CN110408604B - 底物亲和力和辅酶亲和力提高的甲酸脱氢酶突变体 - Google Patents

底物亲和力和辅酶亲和力提高的甲酸脱氢酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及NADP+依赖型的底物亲和力和辅酶亲和力明显提高的甲酸脱氢酶突变体、其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体。甲酸脱氢酶突变体是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第30位精氨酸、第124位异亮氨酸、第146位甘氨酸、第216位甘氨酸、第261位脯氨酸、第262位丝氨酸、第287位丙氨酸、第361位精氨酸或第381位谷氨酰胺中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列构成的衍生蛋白质，所述衍生蛋白质的底物亲和力、辅酶亲和力相较于如SEQ ID No.2所示氨基酸序列构成的甲酸脱氢酶的底物亲和力、辅酶亲和力提高。与现有技术相比，本发明所述突变体具有高底物亲和力和辅酶亲和力等优势，具有很好的应用前景。

Description

底物亲和力和辅酶亲和力提高的甲酸脱氢酶突变体
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种NADP+依赖型的底物亲和力和辅酶亲和力明显提高的甲酸脱氢酶突变体、其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体。
背景技术
甲酸脱氢酶(FDH)是一种重要的辅酶再生工具酶，其以甲酸盐作为辅底物，还原NAD+得到NADH，或还原NADP+得到NADPH，生成的副产物CO2从反应体系中溢出，从而推动反应向着生成NADH或NADPH的方向进行。甲酸脱氢酶催化的辅酶再生体系存在以下几个优点：(1)甲酸盐分子量相对较小，并且价格便宜；(2)反应产物为CO2，易分离；(3)反应几乎不可逆；(4)热稳定性较好，能用于连续反应器中进行反应，上述的优点使得FDH具有工业应用潜力。Degussa公司在上世纪90年代中期将来源于Candida boidinii的FDH(CboFDH)和L-亮氨酸脱氢酶进行偶联，用于L-叔亮氨酸的大规模合成，最终产品得率大于70％，时空产率大于600g L–1d–1，该FDH是第一个工业应用的辅酶再生工具酶(Tetrahedron-Asymmetry,1995,6:2851–2888)。
但是，FDH的活力及催化效率相对较低，有一些研究也进行了改造工作，但目前在FDH的改造工作中，活力或催化效率提高的实例并不多，其中对于NADP+依赖型的FDH的研究工作更少。由于大多数还原酶都是NADPH依赖型的，而目前绝大多数的天然FDH都是NAD+依赖型的，所以研究人员也在FDH的辅酶偏好性翻转方面做了大量的工作，以得到可以高效再生NADPH的FDH。2004年，美国专利US0115691报道在CboFDH中引入突变D195S/Y196H和D195S/Y196H/K356T，使得其对NADP+的活力由母本的0.0013U/mg分别提高为0.19U/mg和0.36U/mg。2009年，Wu等对Asp195和Tyr196进行组合饱和突变，得到双突变体D195Q/Y196R和D195Q/Y196P，其对NADP+的Km分别为0.05mM和0.11mM。之后在双点突变体D195Q/Y196R的基础上引入Q197N得到三点突变体D195Q/Y196R/Q197N，其对NADP+的Km降低到0.029mM，这是目前为止对NADP+亲和力最高的FDH突变体，但比活力只有0.12U/mg，不适合实际应用(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2009,61:157–161)。
2010年，来自Burkholderia stabilis 15516的甲酸脱氢酶BstFDH被报道，其为第一个报道的天然NADP+依赖型的FDH，对NADP+的kcat/Km达到30mM-1s-1，是已报道的FDH中最高的，但由于其对底物和辅酶的Km分别为55.5mM和0.16mM，使得在实际辅酶再生反应中添加的甲酸盐底物和辅酶浓度较高，增加了辅酶再生的成本和反应液的处理成本。因此需要进行工程改造提高酶对底物及辅酶的亲和力，从而进一步提高催化效率(kcat/Km)。2013年，Hoelsch等人通过与来自Burkholderia stabili 15516的NADP+依赖型FDH(BstFDH)进行序列比对，然后在MycFDH中引入突变A198G/D221Q，使得其对NADP+的kcat/Km达到2.94mM-1s-1，继续引入突变得到MycFDHA198G/D221Q/C145/C255V，其对NADP+的kcat/KM达到21.0mM-1s-1，但还是低于BstFDH。因此以BstFDH为出发母本进行改造工作，提高其对底物和辅酶亲和力以及酶的活性具有较大的意义和应用潜力(Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97:2473–2481)。
发明内容
本发明针对现有技术中甲酸脱氢酶的不足，通过半理性设计的手段对其进行改造，进一步提高该酶针对甲酸钠和NADP+的亲和力。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一，提供甲酸脱氢酶突变体。
甲酸脱氢酶BstFDH的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
本发明获得催化性能明显改善的甲酸脱氢酶突变体的方法为：首先构建含有BstFDH的重组菌，将BstFDH的基因克隆到质粒pET-22b中，实现目标蛋白的可溶表达，同时蛋白C端连接组氨酸标签。本发明中，以该酶作为母本，采用基于半理性设计的定点突变和组合突变等策略对其进行定向进化改造，通过动力学参数测定，最终获得辅酶亲和力及底物亲和力明显增加的突变体，突变体对辅酶的催化效率也同时得到提高。
本发明所述甲酸脱氢酶突变体，其是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第30位精氨酸、第124位异亮氨酸、第146位甘氨酸、第216位甘氨酸、第261位脯氨酸、第262位丝氨酸、第287位丙氨酸、第361位精氨酸或第381位谷氨酰胺中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列构成的衍生蛋白质，所述衍生蛋白质的底物亲和力、辅酶亲和力相较于如SEQ ID No.2所示氨基酸序列构成的甲酸脱氢酶的底物亲和力、辅酶亲和力提高。
具体地，所述甲酸脱氢酶突变体蛋白质具有如下序列：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第30位精氨酸替换为组氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸；同时第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸；同时第146位甘氨酸替换为组氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第30位精氨酸替换为组氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第381位谷氨酰胺替换为组氨酸；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸；
(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(15)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第381位谷氨酰胺替换为组氨酸；
(16)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第216位甘氨酸替换为天冬氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(17)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(18)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(19)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(20)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第216位甘氨酸替换为天冬氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(21)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(22)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(23)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(24)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸，第381位天冬酰胺替换为组氨酸。
本发明的技术方案之二，提供一种分离的核酸。
一种分离的核酸，所述核酸是编码如技术方案一中任一种所述甲酸脱氢酶突变体的核酸。
所述核酸，其来源包括：通过基因工程技术对技术方案一所述的系列甲酸脱氢酶突变体的基因序列进行克隆；或者通过人工全序列合成的方法得到编码如技术方案一所述甲酸脱氢酶突变体的核酸分子。
编码甲酸脱氢酶BstFDH的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的技术方案之三，提供一种包含本发明所述甲酸脱氢酶突变体的核酸序列的重组表达载体。
所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将本发明所述的甲酸脱氢酶突变体基因的编码核酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的还原酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
对于大肠杆菌宿主，所述质粒载体优选的为pET-22b(+)质粒。可通过下述方法制得本发明所述的大肠杆菌重组表达载体：将通过PCR扩增所得的甲酸脱氢酶突变体基因片段用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，同时将空载质粒pET-22b(+)同样用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，回收上述酶切后的甲酸脱氢酶突变体的DNA片段以及空载质粒，利用T4DNA连接酶连接，构建获得用于大肠杆菌表达的含有所述甲酸脱氢酶突变体编码核酸的重组表达载体。
本发明的技术方案之四，提供一种包含本发明所述甲酸脱氢酶突变体基因或重组表达载体的重组表达转化体。
重组表达转化体可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)用于高效表达本发明所述的甲酸脱氢酶突变体。
本发明的技术方案之五，提供一种重组甲酸脱氢酶突变体催化剂，所述的重组甲酸脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述甲酸脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述甲酸脱氢酶突变体的粗酶液；
(3)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述甲酸脱氢酶突变体的粗酶液，冷冻干燥得到的粗酶粉；
(4)直接以甲酸脱氢酶BstFDH或所述甲酸脱氢酶突变体作为催化剂。
所述重组甲酸脱氢酶突变体催化剂的应用：所述重组甲酸脱氢酶突变体催化剂以甲酸盐作为辅底物，还原NAD+得到NADH，或还原NADP+得到NADPH。
重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，例如可以包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组甲酸脱氢酶。对于重组大肠杆菌，优选培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 6.5-7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100ml的LB培养基(含氨苄青霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16-25℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述甲酸脱氢酶突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组甲酸脱氢酶突变体的粗酶液。收集的粗酶液置于-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。
本发明中所述甲酸脱氢酶突变体的活力测定方法：将含100mmol/L甲酸钠和1mmol/L NADP+的1ml反应体系(1mol/L磷酸钾缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量的甲酸脱氢酶突变体，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。
用下式计算得到酶活力：
酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)
式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)定义为上述条件下每分钟催化生成1μmol NADPH所需的酶量。
在测定BstFDH对NADP+及甲酸钠的动力学参数时，测活条件如下：测活总体系1mL，其中包含0.1-1mmol/L NADP+、10-800mmol/L甲酸钠、适量酶液和磷酸钾缓冲液(1mol/L,pH7.0)，测活温度为30℃，测活时间为1min。
在上述条件下测定的不同底物和辅酶浓度时BstFDH催化反应的初速度，在软件origin 9.0中选择米氏方程进行拟合，得出米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)，最后根据酶的浓度[E]计算得到kcat，从而得到kcat/Km等参数。
与现有技术相比，本发明甲酸脱氢酶BstFDH对辅酶NADP+的催化效率显著高于文献报道，而甲酸脱氢酶突变体相较于甲酸脱氢酶BstFDH，其底物亲和力和辅酶亲和力均有显著提高，具有很好的应用前景。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整地描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。
本发明实施例中的材料来源如下：
母本重组质粒pET-22b-BstFDH，含有如SEQ ID No.1所示的核酸序列，该核酸序列为发明人以伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis)基因组DNA为模板，根据文献报道的来源于伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis)的FDH(基因序列号ACF35003.1)的核酸序列设计引物，采用本领域常规技术方法(如聚合酶链反应PCR)，获得编码所述BstFDH的完整核酸分子。其中涉及的合成引物，优选的如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示：
正向引物：GGGAATTCCATATGGCGACCGTGCTGTGC，SEQ ID No.3所示；
反向引物：CCGCTCGAGGGTCAGACGATAGCTCTG，SEQ ID No.4所示；
空质粒载体pET-22b购自Novagen公司。
E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶Nde I、Xho I均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。
除非另有说明，下列实施例中的具体实验过程按照本领域常规方法和条件进行，或遵照商品说明书。
实施例1 BstFDH的定点突变
通过Uniprot、NCBI BLAST以及空间结构模建，获得如序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列的BstFDH的立体空间结构，对辅酶及底物的结合位点周围的氨基酸残基进行突变。以母本BstFDH的重组质粒为PCR模板进行定点饱和突变，PCR体系为：2×PrimeStar 10μl，上游引物和下游引物(10ng/μl)各1μl，模板质粒(50ng/μl)1μl，DMSO 1μl和ddH2O 6μl。PCR扩增程序为：98℃预变性5分钟后进行30次如下循环：98℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸7分钟；最后72℃再延伸10分钟。PCR扩增产物加入DpnI进行消化2h，将消化后产物转化E.coli BL21(DE3)，通过挑选单克隆得到含有突变的重组菌。最终发现将第30位精氨酸替换为组氨酸，第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸，第381位天冬酰胺替换为组氨酸得到的突变体对辅酶NADP+或底物的亲和力大幅度提高。
所述甲酸脱氢酶突变体的分光光度计活力测定方法：将含100mmol/L甲酸钠和1mmol/L NADP+的1ml反应体系(1mol/L磷酸钾缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量的BstFDH突变体酶液，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值，计算酶活力。
实施例2BstFDH的组合突变
在实施例1突变的基础上，对一些突变点进行组合，得到了对辅酶和底物亲和力显著提高的突变体，这些突变体的序列以及这些突变体对辅酶和底物亲和力提高的倍数列于表1中。在表1的列表中，序列标号分别指表1后面相对应的一系列序列；突变体亲和力提高倍数中，一个加号“+”表示突变体蛋白比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质对底物或辅酶的亲和力提高了0.1-1倍；两个加号“++”表示突变体蛋白比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质对底物或辅酶的亲和力提高了1-4倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质对底物或辅酶的亲和力提高了4-10倍。
表1 甲酸脱氢酶突变体序列及其亲和力提高倍数
Figure BDA0002166322570000091
Figure BDA0002166322570000101
对应序列标号的甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列分别如下：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第30位精氨酸替换为组氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸；同时第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸；同时第146位甘氨酸替换为组氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第30位精氨酸替换为组氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第381位谷氨酰胺替换为组氨酸；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸；
(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(15)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第381位谷氨酰胺替换为组氨酸；
(16)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第216位甘氨酸替换为天冬氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(17)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(18)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(19)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(20)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第216位甘氨酸替换为天冬氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(21)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(22)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(23)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(24)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸，第381位天冬酰胺替换为组氨酸。
实施例2 重组BstFDH的表达与催化效率kcat/Km的测定
将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-BstFDH接种至含50μg/ml氨苄青霉素的100mL LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100mlLB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，冰水浴中进行如下超声破碎：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液，活力为0.6U/mL。将上清粗酶液通过采用镍柱亲和层析得到纯蛋白，测定动力学参数后发现其对NADP+的kcat和Km分别为10.9s-1和0.19mM，kcat/Km为57.3mM-1s-1；其对甲酸钠的kcat和Km分别为10.9s-1和51.8mM，kcat/Km为0.21mM-1s-1。从测定结果来看，在本实施例中BstFDH对辅酶的kcat/Km显著高于文献报道(30mM-1s-1)。
实施例3 BstFDHM19的表达与催化效率kcat/Km的测定
将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-BstFDHM19接种至含50μg/ml氨苄青霉素的100mL LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，冰水浴中进行如下超声破碎：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液，活力为1.0U/mL。将上清粗酶液通过采用镍柱亲和层析得到纯蛋白，测定动力学参数后发现其对NADP+的kcat和Km分别为7.9s-1和0.13mM，kcat/Km为60.8mM-1s-1；其对甲酸钠的kcat和Km分别为8.1s-1和12.9mM，kcat/Km为0.63mM-1s-1。
实施例4 BstFDHM24催化效率kcat/Km的测定
将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-BstFDHM24接种至含50μg/ml氨苄青霉素的100mL LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，冰水浴中进行如下超声破碎：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液，活力为1.2U/mL。将上清粗酶液通过采用镍柱亲和层析得到纯蛋白，测定动力学参数后发现其对NADP+的kcat和Km分别为6.1s-1和0.11mM，kcat/Km为55.6mM-1s-1；其对甲酸钠的kcat和Km分别为6.5s-1和12.5mM，kcat/Km为0.52mM-1s-1。
实施例5 BstFDHM10催化效率kcat/Km的测定
将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-BstFDHM10接种至含50μg/ml氨苄青霉素的100mL LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，冰水浴中进行如下超声破碎：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液，活力为1.3U/mL。将上清粗酶液通过采用镍柱亲和层析得到纯蛋白，测定动力学参数后发现其对NADP+的kcat和Km分别为8.4s-1和0.09mM，kcat/Km为93.2mM-1s-1；其对甲酸钠的kcat和Km分别为8.9s-1和31.7mM，kcat/Km为0.28mM-1s-1。
实施例6 重组BstFDH催化剂的制备
将重组E.coli BL21/pET22b-BstFDH在含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行划线。从活化平板上挑取单菌，接种到装有4mL LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)的试管中，于37℃、200rpm摇床中培养8.5h，镜检无污染后，将种子液转接到含50μg/mL氨苄青霉素的200mL摇瓶LB培养基中，于37℃、180rpm摇床中培养4h左右。以10％的接种量将摇瓶种子接入到装有20L LB培养基的30-L发酵罐中，发酵罐初始温度和搅拌转速分别设置为37℃和200rpm，通气量调至1vvm，溶氧与搅拌级联控制DO>10％，pH使用氨水自动滴定控制在7.0，用蠕动泵按0.3mL/min的流速流加50％(w/v)的甘油，待OD600达到12-14左右时，将培养温度降至16℃，加入IPTG(终浓度约0.2mM)进行诱导表达。用分光光度计测定OD600和酶活力，当OD600不再增加且酶活力开始下降时，结束发酵，BstFDH的发酵活力为2.0U/mL。发酵液离心，获得湿细胞(转化体细胞)2.9kg，比活力为30U/g湿细胞；将获得的湿细胞重新悬浮于10L磷酸钾缓冲液(10mM,pH 7.0)中，800bar高压匀浆破碎2次，破碎液离心，上清液冷冻干燥，获得粗酶粉510g，比活力为101U/g粗酶粉。
实施例7 重组BstFDH M10催化剂的制备
将重组E.coli BL21/pET22b-BstFDH M10在含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行划线。从活化平板上挑取单菌，接种到装有4mL LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)的试管中，于37℃、200rpm摇床中培养8.5h，镜检无污染后，将种子液转接到含50μg/mL氨苄青霉素的200mL摇瓶LB培养基中，于37℃、180rpm摇床中培养4h左右。以10％的接种量将摇瓶种子接入到装有20L LB培养基的30-L发酵罐中，发酵罐初始温度和搅拌转速分别设置为37℃和200rpm，通气量调至1vvm，溶氧与搅拌级联控制DO>10％，pH使用氨水自动滴定控制在7.0，用蠕动泵按0.3mL/min的流速流加50％(w/v)的甘油，待OD600达到12-14左右时，将培养温度降至16℃，加入IPTG(终浓度约0.2mM)进行诱导表达。用分光光度计测定OD600和酶活力，当OD600不再增加且酶活力开始下降时，结束发酵，BstFDH M10的发酵活力为4.3U/mL。发酵液离心，获得湿细胞(转化体细胞)3.2kg，比活力为56U/g湿细胞；将获得的湿细胞重新悬浮于10L磷酸钾缓冲液(10mM,pH 7.0)中，800bar高压匀浆破碎2次，破碎液离心，上清液冷冻干燥，获得粗酶粉610g，比活力为195U/g粗酶粉。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学、苏州百福安酶技术有限公司
<120> 底物亲和力和辅酶亲和力提高的甲酸脱氢酶突变体
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1161
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德氏菌 (Burkholderia stabilis)
<400> 1
atggcgaccg tgctgtgcgt tctgtatccg gacccggtgg atggttaccc gccgcactat 60
gtgcgtgaca ccatcccggt tattacccgt tatgcggatg gtcaaaccgc gccgaccccg 120
gcgggtccgc cgggcttccg tccgggcgag ctggttggta gcgtgagcgg tgcgctgggt 180
ctgcgtggtt acctggaagc gcacggccac accctgatcg tgaccagcga caaggatggt 240
ccggacagcg agttcgaacg tcgtctgccg gacgcggatg tggttatcag ccaaccgttt 300
tggccggcgt atctgaccgc ggaacgtatt gcgcgtgcgc cgaaactgcg tctggcgctg 360
accgcgggta ttggtagcga tcatgttgat ctggatgcgg cggcgcgtgc gcacatcacc 420
gtggcggaag tgaccggtag caacagcatt agcgtggcgg aacacgtggt tatgaccacc 480
ctggcgctgg ttcgtaacta cctgccgagc catgcgattg cgcagcaagg tggctggaac 540
attgcggact gcgtgagccg tagctatgat gttgagggca tgcacttcgg taccgtgggt 600
gcgggtcgta ttggtctggc ggttctgcgt cgtctgaagc cgtttggtct gcacctgcac 660
tacacccaac gtcaccgtct ggatgcggcg atcgagcaag aactgggtct gacctatcat 720
gcggacccgg cgagcctggc ggcggcggtg gatatcgtta acctgcagat tccgctgtac 780
ccgagcaccg aacacctgtt cgatgcggcg atgatcgcgc gtatgaagcg tggtgcgtat 840
ctgattaaca ccgcgcgtgc gaaactggtg gaccgtgatg cggtggtgcg tgcggttacc 900
agcggtcacc tggcgggtta tggtggcgac gtgtggttcc cgcaaccggc gccggcggat 960
cacccgtggc gtgcgatgcc gtttaacggc atgaccccgc acattagcgg taccagcctg 1020
agcgcgcagg cgcgttatgc ggcgggtacc ctggagatcc tgcaatgctg gtttgacggt 1080
cgtccgatcc gtaacgaata cctgattgtt gatggtggca ccctggcggg taccggtgcg 1140
cagagctatc gtctgaccta a 1161
<210> 2
<211> 386
<212> PRT
<213> 伯克霍尔德氏菌 (Burkholderia stabilis)
<400> 2
Met Ala Thr Val Leu Cys Val Leu Tyr Pro Asp Pro Val Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Pro Pro His Tyr Val Arg Asp Thr Ile Pro Val Ile Thr Arg Tyr Ala
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Ala Pro Thr Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Arg Pro
35 40 45
Gly Glu Leu Val Gly Ser Val Ser Gly Ala Leu Gly Leu Arg Gly Tyr
50 55 60
Leu Glu Ala His Gly His Thr Leu Ile Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly
65 70 75 80
Pro Asp Ser Glu Phe Glu Arg Arg Leu Pro Asp Ala Asp Val Val Ile
85 90 95
Ser Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Ala Glu Arg Ile Ala Arg
100 105 110
Ala Pro Lys Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His
115 120 125
Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala His Ile Thr Val Ala Glu Val
130 135 140
Thr Gly Ser Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Thr Thr
145 150 155 160
Leu Ala Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Ala Ile Ala Gln Gln
165 170 175
Gly Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser Arg Ser Tyr Asp Val Glu
180 185 190
Gly Met His Phe Gly Thr Val Gly Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val
195 200 205
Leu Arg Arg Leu Lys Pro Phe Gly Leu His Leu His Tyr Thr Gln Arg
210 215 220
His Arg Leu Asp Ala Ala Ile Glu Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr His
225 230 235 240
Ala Asp Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ala Val Asp Ile Val Asn Leu Gln
245 250 255
Ile Pro Leu Tyr Pro Ser Thr Glu His Leu Phe Asp Ala Ala Met Ile
260 265 270
Ala Arg Met Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Ile Asn Thr Ala Arg Ala Lys
275 280 285
Leu Val Asp Arg Asp Ala Val Val Arg Ala Val Thr Ser Gly His Leu
290 295 300
Ala Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp
305 310 315 320
His Pro Trp Arg Ala Met Pro Phe Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser
325 330 335
Gly Thr Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Leu Glu
340 345 350
Ile Leu Gln Cys Trp Phe Asp Gly Arg Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu
355 360 365
Ile Val Asp Gly Gly Thr Leu Ala Gly Thr Gly Ala Gln Ser Tyr Arg
370 375 380
Leu Thr
385
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gggaattcca tatggcgacc gtgctgtgc 29
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ccgctcgagg gtcagacgat agctctg 27

Claims (7)

1.甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体蛋白质具有如下序列：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第30位精氨酸替换为组氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸；同时第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸；同时第146位甘氨酸替换为组氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第30位精氨酸替换为组氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第381位谷氨酰胺替换为组氨酸；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸；
(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(15)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第381位谷氨酰胺替换为组氨酸；
(16)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第216位甘氨酸替换为天冬氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(17)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸；
(18)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为组氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(19)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(20)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第216位甘氨酸替换为天冬氨酸，第361位精氨酸替换为赖氨酸；
(21)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(22)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(23)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸；
(24)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位异亮氨酸替换为缬氨酸，第146位甘氨酸替换为组氨酸，第261位脯氨酸替换为丙氨酸，第262位丝氨酸替换为丙氨酸，第287位丙氨酸替换为甘氨酸，第381位天冬酰胺替换为组氨酸。
2.一种核酸，其特征在于，编码如权利要求1所述甲酸脱氢酶突变体。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。
4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。
5.如权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体的构建方法，其特征在于，首先构建含有甲酸脱氢酶BstFDH的重组菌，甲酸脱氢酶BstFDH的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，将甲酸脱氢酶BstFDH的基因克隆到质粒中，实现目标蛋白的可溶表达，以该甲酸脱氢酶BstFDH作为母本，采用基于半理性设计的定点突变和组合突变等策略对其进行定向进化改造，通过动力学参数测定，最终获得辅酶亲和力及底物亲和力增加的甲酸脱氢酶突变体，甲酸脱氢酶突变体对辅酶的催化效率也同时得到提高。
6.一种重组甲酸脱氢酶突变体催化剂，其特征在于，是以下形式中的任意一种：
(1)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有所述甲酸脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有所述甲酸脱氢酶突变体的粗酶液；
(3)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有所述甲酸脱氢酶突变体的粗酶液，冷冻干燥得到的粗酶粉；
(4)权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体。
7.如权利要求6所述重组甲酸脱氢酶突变体催化剂的应用，其特征在于，所述重组甲酸脱氢酶突变体催化剂以甲酸盐作为辅底物，还原NAD+得到NADH，或还原NADP+得到NADPH。
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