CN115354034B - Nadp依赖型甲酸脱氢酶突变体、辅酶再生体系及其在制备l-草铵膦中的应用 - Google Patents

Nadp依赖型甲酸脱氢酶突变体、辅酶再生体系及其在制备l-草铵膦中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体、辅酶再生体系及其在制备L‑草铵膦铵盐中的应用，所述甲酸脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第198位、第221位、第246位、第272位或第379位中的一个或多个突变获得的。本发明甲酸脱氢酶突变体对NADP有较高亲和力，能高效地为氧化还原体系不断提供NADPH，突变体ApFDH‑A1对NAD的活力提高了0.38倍，对NADP的活力提高了11倍。利用甲酸脱氢酶突变体构建辅酶循环体系制备L‑草铵膦中，200mM底物转化率高达100％、副产物二氧化碳易于排出反应体系，产物分离纯化更方便，具有很好的应用前景。

Description

NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体、辅酶再生体系及其在制备L- 草铵膦中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体、辅酶再生体系及其应用。
(二)背景技术
氧化还原酶大多依赖辅酶NADPH或NADH进行催化反应，是手性化合物合成的重要生物催化剂，然而辅酶会随着产物的生成而消耗，同时NAD(P)H的高成本阻碍了其大规模生产。因此可以在反应系统中加入第二种氧化还原酶，以牺牲廉价的底物回收辅因子，构建一个高效、低成本的辅因子再生体系。
甲酸脱氢酶(FDH)催化甲酸盐生成CO2，同时将NAD(P)+还原为NAD(P)H，如图1，其构筑的氧化还原生物合成体系具有如下优势：(1)甲酸盐价格低廉，工业上能够有效控制成本；(2)甲酸盐是一种小分子，容易透过细胞膜进入细胞，提高了辅酶再生的效率；(3)副产物仅为CO2，易被排出反应体系，保证了产品纯度，并且CO2是惰性的，不会抑制生产酶的活性；(4)FDH的最适pH范围较广，一般在6.0～9.0之间，扩大了其操作范围。
但是，目前所挖掘的大部分FDH活力较低(≤10U/mg)、热稳定性较差以及仅对辅因子NAD具有依赖性。因此，研究人员正通过基因工程等手段尝试解决这些问题，并在FDH的辅酶偏好性翻转方面做了大量的工作，以得到可以高效再生NADPH的FDH。
(三)发明内容
本发明针对甲酸脱氢酶的缺点，提供一种NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体、工程菌、辅酶再生体系及在L-草铵膦制备中的应用，通过定点饱和突变的方法对甲酸脱氢酶进行改造，改变了其辅酶偏好性同时提高该酶对NADP的亲和力，可以广泛应用酶催化辅酶再生反应，酶活力和热稳定性均得到有效提高，克服现有技术中甲酸脱氢酶活力较低、热稳定较差以及仅依赖辅因子NAD的缺陷。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明的技术方案之一，提供一种NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示甲酸脱氢酶ApFDH氨基酸序列的第 198位丙氨酸、第221位天冬氨酸、第246位谷氨酸、第272位精氨酸或第379 位组氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基形成的新氨基酸序列获得的，所述突变体相较于SEQ ID No.2所示氨基酸序列构成的甲酸脱氢酶对NAD的辅酶偏好性改变为对NADP的辅酶偏好性，并且对NADP的催化效率有明显提高。
具体地，优选所述甲酸脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列突变为下列之一：
(1)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第246 位谷氨酸突变为甘氨酸、第272位精氨酸突变为亮氨酸、第379位组氨酸突变为丝氨酸(A198G/D221Q/E246G/R272L/H379S，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示)；(2)第198位丙氨酸突变为甘氨酸(A198G)； (3)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺 (A198G/D221Q)；(4)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第272位精氨酸突变为亮氨酸(A198G/D221Q/R272L)；(5)第198 位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第246位谷氨酸突变为甘氨酸(A198G/D221Q/E246G)；(6)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221 位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第272位精氨酸突变为亮氨酸、第246位谷氨酸突变为甘氨酸(A198G/D221Q/R272L/E246G)；(7)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第272位精氨酸突变为亮氨酸、第246位谷氨酸突变为甘氨酸、第379位组氨酸突变为赖氨酸 (A198G/D221Q/R272L/E246G/H379K)。
本发明获得甲酸脱氢酶突变体的方法为：首先将甲酸脱氢酶ApFDH的基因 (蛋白C端连接组氨酸标签)克隆到质粒pET-28a的Nco I和Xho I酶切位点之间，构建质粒pET-28a-ApFDH，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，构建含有甲酸脱氢酶ApFDH的重组菌，实现目标蛋白的可溶表达。以pET-28a-ApFDH作为模板，采用定点饱和突变对其进行改造并将筛选到的有益突变组合在一起，通过酶活和动力学参数的测定，最终获得NADP依赖型的ApFDH突变体，并且该突变体对NADP的催化效率也得到提高。
本发明的技术方案之二，提供一种编码所述的甲酸脱氢酶突变体的基因。
本发明的技术方案之三，提供了一种能够表达上述甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌以质粒pET-28a为载体，以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。
本发明的技术方案之四，提供了上述甲酸脱氢酶突变体在构建氧化还原酶辅酶再生体系中的应用，所述辅酶再生体系是指甲酸脱氢酶催化的反应体系， NADP从甲酸盐获得还原力生成NADPH。本发明中甲酸盐为甲酸铵，NADP在甲酸脱氢酶作用下获得质子H变为还原型辅酶NADPH。
本发明还提供了甲酸脱氢酶突变体构成的辅酶再生体系在制备L-草铵膦中的应用，所述的应用以2-氧代-4-[(羟基)(甲基)膦基]丁酸(简称PPO)为底物，以草铵膦脱氢酶(PPTGDH)和甲酸脱氢酶(FDH)突变体共表达重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，加入甲酸铵和NADP，以pH5-9的缓冲液为反应介质构成辅酶再生体系，在20-50℃、400-600rpm下反应，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶突变体共表达重组工程菌是将草铵膦脱氢酶编码基因与甲酸脱氢酶突变体编码基因共同转入宿主菌构建而成，其中草铵膦脱氢酶编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
所述辅酶再生体系中，生物催化剂加入量为2-10gDCW/L(优选5gDCW/L)；甲酸铵加入终浓度为100-1500mM(优选300mM)；NADP加入终浓度0.1-0.5mM (优选0.1mM)；底物PPO加入终浓度为100-1500mM(优选200mM)。所述反应条件优选为35℃、搅拌转速为600rpm。所述缓冲液优选为7.5的磷酸钠缓冲液。
所述草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶突变体共表达重组基因工程菌是采用一步克隆法将甲酸脱氢酶突变体基因克隆到含草铵膦脱氢酶基因的 pETDuet-1-PPTGDH载体的第二个多克隆位点上(Nde I和Avr II酶切位点之间)，转入宿主E.coli BL21(DE3)，构建共表达重组基因工程菌。
所述生物催化剂按如下方法制备：将甲酸脱氢酶突变体和草铵膦脱氢酶共表达重组工程菌(优选E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-A1)接种至含50μg/ml氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为12μg/mL 的IPTG，18℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心15min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸钠缓冲液洗涤两次，获得湿菌体。
所述反应液分离纯化的方法为下列一种：(1)将反应液进行喷雾干燥，获得 L-草铵膦粉剂；喷雾干燥的条件为进口温度为200℃，出口温度为100℃，流速5mL/min；(2)将反应液加入甲醇中，搅拌均匀，通入氨气，10℃搅拌10h，过滤，滤饼90℃真空干燥2h，得L-草铵膦铵盐粉剂；所述甲醇用量以反应液体积计为128-640g/L反应液；所述氨气通入量以反应液体积计为1.5-6mol/L反应液。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
(1)本发明通过定点饱和突变，构建获得甲酸脱氢酶突变体的基因文库，将有益突变组合在一起并从中筛选获得对NADP有较高亲和力、催化性能高的甲酸脱氢酶突变体；其中甲酸脱氢酶突变体ApFDH-A1与ApFDH-WT相比，对 NAD的活力提高了0.38倍，对NADP的活力提高了11倍。
(2)本发明提供的甲酸脱氢酶突变体(特别是ApFDH-A1)能够高效地为氧化还原体系不断提供NADPH，使合成路线降低了成本。
(3)本发明提供的利用甲酸脱氢酶突变体构建辅酶循环体系制备L-草铵膦的方法中，200mM底物转化率高达100％、副产物二氧化碳易于排出反应体系，使产物分离纯化更方便。本发明的甲酸脱氢酶突变体ApFDH-A1对NADP的催化效率显著高于野生型，具有很好的应用前景。
(四)附图说明
图1为甲酸脱氢酶的反应示意图。
图2为甲酸脱氢酶SDS-PAGE电泳图，其中泳道M：标准蛋白分子量；泳道1：pET-28a-ApFDH-A1粗酶液；泳道2：pET-28a-ApFDH-A1纯酶液；泳道3： pET-28a-ApFDH-WT粗酶液；泳道4：pET-28a-ApFDH-WT纯酶液。
图3为利用草铵膦脱氢酶偶联甲酸脱氢酶催化2-氧代-4-[(羟基)(甲基)膦基] 丁酸制备L-草铵膦的反应示意图。
图4为甲酸脱氢酶和草铵膦脱氢酶重组基因工程菌制备L-草铵膦的反应进程图。
图5为L-草铵膦粉剂成品照片。
(五)具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体的实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
本发明实施例中使用的Phanta DNA Polymerase、一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒均购自Axygen杭州有限公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂均购自于Sigma公司；E.coli BL21(DE3)、质粒、异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)均购自于上海生工有限公司；DpnI限制性核酸内切酶购自于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，引物合成与基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。
本发明中所述甲酸脱氢酶及其突变体的活力测定反应体系：100mmol/L磷酸钠缓冲液、200mmol/L甲酸铵、2mmol/L NAD/NADP，pH 7.5，然后加入适量甲酸脱氢酶或突变体的酶液，总体积为200μL，35℃，记录340nm处吸光值变化。在测定条件下，每分钟生成1μmolNADH/NADPH所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
LB液体培养基组成：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH自然。
LB平板组成是在LB液体培养基中加入20g/L的琼脂。
在测定甲酸脱氢酶及其突变体对NAD/NADP及甲酸铵的动力学参数时，测定条件如下：总体系为200μL，0.01-10mmol/L NAD/NADP、2.5-2000mmol/L甲酸铵、适量酶液和100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5，温度35℃，每隔30s检测一次。在上述条件下测定出不同甲酸铵浓度和辅酶浓度时ApFDH催化反应的初速度，用Origin 2018中的非线性拟合中米氏方程(Michaelis Menten)进行拟合，得出米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)，最后根据酶的浓度[E]计算得到 kcat，从而得到kcat/Km等参数。
除非另有说明，下列实施例中的具体实验过程按照本领域常规方法和条件进行，或遵照商品说明书。
实施例1、野生型甲酸脱氢酶重组基因工程菌的构建
1、重组质粒pET-28a-ApFDH
根据GenBank中来源于固氮螺菌(Azospirillumpalustre)的甲酸脱氢酶的核酸序列(NCBI登录号为WP_098736599.1)，由杭州擎科生物技术有限公司进行全基因合成，获得野生型甲酸脱氢酶(记为ApFDH-WT)，并将获得的ApFDH-WT 基因克隆到质粒pET-28a的NcoI和Xho I酶切位点之间，构建重组质粒 pET-28a-ApFDH-WT，ApFDH-WT基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1
GCCAAAATTGTTTGTGTGCTGTATGATGATCCGGTGACCGGCTATCCGA CCAGCTATGCACGTGATGATCTGCCGAAAATTGATGGTTATGCAGGTGGCC AGACCCTGCCGACCCCGAAAGCAATTGATTTTCAGCCGGGCACCCTGCTG GGCAGCGTGAGTGGTGAACTGGGCCTGCGTCGTTATCTGGAAAGTCTGGG TCATGAACTGGTGGTGACCAGTGATAAAGATGGCCCGGATAGTCGCCTGGA AAAAGAACTGGCAGATGCCGAAATTGTTATTAGCCAGCCGTTTTGGCCGGC CTATCTGACCGCAGAACGCATTGCAAAAGCCCCGAAACTGAAACTGGCCC TGACCGCCGGCATTGGCAGCGATCATGTGGATCTGCAGGCCGCAATGGATC GTGGCGTTACCGTTGCAGAAGTGACCTATTGCAATAGCATTAGTGTGGCAG AACATGTTGTGATGATGATTCTGGGTCTGGTGCGCAATTATCTGCCGAGTCA TGATTGGGTTCGCAAAGGCGGTTGGAATATTGCCGATTGTGTGGCACGTAG TTATGATGTTGAAGGCATGCATGTGGGTACCGTGGCCGCAGGTCGCATTGG TCTGGCCGTTCTGCGTCGCCTGAAACCGTTTGATATGCATCTGCATTATACC GATCGCCATCGTCTGCCGGAAAGTGTTGAAGCCGAACTGAATCTGACCTGG CATGCAACCCGTGAAGAAATGTTTGAAGTGTGTGATGTGGTGACCCTGAAT TGCCCGCTGCATCCGGAAACCGAACACATGATTAATGAAGAAACCCTGAAACGTTTTAAGCGTGGCGCATATCTGGTGAATACCGCACGTGGCAAACTGTG CGATCGCGATGCAATTGCACGCGCACTGGAAAGCGGTCGCCTGGCAGGCTA TGCCGGTGATGTGTGGTTTCCGCAGCCGGCCCCGCAGGATCATCCGTGGCG TACCATGCCGCATCATGGCATGACCCCGCATATTAGTGGTACCAGTCTGAGT GCACAGACCCGCTATGCAGCAGGTACCCGCGAAATTCTGGAATGCTGGTTT GAAGGCCGTCCGATTCGTGATGAATATCTGATTGTTGATGGTGGTCGTCTGG CAGGCGTGGGCGCCCATAGCTATAGTGCCGGCAATGCCACCGGCGGTAGCG AAGAAGCCGAACGTTTTAAAGCAGCCGTGCCGGCA.
SEQ ID NO.2：
AKIVCVLYDDPVTGYPTSYARDDLPKIDGYAGGQTLPTPKAIDFQPGTLL GSVSGELGLRRYLESLGHELVVTSDKDGPDSRLEKELADAEIVISQPFWPAYLT AERIAKAPKLKLALTAGIGSDHVDLQAAMDRGVTVAEVTYCNSISVAEHVVM MILGLVRNYLPSHDWVRKGGWNIADCVARSYDVEGMHVGTVAAGRIGLAVL RRLKPFDMHLHYTDRHRLPESVEAELNLTWHATREEMFEVCDVVTLNCPLHP ETEHMINEETLKRFKRGAYLVNTARGKLCDRDAIARALESGRLAGYAGDVWF PQPAPQDHPWRTMPHHGMTPHISGTSLSAQTRYAAGTREILECWFEGRPIRDE YLIVDGGRLAGVGAHSYSAGNATGGSEEAERFKAAVPA.
2、野生型重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ApFDH-WT。
感受态细胞的制备：从-80℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coli BL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含5mL的LB培养基的试管中，37℃、180rpm培养9h；从试管中取1mL 菌液，接种到50mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养OD600至0.4-0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10min，4℃、5000rpm 离心10min；将上清液倒出，用4℃预冷的0.1mol/L的CaCl2水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30min；4℃、5000rpm离心10min，弃上清，用4℃预冷的含 15％甘油的0.1mol/L的CaCl2水溶液重悬沉淀细胞，取100μL重悬细胞分装至灭菌的1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱，需要时取出。
重组大肠杆菌的构建：首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞在0℃冰浴5min，然后在超净台内加入2μL的质粒pET-28a-ApFDH-WT，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴5min，加入600μL的LB液体培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒的野生型重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ApFDH-WT。
实施例2、ApFDH-WT基因的随机突变和定点饱和突变
1、随机突变
以实施例1中pET-28a-ApFDH-WT为模板(其中ApFDH-WT为目的基因)，设计易错PCR引物(上游引物：5’-ATGGCCAAAATTGTTTGTGTG-3’；下游引物：5’-GCTCGAGTTATGCCGGCAC-3’)，对ApFDH-WT基因进行随机突变，构建基因文库的PCR体系为：2×PCR Buffer 25μL，PCRdNTP 1μL，Taq DNA Polymerase 1μL，ddH2O 18μL，模板质粒1μL，上游引物和下游引物(10ng/μl) 各2μL，Mn2+＝0.2mM。PCR扩增程序为：95℃预变性5min后进行20次如下循环：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸5min；最后72℃再延伸10 min。然后将PCR产物通过大片段克隆技术克隆到pET-28a上，将消化后产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选了13500个单克隆进行酶活检测。发现在 A198、D221、E246、R272、H379进行突变后，突变体酶活上升超过30％；而 P97、F98、N146、R284、H332位点改变后突变体的酶活均有一定程度下降。
2、定点饱和突变
定点饱和突变均以实施例1的载体pET-28a-ApFDH-WT为PCR模板，在这五个氨基酸位点(A198、D221、E246、R272、H379)进行定点饱和突变(引物设计如表1所示)。
定点饱和突变PCR体系为：2×PCR Buffer 25μL，PCR dNTP 1μL，Phanta DNAPolymerase 1μL，ddH2O 18μL，模板质粒1μL，上游引物和下游引物(10ng/μl) 各2μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min后进行30次如下循环：95℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸4min；最后72℃再延伸10min。
PCR扩增产物加入DpnI进行消化2h，将消化后产物转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞，通过挑选单克隆得到含有突变的重组菌。每个点挑选突变体100 个，一共500个突变体进行酶活检测，筛选活力较高的突变体。最终发现将第 198位丙氨酸替换为甘氨酸对NAD的比酶活提高了28％、替换为缬氨酸和半胱氨酸对NAD的比酶活分别下降了15％和22％；第246位谷氨酸替换为甘氨酸对 NAD的比酶活提高了16％、替换为丙氨酸对NAD的比酶活下降了31％；第272 位精氨酸替换为亮氨酸对NAD的比酶活提高了17％、替换为丝氨酸和组氨酸对 NAD的比酶活分别下降了8％和13％；第379位组氨酸替换为赖氨酸或丝氨酸对 NAD的比酶活分别提高了13％和28％、替换为天冬氨酸对NAD的比酶活下降了6％，但上述突变体对NADP的比酶活均无明显变化。第221位天冬氨酸替换为谷氨酰胺对NAD的比酶活降低了近一半，但对NADP的比酶活提高了4倍，有效改变了其辅酶依赖型。
所述甲酸脱氢酶突变体的活力测定反应体系：100mmol/L磷酸钠缓冲液、200mmol/L甲酸铵、2mmol/L NAD或NADP，pH 7.5，然后加入终浓度为0.1g DCW/L的甲酸脱氢酶全细胞，总体积为200μL，35℃，每隔30s记录一次340nm 处NADH或NADPH的吸光值变化，根据其标准曲线计算出产物NADH和 NADPH的浓度，计算酶活力。在测定条件下，每分钟生成1μmolNADH/NADPH 所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
NADH标准曲线：在340nm处检测不同浓度(0.01-0.5mM)NADH的标准曲线为y＝2.76181+0.23691，R2＝0.9989。
NADPH标准曲线：在340nm处检测不同浓度(0.01-0.5mM)NADPH的标准曲线为y＝2.9917x+0.1862，R2＝0.9997。
表1甲酸脱氢酶定点饱和突变引物设计
实施例3、基于ApFDH-WT的组合突变
在实施例2突变的基础上，对一些有益突变点进行组合，得到了对NAD或 NADP活性显著增加的突变体，这些突变体的突变位点及其对NAD和NADP的相对酶活均列于表2中。
突变体A3：以实施例2构建的pET-28a-ApFDH-A198G为模板，以表2中 D221-F、D221-R为引物，采用实施例2所述定点饱和突变方法，获得突变体A3。同样方法获得表2所示各个突变体。突变体A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
表2甲酸脱氢酶突变体的突变位点及其对NAD和NADP的相对活力
实施例4、ApFDH-WT的表达与催化效率的测定
1、粗酶液
将实施例1构建的野生型甲酸脱氢酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ApFDH-WT接种至含50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有 50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为12μg/mL的IPTG，18℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm 离心15min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸钠缓冲液洗涤两次，获得湿菌体；将0.5g湿菌体加入pH 7.5、100mM的磷酸钠缓冲液10mL中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停 5s，破碎混合液4℃、8000rpm离心15min，取上清液即获得粗酶液。
2、纯酶液
将粗酶液用连接蛋白纯化仪的Ni亲和柱(40×12.6mm，Bio-Rad，USA)进行纯化得到纯酶液，其步骤为：
(1)平衡基线：先用超纯水冲洗Ni亲和柱5-10个柱体积，流速2mL/min；再用平衡液冲洗5-10个柱体积，流速2mL/min，至UV基线平衡。其中平衡液： 50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，pH 8.0，用超纯水溶解。
(2)上样：将步骤1制备的粗酶液上样，上样量为10mL，流速为2mL/min；
(3)洗脱杂蛋白：上样结束后，用冲洗液冲洗5-10个柱体积，流速2mL/min，将UV基线冲平，此时杂蛋白以及未结合的目的蛋白被除去；冲洗液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，50mM咪唑，pH 8.0，用超纯水溶解。
(4)洗脱目的蛋白：用洗脱液冲洗步骤(3)Ni亲和柱洗脱目的蛋白，洗脱 10个柱体积，流速1.0mL/min，当吸光度达到0.3并上升时开始收集目的蛋白洗脱液，当吸光度降到0.3时，停止收集，收集过程在冰上进行；洗脱液：50mM 磷酸二氢钠，300mM氯化钠，300mM咪唑，pH 8.0，用超纯水溶解。
(5)平衡基线：步骤(4)收集洗脱液后的Ni亲和柱继续用平衡液冲洗，流速调为3.0mL/min，到基线冲平为止。
(6)保存镍柱：用20％乙醇进行冲洗，至基线稳定后，将柱子拆下并于4℃冰箱保存；
(7)目的蛋白透析：将步骤(4)收集的目的蛋白洗脱液装入透析袋(MWCO 14KDa)，置于pH 7.5的磷酸钠缓冲液中于冰上透析，隔6h更换一次透析缓冲液，取截留液，获得纯化的酶液，置于冰上待用。
粗酶液和纯酶液分别采用BCA蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)检测蛋白含量分别为3.08g/L和2.99g/L。分别将粗酶液和纯酶液进行SDS-PAGE分析，其结果如图2中泳道3和4所示，酶蛋白有较好表达并且纯酶液无杂蛋白。
3、动力学参数的测定
不同甲酸铵浓度测定条件如下：总体系为200μL，终浓度为1mmol/L NAD、 2.5-2000mmol/L(2.5、12.5、125、250、500、1000、1500、2500mmol/L)甲酸铵、50mg/L(以蛋白含量计)的纯酶液和100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5，温度35℃，按实施例2所述酶活检测方法检测。
不同辅酶浓度测定条件如下：总体系为200μL，终浓度为0.01-10mmol/L (0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10mmol/L)NAD、500mmol/L甲酸铵、50mg/L (以蛋白含量计)的纯酶液和100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5，温度35℃，按实施例2所述酶活检测方法检测。
在上述条件下测定出不同甲酸铵浓度和辅酶浓度时ApFDH催化反应的初速度，用Origin 2018中的非线性拟合中米氏方程(Michaelis-Mentenequation)进行拟合，得出米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)，最后根据酶的浓度[E]计算得到kcat，从而得到kcat/Km等参数。
ApFDH-WT对NAD的Km和kcat分别为0.048mM和2.17s-1，kcat/Km为44.95 mM-1s-1；对甲酸盐的Km和kcat分别为8.70mM和2.10s-1，kcat/Km为0.24mM-1s-1。
实施例5、ApFDH-A1的表达与催化效率的测定
将实施例4构建的甲酸脱氢酶突变体工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ApFDH-A1接种至含50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有 50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体 OD600达0.6-0.8，加入终浓度为12μg/mL的IPTG，18℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心15min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸钠缓冲液洗涤两次，获得湿菌体；将0.5g湿菌体加入pH 7.5、100mM的磷酸钠缓冲液10mL 中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎 1s，暂停5s后，10min后将破碎混合液在4℃、8000rpm条件下离心15min，取上清液即获得粗酶液。同实施例4方法，将粗酶液用Ni亲和柱进行纯化得到纯酶液，蛋白浓度为2.88g/L，并进行SDS-PAGE分析，其结果如图2中泳道1和2所示，酶蛋白有较好表达并且纯酶液无杂蛋白。
采用实施例4方法(分别采用NAD和NADP作为辅酶)对其进行动力学参数的测定，ApFDH-A1对NAD的Km和kcat分别为1.19mM和4.04s-1，kcat/Km为3.4mM-1s-1；对甲酸盐的Km和kcat分别为13.87mM和4.32s-1，kcat/Km为0.31 mM-1s-1。ApFDH-A1对NADP的Km和kcat分别为0.12mM和5.01s-1，kcat/Km为41.78mM-1s-1；对甲酸盐的Km和kcat分别为8.36mM和3.12s-1，kcat/Km为0.37mM-1s-1。
实施例6、甲酸脱氢酶和草铵膦脱氢酶共表达重组基因工程菌的构建
采用一步克隆法将ApFDH-WT和ApFDH-A1分别克隆到含草铵膦脱氢酶基因的pETDuet-1-PPTGDH载体的第二个多克隆位点上(Nde I和Avr II酶切位点之间)，转入宿主E.coli BL21(DE3)，构建重组基因工程菌。其中，含草铵膦脱氢酶基因的pETDuet-1-PPTGDH载体同专利申请CN110592036A(薛亚平,程峰, 李清华,郑裕国.一种草铵膦脱氢酶突变体及在氧化-还原多酶偶联生产L-草铵膦中的应用[P].浙江省：2019-12-20.)的实施例1，具体操作如下：
1、引物设计
根据SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列设计引物1、引物2和引物3、引物4，并将载体pETDuet-1-PPTGDH中包含Nde I和Avr II酶切位点约20bp作为同源臂分别添加到甲酸脱氢酶基因特异性正/反向扩增引物序列(引物1和引物2)的5’端。
引物1：5’-tataagaaggagatatacatGGCCAAAATTGTTTGTGTGCT-3’；
引物2：5’-ggtggcagcagcctaggttaTGCCGGCACGGCTGCTTT-3’；
引物3：5’-TAACCTAGGCTGCTGCCACC-3’；
引物4：5’-ATGTATATCTCCTTCTTATACTTAACTAATATACTAAGA-3’；
2、片段扩增
(1)pETDuet-1-PPTGDH的载体
以pETDuet-1-PPTGDH为模板，以引物3和引物4为引物，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，加入DPN I对其进行消化，得到pETDuet-1-PPTGDH的载体，其中草铵膦脱氢酶PPTGDH编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
(2)ApFDH-WT片段
以pET-28a-ApFDH-WT为模板，以引物1和引物2为引物，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，加入DPN I对其进行消化，得到带有同源臂的甲酸脱氢酶基因ApFDH-WT片段。
(3)ApFDH-A1片段
以pET-28a-ApFDH-A1为模板，以引物1和引物2为引物，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，加入DPN I对其进行消化，得到带有同源臂的甲酸脱氢酶基因ApFDH-A1片段。
(4)单片段同源重组
将步骤(1)到步骤(3)各个片段采用NanoDropone微量分光光度计 (TermoFisherScientific，USA)进行核酸浓度的测定，根据浓度按照表3的单片段同源重组反应体系进行配置。
最适克隆载体使用量＝{0.02*克隆载体碱基对数}ng(0.03pmol)
最适插入片段使用量＝{0.04*插入片段碱基对数}ng(0.06pmol)
表3、反应体系
注：X表示加入线性化载体的量，Y表示插入片段的量，n为插入片段数量。
将配置好的反应体系使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心后将反应液收集到管底。反应体系放在50℃的水浴中，静置5min，然后立即放在冰上冷却。将3 种不同体系分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/mL 氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养12-16h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选含有草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-WT和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-A1。
实施例7：甲酸脱氢酶和草铵膦脱氢酶共表达重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-A1制备L-草铵膦
1、生物催化剂
将甲酸脱氢酶和草铵膦脱氢酶共表达重组工程菌 E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-WT和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-A1分别接种至含50μg/ml氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为12μg/mL的IPTG，18℃下诱导培养16h 后，4℃、8000rpm离心15min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸钠缓冲液洗涤两次，获得湿菌体。
2、L-草铵膦的合成
参照图3的合成路线，以2-氧代-4-[(羟基)(甲基)膦基]丁酸(简称PPO)为底物，以草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂进行反应，生成L-草铵膦，具体操作如下：
先将5gDCW/L的草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-A1湿菌体、300mM甲酸铵、0.1mM NADP依次溶解于1L的100mM、pH7.5的磷酸钠缓冲液中，然后加入终浓度为 200mM的底物PPO(36.2g/L)构成辅酶再生体系1L，35℃、搅拌转速为600rpm 下反应5h，反应液取样采用高效液相色谱检测产物L-草铵膦的生成和ee值的变化，结果如图4所示。同样条件下，以甲酸脱氢酶和草铵膦脱氢酶共表达重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-WT为对照。
图4显示，菌株E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-A1反应时产物浓度随时间的推移而逐渐升高，4h内反应完成，底物转化率大于99％，产物 ee值始终保持在99％以上。E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-WT 菌株反应4h的转化率仅为10％。
高效液相色谱(HPLC)检测产物浓度，分析方法为：色谱柱型号：GL Sciences 4.6*250mm*AX 5μm；流动相：磷酸二氢钾13.6g(0.1mol)，加入600mL去离子水，超声2-3min，静置至常温，加入150mL甲醇，用水定容至1000mL，用磷酸调节溶液至2.6。检测波长为195nm，流速：1.0mL/min。柱温：40℃，出峰时间为：4.0分钟。
高效液相色谱(HPLC)检测底物浓度，分析方法为：色谱柱型号：QS-C18，5 μm，4.6×250mm。流动相：将50mM磷酸二氢胺和10mM四丁基氢氧化铵溶于800mL超纯水中，用磷酸调pH到3.8，并定容至1000mL，与乙腈以体积比 88:12混合。检测波长为232nm，流速：0.8mL/min，柱温：40℃，出峰时间为： 10.0分钟。
实施例8、喷雾干燥制备L-草铵膦粉剂
将实施例7中反应完全的1L反应液直接进行喷雾干燥，理论上可制得36.0 g的L-草铵膦粉剂(图5)，实际上得到35.6g。随后对制得的L-草铵膦粉剂的纯度进行验证，取0.01g的L-草铵膦粉剂溶于10mL超纯水中，配置成1g/L的 L-草铵膦水溶液，并对其进行液相检测(同实施例7)，结果显示L-草铵膦质量分数>95％。
喷雾干燥的条件为进口温度为200℃，出口温度为100℃，流速5mL/min。
实施例9、甲醇结晶制备L-草铵膦铵盐粉剂
将实施例7中反应完全的1L反应液加入128g甲醇中，搅拌均匀，通入25.5g(1.5mol)氨气，10℃搅拌10h，过滤，滤饼90℃真空干燥2h，得L-草铵膦铵盐粉剂39.7g(含量96％)。
实施例10、甲酸脱氢酶和草铵膦脱氢酶共表达重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-A1制备高浓度L-草铵膦。
将10g DCW/L的实施例7制备的草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-A1湿菌体、1.3M甲酸铵、 0.3mM NADP依次溶解于pH7.5、100mM磷酸钠缓冲液，然后加入终浓度为 1mol/L的底物PPO(180.1g/L)构成辅酶再生体系1L，35℃、搅拌转速为600rpm 下反应，采用实施例7高效液相色谱法取样检测，8h内反应完成，底物转化率大于99％，产物ee值始终保持在99％以上。
对比例1、甲酸脱氢酶和草铵膦脱氢酶共表达重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-WT制备高浓度L-草铵膦。
将10g DCW/L的实施例7制备的草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH-ApFDH-WT湿菌体、1.3M甲酸铵、 0.3mM NADP依次溶解于pH7.5、100mM磷酸钠缓冲液，然后加入终浓度为1mol 的底物PPO(180.1g)构成辅酶再生体系1L，35℃、搅拌转速为600rpm下反应，采用实施例7高效液相色谱法取样检测，反应8h后，底物转化率仅为59％，产物ee值99％，进一步反应12h后，底物转化率也小于65％。
实施例11、喷雾干燥高浓度转化液体制备L-草铵膦铵盐粉剂
将实施例10中反应完全的1L反应液直接进行喷雾干燥，理论上可制得 181.1g的L-草铵膦粉剂，实际上得到178.6g。随后对制得的L-草铵膦粉剂的纯度进行验证，取0.01g的L-草铵膦粉剂溶于10mL超纯水中，配置成1g/L的L- 草铵膦水溶液，并对其进行实施例7所述高效液相色谱检测，结果显示L-草铵膦质量分数>98％。
喷雾干燥的条件：进口温度为200℃，出口温度为100℃，流速5mL/min。
实施例12、甲醇结晶高浓度转化液体制备L-草铵膦铵盐粉剂
将实施例10中反应完全的1L反应液加入640g甲醇中，搅拌均匀，通入102g (6mol)氨气，10℃搅拌10h，过滤，滤饼90℃真空干燥2h，得L-草铵膦铵盐粉剂198.2g(含量96％)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改和变化。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体 、辅酶再生体系及其在制备L-草铵膦中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1206
<212> DNA
<213> 固氮螺菌(Azospirillum palustre)
<400> 1
gccaaaattg tttgtgtgct gtatgatgat ccggtgaccg gctatccgac cagctatgca 60
cgtgatgatc tgccgaaaat tgatggttat gcaggtggcc agaccctgcc gaccccgaaa 120
gcaattgatt ttcagccggg caccctgctg ggcagcgtga gtggtgaact gggcctgcgt 180
cgttatctgg aaagtctggg tcatgaactg gtggtgacca gtgataaaga tggcccggat 240
agtcgcctgg aaaaagaact ggcagatgcc gaaattgtta ttagccagcc gttttggccg 300
gcctatctga ccgcagaacg cattgcaaaa gccccgaaac tgaaactggc cctgaccgcc 360
ggcattggca gcgatcatgt ggatctgcag gccgcaatgg atcgtggcgt taccgttgca 420
gaagtgacct attgcaatag cattagtgtg gcagaacatg ttgtgatgat gattctgggt 480
ctggtgcgca attatctgcc gagtcatgat tgggttcgca aaggcggttg gaatattgcc 540
gattgtgtgg cacgtagtta tgatgttgaa ggcatgcatg tgggtaccgt ggccgcaggt 600
cgcattggtc tggccgttct gcgtcgcctg aaaccgtttg atatgcatct gcattatacc 660
gatcgccatc gtctgccgga aagtgttgaa gccgaactga atctgacctg gcatgcaacc 720
cgtgaagaaa tgtttgaagt gtgtgatgtg gtgaccctga attgcccgct gcatccggaa 780
accgaacaca tgattaatga agaaaccctg aaacgtttta agcgtggcgc atatctggtg 840
aataccgcac gtggcaaact gtgcgatcgc gatgcaattg cacgcgcact ggaaagcggt 900
cgcctggcag gctatgccgg tgatgtgtgg tttccgcagc cggccccgca ggatcatccg 960
tggcgtacca tgccgcatca tggcatgacc ccgcatatta gtggtaccag tctgagtgca 1020
cagacccgct atgcagcagg tacccgcgaa attctggaat gctggtttga aggccgtccg 1080
attcgtgatg aatatctgat tgttgatggt ggtcgtctgg caggcgtggg cgcccatagc 1140
tatagtgccg gcaatgccac cggcggtagc gaagaagccg aacgttttaa agcagccgtg 1200
ccggca 1206
<210> 2
<211> 402
<212> PRT
<213> 固氮螺菌(Azospirillum palustre)
<400> 2
Ala Lys Ile Val Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Thr Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Thr Ser Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp Gly Tyr Ala Gly
20 25 30
Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Gln Pro Gly Thr
35 40 45
Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu
50 55 60
Ser Leu Gly His Glu Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro Asp
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Lys Glu Leu Ala Asp Ala Glu Ile Val Ile Ser Gln
85 90 95
Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Ala Glu Arg Ile Ala Lys Ala Pro
100 105 110
Lys Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val Asp
115 120 125
Leu Gln Ala Ala Met Asp Arg Gly Val Thr Val Ala Glu Val Thr Tyr
130 135 140
Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu Gly
145 150 155 160
Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Asp Trp Val Arg Lys Gly Gly
165 170 175
Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ala Arg Ser Tyr Asp Val Glu Gly Met
180 185 190
His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu Arg
195 200 205
Arg Leu Lys Pro Phe Asp Met His Leu His Tyr Thr Asp Arg His Arg
210 215 220
Leu Pro Glu Ser Val Glu Ala Glu Leu Asn Leu Thr Trp His Ala Thr
225 230 235 240
Arg Glu Glu Met Phe Glu Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys Pro
245 250 255
Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Glu Glu Thr Leu Lys Arg
260 265 270
Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu Cys
275 280 285
Asp Arg Asp Ala Ile Ala Arg Ala Leu Glu Ser Gly Arg Leu Ala Gly
290 295 300
Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Gln Asp His Pro
305 310 315 320
Trp Arg Thr Met Pro His His Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly Thr
325 330 335
Ser Leu Ser Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile Leu
340 345 350
Glu Cys Trp Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile Val
355 360 365
Asp Gly Gly Arg Leu Ala Gly Val Gly Ala His Ser Tyr Ser Ala Gly
370 375 380
Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Glu Arg Phe Lys Ala Ala Val
385 390 395 400
Pro Ala
<210> 3
<211> 1206
<212> DNA
<213> 固氮螺菌(Azospirillum palustre)
<400> 3
gccaaaattg tttgtgtgct gtatgatgat ccggtgaccg gctatccgac cagctatgca 60
cgtgatgatc tgccgaaaat tgatggttat gcaggtggcc agaccctgcc gaccccgaaa 120
gcaattgatt ttcagccggg caccctgctg ggcagcgtga gtggtgaact gggcctgcgt 180
cgttatctgg aaagtctggg tcatgaactg gtggtgacca gtgataaaga tggcccggat 240
agtcgcctgg aaaaagaact ggcagatgcc gaaattgtta ttagccagcc gttttggccg 300
gcctatctga ccgcagaacg cattgcaaaa gccccgaaac tgaaactggc cctgaccgcc 360
ggcattggca gcgatcatgt ggatctgcag gccgcaatgg atcgtggcgt taccgttgca 420
gaagtgacct attgcaatag cattagtgtg gcagaacatg ttgtgatgat gattctgggt 480
ctggtgcgca attatctgcc gagtcatgat tgggttcgca aaggcggttg gaatattgcc 540
gattgtgtgg cacgtagtta tgatgttgaa ggcatgcatg tgggtaccgt gggcgcaggt 600
cgcattggtc tggccgttct gcgtcgcctg aaaccgtttg atatgcatct gcattatacc 660
cagcgccatc gtctgccgga aagtgttgaa gccgaactga atctgacctg gcatgcaacc 720
cgtgaagaaa tgtttggtgt gtgtgatgtg gtgaccctga attgcccgct gcatccggaa 780
accgaacaca tgattaatga agaaaccctg aaactgttta agcgtggcgc atatctggtg 840
aataccgcac gtggcaaact gtgcgatcgc gatgcaattg cacgcgcact ggaaagcggt 900
cgcctggcag gctatgccgg tgatgtgtgg tttccgcagc cggccccgca ggatcatccg 960
tggcgtacca tgccgcatca tggcatgacc ccgcatatta gtggtaccag tctgagtgca 1020
cagacccgct atgcagcagg tacccgcgaa attctggaat gctggtttga aggccgtccg 1080
attcgtgatg aatatctgat tgttgatggt ggtcgtctgg caggcgtggg cgccagcagc 1140
tatagtgccg gcaatgccac cggcggtagc gaagaagccg aacgttttaa agcagccgtg 1200
ccggca 1206
<210> 4
<211> 402
<212> PRT
<213> 固氮螺菌(Azospirillum palustre)
<400> 4
Ala Lys Ile Val Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Thr Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Thr Ser Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp Gly Tyr Ala Gly
20 25 30
Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Gln Pro Gly Thr
35 40 45
Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu
50 55 60
Ser Leu Gly His Glu Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro Asp
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Lys Glu Leu Ala Asp Ala Glu Ile Val Ile Ser Gln
85 90 95
Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Ala Glu Arg Ile Ala Lys Ala Pro
100 105 110
Lys Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val Asp
115 120 125
Leu Gln Ala Ala Met Asp Arg Gly Val Thr Val Ala Glu Val Thr Tyr
130 135 140
Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu Gly
145 150 155 160
Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Asp Trp Val Arg Lys Gly Gly
165 170 175
Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ala Arg Ser Tyr Asp Val Glu Gly Met
180 185 190
His Val Gly Thr Val Gly Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu Arg
195 200 205
Arg Leu Lys Pro Phe Asp Met His Leu His Tyr Thr Gln Arg His Arg
210 215 220
Leu Pro Glu Ser Val Glu Ala Glu Leu Asn Leu Thr Trp His Ala Thr
225 230 235 240
Arg Glu Glu Met Phe Gly Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys Pro
245 250 255
Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Glu Glu Thr Leu Lys Leu
260 265 270
Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu Cys
275 280 285
Asp Arg Asp Ala Ile Ala Arg Ala Leu Glu Ser Gly Arg Leu Ala Gly
290 295 300
Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Gln Asp His Pro
305 310 315 320
Trp Arg Thr Met Pro His His Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly Thr
325 330 335
Ser Leu Ser Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile Leu
340 345 350
Glu Cys Trp Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile Val
355 360 365
Asp Gly Gly Arg Leu Ala Gly Val Gly Ala Ser Ser Tyr Ser Ala Gly
370 375 380
Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Glu Arg Phe Lys Ala Ala Val
385 390 395 400
Pro Ala
<210> 5
<211> 1338
<212> DNA
<213> 固氮螺菌(Azospirillum palustre)
<400> 5
atgattgaga gcgtcgagtc tttcttggcc cgccttaaaa agcgcgaccc tgaccagccg 60
gagtttcatc aggcagttga ggaagtctta cgctcattat ggccgttcct ggaagctaac 120
ccccgttatt tgactagcgg cattcttgaa cgtatttgcg agccggaacg tgccatcgtt 180
ttccgtgtga gctgggtaga cgaccaagga aaggtgcaag tgaaccgtgg cttccgcatc 240
cagatgaact cagctatcgg cccatataaa ggcgggttgc gttttcatcc aagcgttaat 300
ttgggtgtct taaaattctt agcgttcgag caaacattta aaaacagctt aacatcgtta 360
cccatgggtg gaggaaaggg tggtagtgac ttcgacccaa aggggaagag cgatgcggaa 420
gtcatgcgtt tctgccaggc attcatgtca gagctttacc gtcacatcgg ggcggacgtc 480
gatgtgccag gtggagatat tggcgtgggt gcgcgcgaga ttggattttt attcggtcag 540
tataagcgtc tgtctaacca gttcacctcg gtacttacgg gtaagggacc gtcatatggc 600
ggcagtttga ttcgcccaga agctaccgga tttggttgtg tttattttgc cgaagaaatg 660
cttaagcgcc gtggagaaac cgtggaaggc aagcgtgttg ccattagtgg ctctgggaac 720
gtagcgcagt atgcggcccg caaggtgatg gatcttggcg gaaaagtcat ttctttatca 780
gacagcgagg gcacattata ctgcgaatcc ggtttgactg aagctcaatg gcaagcagtg 840
ttggaactga agaatgtaca acgtggccgt atttcagaat tagccggacg ctttggtctt 900
gaatttttag cgggccaacg cccctggggt ttatcttgcg atatcgccct tccttgcgcg 960
acgcagaacg agcttgacgc cgaagctgcg cgtgctttac ttcgtaatgg atgcacgtgc 1020
gtcgctgaag gggcgaacat gccgacaacc cttgaggcgg ttgatctgtt tatcgaagcg 1080
ggtattctgt tcgctccagg taaagcctcg aatgctggcg gggttgcagt gtcgggttta 1140
gagatgtcgc aaaacgcaat gcgtttattg tggacagggg gcgaggttga ctcaaaattg 1200
catgctatca tgcagagcat ccatcatgct tgcgtacatt acggtgaaga gaacggtcag 1260
gtaaactacg taaagggggc gaatattgct ggattcgtga aggttgctga tgcaatgctg 1320
gcacaggggg tcgtctaa 1338

Claims (9)

1.一种NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体是将SEQID No .2所示氨基酸序列突变为下列之一：
（1）第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第246位谷氨酸突变为甘氨酸、第272位精氨酸突变为亮氨酸、第379位组氨酸突变为丝氨酸；（2）第198位丙氨酸突变为甘氨酸；（3）第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；（4）第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第272位精氨酸突变为亮氨酸；（5）第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第246位谷氨酸突变为甘氨酸；（6）第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第272位精氨酸突变为亮氨酸、第246位谷氨酸突变为甘氨酸；（7）第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第272位精氨酸突变为亮氨酸、第246位谷氨酸突变为甘氨酸、第379位组氨酸突变为赖氨酸。
2.一种含权利要求1所述甲酸脱氢酶突变体编码基因的重组基因工程菌。
3.一种权利要求1所述NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体在构建氧化还原酶辅酶再生体系中的应用。
4.一种权利要求1所述NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体构建的氧化还原酶辅酶再生体系在制备L-草铵膦中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用以2-氧代-4-[(羟基)(甲基)膦基]丁酸为底物，以草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶突变体共表达重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，加入甲酸铵和NADP，以pH5-9的缓冲液为反应介质构成辅酶再生体系，在20-50℃、400-600rpm下反应，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶突变体共表达重组工程菌是将草铵膦脱氢酶编码基因与甲酸脱氢酶突变体编码基因共同转入宿主菌构建而成，其中草铵膦脱氢酶编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述辅酶再生体系中，生物催化剂加入量为2-10gDCW/L；甲酸铵加入终浓度为100-1500mM；NADP加入终浓度0.1-0.5mM；底物2-氧代-4-[(羟基)(甲基)膦基]丁酸加入终浓度为100-1500mM。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶突变体共表达重组工程菌是采用一步克隆法将甲酸脱氢酶突变体基因克隆到含草铵膦脱氢酶基因的pETDuet-1-PPTGDH载体的Nde I和Avr II酶切位点之间，转入宿主E.coli BL21(DE3)，构建共表达重组工程菌。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物催化剂按如下方法制备：将甲酸脱氢酶突变体和草铵膦脱氢酶共表达重组工程菌接种至含50μg/ml氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37 ℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为12μg/mL的IPTG，18 ℃下诱导培养16h后，4 ℃、8000rpm离心15min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸钠缓冲液洗涤两次，获得湿菌体。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应液分离纯化的方法为下列一种：（1）将反应液直接进行喷雾干燥，获得L-草铵膦粉剂；喷雾干燥的条件为进口温度为200 ℃，出口温度为100 ℃，流速5 mL/min；（2）将反应液加入甲醇中，搅拌均匀，通入氨气，10℃搅拌10 h，过滤，滤饼90 ℃真空干燥2 h，得L-草铵膦铵盐粉剂；所述甲醇用量以反应液体积计为128-640g/L；所述氨气通入量以反应液体积计为1.5-6mol/L。
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