CN116121308A - 一种基于nadph辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，旨在通过体外级联酶催化技术将姜黄素高效转化为四氢姜黄素。本发明利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞，表达NADPH依赖性姜黄素转化酶（CurA）以及甲酸脱氢酶（Fdh）。使用LB培养基进行发酵，超声细胞破碎以得到CurA和Fdh的粗酶液。NADPH依赖性的CurA负责将姜黄素转化为四氢姜黄素。Fdh负责将产生的NADP+还原为NADPH以实现NADPH辅因子的高效循环利用。此外，借助离子液体提高姜黄素在反应体系中的溶解度，通过底物以及离子液体浓度的优化最终姜黄素转化率约为40.5%，四氢姜黄素产率约为48.66%，产量约为11.01mg/L。
Description
技术领域
本发明属于生物催化领域，具体涉及一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，通过生物酶催化与大肠杆菌蛋白表达，采用水-离子液体相结合的催化体系和NADPH辅因子循环的级联酶催化，最终实现姜黄素高效合成四氢姜黄素。
背景技术
四氢姜黄素(THC)作为姜黄素(CUR)在体内的代谢产物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、美白等多方面的生理作用，且大量的实验结果表明，其生物活性均优于姜黄素。四氢姜黄素在抗氧化方面的作用等同于姜黄素，并可在较低的浓度下发挥作用，是具有广阔应用前景的姜黄素药物替代物，因此利用微生物优化四氢姜黄素的生物合成过程十分重要。
目前合成四氢姜黄素的方法包括化学合成法、生物合成法。由于化学合成法经济性差、环境污染严重、选择性差、纯化困难，而且，随着反应规模的放大，反应时间延长，过度还原的副产物明显增加，不能够成为合成四氢姜黄素的主流方法。与化学法相比，微生物全细胞发酵法，尽管转化的效率较其他报道已大大提高，但产物纯度低及杂质比较多，并不具备商业化前景。本发明利用生物体外级联酶催化法具有反应条件温和、活性高、使用剂量低、环境友好等优点，大幅降低工业化生产成本，而且符合当下绿色环保的生产原则。
NADPH是一种辅酶，叫还原型辅酶Ⅱ，学名还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。本发明通过探索和挖掘在大肠杆菌基因组内可能存在的能够代谢姜黄素转化酶(CurA)构建基因重组表达载体，同时利用甲酸脱氢酶(Fdh)构建NADPH辅因子循环，添加NADPH辅因子的持续供给，两步催化反应级联后可实现高效合成四氢姜黄素，采用水-离子液体相结合的催化体系并优化四氢姜黄素的生物合成过程，为四氢姜黄素的生物催化提供一条新的思路。
发明内容
本发明旨在针对上述问题，提供了一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法。本发明通过构建姜黄素转化酶(CurA)和甲酸脱氢酶(Fdh)的基因重组表达载体，采用水-离子液体相结合的催化体系和NADPH辅因子循环的级联酶催化，最终实现姜黄素高效合成四氢姜黄素。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，其是在生物催化中利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞表达NADPH依赖性姜黄素转化酶(CurA)以及甲酸脱氢酶(Fdh)，使用LB液体培养基进行发酵培养，超声细胞破碎以得到CurA粗酶液和Fdh粗酶液；NADPH依赖性的CurA负责将姜黄素转化为四氢姜黄素，Fdh负责将产生的NADP+还原为NADPH以实现NADPH辅因子的高效循环利用；此外，借助离子液体提高姜黄素在反应体系中的溶解度，通过底物以及离子液体浓度的优化，实现姜黄素高效合成四氢姜黄素。
进一步，上述一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，具体包括以下步骤：
1)将NADPH依赖性姜黄素转化酶基因curA与pRSFDuet-1质粒重组构成重组表达载体pRSFDuet-curA，将甲酸脱氢酶基因fdh与pRSFDuet-1质粒重组构成重组表达载体pRSFDuet-fdh；
2)将重组表达载体pRSFDuet-curA以化学转化法转染至大肠杆菌BL21(DE3)，使用LB液体培养基培养并添加0.2mM IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细胞得到CurA粗酶液；CurA催化姜黄素合成四氢姜黄素的反应体系总体积为1mL，包括：0.1mM NADPH，75μM姜黄素，270μL CurA粗酶液，其余为0.1M pH6.0磷酸二氢钾缓冲液；
3)将重组表达载体pRSFDuet-fdh以化学转化法转染至大肠杆菌BL21(DE3)，使用LB液体培养基培养并添加0.2mM IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细胞得到Fdh粗酶液；NADPH辅因子循环的四氢姜黄素合成体系总体积为1mL，包括：0.1mM NADPH，75μM姜黄素，0.3M甲酸钠，270μL CurA粗酶液，200μL Fdh粗酶液，其余为0.1M pH6.0磷酸二氢钾缓冲液；
4)选择四种离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基吡啶四氟酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，分别加入至步骤3)中NADPH辅因子循环的四氢姜黄素合成体系当中，离子液体与NADPH辅因子循环的四氢姜黄素合成体系中的磷酸二氢钾缓冲液组成两相体系，目的是兼顾酶活与底物溶解度，二者可在相界面进行级联催化反应；
5)通过优化步骤4)合成体系中姜黄素浓度，以及合成体系中离子液体的体积比，最终实现姜黄素高效转化为四氢姜黄素。
进一步，上述步骤1)中，NADPH依赖性姜黄素还原酶基因curA序列如SEQ IDNO.1所示，甲酸脱氢酶基因fdh序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，上述步骤4)中，所述的离子液体的选择，通过对比姜黄素在四种离子液体的溶解度，同时监测CurA和Fdh的活性损失，最终选择1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIm][PF6]。
进一步，上述步骤5)中，所述的优化姜黄素浓度，设置不同底物浓度梯度，分别为75μM、150μM、300μM、450μM，最终确定150μM姜黄素为最优底物浓度；随后，设置离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐在反应体系中不同的体积比5％、10％、15％、20％、25％、30％，最终确定离子液体的最佳体积比为20％。
优选的，最终确定一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，包括以下步骤：
1)将NADPH依赖性姜黄素转化酶基因curA与pRSFDuet-1质粒重组构成重组表达载体pRSFDuet-curA，将甲酸脱氢酶基因fdh与pRSFDuet-1质粒重组构成重组表达载体pRSFDuet-fdh；
2)将重组质粒pRSFDuet-curA以化学转化法转染至大肠杆菌BL21(DE3)，使用LB液体培养基培养并添加0.2mM IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细胞得到CurA粗酶液；将重组质粒pRSFDuet-fdh以化学转化法转染至大肠杆菌BL21(DE3)，使用LB液体培养基培养并添加0.2mM IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细胞得到Fdh粗酶液；
3)基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的反应体系总体积1mL：0.1mM NADPH，150μM姜黄素，0.3M甲酸钠，270μL CurA粗酶液，200μL Fdh粗酶液，200μL1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，其余为0.1M pH6.0磷酸二氢钾缓冲液；反应在25℃进行，使用磁力搅拌器进行搅拌，转速为300rpm。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
在本发明中，利用NADPH辅因子对姜黄素转化酶(CurA)依赖性，通过体外级联酶催化反应将姜黄素转化为四氢姜黄素。引入甲酸脱氢酶(Fdh)将反应产生的NADP+还原为NADPH以实现NADPH辅因子的高效循环利用。此外，借助离子液体提高姜黄素在反应体系中的溶解度，通过底物以及离子液体浓度的优化，大大提高了四氢姜黄素的产量，最终四氢姜黄素产量达到11.01mg/L。
附图说明
图1A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法验证第一泳道为空质粒pRSFDuet-1，第二泳道为蛋白pRSFDuet-curA-fdh，第三泳道为蛋白pRSFDuet-curA，第四泳道为蛋白pRSFDuet-fdh。图1B：姜黄素高效合成四氢姜黄素与NADPH辅因子循环图。
图2A至图2D：(A)无辅因子循环的酶催化体系中姜黄素的转化率图；(B)无辅因子循环的酶催化体系中四氢姜黄素的产率与产量图；(C)有辅因子循环的酶催化体系中姜黄素的转化率图；(D)有辅因子循环的酶催化体系中四氢姜黄素的产率与产量图。图2E：产物四氢姜黄素(THC)质谱图。
图3：酶催化体系中离子液体种类的选择图；其中，(A)姜黄素在不同离子液体的溶解度与水相的溶解度的比值图；(B)在含有不同离子液体的酶催化体系中姜黄素的转化率图；(C)在含有不同离子液体的酶催化体系中四氢姜黄素的产率与产量图。
图4：底物姜黄素浓度优化图；其中，(A)含有不同姜黄素浓度的酶催化体系中姜黄素的转化率图；(B)含有不同姜黄素浓度的酶催化体系中四氢姜黄素的产率与产量图。
图5：离子液体体积比优化图；其中，(A)含有离子液体体积比的酶催化体系中姜黄素的转化率图；(B)含有离子液体体积比的酶催化体系中四氢姜黄素的产率与产量图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
重组质粒pRSFDuet-curA和pRSFDuet-fdh的构建
(1)目的基因的扩增
本专利的目的基因为NADPH依赖性姜黄素转化酶基因curA与甲酸脱氢酶基因fdh。其中，NADPH依赖性姜黄素转化酶基因curA序列如SEQ ID NO.1所示，来源于E.coli JM109(DE3)；甲酸脱氢酶基因fdh序列如SEQ ID NO.2所示，来自假单胞杆菌(Pseudomonassp.)101，假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)101已公开于参考文献：Tishkov V I,GalkinA G,Fedorchuk V V,et al.Pilot scale production and isolation of recombinant NAD+-and NADP+-specific formate dehydrogenases[J].Biotechnol Bioeng,1999(2).。
通过分子生物学设计curA-F、curA-R为目的基因引物，以pRSFDuet-1质粒(购自Novagen)为模板，进行PCR扩增，获得SEQ ID NO.1所示的目的基因curA的扩增产物。通过分子生物学设计fdh-F、fdh-R为目的基因引物，以人工合成的甲酸脱氢酶基因fdh序列为模板，进行PCR扩增，获得SEQ ID NO.2所示的目的基因fdh的扩增产物。实验中所使用的引物序列、PCR体系和扩增条件如下所示。
表1-1目的基因引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| curA-F | CATGCCATGGGGCAACAAAAGCAGC |
| curA-R | CCCAAGCTTTTAATCATCACCCGCCAC |
| fdh-F | GGAATTCCATATGGCAAAAGTTCTGTGCG |
| fdh-R | CGGGGTACCTTAAACCGCTTTTTTGAATTTC |
表1-2PCR扩增体系
| 样品 | 体积(μL) |
| Primer STAR(2x) | 50 |
| Upstream primer | 4 |
| Downstream primer | 4 |
| Template | 4 |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 38 |
| 总体系 | 100 |
表1-3PCR设定程序
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 1预变性 | 98℃ | 3min |
| 2变性 | 98℃ | 10s |
| 3退火 | 57℃ | 30s |
| 4延伸 | 72℃ | 70s |
| 5循环扩增 | Go to step 2 | 30cycles |
| 6延伸 | 72℃ | 10min |
| 7Hold | 12℃ | forever |
| 8 | END |
PCR扩增结束后，分别在目的基因curA和fdh的扩增产物中加入体积为15μL DNA上样缓冲液Loading buffer，并用移液枪轻轻混合均匀后加入到配置好的琼脂糖分离核酸胶孔中，并设置琼脂糖凝胶电泳仪为130V，30min。待凝胶电泳结束后，将琼脂糖凝胶放到照胶仪中，观察基因片段条带的长短，对正确的亮条带快速切胶，进行胶回收，得到纯化的目的基因curA片段与纯化的目的基因fdh片段，并放到-20℃冰箱备用。
(2)酶切和连接
用限制性内切酶NcoI和HindIII对质粒pRSFDuet-1和前述纯化获得的目的基因curA片段分别进行双酶切，酶切完成后通过胶回收再次纯化目的基因，纯化的目的基因curA与酶切后的pRSFDuet-1质粒在金属浴进行连接，得到重组质粒pRSFDuet-curA。同理，用限制性内切酶NcoI和HindIII对质粒pRSFDuet-1和前述纯化获得的目的基因fdh片段分别进行双酶切，酶切完成后通过胶回收再次纯化目的基因，纯化的目的基因fdh与酶切后的pRSFDuet-1质粒在金属浴进行连接，得到重组质粒pRSFDuet-fdh。其中，金属浴设定条件：双酶切温度37℃，连接温度16℃，连接时间12h～16h，实验过程所用的双酶切体系和连接体系如下所示。
表1-4双酶切体系
| 样品 | 体积(μL) |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 11 |
| 10×buffer酶 | 5 |
| NcoI | 2 |
| HindIII | 2 |
| 质粒/基因 | 30 |
| 总体积 | 50 |
表1-5连接体系
| 样品 | 体积(μL) |
| 双酶切后的基因 | 6 |
| 双酶切后的质粒 | 2.5 |
| T4 Buffer | 1 |
| T4连接酶 | 0.5 |
| 总体系 | 10 |
实施例2
在体外酶催化体系中构建NADPH辅因子循环
将重组质粒pRSFDuet-curA与pRSFDuet-fdh分别以化学转化法转染至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(curA)与BL21(DE3)(fdh)。将获得的重组大肠杆菌分别在200mL的LB液体培养基中37℃培养，直至OD600达到0.6-0.8，再向培养液中添加终浓度0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，设置摇床温度20℃，继续培养约16h，以诱导蛋白表达。诱导结束后进行8000rpm、4℃离心法收集细胞，用0.1M磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.0)洗涤细胞两次，收集菌体并用10mL 0.1M磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.0)重悬。冰浴超声裂解菌体，4℃、6000rpm离心4min，分离上清液和沉淀，所得上清液即为粗酶液。取适量上清液用于体外酶催化实验，其余离心上清液放-20℃保存。
如上，利用破胞得到姜黄素转化酶(CurA)粗酶液和甲酸脱氢酶(Fdh)粗酶液。经测定，CurA粗酶液的蛋白浓度为6mg/mL、CurA粗酶的比活力为3.01U/mg，Fdh粗酶液的蛋白浓度为8mg/mL、Fdh粗酶的比活力为4.00U/mg。
分别平行对照做无NADPH辅因子循环的体外酶催化反应，与有NADPH辅因子循环的体外级联酶催化反应。体系中无NADPH辅因子循环时，反应体系总体积为1mL，包括：0.1mMNADPH，75μM姜黄素，270μL CurA粗酶液，其余为0.1M pH6.0磷酸二氢钾缓冲液。体系中有NADPH辅因子循环时，反应体系总体积为1mL，包括：0.1mM NADPH，75μM姜黄素，0.3M甲酸钠，270μL CurA粗酶液，200μL Fdh粗酶液，其余为0.1M pH6.0磷酸二氢钾缓冲液。反应均在室温25℃下进行，使用磁力搅拌器进行搅拌，反应转速均为300rpm。反应时间为200min，每隔一定时间取一次样品。
实验结果显示(图2A至图2D，图2E)，加入NADPH辅因子循环，姜黄素的转化率提高了6％，四氢姜黄素的产率提高了3.4％，说明NADPH辅因子循环有利于姜黄素高效合成四氢姜黄素。
实施例3
在体外酶催化体系中构建两相选择
测定了姜黄素在不同离子液体中的溶解度，酶催化反应体系总体积为1mL，包括：0.1mM NADPH，75μM姜黄素，0.3M甲酸钠，270μL CurA粗酶液，200μL Fdh粗酶液，其余为0.1MpH6.0磷酸二氢钾缓冲液。平行实验分别再在酶催化反应体系中加入体积比10％(v/v)的不同离子液体，即酶催化反应体系总体积为1mL，包括：0.1mM NADPH，75μM姜黄素，0.3M甲酸钠，270μL CurA粗酶液，200μL Fdh粗酶液，100μL离子液体，其余为0.1M pH6.0磷酸二氢钾缓冲液。反应均在室温25℃下进行，使用磁力搅拌器进行搅拌，反应转速均为300rpm。反应时间为200min，每隔一定时间取一次样品。
由于姜黄素在水相体系中，溶解度极低，但在离子液体中溶解度较高。选择四种离子液体：1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[BMIm][BF4]、1-丁基吡啶四氟酸盐[Bpy][BF4]、1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐[BMIm]NTf2、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIm][PF6]，分别与酶催化反应体系中的磷酸二氢钾缓冲液(水相)组成两相体系，二者可在相界面进行级联催化反应，通过对比姜黄素在四种离子液体的溶解度，同时监测姜黄素转化酶(CurA)和甲酸脱氢酶(Fdh)的活性损失，最终选择1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIm][PF6](图3)。
表1-6实验试剂
| 试剂 | 来源 |
| 姜黄素(98％) | 源叶生物 |
| <![CDATA[1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIm][BF<sub>4</sub>])(97％)]]> | 麦克林 |
| <![CDATA[1-丁基吡啶四氟硼酸盐([Bpy][BF<sub>4</sub>])(98％)]]> | 阿拉丁 |
| <![CDATA[1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF<sub>6</sub>])(97％)]]> | 源叶生物 |
| <![CDATA[1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐([BMIm]NTf<sub>2</sub>)(99％)]]> | 麦克林 |
| <![CDATA[pRSFDuet-1(T7promoter,Kan<sup>R</sup>)]]> | Novagen |
实施例4
在体外酶催化体系中优化实验条件
在NADPH辅因子循环的条件下，加入体积比10％(v/v)的离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIm][PF6]作为有机相，首先优化了姜黄素底物的浓度，分别设置不同底物终浓度梯度，分别为75μM、150μM、300μM、450μM，其他条件不变，测定底物姜黄素的剩余量和四氢姜黄素的产量，计算姜黄素的转化率与四氢姜黄素的产率。具体的，酶催化反应体系总体积为1mL，包括：0.1mM NADPH，不同终浓度姜黄素，0.3M甲酸钠，270μL CurA粗酶液，200μL Fdh粗酶液，100μL离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIm][PF6]，其余为0.1MpH6.0磷酸二氢钾缓冲液。反应在室温25℃下进行，使用磁力搅拌器进行搅拌，反应转速均为300rpm。反应时间为200min。通过对比分析(图4)，最终选择150μM为最佳姜黄素底物浓度。
其次优化了[BMIm][PF6]的体积比浓度，分别设置不同体积比梯度，分别为5％、10％、15％、20％、25％、30％，其他条件不变，测定底物姜黄素的剩余量和四氢姜黄素的产量，计算姜黄素的转化率与四氢姜黄素的产率。具体的，酶催化反应体系总体积为1mL，包括：0.1mM NADPH，150μM姜黄素，0.3M甲酸钠，270μL CurA粗酶液，200μL Fdh粗酶液，不同体积[BMIm][PF6]，其余为0.1M pH6.0磷酸二氢钾缓冲液。在室温25℃下进行，使用磁力搅拌器进行搅拌，反应转速均为300rpm。反应时间为200min。通过对比分析(图5)，最终确定离子液体的体积比为20％，即酶催化反应体系中[BMIm][PF6]的最佳体积为200μL。经过计算，最终姜黄素转化率约为40.5％，四氢姜黄素产率约为48.66％，产量约为11.01mg/L。
需说明的是，本实验上述所涉及的酶催化均使用的是未固定化未突变的粗酶溶液。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，其特征在于：构建姜黄素转化酶CurA的基因重组表达载体和甲酸脱氢酶Fdh的基因重组表达载体，并分别转染至大肠杆菌BL21(DE3)中表达，得到姜黄素转化酶CurA粗酶液和甲酸脱氢酶Fdh粗酶液；姜黄素转化酶CurA催化姜黄素转化为四氢姜黄素并消耗NADPH辅因子，而甲酸脱氢酶Fdh氧化甲酸的反应中将NADP+还原为NADPH，因此，两步催化反应级联后实现四氢姜黄素合成时NADPH辅因子的持续供给；采用水-离子液体相结合的催化体系，维持水相中姜黄素转化酶CurA和甲酸脱氢酶Fdh的高活力，并保证姜黄素在离子液体中的溶解度；此外，通过对底物姜黄素浓度和离子液体浓度的逐步优化，最终实现基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素。
2.根据权利要求1所述的一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将NADPH依赖性姜黄素转化酶基因curA与pRSFDuet-1质粒重组构成重组表达载体pRSFDuet-curA，将甲酸脱氢酶基因fdh与pRSFDuet-1质粒重组构成重组表达载体pRSFDuet-fdh；
2）将重组表达载体pRSFDuet-curA以化学转化法转染至大肠杆菌BL21(DE3)，使用LB液体培养基培养并添加0.2mM IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细胞得到姜黄素转化酶CurA粗酶液；姜黄素转化酶CurA催化姜黄素合成四氢姜黄素的反应体系总体积为1mL，包括：0.1mMNADPH，75μM姜黄素，270μL姜黄素转化酶CurA粗酶液，其余为0.1M pH6.0磷酸二氢钾缓冲液；
3）将重组表达载体pRSFDuet-fdh以化学转化法转染至大肠杆菌BL21(DE3)，使用LB液体培养基培养并添加0.2mM IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细胞得到甲酸脱氢酶Fdh粗酶液；NADPH辅因子循环的四氢姜黄素合成体系总体积为1mL，包括：0.1mM NADPH，75μM姜黄素，0.3M甲酸钠，270μL姜黄素转化酶CurA粗酶液，200μL甲酸脱氢酶Fdh粗酶液，其余为0.1 MpH6.0磷酸二氢钾缓冲液；
4）选择四种离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基吡啶四氟酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，分别加入至步骤3）中NADPH辅因子循环的四氢姜黄素合成体系当中，离子液体与NADPH辅因子循环的四氢姜黄素合成体系中的磷酸二氢钾缓冲液组成两相体系，目的是兼顾酶活与底物溶解度，二者可在相界面进行级联催化反应；
5）通过优化步骤4）合成体系中姜黄素浓度，以及合成体系中离子液体的体积比，最终实现姜黄素高效转化为四氢姜黄素。
3.根据权利要求2所述的一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，其特征在于：NADPH依赖性姜黄素转化酶基因curA序列如SEQ ID NO.1所示，甲酸脱氢酶基因fdh序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，其特征在于：四氢姜黄素的合成均在25℃进行，使用磁力搅拌器进行搅拌，转速为300rpm。
5.根据权利要求4所述的一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，其特征在于：通过对比姜黄素在四种离子液体的溶解度，同时监测姜黄素转化酶CurA和甲酸脱氢酶Fdh的活性损失，最终选择1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐。
6.根据权利要求5所述的一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，其特征在于：设置不同底物浓度梯度，分别为75μM、150μM、300μM、450μM，最终确定150μM姜黄素为最优底物浓度；随后，设置离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐在反应体系中不同的体积比5%、10%、15%、20%、25%、30%，最终确定离子液体的最佳体积比为20%。
7.根据权利要求6所述的一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将NADPH依赖性姜黄素转化酶基因curA与pRSFDuet-1质粒重组构成重组表达载体pRSFDuet-curA，将甲酸脱氢酶基因fdh与pRSFDuet-1质粒重组构成重组表达载体pRSFDuet-fdh；
2）将重组质粒pRSFDuet-curA以化学转化法转染至大肠杆菌BL21(DE3)，使用LB液体培养基培养并添加0.2mM IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细胞得到姜黄素转化酶CurA粗酶液；将重组质粒pRSFDuet-fdh以化学转化法转染至大肠杆菌BL21(DE3)，使用LB液体培养基培养并添加0.2mM IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细胞得到甲酸脱氢酶Fdh粗酶液；
3）基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的反应体系总体积为1mL，包括：0.1mM NADPH，150μM姜黄素，0.3M甲酸钠，270μL姜黄素转化酶CurA粗酶液，200μL甲酸脱氢酶Fdh粗酶液，200μL 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，其余为0.1M pH6.0磷酸二氢钾缓冲液；反应在25℃进行，使用磁力搅拌器进行搅拌，转速为300 rpm。
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| CN202310255061.1A CN116121308A (zh) | 2023-03-16 | 2023-03-16 | 一种基于nadph辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法 |
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| CN202310255061.1A CN116121308A (zh) | 2023-03-16 | 2023-03-16 | 一种基于nadph辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法 |
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| US20100009418A1 (en) * | 2006-08-29 | 2010-01-14 | Rice University | Increasing NADPH-Dependent Products |
| US20200010864A1 (en) * | 2018-07-04 | 2020-01-09 | Jiangnan University | Recombinant Engineered Bacterium Co-Expressing Trans-Anethole Oxygenase and Formate Dehydrogenase and Application thereof in Production of Piperonal |
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| CN114891666A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-08-12 | 厦门大学 | 海洋菌株及其催化制备四氢姜黄素的用途 |
| CN115354034A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-11-18 | 浙江工业大学 | Nadp依赖型甲酸脱氢酶突变体、辅酶再生体系及其在制备l-草铵膦中的应用 |
-
2023
- 2023-03-16 CN CN202310255061.1A patent/CN116121308A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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