg ccaccattgc cactttcacc gacttggccg aaggcgttgc acaagcaaat 1140
tccaccgaat tcggcctcgc agcctacgga ttcagcaaca atgtgaaagc aacacagtac 1200
atggcggaac acttggaagc cggaatggtc ggaatcaaca gaggcgccat ctctgaccca 1260
gcagcacctt ttggcggcat cggacaatcc ggcttcggca gagaaggcgg aaccgaagga 1320
atcgaagaat atctctccgt gcgttacctc gctttgccgt ga 1362
<210> 24
<211> 1566
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum(Ncgl2619)
<400> 24
atgatcaaac gtcttccttt aggtccgctg cctaaagaac ttcatcagac tctgcttgat 60
ctgaccgcaa atgcccaaga tgcggcgaaa gtggaggtta tagcgccatt tactggcgag 120
accctcggat ttgtttttga tggtgatgag caagacgtcg agcatgcttt tgcactttca 180
agggcagccc agaaaaagtg ggtgcacacc acggcagtgg aacggaagaa gatcttcctg 240
aagtttcatg atctggtatt gaaaaaccgt gagctgctca tggacatcgt gcagttggaa 300
acaggcaaaa atcgagcatc ggctgccgat gaggtgttgg acgttgcgat caccacccgc 360
ttctacgcaa acaatgcagg aaagttttta aatgacaaga aacgccccgg cgcgcttccg 420
atcatcacga aaaacacaca acagtatgtg cccaagggag tggtcgggca gatcacgccg 480
tggaattacc ctttaacttt gggagtatct gatgctgttc cggcgctgct ggcaggaaac 540
gcagtggtgg ctaaacctga cctcgcgaca cctttctcct gcttgatcat ggtgcacctg 600
ctcattgaag ccggtctgcc gcgtgatttg atgcaggttg tcaccggccc tggcgatatt 660
gttggcggtg cgattgcagc tcagtgtgat ttcctcatgt tcactggatc cacggccacg 720
ggccggatct tgggtcggac aatgggtgag cgtttggtgg gtttctctgc ggaattaggc 780
ggaaagaacc ctcttattgt ggccaaggat gcagatctgg acaaggtgga agctgagctt 840
ccgcaggcgt gtttttccaa ctcggggcaa ttgtgtgtct ccactgaacg tatttatgtc 900
gaggaagacg tgtacgagga ggtgattgca cggtttagca aggcggcgaa agccatgtcc 960
attggtgccg gatttgagtg gaaatatgag atgggttcgt tgatcaatca ggcgcagctg 1020
gatcgggtga gcacctttgt tgatcaggct aaagctgcgg gcgccacggt gctgtgcggt 1080
ggcaagtcac gccctgatat tggtcccttc ttctatgagc ccacggtatt ggcggatgtc 1140
ccagagggca ccccactgct cacggaggaa gtcttcgggc cggtggtgtt catcgaaaag 1200
gtagccacac tggaagaagc cgtcgataag gcaaatggca cgccctacgg cctgaatgcg 1260
tccgtctttg ggtcgtcgga aaccggcaat cttgttgcag gccagctgga agctggcggt 1320
atcggtatta atgatggcta cgccgcgacg tgggcgagcg tgtccacgcc tctgggtggc 1380
atgaagcagt cggggctggg gcaccgccat ggtgcggagg gaattacaaa atatgcggag 1440
atccgaaaca tcgcggagca gcgctggatg tctatgcgtg ggccggccaa aatgccgcga 1500
aaggtgtact cagacaccgt ggccacagcg ctaaagctgg gcaaaatctt taaagttttg 1560
ccgtag 1566
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for removing LDH
<400> 25
gcaggcatgc aagcttctag tctggggagc gaaacc 36
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for removing LDH
<400> 26
gagctcagtc agtcatggac gccacgagga agatg 35
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for removing LDH
<400> 27
tgactgactg agctcctgga caaagaccca gagct 35
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for removing LDH
<400> 28
ggccagtgcc aagcttttgc gggcaccaac gtaatg 36
<210> 29
<211> 230
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> deleted ldh sequences
<400> 29
acccagtgga tatcctgacc tacgcagtgt ggaaattctc cggcttggaa tggaaccgcg 60
tgatcggctc cggaactgtc ctggactccg ctcgattccg ctacatgctg ggcgaactct 120
acgaagtggc accaagctcc gtccacgcct acatcatcgg cgaacacggc gacactgaac 180
ttccagtcct gtcctccgcg accatcgcag gcgtatcgct tagccgaatg 230
<210> 30
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for deleting Mqo
<400> 30
ctgcaggtcg actctagaga agaagtagtc cgtcatgccg tgaacc 46
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for deleting Mqo
<400> 31
tagaagatta tttttgactg acgcgtgggg cg 32
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for deleting Mqo
<400> 32
gtcaaaaata atcttctaac tgctttcttt aaagcacccg 40
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for deleting Mqo
<400> 33
ctcggtaccc ggggatcctc ttaaagcctg agatagcgag ttcca 45
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for deleting pckG
<400> 34
gctctagagt catgtattta ggtagggc 28
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for deleting pckG
<400> 35
atctgaaagc atgcatttgc aacgacacca agt 33
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for deleting pckG
<400> 36
gttgcaaatg catgctttca gatacagaac tag 33
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequences for deleting pckG
<400> 37
gctctagaca gtcgttgaac tcaggt 26
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequences for substituting Pro to Ser in PYC
<400> 38
gctctagatt gagcacaccg tgact 25
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequences for substituting Pro to Ser in PYC
<400> 39
ccggattcat tgccgatcac tc 22
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequences for substituting Pro to Ser in PYC
<400> 40
gctctagact gtcccacgga tcctcaaa 28
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequences for substituting Pro to Ser in PYC
<400> 41
ctgaaggagg tgcgagtga 19
<210> 42
<211> 945
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032(NCgl2810)
<400> 42
atgaaagaaa ccgtcggtaa caagattgtc ctcattggcg caggagatgt tggagttgca 60
tacgcatacg cactgatcaa ccagggcatg gcagatcacc ttgcgatcat cgacatcgat 120
gaaaagaaac tcgaaggcaa cgtcatggac ttaaaccatg gtgttgtgtg ggccgattcc 180
cgcacccgcg tcaccaaggg cacctacgct gactgcgaag acgcagccat ggttgtcatt 240
tgtgccggcg cagcccaaaa gccaggcgag acccgcctcc agctggtgga caaaaacgtc 300
aagattatga aatccatcgt cggcgatgtc atggacagcg gattcgacgg catcttcctc 360
gtggcgtcca acccagtgga tatcctgacc tacgcagtgt ggaaattctc cggcttggaa 420
tggaaccgcg tgatcggctc cggaactgtc ctggactccg ctcgattccg ctacatgctg 480
ggcgaactct acgaagtggc accaagctcc gtccacgcct acatcatcgg cgaacacggc 540
gacactgaac ttccagtcct gtcctccgcg accatcgcag gcgtatcgct tagccgaatg 600
ctggacaaag acccagagct tgagggccgt ctagagaaaa ttttcgaaga cacccgcgac 660
gctgcctatc acattatcga cgccaagggc tccacttcct acggcatcgg catgggtctt 720
gctcgcatca cccgcgcaat cctgcagaac caagacgttg cagtcccagt ctctgcactg 780
ctccacggtg aatacggtga ggaagacatc tacatcggca ccccagctgt ggtgaaccgc 840
cgaggcatcc gccgcgttgt cgaactagaa atcaccgacc acgagatgga acgcttcaag 900
cattccgcaa ataccctgcg cgaaattcag aagcagttct tctaa 945
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence for deleting gabD3
<400> 43
attcggtgag gaatccggcg gtg 23
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence for deleting gabD3
<400> 44
ctatgagaca gtcgtcctgt acccat 26
<210> 45
<211> 5390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotides coding succinyl-CoA:coenzyme A transferase,
succinate semialdehyde dehydrogenase and 4-hydroxybutyrate
dehydrogenase
<400> 45
tctagaatga ctattaatgt ctccgaacta cttgccaaag tccccacggg tctactgatt 60
ggtgattcct gggtggaagc atccgacggc ggtactttcg atgtggaaaa cccagcgacg 120
ggtgaaacaa tcgcaacgct cgcgtctgct acttccgagg atgcactggc tgctcttgat 180
gctgcatgcg ctgttcaggc cgagtgggct aggatgccag cgcgcgagcg ttctaatatt 240
ttacgccgcg gttttgagct cgtagcagaa cgtgcagaag agttcgccac cctcatgacc 300
ttggaaatgg gcaagccttt ggctgaagct cgcggcgaag tcacctacgg caacgaattc 360
ctgcgctggt tctctgagga agcagttcgt ctgtatggcc gttacggaac cacaccagaa 420
ggcaacttgc ggatgctgac cgccctcaag ccagttggcc cgtgcctcct gatcacccca 480
tggaacttcc cactagcaat ggctactaga tgattttgca tctgctgcga aatctttgtt 540
tccccgctaa agttgaggac aggttgacac ggagttgact cgacgaatta tccaatgtga 600
gtaggtttgg tgcgtgagtt ggaaaaattc gccatactcg cccttgggtt ctgtcagctc 660
aagaattctt gagtgaccga tgctctgatt gacctaactg cttgacacat tgcatttcct 720
acaatcttta gaggagacac aacatgtcta aaggaatcaa gaatagccaa ttgaaaaaaa 780
agaacgtcaa ggccagtaac gttgctgaga agatcgaaga gaaggtggaa aagaccgaca 840
aggtcgttga gaaggctgct gaggtgaccg aaaagcgaat tcgaaactta aagctccagg 900
aaaaagttgt gaccgcagat gtcgcagctg acatgatcga gaatggcatg atcgtcgcaa 960
ttagcggctt cacgccatcc gggtatccaa aggaggttcc aaaagccctt actaagaagg 1020
ttaatgcgct ggaggaggag ttcaaggtga cgctgtatac cggttctagc acaggcgctg 1080
atattgacgg agaatgggcg aaggcaggaa taatcgaacg gcgtatccca taccagacca 1140
actctgacat gaggaaaaaa ataaacgatg gttcaatcaa gtacgcagat atgcacctga 1200
gccacatggc tcaatacatt aactattctg tgattcctaa ggttgacatt gccatcatcg 1260
aggcggtggc cattaccgag gaaggggata ttattcctag tactggaatc ggcaacacag 1320
ctacgtttgt cgagaatgcg gataaggtaa ttgtggaaat aaacgaggct cagccgcttg 1380
agttggaagg catggcagat atctataccc tgaagaaccc tccacgtcgc gagcccatcc 1440
cgatagtcaa cgcaggcaac cgcataggga ccacttacgt cacctgtggc tctgaaaaaa 1500
tctgcgcgat cgtcatgacc aacacccaag acaaaacccg cccactcacc gaagtttctc 1560
ctgtcagtca ggcaatctcc gataacctga ttggcttcct gaacaaagaa gtagaggagg 1620
gtaaactccc aaaaaacctg ctccccatac agtcaggtgt cggttcggtt gctaacgccg 1680
tgcatcccgg actctgcgaa tcaaacttca aaaatttgag ctgctacaca gaagtgatcc 1740
aggattcgat gttgaagctg atcaaatgtg gaaaggcaga tgtggtgtcc ggcacctcga 1800
tctcgccatc accggaaatg ctgcccgagt tcataaagga cataaatttt tttcgcgaga 1860
agatagtact gcgcccccag gaaatatcta ataatccgga aatagctcgt cgtataggag 1920
tgatctccat aaacactgct ttggaagtag acatctacgg taatgtgaac tccacgcatg 1980
tcatgggctc caagatgatg aacggcatcg gcggcagcgg cgactttgcc cgcaacgcat 2040
acctcaccat attcactacg gagtccatcg cgaagaaggg cgacatttcc tctatcgttc 2100
ctatggtttc ccacgtggac cacaccgagc atgacgtaat ggtcatcgtt accgaacagg 2160
gggttgcgga tctccgcggt ctttcccctc gggaaaaggc cgtggcgata attgagaatt 2220
gcgtccaccc ggattacaag gatatgctca tggagtactt cgaggaggct tgtaagtcct 2280
caggtggcaa caccccacac aaccttgaaa aagccctatc ctggcacact aagttcataa 2340
aaactggctc gatgaagtaa ttagaggaga cacaacatgg agattaaaga gatggtcagt 2400
cttgcgcgca aagctcagaa ggagtatcag gccacccata accaagaagc tgtggacaac 2460
atctgccgag ctgcagcgaa ggttatttac gaaaatgcag caattctggc ccgcgaggca 2520
gtggacgaaa ccggcatggg tgtttacgag cacaaggtgg ccaagaatca aggcaagtcc 2580
aaaggtgttt ggtacaacct gcataacaag aagtcgattg gcatcctcaa tatcgatgag 2640
cgtaccggca tgatcgagat cgcaaaacct atcggggttg taggcgccgt tacgccaacc 2700
accaacccta tcgttactcc gatgagcaac atcatctttg ctcttaagac ctgcaacgcc 2760
atcattatcg ccccacaccc gcgctccaaa aagtgctctg cccacgcagt tcggctgatc 2820
aaagaggcta tcgctccgtt caacgtgccc gaaggtatgg ttcagatcat cgaggagcct 2880
agcatcgaga agacgcagga attgatgggc gccgtagacg tggtcgttgc taccgggggc 2940
atgggcatgg tcaagtctgc ctactcctca gggaagcctt ctttcggtgt cggagccggc 3000
aatgttcagg tgatagtgga cagcaacatc gatttcgaag cggctgcaga aaagatcatc 3060
accggacgtg ccttcgacaa cggtatcatc tgctcaggcg aacagtccat catctacaac 3120
gaggctgaca aggaagcagt tttcacagca ttccgcaacc acggtgcgta cttttgcgac 3180
gaggccgagg gagatcgggc tcgtgcagcg atcttcgaaa atggagccat cgcgaaagat 3240
gttgtgggcc agtccgttgc ctttattgcc aagaaggcga acattaatat ccccgagggt 3300
actcgtattc tcgtggtcga agctcgcgga gtaggcgccg aagatgtcat ctgtaaagaa 3360
aagatgtgtc cagtcatgtg cgccctctcc tacaagcact tcgaagaggg ggtagagatc 3420
gcaaggacga acctcgcaaa cgaaggcaat ggccatacct gtgctatcca ctccaacaac 3480
caagcacaca tcatcttggc aggctcggag ctgaccgtgt ctcgcatcgt ggtcaacgcg 3540
ccaagtgcta ccacagcagg cggtcacatc cagaacggtc ttgccgtcac caatactcta 3600
ggctgcggct cttggggtaa caactcgatc tccgaaaact tcacttataa acacctgctc 3660
aacatttcac gcatcgcccc gttgaactcc agcattcata tcccagatga taaggaaatc 3720
tgggaactct aattagagga gacacaacat gcagcttttc aagctcaaga gcgtcacaca 3780
tcactttgat acttttgcag agtttgccaa ggaattctgt ctcggtgaac gcgacttggt 3840
aattaccaac gagttcatct acgaaccgta tatgaaggca tgccagctgc cttgtcattt 3900
tgtgatgcag gagaaatacg gccaaggcga gccttctgac gagatgatga acaacatcct 3960
agcagatatc cgtaatatcc agttcgaccg cgtgatcggg atcggaggtg gtacggttat 4020
tgacatctca aaactctttg ttctgaaggg attaaatgat gttctcgacg cgttcgatcg 4080
caagattccc cttatcaaag agaaagaact gatcattgtg cccaccacct gcggaaccgg 4140
ctcggaggtg acgaacattt ccatcgccga gatcaagtcc cggcacacca agatgggttt 4200
ggctgacgat gcaattgttg ctgaccacgc cataatcatc cctgaacttc tgaagagctt 4260
gcccttccac ttctatgcat gctccgcaat cgatgctctt attcatgcca tcgagtcata 4320
cgtttctcca aaagcgtctc catactcccg tctgttcagt gaggcggcgt gggacattat 4380
cctggaagtt ttcaagaaaa tcgccgaaca cggcccagag taccgcttcg agaagctggg 4440
ggaaatgatc atggccagca actatgccgg tatcgctttc ggcaacgcag gcgttggcgc 4500
cgtccacgct ctatcctacc cgttgggcgg caactatcac gtgccgcatg gagaagcaaa 4560
ctatcagttc ttcaccgagg tctttaaagt ataccaaaag aagaatccgt tcggctatat 4620
tgtcgaactc aactggaagc tctccaagat tctgaactgc cagccagagt acgtgtaccc 4680
gaagctggat gaactgctcg gttgccttct taccaagaaa cctttgcacg aatacggcat 4740
gaaggacgaa gaggttcgtg gcttcgcgga atcggtcctg aagacccagc aacgcttgct 4800
cgccaacaac tacgtcgaac ttactgtcga tgagatcgaa ggtatctacc gacgtctcta 4860
ctaacatatg gcggccgcaa gcttgcctcg acgaaggcgt caccgtgggc cccctggttg 4920
aggaaaaagc acgagacagc gttgcatcgc ttgtcgacgc cgccgtcgcc gaaggtgcca 4980
ccgtcctcac cggcggcaag gccggcacag gtgcaggcta cttctacgaa ccaacggtgc 5040
tcacgggagt ttcaacagat gcggctatcc tgaacgaaga gatcttcggt cccgtcgcac 5100
cgatcgtcac cttccaaacc gaggaagaag ccctgcgtct agccaactcc accgaatacg 5160
gactggcctc ctatgtgttc acccaggaca cctcacgtat tttccgcgtc tccgatggtc 5220
tcgagttcgg cctagtgggc gtcaattccg gtgtcatctc taacgctgct gcaccttttg 5280
gtggcgtaaa acaatccgga atgggccgcg aaggtggtct cgaaggaatc gaggagtaca 5340
cctccgtgca gtacatcggt atccgggatc cttacgccgg ctaggctagc 5390
<210> 46
<211> 4625
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotides coding alpha-ketoglutarate synthase
<400> 46
tctagaggat ccccgggtag gagcacgcag gagcttgccg aactcacacc atcgcaatat 60
ctggcaaaaa tggaatggcg cctagacaat cccaacctag gcaacattgg atccaacaag 120
attgttgcga ctggatataa gacctattac aagttgtgta tgagtatcct gaaattgctc 180
gcttaacacc ccataaagag ggtgaagatt taagttcagg tgcgatctgg gtgaacagta 240
cataaatatc atctttcgct aatggaaagc cccagctcac cgaattctcc attcgtttta 300
attgcttcgt taattaaaac gccatataaa aaccggcgca ttgccggtat ttttccagga 360
gaatttaatg attttgcatc tgctgcgaaa tctttgtttc cccgctaaag ttgaggacag 420
gttgacacgg agttgactcg acgaattatc caatgtgagt aggtttggtg cgtgagttgg 480
aaaaattcgc catactcgcc cttgggttct gtcagctcaa gaattcttga gtgaccgatg 540
ctctgattga cctaactgct tgacacattg catttcctac aatctttaga ggagacacaa 600
catgtaccga aaattccgcg acgatccatc ttctgtcgat ccttcatggc atgaattcct 660
tgtggattat tcacccgagc caacttctca acctgctgcc gaacctacgc gtgtgacttc 720
gccattggtt gctgaacgcg cagcagcagc ggctccccaa gctccaccaa agcccgcaga 780
tactgccgct gcaggtaacg gtgtagttgc tgcattggca gcaaagaccg ctgtgccacc 840
tccagctgag ggtgatgagg tagctgtgct tcgtggagca gcagctgcgg ttgtgaagaa 900
catgtctgct tccctcgagg tgccgactgc aacgtctgtt cgcgccgtac ccgccaaact 960
gctgatcgac aatcgcattg tgatcaacaa tcaactcaag cgtacgcgag gcggcaagat 1020
ctcctttact cacttgttgg gctacgccct cgttcaggcc gtcaagaaat tcccgaacat 1080
gaaccgccat tacaccgaag tagacggaaa gccgacagcc gtcacgccag cacacacgaa 1140
cctgggcctc gctatcgatc tgcagggtaa agacggtaaa cgttcgcttg tcgtcgcagg 1200
catcaagcgc tgcgagacaa tgcgtttcgc ccagtttgtt actgcgtatg aggatatcgt 1260
tcgccgtgcg cgtgacggta agctcacaac cgaggacttc gcaggggtca cgatcagcct 1320
tacgaaccct gggaccattg gtaccgttca ttcggtccca cgactgatgc caggccaagg 1380
ggccatcatc ggcgttgggg ctatggaata ccctgcggag ttccagggag cctctgagga 1440
gcgcattgca gaacttggca tcggtaagct gatcaccctg actagcacct atgaccaccg 1500
cattattcag ggggcagaaa gcggtgattt cctccgaacc atccatgagc tcctgctctc 1560
cgatggcttt tgggatgagg ttttccgaga actttccatt ccgtacctcc cggtccgctg 1620
gagcaccgac aaccccgatt ccatcgtcga taaaaacgcc cgagtcatga acctcatcgc 1680
tgcgtaccgt aaccgtggcc acttgatggc cgatacggac cccttgcgct tggacaaggc 1740
tcgcttccgc tcgcacccgg atcttgaagt gctgacccat ggcctgaccc tttgggatct 1800
ggatcgtgtc ttcaaggtcg acggttttgc cggagcacag tacaagaaac ttcgagacgt 1860
cctcggcctc ctgcgtgatg cgtactgccg tcacatcggc gtggaatatg cccacatcct 1920
tgaccctgaa cagaaggagt ggttggagca acgcgtcgag actaaacacg tgaagccaac 1980
cgtggcgcag caaaagtaca tcctgtcgaa gttgaacgca gccgaggcct tcgagacttt 2040
cttgcagacc aaatatgttg gccaaaagcg gttctctctg gagggcgcgg agtccgtgat 2100
tcctatgatg gatgccgcta tcgaccaatg cgcagagcac ggactggacg aggtcgttat 2160
cggcatgcct catcgcggcc gccttaatgt cttggcaaat attgtgggaa agccgtattc 2220
ccagatcttc accgagttcg aaggtaatct gaacccatcc caggctcatg gctcgggcga 2280
tgttaagtac cacctgggcg ccaccggttt gtatctccag atgtttggtg ataacgatat 2340
tcaagttagc cttaccgcta atccgtccca cctggaggct gtggatccgg tgctcgaagg 2400
tctcgtgcgg gcgaagcagg atctgctcga ccacggttcc atcgactctg atggtcagcg 2460
cgccttctca gtcgttccct tgatgttgca cggagatgcg gcattcgctg gtcaaggagt 2520
agtggcggaa accctcaacc tcgcgaacct gccgggctac cgcgttgggg gcactatcca 2580
cattattgtc aacaaccaga ttggctttac cacagctccc gagtactctc gctcttcaga 2640
atactgtact gacgtcgcga agatgatcgg tgcgccgatc ttccatgtca acggcgacga 2700
cccagaggca tgtgtctggg tcgcacgtct cgccgtcgat ttccgccagc ggttcaagaa 2760
agacgtcgtg attgacatgc tttgctaccg ccgccgcggg cacaatgagg gagatgaccc 2820
atcaatgacc aacccataca tgtacgacgt tgtagatacc aagcgcggcg cgcgtaaatc 2880
ctacaccgag gcccttatcg gtcggggcga tatctccatg aaagaggctg aagatgcact 2940
tcgggattac cagggccagt tggaacgcgt ttttaacgaa gttcgcgagc tggaaaaaca 3000
tggagttcag ccgtccgagt cggttgaaag cgatcaaatg attccagctg gcttggcgac 3060
cgccgttgat aaatccttgc tggctcggat cggagatgca ttcctggcgc tgcctaatgg 3120
tttcaccgcg cacccacgcg tgcagccggt acttgagaag cgccgtgaaa tggcctacga 3180
aggcaagatt gactgggcat tcggtgaact gctggctctg ggttcgctgg tggcggaggg 3240
taagcttgtt cgactgtccg gccaggattc ccgtcggggc accttctccc agcgccactc 3300
tgtcctgatc gatcggcaca caggcgaaga attcacccct ctgcagcttc tcgctaccaa 3360
ctcagacgga tcgccaaccg gaggaaagtt cctcgtatat gatagccccc tctcagaata 3420
cgcagcagtg ggctttgagt acggctacac tgtaggcaat cccgacgcgg tggtcctttg 3480
ggaggctcag ttcggtgact ttgttaacgg cgcacagtcc atcatcgacg agtttatttc 3540
aagcggcgaa gcaaagtggg gtcaattgtc caatgtcgtg ctgctcctgc cacatggaca 3600
cgaaggtcag gggccggacc acacctccgc tcgtattgaa cgcttcctcc aactgtgggc 3660
agaaggaagc atgaccattg ctatgccatc caccccatca aattattttc acctgctgcg 3720
gcgccatgcc ttggacggga tccagcggcc tcttattgtc ttcacaccaa agtccatgct 3780
ccgccacaaa gctgcagtgt ctgaaatcaa agacttcacc gaaatcaagt tccgctccgt 3840
tctggaagaa ccaacctacg aggacggaat cggcgaccgc aacaaggtgt cccgtatcct 3900
gttgacttcc ggaaaactct attacgaact tgcagcgcgt aaggcaaagg ataaccggaa 3960
tgacctcgcc atcgtgcgcc tggagcagct cgcacctttg cctcgtcgac gcctccgcga 4020
aaccctggac cgttacgaaa acgttaagga atttttctgg gtgcaggaag agcctgctaa 4080
ccagggtgcc tggccacgtt ttgggctcga gcttcccgaa ctcctgccgg ataaactcgc 4140
tggtattaaa cggatctccc gtcgtgctat gtctgcccct tccagcggca gctctaaggt 4200
gcacgcggtg gagcaacagg agatcctgga tgaagcattt ggttaactca gcttcaggct 4260
atgtttgcgc agttcatgta ataacttgta gtaaataaat cgggccttcc caaaagattc 4320
tttcttggga aaggcccgat tttggtattt gaggtctttt agtggagtgt cttagacatt 4380
tgtcgcaaca ctgactaact ggcggtcgta tttgtcagtt gtcgcacttt caagcatgac 4440
ccacgcagca tcttcatatg aggtgtacat tccggtttct cgatttactc gaacaacacg 4500
attctcaagc ttactgcgtg ccccttgagc atccataagg gaagtgacgg gaaactgtct 4560
ttaagccctg aacgtaagag atcaacgatg ctagtggcct gaatggcgaa tggcgataag 4620
ctagc 4625
<210> 47
<211> 2444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotides coding formate dehydrogenase
<400> 47
ggatccgtgt caccgatcat tcgtaaattg agtatccccg agttcaccac caacacccca 60
gtgttggtgg atatctacat cgcagcgatg aactatgaca aagcaatcag ggatacccgg 120
atcgaagtct ggcggagaaa ctcccagaac cccggattca cagcagtggc agcgctgatg 180
gatgatcagg tcgtgggcgt ggcctatggc ttcaatggca gcccagatca ttggtggcaa 240
caccaattac gccggggact ccgacaacaa atgattttgc atctgctgcg aaatctttgt 300
ttccccgcta aagttgagga caggttgaca cggagttgac tcgacgaatt atccaatgtg 360
agtaggtttg gtgcgtgagt tggaaaaatt cgccatactc gcccttgggt tctgtcagct 420
caagaattct tgagtgaccg atgctctgat tgacctaact gcttgacaca ttgcatttcc 480
tacaatcttt agaggagaca caacctcgag gtcgacggta tcgataagct tatggctaag 540
gtcctgtgcg ttctttacga tgatccagtt gacggctacc ctaagaccta cgcccgcgac 600
gatcttccaa agatcgacca ctaccctggc ggccagatcc tcccaacccc aaaggccatc 660
gacttcaccc ctggccagct cctcggctcc gtctccggcg aactcggcct gcgcgaatac 720
ctcgaatcca acggccacac cctggtcgtt acctccgaca aggacggccc agactccgtt 780
ttcgagcgcg agctggtcga tgcagatgtc gtcatctccc agccattctg gccagcctac 840
ctgaccccag agcgcatcgc caaggctaag aacctgaagc tcgctctcac cgctggcatc 900
ggttccgacc acgtcgatct tcagtccgct atcgaccgca acgtcaccgt tgcagaagtc 960
acctactgca actccatcag cgtcgccgag cacgtggtta tgatgatcct gtccctggtt 1020
cgcaactacc tgccttccca cgaatgggcg cgcaagggcg gctggaacat cgccgactgc 1080
gtctcccacg cctacgacct cgaagctatg cacgtcggca ccgttgctgc cggccgcatc 1140
ggtctcgcag ttctgcgccg tctggcacca ttcgacgttc acctgcacta caccgaccgt 1200
caccgcctgc ctgaatccgt cgagaaggaa ctcaacctca cctggcacgc aacccgcgag 1260
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gccggctacg ccggcgacgt ttggttccca cagcctgcac caaaggacca cccatggcgc 1500
accatgccat acaacggcat gaccccacac atctccggca ccaccctgac cgcacaggca 1560
cgttacgcag caggcacccg cgagatcctg gagtgcttct tcgagggccg tcctatccgc 1620
gacgaatacc tcatcgttca gggcggcgct cttgctggca ccggcgcaca ttcctactcc 1680
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cagcccgggg gatccactag ttctagagcg gccgccaccg cggtggagct catttagcgg 1800
atgattctcg ttcaacttcg gccgaagcca cttcgtctgt cataatgaca gggatggttt 1860
cggccgtttt tgcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc 1920
tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac 1980
gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat 2040
caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca aactcttcct 2100
gtcgtcatat ctacaagcca tccccccaca gatacggtgg aggcccgacg gaagaggaaa 2160
tccatatcat ccacaactac tttgaggttg cggaagttca tgttcagcct ggcttccaag 2220
gtcacggcat tggccgaaag ctgatgcatg aactgttaaa agacaaacaa aacacttttg 2280
ccattttgtc tacacccgag gtcgacgatg aggcgaacca tgcgtttagc ctgtatcgct 2340
ctctcggctt cactgacttg ctcaggcagt ttaggtttga cggggatcaa cggccgtttg 2400
ccgtattgat caccgccctc ccccttcatg attcctaaga attc 2444
<210> 48
<211> 887
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 48
Met Ser Glu Arg Phe Pro Asn Asp Val Asp Pro Ile Glu Thr Arg Asp
1 5 10 15
Trp Leu Gln Ala Ile Glu Ser Val Ile Arg Glu Glu Gly Val Glu Arg
20 25 30
Ala Gln Tyr Leu Ile Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ala Arg Lys Gly Gly
35 40 45
Val Asn Val Ala Ala Gly Thr Gly Ile Ser Asn Tyr Ile Asn Thr Ile
50 55 60
Pro Val Glu Glu Gln Pro Glu Tyr Pro Gly Asn Leu Glu Leu Glu Arg
65 70 75 80
Arg Ile Arg Ser Ala Ile Arg Trp Asn Ala Ile Met Thr Val Leu Arg
85 90 95
Ala Ser Lys Lys Asp Leu Glu Leu Gly Gly His Met Ala Ser Phe Gln
100 105 110
Ser Ser Ala Thr Ile Tyr Asp Val Cys Phe Asn His Phe Phe Arg Ala
115 120 125
Arg Asn Glu Gln Asp Gly Gly Asp Leu Val Tyr Phe Gln Gly His Ile
130 135 140
Ser Pro Gly Val Tyr Ala Arg Ala Phe Leu Glu Gly Arg Leu Thr Gln
145 150 155 160
Glu Gln Leu Asp Asn Phe Arg Gln Glu Val His Gly Asn Gly Leu Ser
165 170 175
Ser Tyr Pro His Pro Lys Leu Met Pro Glu Phe Trp Gln Phe Pro Thr
180 185 190
Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Ile Gly Ala Ile Tyr Gln Ala Lys Phe
195 200 205
Leu Lys Tyr Leu Glu His Arg Gly Leu Lys Asp Thr Ser Lys Gln Thr
210 215 220
Val Tyr Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu Met Asp Glu Pro Glu Ser Lys
225 230 235 240
Gly Ala Ile Thr Ile Ala Thr Arg Glu Lys Leu Asp Asn Leu Val Phe
245 250 255
Val Ile Asn Cys Asn Leu Gln Arg Leu Asp Gly Pro Val Thr Gly Asn
260 265 270
Gly Lys Ile Ile Asn Glu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Gly Ala Gly Trp
275 280 285
Asn Val Ile Lys Val Met Trp Gly Ser Arg Trp Asp Glu Leu Leu Arg
290 295 300
Lys Asp Thr Ser Gly Lys Leu Ile Gln Leu Met Asn Glu Thr Val Asp
305 310 315 320
Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ser Lys Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu
325 330 335
His Phe Phe Gly Lys Tyr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Val Ala Asp Trp
340 345 350
Thr Asp Glu Gln Ile Trp Ala Leu Asn Arg Gly Gly His Asp Pro Lys
355 360 365
Lys Ile Tyr Ala Ala Phe Lys Lys Ala Gln Glu Thr Lys Gly Lys Ala
370 375 380
Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys Gly Tyr Gly Met Gly Asp Ala
385 390 395 400
Ala Glu Gly Lys Asn Ile Ala His Gln Val Lys Lys Met Asn Met Asp
405 410 415
Gly Val Arg His Ile Arg Asp Arg Phe Asn Val Pro Val Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ile Glu Lys Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Pro Glu Gly Ser Glu Glu
435 440 445
His Thr Tyr Leu His Ala Gln Arg Gln Lys Leu His Gly Tyr Leu Pro
450 455 460
Ser Arg Gln Pro Asn Phe Thr Glu Lys Leu Glu Leu Pro Ser Leu Gln
465 470 475 480
Asp Phe Gly Ala Leu Leu Glu Glu Gln Ser Lys Glu Ile Ser Thr Thr
485 490 495
Ile Ala Phe Val Arg Ala Leu Asn Val Met Leu Lys Asn Lys Ser Ile
500 505 510
Lys Asp Arg Leu Val Pro Ile Ile Ala Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly
515 520 525
Met Glu Gly Leu Phe Arg Gln Ile Gly Ile Tyr Ser Pro Asn Gly Gln
530 535 540
Gln Tyr Thr Pro Gln Asp Arg Glu Gln Val Ala Tyr Tyr Lys Glu Asp
545 550 555 560
Glu Lys Gly Gln Ile Leu Gln Glu Gly Ile Asn Glu Leu Gly Ala Gly
565 570 575
Cys Ser Trp Leu Ala Ala Ala Thr Ser Tyr Ser Thr Asn Asn Leu Pro
580 585 590
Met Ile Pro Phe Tyr Ile Tyr Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Ile
595 600 605
Gly Asp Leu Cys Trp Ala Ala Gly Asp Gln Gln Ala Arg Gly Phe Leu
610 615 620
Ile Gly Gly Thr Ser Gly Arg Thr Thr Leu Asn Gly Glu Gly Leu Gln
625 630 635 640
His Glu Asp Gly His Ser His Ile Gln Ser Leu Thr Ile Pro Asn Cys
645 650 655
Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Tyr Ala Tyr Glu Val Ala Val Ile Met His
660 665 670
Asp Gly Leu Glu Arg Met Tyr Gly Glu Lys Gln Glu Asn Val Tyr Tyr
675 680 685
Tyr Ile Thr Thr Leu Asn Glu Asn Tyr His Met Pro Ala Met Pro Glu
690 695 700
Gly Ala Glu Glu Gly Ile Arg Lys Gly Ile Tyr Lys Leu Glu Thr Ile
705 710 715 720
Glu Gly Ser Lys Gly Lys Val Gln Leu Leu Gly Ser Gly Ser Ile Leu
725 730 735
Arg His Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Leu Ala Lys Asp Tyr Gly Val
740 745 750
Gly Ser Asp Val Tyr Ser Val Thr Ser Phe Thr Glu Leu Ala Arg Asp
755 760 765
Gly Gln Asp Cys Glu Arg Trp Asn Met Leu His Pro Leu Glu Thr Pro
770 775 780
Arg Val Pro Tyr Ile Ala Gln Val Met Asn Asp Ala Pro Ala Val Ala
785 790 795 800
Ser Thr Asp Tyr Met Lys Leu Phe Ala Glu Gln Val Arg Thr Tyr Val
805 810 815
Pro Ala Asp Asp Tyr Arg Val Leu Gly Thr Asp Gly Phe Gly Arg Ser
820 825 830
Asp Ser Arg Glu Asn Leu Arg His His Phe Glu Val Asp Ala Ser Tyr
835 840 845
Val Val Val Ala Ala Leu Gly Glu Leu Ala Lys Arg Gly Glu Ile Asp
850 855 860
Lys Lys Val Val Ala Asp Ala Ile Ala Lys Phe Asn Ile Asp Ala Asp
865 870 875 880
Lys Val Asn Pro Arg Leu Ala
885
<210> 49
<211> 2664
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 49
atgtcagaac gtttcccaaa tgacgtggat ccgatcgaaa ctcgcgactg gctccaggcg 60
atcgaatcgg tcatccgtga agaaggtgtt gagcgtgctc agtatctgat cgaccaactg 120
cttgctgaag cccgcaaagg cggtgtaaac gtagccgcag gcacaggtat cagcaactac 180
atcaacacca tccccgttga agaacaaccg gagtatccgg gtaatctgga actggaacgc 240
cgtattcgtt cagctatccg ctggaacgcc atcatgacgg tgctgcgtgc gtcgaaaaaa 300
gacctcgaac tgggcggcca tatggcgtcc ttccagtctt ccgcaaccat ttatgatgtg 360
tgctttaacc acttcttccg tgcacgcaac gagcaggatg gcggcgacct ggtttacttc 420
cagggccaca tctccccggg cgtgtacgct cgtgctttcc tggaaggtcg tctgactcag 480
gagcagctgg ataacttccg tcaggaagtt cacggcaatg gcctctcttc ctatccgcac 540
ccgaaactga tgccggaatt ctggcagttc ccgaccgtat ctatgggtct gggtccgatt 600
ggtgctattt accaggctaa attcctgaaa tatctggaac accgtggcct gaaagatacc 660
tctaaacaaa ccgtttacgc gttcctcggt gacggtgaaa tggacgaacc ggaatccaaa 720
ggtgcgatca ccatcgctac ccgtgaaaaa ctggataacc tggtcttcgt tatcaactgt 780
aacctgcagc gtcttgacgg cccggtcacc ggtaacggca agatcatcaa cgaactggaa 840
ggcatcttcg aaggtgctgg ctggaacgtg atcaaagtga tgtggggtag ccgttgggat 900
gaactgctgc gtaaggatac cagcggtaaa ctgatccagc tgatgaacga aaccgttgac 960
ggcgactacc agaccttcaa atcgaaagat ggtgcgtacg ttcgtgaaca cttcttcggt 1020
aaatatcctg aaaccgcagc actggttgca gactggactg acgagcagat ctgggcactg 1080
aaccgtggtg gtcacgatcc gaagaaaatc tacgctgcat tcaagaaagc gcaggaaacc 1140
aaaggcaaag cgacagtaat ccttgctcat accattaaag gttacggcat gggcgacgcg 1200
gctgaaggta aaaacatcgc gcaccaggtt aagaaaatga acatggacgg tgtgcgtcat 1260
atccgcgacc gtttcaatgt gccggtgtct gatgcagata tcgaaaaact gccgtacatc 1320
accttcccgg aaggttctga agagcatacc tatctgcacg ctcagcgtca gaaactgcac 1380
ggttatctgc caagccgtca gccgaacttc accgagaagc ttgagctgcc gagcctgcaa 1440
gacttcggcg cgctgttgga agagcagagc aaagagatct ctaccactat cgctttcgtt 1500
cgtgctctga acgtgatgct gaagaacaag tcgatcaaag atcgtctggt accgatcatc 1560
gccgacgaag cgcgtacttt cggtatggaa ggtctgttcc gtcagattgg tatttacagc 1620
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gcagcggcga cctcttacag caccaacaat ctgccgatga tcccgttcta catctattac 1800
tcgatgttcg gcttccagcg tattggcgat ctgtgctggg cggctggcga ccagcaagcg 1860
cgtggcttcc tgatcggcgg tacttccggt cgtaccaccc tgaacggcga aggtctgcag 1920
cacgaagatg gtcacagcca cattcagtcg ctgactatcc cgaactgtat ctcttacgac 1980
ccggcttacg cttacgaagt tgctgtcatc atgcatgacg gtctggagcg tatgtacggt 2040
gaaaaacaag agaacgttta ctactacatc actacgctga acgaaaacta ccacatgccg 2100
gcaatgccgg aaggtgctga ggaaggtatc cgtaaaggta tctacaaact cgaaactatt 2160
gaaggtagca aaggtaaagt tcagctgctc ggctccggtt ctatcctgcg tcacgtccgt 2220
gaagcagctg agatcctggc gaaagattac ggcgtaggtt ctgacgttta tagcgtgacc 2280
tccttcaccg agctggcgcg tgatggtcag gattgtgaac gctggaacat gctgcacccg 2340
ctggaaactc cgcgcgttcc gtatatcgct caggtgatga acgacgctcc ggcagtggca 2400
tctaccgact atatgaaact gttcgctgag caggtccgta cttacgtacc ggctgacgac 2460
taccgcgtac tgggtactga tggcttcggt cgttccgaca gccgtgagaa cctgcgtcac 2520
cacttcgaag ttgatgcttc ttatgtcgtg gttgcggcgc tgggcgaact ggctaaacgt 2580
ggcgaaatcg ataagaaagt ggttgctgac gcaatcgcca aattcaacat cgatgcagat 2640
aaagttaacc cgcgtctggc gtaa 2664
<210> 50
<211> 630
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 50
Met Ala Ile Glu Ile Lys Val Pro Asp Ile Gly Ala Asp Glu Val Glu
1 5 10 15
Ile Thr Glu Ile Leu Val Lys Val Gly Asp Lys Val Glu Ala Glu Gln
20 25 30
Ser Leu Ile Thr Val Glu Gly Asp Lys Ala Ser Met Glu Val Pro Ser
35 40 45
Pro Gln Ala Gly Ile Val Lys Glu Ile Lys Val Ser Val Gly Asp Lys
50 55 60
Thr Gln Thr Gly Ala Leu Ile Met Ile Phe Asp Ser Ala Asp Gly Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Pro Ala Gln Ala Glu Glu Lys Lys Glu Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Asp Val Asn Val Pro Asp
100 105 110
Ile Gly Ser Asp Glu Val Glu Val Thr Glu Ile Leu Val Lys Val Gly
115 120 125
Asp Lys Val Glu Ala Glu Gln Ser Leu Ile Thr Val Glu Gly Asp Lys
130 135 140
Ala Ser Met Glu Val Pro Ala Pro Phe Ala Gly Thr Val Lys Glu Ile
145 150 155 160
Lys Val Asn Val Gly Asp Lys Val Ser Thr Gly Ser Leu Ile Met Val
165 170 175
Phe Glu Val Ala Gly Glu Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ala Lys Gln
180 185 190
Glu Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Gly Val Lys Glu
195 200 205
Val Asn Val Pro Asp Ile Gly Gly Asp Glu Val Glu Val Thr Glu Val
210 215 220
Met Val Lys Val Gly Asp Lys Val Ala Ala Glu Gln Ser Leu Ile Thr
225 230 235 240
Val Glu Gly Asp Lys Ala Ser Met Glu Val Pro Ala Pro Phe Ala Gly
245 250 255
Val Val Lys Glu Leu Lys Val Asn Val Gly Asp Lys Val Lys Thr Gly
260 265 270
Ser Leu Ile Met Ile Phe Glu Val Glu Gly Ala Ala Pro Ala Ala Ala
275 280 285
Pro Ala Lys Gln Glu Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Lys Ala Glu
290 295 300
Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Glu Gly Lys Ser Glu Phe
305 310 315 320
Ala Glu Asn Asp Ala Tyr Val His Ala Thr Pro Leu Ile Arg Arg Leu
325 330 335
Ala Arg Glu Phe Gly Val Asn Leu Ala Lys Val Lys Gly Thr Gly Arg
340 345 350
Lys Gly Arg Ile Leu Arg Glu Asp Val Gln Ala Tyr Val Lys Glu Ala
355 360 365
Ile Lys Arg Ala Glu Ala Ala Pro Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ile Pro
370 375 380
Gly Met Leu Pro Trp Pro Lys Val Asp Phe Ser Lys Phe Gly Glu Ile
385 390 395 400
Glu Glu Val Glu Leu Gly Arg Ile Gln Lys Ile Ser Gly Ala Asn Leu
405 410 415
Ser Arg Asn Trp Val Met Ile Pro His Val Thr His Phe Asp Lys Thr
420 425 430
Asp Ile Thr Glu Leu Glu Ala Phe Arg Lys Gln Gln Asn Glu Glu Ala
435 440 445
Ala Lys Arg Lys Leu Asp Val Lys Ile Thr Pro Val Val Phe Ile Met
450 455 460
Lys Ala Val Ala Ala Ala Leu Glu Gln Met Pro Arg Phe Asn Ser Ser
465 470 475 480
Leu Ser Glu Asp Gly Gln Arg Leu Thr Leu Lys Lys Tyr Ile Asn Ile
485 490 495
Gly Val Ala Val Asp Thr Pro Asn Gly Leu Val Val Pro Val Phe Lys
500 505 510
Asp Val Asn Lys Lys Gly Ile Ile Glu Leu Ser Arg Glu Leu Met Thr
515 520 525
Ile Ser Lys Lys Ala Arg Asp Gly Lys Leu Thr Ala Gly Glu Met Gln
530 535 540
Gly Gly Cys Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gly Gly Leu Gly Thr Thr His
545 550 555 560
Phe Ala Pro Ile Val Asn Ala Pro Glu Val Ala Ile Leu Gly Val Ser
565 570 575
Lys Ser Ala Met Glu Pro Val Trp Asn Gly Lys Glu Phe Val Pro Arg
580 585 590
Leu Met Leu Pro Ile Ser Leu Ser Phe Asp His Arg Val Ile Asp Gly
595 600 605
Ala Asp Gly Ala Arg Phe Ile Thr Ile Ile Asn Asn Thr Leu Ser Asp
610 615 620
Ile Arg Arg Leu Val Met
625 630
<210> 51
<211> 1893
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 51
atggctatcg aaatcaaagt accggacatc ggggctgatg aagttgaaat caccgagatc 60
ctggtcaaag tgggcgacaa agttgaagcc gaacagtcgc tgatcaccgt agaaggcgac 120
aaagcctcta tggaagttcc gtctccgcag gcgggtatcg ttaaagagat caaagtctct 180
gttggcgata aaacccagac cggcgcactg attatgattt tcgattccgc cgacggtgca 240
gcagacgctg cacctgctca ggcagaagag aagaaagaag cagctccggc agcagcacca 300
gcggctgcgg cggcaaaaga cgttaacgtt ccggatatcg gcagcgacga agttgaagtg 360
accgaaatcc tggtgaaagt tggcgataaa gttgaagctg aacagtcgct gatcaccgta 420
gaaggcgaca aggcttctat ggaagttccg gctccgtttg ctggcaccgt gaaagagatc 480
aaagtgaacg tgggtgacaa agtgtctacc ggctcgctga ttatggtctt cgaagtcgcg 540
ggtgaagcag gcgcggcagc tccggccgct aaacaggaag cagctccggc agcggcccct 600
gcaccagcgg ctggcgtgaa agaagttaac gttccggata tcggcggtga cgaagttgaa 660
gtgactgaag tgatggtgaa agtgggcgac aaagttgccg ctgaacagtc actgatcacc 720
gtagaaggcg acaaagcttc tatggaagtt ccggcgccgt ttgcaggcgt cgtgaaggaa 780
ctgaaagtca acgttggcga taaagtgaaa actggctcgc tgattatgat cttcgaagtt 840
gaaggcgcag cgcctgcggc agctcctgcg aaacaggaag cggcagcgcc ggcaccggca 900
gcaaaagctg aagccccggc agcagcacca gctgcgaaag cggaaggcaa atctgaattt 960
gctgaaaacg acgcttatgt tcacgcgact ccgctgatcc gccgtctggc acgcgagttt 1020
ggtgttaacc ttgcgaaagt gaagggcact ggccgtaaag gtcgtatcct gcgcgaagac 1080
gttcaggctt acgtgaaaga agctatcaaa cgtgcagaag cagctccggc agcgactggc 1140
ggtggtatcc ctggcatgct gccgtggccg aaggtggact tcagcaagtt tggtgaaatc 1200
gaagaagtgg aactgggccg catccagaaa atctctggtg cgaacctgag ccgtaactgg 1260
gtaatgatcc cgcatgttac tcacttcgac aaaaccgata tcaccgagtt ggaagcgttc 1320
cgtaaacagc agaacgaaga agcggcgaaa cgtaagctgg atgtgaagat caccccggtt 1380
gtcttcatca tgaaagccgt tgctgcagct cttgagcaga tgcctcgctt caatagttcg 1440
ctgtcggaag acggtcagcg tctgaccctg aagaaataca tcaacatcgg tgtggcggtg 1500
gataccccga acggtctggt tgttccggta ttcaaagacg tcaacaagaa aggcatcatc 1560
gagctgtctc gcgagctgat gactatttct aagaaagcgc gtgacggtaa gctgactgcg 1620
ggcgaaatgc agggcggttg cttcaccatc tccagcatcg gcggcctggg tactacccac 1680
ttcgcgccga ttgtgaacgc gccggaagtg gctatcctcg gcgtttccaa gtccgcgatg 1740
gagccggtgt ggaatggtaa agagttcgtg ccgcgtctga tgctgccgat ttctctctcc 1800
ttcgaccacc gcgtgatcga cggtgctgat ggtgcccgtt tcattaccat cattaacaac 1860
acgctgtctg acattcgccg tctggtgatg taa 1893
<210> 52
<211> 474
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 52
Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly Pro
1 5 10 15
Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu Thr
20 25 30
Val Ile Val Glu Arg Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val
35 40 45
Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile Glu
50 55 60
Glu Ala Lys Ala Leu Ala Glu His Gly Ile Val Phe Gly Glu Pro Lys
65 70 75 80
Thr Asp Ile Asp Lys Ile Arg Thr Trp Lys Glu Lys Val Ile Asn Gln
85 90 95
Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Gly Arg Lys Val Lys Val
100 105 110
Val Asn Gly Leu Gly Lys Phe Thr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Val Glu
115 120 125
Gly Glu Asn Gly Lys Thr Val Ile Asn Phe Asp Asn Ala Ile Ile Ala
130 135 140
Ala Gly Ser Arg Pro Ile Gln Leu Pro Phe Ile Pro His Glu Asp Pro
145 150 155 160
Arg Ile Trp Asp Ser Thr Asp Ala Leu Glu Leu Lys Glu Val Pro Glu
165 170 175
Arg Leu Leu Val Met Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr
180 185 190
Val Tyr His Ala Leu Gly Ser Gln Ile Asp Val Val Glu Met Phe Asp
195 200 205
Gln Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Asp Ile Val Lys Val Phe Thr Lys
210 215 220
Arg Ile Ser Lys Lys Phe Asn Leu Met Leu Glu Thr Lys Val Thr Ala
225 230 235 240
Val Glu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Tyr Val Thr Met Glu Gly Lys Lys
245 250 255
Ala Pro Ala Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ile Gly
260 265 270
Arg Val Pro Asn Gly Lys Asn Leu Asp Ala Gly Lys Ala Gly Val Glu
275 280 285
Val Asp Asp Arg Gly Phe Ile Arg Val Asp Lys Gln Leu Arg Thr Asn
290 295 300
Val Pro His Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu
305 310 315 320
Ala His Lys Gly Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Val Ile Ala
325 330 335
Gly Lys Lys His Tyr Phe Asp Pro Lys Val Ile Pro Ser Ile Ala Tyr
340 345 350
Thr Glu Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Thr Glu Lys Glu Ala Lys
355 360 365
Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Pro Trp Ala Ala Ser
370 375 380
Gly Arg Ala Ile Ala Ser Asp Cys Ala Asp Gly Met Thr Lys Leu Ile
385 390 395 400
Phe Asp Lys Glu Ser His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly Thr
405 410 415
Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met Gly
420 425 430
Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr Leu
435 440 445
His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile Thr
450 455 460
Asp Leu Pro Asn Pro Lys Ala Lys Lys Lys
465 470
<210> 53
<211> 1425
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 53
atgagtactg aaatcaaaac tcaggtcgtg gtacttgggg caggccccgc aggttactcc 60
gctgccttcc gttgcgctga tttaggtctg gaaaccgtaa tcgtagaacg ttacaacacc 120
cttggcggtg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcta aagcactgct gcacgtagca 180
aaagttatcg aagaagccaa agcgctggct gaacacggta tcgtcttcgg cgaaccgaaa 240
accgatatcg acaagattcg tacctggaaa gagaaagtga tcaatcagct gaccggtggt 300
ctggctggta tggcgaaagg ccgcaaagtc aaagtggtca acggtctggg taaattcacc 360
ggggctaaca ccctggaagt tgaaggtgag aacggcaaaa ccgtgatcaa cttcgacaac 420
gcgatcattg cagcgggttc tcgcccgatc caactgccgt ttattccgca tgaagatccg 480
cgtatctggg actccactga cgcgctggaa ctgaaagaag taccagaacg cctgctggta 540
atgggtggcg gtatcatcgg tctggaaatg ggcaccgttt accacgcgct gggttcacag 600
attgacgtgg ttgaaatgtt cgaccaggtt atcccggcag ctgacaaaga catcgttaaa 660
gtcttcacca agcgtatcag caagaaattc aacctgatgc tggaaaccaa agttaccgcc 720
gttgaagcga aagaagacgg catttatgtg acgatggaag gcaaaaaagc acccgctgaa 780
ccgcagcgtt acgacgccgt gctggtagcg attggtcgtg tgccgaacgg taaaaacctc 840
gacgcaggca aagcaggcgt ggaagttgac gaccgtggtt tcatccgcgt tgacaaacag 900
ctgcgtacca acgtaccgca catctttgct atcggcgata tcgtcggtca accgatgctg 960
gcacacaaag gtgttcacga aggtcacgtt gccgctgaag ttatcgccgg taagaaacac 1020
tacttcgatc cgaaagttat cccgtccatc gcctataccg aaccagaagt tgcatgggtg 1080
ggtctgactg agaaagaagc gaaagagaaa ggcatcagct atgaaaccgc caccttcccg 1140
tgggctgctt ctggtcgtgc tatcgcttcc gactgcgcag acggtatgac caagctgatt 1200
ttcgacaaag aatctcaccg tgtgatcggt ggtgcgattg tcggtactaa cggcggcgag 1260
ctgctgggtg aaatcggcct ggcaatcgaa atgggttgtg atgctgaaga catcgcactg 1320
accatccacg cgcacccgac tctgcacgag tctgtgggcc tggcggcaga agtgttcgaa 1380
ggtagcatta ccgacctgcc gaacccgaaa gcgaagaaga agtag 1425
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 54
aaatggaatg gcgcctagac aatcc 25
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 55
cacttccctt atggatgctc aagg 24
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-616
<400> 56
aaagtgtaaa gcctgggaac aacaagaccc atcatagttt gccccc 46
<210> 57
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-618
<400> 57
gttcttctaa tcagaattgg ttaattggtt gtaaca 36
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-615
<400> 58
gcgtaatagc gaagaggggc gtttttccat aggctccgcc 40
<210> 59
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-617
<400> 59
gttcaatcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc 40
<210> 60
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-619
<400> 60
gggtgttatg attgaacaag atggattgca c 31
<210> 61
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-620
<400> 61
attctgatta gaagaactcg tcaagaaggc gatagaagg 39
<210> 62
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacZa-NR
<400> 62
cctcttcgct attacgc 17
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-404
<400> 63
cccaggcttt acactttatg c 21
<210> 64
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-627
<400> 64
gccaccgcgg tggagctcat ttagcggatg attctcgttc aacttcg 47
<210> 65
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-628
<400> 65
ttttatttgc aaaaacggcc gaaaccatcc ct 32
<210> 66
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-629
<400> 66
ccgtttttgc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact 40
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-630
<400> 67
gaacaaaagc tggagctacc gtatctgtgg ggggatggct tgt 43
<210> 68
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> J0180
<400> 68
ctatagggcg aattgggtac ctgcgttaat aaaggtggag aataagttgt 50
<210> 69
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-1081
<400> 69
tgacctcctc tcgagtttag attccctaaa cttttatcga g 41
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-1082
<400> 70
aaactcgaga ggaggtcatg atgagtactg aaatca 36
<210> 71
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-1083
<400> 71
ttattcctcc tacttcttct tcgctttcgg gttcgg 36
<210> 72
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-1084
<400> 72
aagaagtagg aggaataacc catgtcagaa cgtttcc 37
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-1085
<400> 73
ttttacctcc tacgccagac gc 22
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-1086
<400> 74
tctggcgtag gaggtaaaag aataat 26
<210> 75
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MD-1087
<400> 75
ggtggcggcc gctctagatt acatcaccag acggcgaatg tca 43
<210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 76
caggtcgact ctagaggatc cgtgtcaccg atcattcgta aattgag 47
<210> 77
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 77
gtaaaacgac ggccagtgaa ttcttaggaa tcatgaaggg ggaggg 46
Claims (18)
- 4-히드록시부티레이트를 생산하는 미생물로서,
알파-케토글루타레이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고;
말레이트 퀴논 옥시도리덕타제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 또는 이의 조합의 감소 또는 제거된 활성을 가지며;
루멘 박테리아, 코리네박테리움 속, 브레비박테리움 속, 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 미생물. - 청구항 1에 있어서, 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 활성이 제거되거나 감소된 것인 미생물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 활성의 감소는 Ncgl0049, Ncgl0463 또는 Ncgl2619 유전자 중 어느 하나의 유전자가 부가, 치환 또는 결실되어 활성이 감소된 것인 미생물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 Ncgl0049는 서열번호 22의 핵산 서열을 갖고, Ncgl0463는 서열번호 23의 핵산 서열을 가지며, Ncgl2619는 서열번호 24의 핵산 서열을 갖는 것인 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 피루베이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 미생물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 피루베이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 lpd 유전자, aceE 유전자 및 aceF 유전자를 포함하는 것인 미생물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 lpd는 서열번호 12의 핵산 서열을 갖고, aceE는 서열번호 13의 핵산 서열을 가지며, aceF는 서열번호 14의 핵산 서열을 갖는 것인 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 포르메이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 미생물.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 코리네박테리움 속은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 알파-케토글루타레이트 신타제는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 미생물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 숙시닐-CoA 조효소 A 트란스퍼라아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인 미생물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 포르메이트 데히드로게나제는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 것인 미생물.
- 청구항 1의 미생물을 배양하는 단계;
배양물에서 C4 화학물질을 분리하는 단계를 포함하는 C4 화학물질 생산 방법. - 청구항 17에 있어서, 상기 C4 화학물질은 4-히드록시부티레이트인 것인 생산 방법.
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