CN114921392A - 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法 - Google Patents

一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114921392A
CN114921392A CN202210471906.6A CN202210471906A CN114921392A CN 114921392 A CN114921392 A CN 114921392A CN 202210471906 A CN202210471906 A CN 202210471906A CN 114921392 A CN114921392 A CN 114921392A
Authority
CN
China
Prior art keywords
escherichia coli
allitol
gluconic acid
recombinant
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210471906.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114921392B (zh
Inventor
刘继栋
冯婷婷
赵婧邑
王志琦
李宏伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Chengda Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi University filed Critical Guangxi University
Priority to CN202210471906.6A priority Critical patent/CN114921392B/zh
Publication of CN114921392A publication Critical patent/CN114921392A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114921392B publication Critical patent/CN114921392B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/02011—Nicotinate phosphoribosyltransferase (2.4.2.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01018—Glucose isomerase (5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/05—Carbon-nitrogen ligases with glutamine as amido-N-donor (6.3.5)
    • C12Y603/05001—NAD+ synthase (glutamine-hydrolyzing) (6.3.5.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法，以D‑葡萄糖为原料，使用重组大肠杆菌湿菌体进行全细胞催化反应后制取葡萄糖糖酸和蒜糖醇，其中重组大肠杆菌构建过程包括异源表达葡萄糖异构酶(gi)、D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶(DPEase)、葡萄糖脱氢酶(gdh)与核糖醇脱氢酶(rdh)以及过表达大肠杆菌中的nadE和pncB基因。通过本方法实现了高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇，而且不需要额外添加辅因子。本发明具有制备过程简单、经济成本低、产品转化率高、绿色经济的特点，可用于工业化生产。

Description

一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法
技术领域
本发明属于合成生物技术领域，具体涉及一种高效联产蒜糖醇和葡萄糖酸的方法。
背景技术
蒜糖醇(Allitol)，又名阿洛醇，是一种在自然界中天然存在，但含量极少的高值六碳稀有糖醇，具有多种重要生理功能的稀有糖醇。与普通糖醇相比，稀有糖醇具有风味良好、不被人体吸收、抑制血糖提升等特性，使其可广泛应用于食品、农业、医疗等领域。然而目前蒜糖醇在自然界中的含量极低，从植物中提取受季节性因素影响较大，且存在多种结构类似物，高纯度产品的提取成本较高；利用稀有糖D-阿洛酮糖为底物化学合成蒜糖醇受限于原料价格昂贵、副产物繁杂导致分离纯化困难，严重限制了其在上述领域的广泛应用。微生物法生产因其具有绿色、高效、低成本、可连续化生产等优势而受到研究者们的广泛关注，并成功生产出多种食品、医药行业中重要的原料物质。基于微生物发酵法生产蒜糖醇有着广阔的应用前景，有望从根本上解决蒜糖醇的供应不足、价格昂贵等问题。
基于酶转化法利用D-果糖生产蒜糖醇的需要向反应体系中添加昂贵的辅酶 NAD(H)。在宿主内构建多酶表达系统，结合融合蛋白策略，以及发酵条件优化、全细胞催化条件等措施可以以提高蒜糖醇的生产效率，但是以廉价单糖为底物利用胞内级联反应催化生产蒜糖醇的过程存在明显的低效性，且催化终点处有中间产物积累。催化体系效率偏低除受限于多酶体系中各酶性质的较大差异外，蒜糖醇合成过程中辅因子的持续性需求及NAD+依赖型甲酸脱氢酶活性较弱，以及因其可能导致的NAD(H)再生能力不足。
葡萄糖酸是葡萄糖的1位的醛基被羧基置换从而形成的醛糖糖酸。葡萄糖酸是化工、医药及食品等产品的重要中间体，可被用来生产葡萄糖酸的衍生物或者直接作为一种产品，可用在乳品工业上防止乳石沉淀、用在食品配方中作为酸味剂等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种高效联产蒜糖醇和葡萄糖酸的方法，利用该方法可以提高蒜糖醇的产率以及同时合成葡萄糖酸。
为解决上述技术发明，本发明的技术方案是：
一种重组大肠杆菌，同时表达葡萄糖异构酶gi基因、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶dpe基因、rdh基因、葡萄糖脱氢酶gdh基因以及过表达NAPRTase和 NAD+Syn的编码基因pncB和nadE。
所述gi基因来源于Bacillus sp.的葡萄糖异构酶基因gi。
所述的重组大肠杆菌构建按以下操作进行：将来源于Bacillus sp.的葡萄糖异构酶基因gi以及来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的D-阿洛酮糖-3- 差向异构酶基因dpe连接在pRSFDuet-1上，得到重组质粒pRSFDuet-gi-dpe；将来源于Providenciaalcalifaciens的rdh基因片段以及来源于枯草WB800的 gdh基因片段其连接在pETDuet-1表达载体得到质粒pETDuet-gdh-rdh；再将重组质粒pRSFDuet-gi-dpe和上述重组质粒pETDuet-gdh-rdh转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌Ec/pRgd-pEgr；在上述重组大肠杆菌 Ec/pRgd-pEgr的基础上，过表达大肠杆菌中的NAPRTase和NAD+Syn的编码基因pncB和nadE。
所述的重组大肠杆菌在制备蒜糖醇或葡萄糖酸上的应用。
所述的重组大肠杆菌高效制备蒜糖醇和葡萄糖酸的方法，以D-葡萄糖为原料，加入所述的重组大肠杆菌湿菌体进行全细胞催化反应后制取葡萄糖糖酸和蒜糖醇。
所述重组大肠杆菌湿菌体制备按以下操作进行：将所述的重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养，采用诱导剂IPTG在20℃，pH为7.0条件下诱导20-24 h,收集得到湿菌体。
所述的将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养的接种量为：5ml菌液 /50ml LB培养基。
所述的LB培养基按以下组分制备：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10 g/L氯化钠。
所述全细胞催化反应，以D-葡萄糖为底物，底物浓度为20～30g/L，加入金属离子Co2+，所述的Co2+添加量为1mMol/L。
所述催化条件为温度为45℃以及pH为8.5。
本发明获得的有益效果是：
本发明在重组大肠杆菌构建时创新性的以葡萄糖脱氢酶(GDH)与核糖醇脱氢酶(RDH)偶联构建辅酶循环系统以提高细胞生产过程中所需的NADH的再生效率，同时，结合引入nadE和pncB构建NAD+补偿途径，胞内NAD(H)含量提高了120.3％。通过催化过程优化，蒜糖醇产量达到10.72g/L。
本发明以D-葡萄糖为底物进行转化，D-葡萄糖作为自然界中一种成本低廉、易获得的单糖，相对于常规合成D-阿洛酮糖所用的果糖，能有效降低制备成本。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为本发明的反应流程图。
图3为对实施例1条件下反应产物蒜糖醇的HPLC图。
图4为对实施例1条件下反应产物葡萄糖酸的HPLC图。
具体实施方式
下面结合具体实例来进一步说明。若为特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明实施例中所用到的原料和试剂均为常规化学试剂，均能通过商业渠道购买得到。
实施例1
本实施例是高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法的一个实施实例，具体步骤如下：
重组大肠杆菌的构建：
重组质粒pRSFDuet-gi-dpe的构建：以来源于Bacillus.sp的gi基因片段和来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的dpe基因片段为模板，以gi-F： ccacagccaggatccgaattcaatgagcctgaccaccg(BamHI)为上游引物，gi-R： taagcattatgcggccgcaagcttttaaccacgcgc(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，扩增得到目的片段gi；以dpe-F：atatacatatggcagatctaatgcgttacttcaaagaagaagtt(BamHI)为上游引物，dpe-R：gtttctttaccagactcgagttagataccgaaaacgtgcctaca(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，扩增得到目的片段dpe。通过用限制性内切酶BamHI和 HindIII对质粒pRSFDuet-1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒分别将目的基因gi和dpe与表达载体pRSFDuet-1的多克隆位点MCS1和MCS2进行重组连接，得到重组质粒pRSFDuet-gi-dpe。
重组质粒pETDuet-gdh-rdh的构建：以来源于Providencia alcalifaciens的 rdh基因片段为模板，以rdh-F： atatacatatggcagatctgatggctatctctctggaaaacaaa(BamHI)为上游引物，以rdh-R： gtttctttaccagactcgagttacagatcaacgctgttcgg(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，扩增得到目的片段rdh；用限制性内切酶BamHI和HindIII对质粒pRSFDuet-1在 37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒对基因片段和质粒pRSFDuet-1进行重组连接，得到重组质粒pRSFDuet-rdh。以来源于枯草WB800的GDH基因片段为模板，以gdh-F：ctgatatcggatccgaattcatgtatccggatttaaaaggaaaagt(EcoRⅠ)为上游引物，以gdh-R：tggtggtggtggtgctcgagttaaccgcggcctgc(XhoⅠ)为下游引物进行PCR扩增扩增得到目的片段gdh。用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对质 pRSFDuet-rdh在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒对基因片段和质粒 pRSFDuet-rdh进行重组连接，得到重组质粒pETDuet-gdh-rdh。
重组质粒pRSFDuet-gi-dpe和重组质粒pETDuet-gdh-rdh的转化：将重组质粒pRSFDuet-gi-dpe和重组质粒pETDuet-gdh-rdh共同转化至E.coli BL21 (DE3)中得到重组大肠杆菌Ec/pRgd-pEgr。
在上步重组大肠杆菌Ec/pRgd-pEgr中过表达大肠杆菌中的NAPRTase和 NAD+Syn的编码基因pncB和nadE得到最终的重组大肠杆菌。
湿菌体的制备：
将重组大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，至OD600为0.6-1.0时，加入终浓度为1mMIPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。20℃诱导24h,收集得到湿菌体；
全细胞催化反应：
以D-葡萄糖为底物(D-葡萄糖浓度为25g/L)，加入金属离子(1mMol/L 的Co2+)、以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体(湿菌体浓度为25g/L)，以tris-HCl(pH 8.5)缓冲液为反应液，控制反应温度为45℃，经过12-18h催化反应，其中反应体系为1mL。
(5)通过高效液相色谱(HPLC)检测底物D-葡萄糖的消耗和蒜糖醇的产生，并计算转化率。
HPLC检测条件如下：色谱分析柱Carbomix-Pb-NP10:8％(7.8×300mm), 流动相为超纯水，流速为0.5mL/min,柱温78℃，示差(RI)检测器,其中D- 葡萄糖标准品保留时间为14.28min,D-果糖标准品保留时间为20.12min，蒜糖醇标准品保留时间为34.13min(图3-1)。
(6)通过高效液相色谱(HPLC)检测葡萄糖酸产生，并计算转化率。
HPLC检测条件如下：色谱柱：Zorbax SAX￠4.6mm×25mm；流动相：0.1 M的磷酸二氢钾溶液；流速：1.0mL/min；检测器：紫外和势差折光检测器；柱温：室温(＜30℃)；进样量：100μL。(图3-2)
实施例2
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为50℃，其余操作均与实施例1 操作相同。
实施例3
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为35℃，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例4
全细胞催化反应时整个反应体系的pH为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例5
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为30℃，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例6
全细胞催化反应时整个反应体系的pH为8.0，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例7
全细胞催化反应时整个反应体系中D-葡萄糖浓度为50g/L,其余操作均与实施例1相同。
本发明实施例1-7的蒜糖醇产量以及葡萄糖产量分别见表1。
表1
Figure BDA0003622969110000071
通过表1数据可以发现，本发明以D-葡萄糖为底物，经重组大肠杆菌构建、湿菌体制备以及全细胞催化反应制取葡萄糖糖酸和蒜糖醇。相比较7个实施例，得出最佳催化条件为温度为45℃以及pH为8.5。
以上所述仅为本发明的较佳实例而已，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明涉及的主要基因序列如表2所示。
表2
Figure BDA0003622969110000081
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccacagccag gatccgaatt caatgagcct gaccaccg 38
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taagcattat gcggccgcaa gcttttaacc acgcgc 36
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atatacatat ggcagatcta atgcgttact tcaaagaaga agtt 44
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtttctttac cagactcgag ttagataccg aaaacgtgcc taca 44
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atatacatat ggcagatctg atggctatct ctctggaaaa caaa 44
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtttctttac cagactcgag ttacagatca acgctgttcg g 41
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgatatcgg atccgaattc atgtatccgg atttaaaagg aaaagt 46
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggtggtggt ggtgctcgag ttaaccgcgg cctgc 35
<210> 9
<211> 1224
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgagcctga ccaccgctag cagcaaaacc atcgaagttg cgaccccgtc taaagaagat 60
cgtttcagct tcggcctgtg gaccgttggc tggcaggcgc gtgatccgtt cggcgaagcg 120
acccgtccgc cgctggaccc ggttgaagcg gtgcacaaac tggcggaact gggcgcgtac 180
ggcgttacct tccacgatga tgatctggtt ccgttcggca gctccgatgc ggaacgtgct 240
cgtctgatcg accgcttcaa aaaagcactg gcggataccg gtctggtggt gccgatgatg 300
accaccaacc tgttcaccca cccgatcttc aaagatggtg cgttcaccgc gaacgaccgt 360
agcatccgtc gttacgcaat ccgtaaagtt atgcgcaacc tggatctggc tgctgaactg 420
ggtgcgcgta cctacgtttt ctggggtggc cgtgaaggca gcgaaatcga tgctgcgaaa 480
gacatccgcg ctgcgctgga tcgttaccgt gaagcgattg ataccctggc gcagtatgtt 540
aaagatcagg gttacggcat ccgtttcgcg ctggaaccga aaccgaacga accgcgtggc 600
gatattttcc tgccgaccat cggccacgct ctggcgttca tcaactctct ggaacactcc 660
gacatcgttg gtctgaaccc ggaagttggt cacgaacaga tgtctaacct gaacttcgtt 720
cacggcatcg ctcaggcgct gtggcacggc aaactgttcc atatcgatct gaacggccag 780
cacggcccga aatacgatca ggatctggtt ttcggtcacg gcgatctgct gtccgcgttc 840
ttcctggttg atctgctgga aaacggcttt ccgggcggcg gtccggttta cgatggtccg 900
cgtcacttcg attacaaacc gatgcgtacc gaagacatcg atggtgtttg ggcgtctgcg 960
gcggcaaaca tgcgtaccta cctgctgctg aaacagcgcg cgaaagcgtt ccgcgcggac 1020
ccggaagtgc aggcggcgct gaccgctagc cgtgtgccgg aactggcggt tccgaccctg 1080
ggcgaaggcg aatcttacgc ggatctgctg gcggatcgta gcgcgtggga agaatttgat 1140
gttgatcgtg cggcaaacca gggctacggc tacgcgcgtc tggatcagct ggcgatcgaa 1200
cacctgctgg gcgcgcgtgg ttaa 1224
<210> 10
<211> 869
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgaaacacg gtatctacta cgcttactgg gaaaaagaat gggctgctga ttacctttac 60
tacgttgaaa aagttgctcg tttaggtttc gatcttttag aaatcggtgc tgctccatta 120
cctgaatact ctactgacca aataaaagca cttcgtgatt gtgcttctca aaacggtatc 180
caacttacag ctggttacgg tccaacttac gatcacaaca tgggttcttc tgatgcaggt 240
atccgcgctg gtgctttaga atggtacaaa cgtttattcg acgttatgga acaattagat 300
atccacttaa tcggtggtgc tctttacggt tactggccag ttgatttctc taacattaac 360
aaagaagaag attggaaacg ttctgttgaa ggtatgcact tacttgctcc aatcgctaaa 420
gaacacgaca tcaacttagg tatggaagta cttaaccgtt tcgaatctcc atcttaaaca 480
ctgctgaaga aggtgttgct ttcgttaaag aagttggtca agaaaacgta aaagtaatgc 540
ttgatacttt ccacatgaac atcgaggaag aaagcatcgg cgacgctatc cgcacagcgg 600
gcaaccttct tggtcacttc cacacaggtg agtgcaaccg tatggttcca ggtaagggtc 660
gcactccttg gcgtgaaatc ggcaacgcac tacgtgacat cgagtacgac ggcactgttg 720
ttatggagcc attcgtttct atgggcggtc aagtaggtcg tgacatccac atctggcgtg 780
acatctctcg tggcgcttct gaagctgagc ttgataaaga cgctaaaaac gctgtagctt 840
tccaaaaata catgcttgac tggaaataa 869
<210> 11
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggctatct ctctggaaaa caaagttgca gcgatcaccg gtgcggcgag cggtatcggt 60
ctggaatgtg cgcgtaccct gctgaaagct ggtgcgaaag ttgttctgat cgatcgtgct 120
gaagaacgtc tgaaccagct ggttgcggaa ctgggcgata acgctatccc gttagttgtt 180
gatctgatga aacctgaaca ggttgatggc atgctggatg ctattctggc taaagctggt 240
cgtctggata tcttccatgc taatgcaggc gcgtatatcg gtggtccggt tgctgaaggt 300
gatccggatg tgtgggacaa agtattgaac ttaaatatta acgcagcatt tcgctctgtt 360
cgtgcggttc tgccgcactt tatcgaacag aaaagtggtg atgttctgtt cactagctct 420
attgcgggta tggttccagt tatctgggaa ccgatttata ccgcttctaa atttgcggtt 480
caggcattcg ttcacagtac ccgtcgtcag gtttcccagt atggcgttcg tgtaggtgct 540
gtcctgccgg gcccggttgt taccgcgctg ctggatgatt ggccgaaaga aaaaatggaa 600
gaagcactgg cgaacggctc tctgatgcag cctattgaag ttgctgaagc tgttttattc 660
atgctgaccc gtccgaaaaa cgttaccatc cgtgatttag ttatcctgcc gaacagcgtt 720
gatctgtaa 729
<210> 12
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accgcggcct gcctggaatg aaggatattg tgtcataccg ccgtccgcga ataacgtgat 60
gcctgtgacg tagctggctt ccttcgaagc aagccaggct gctactgcgg cgatctcctc 120
cggttcgccg atatatccca ttggaatcat gctttctaca tcagctttct gtttagggtc 180
agcgaatttt tcagcattga ttggcgtgtt gatcgcacct ggcccaatat tattgacgcg 240
aatgcccttc ggcgcgtatt ccaacgctaa tgtttctgtc atcagcttta tcccgccttt 300
acttgccgca tagtggacaa ataacggcca aggaatcact tcgtgcacac tggacatgtt 360
aatgacattt cccttgatat cgttttctac gaaatattta atcgcttcac ggcttcctaa 420
aaaggcaccc gttaagttcg tgccgatgac tttatcccaa tccttgagcg gcatttcgtg 480
agatggcaca ggattttcaa gaccggcatt attaatcata atatcgagtg tgccgaactc 540
cttaattgcc gtttgcacga tattttttac atcttcctct ttcgtgacat ctccttggac 600
gacaacagct tcaccgcccg ccttgatgac ctcttctttt acctcgttcg gatcttgttt 660
attactataa tagttgataa ccacttttgc ctgctccttg ccgaagcgaa tggccatcgc 720
ctttccgagc cctgaagcag ctcctgtaat agcgacgact tttcctttta aatccggata 780
cat 783

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，同时表达葡萄糖异构酶gi基因、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶dpe基因、rdh基因、葡萄糖脱氢酶gdh基因以及过表达NAPRTase和NAD+Syn的编码基因pncB和nadE。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述gi基因来源于Bacillus sp.的葡萄糖异构酶基因gi。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌构建按以下操作进行：将来源于Bacillus sp.的葡萄糖异构酶基因gi以及来源于Clostridiumbolteae ATCCBAA-613的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因dpe连接在pRSFDuet-1上，得到重组质粒pRSFDuet-gi-dpe；将来源于Providencia alcalifaciens的rdh基因片段以及来源于枯草WB800的gdh基因片段其连接在pETDuet-1表达载体得到质粒pETDuet-gdh-rdh；再将重组质粒pRSFDuet-gi-dpe和上述重组质粒pETDuet-gdh-rdh转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌Ec/pRgd-pEgr；在上述重组大肠杆菌Ec/pRgd-pEgr的基础上，过表达大肠杆菌中的NAPRTase和NAD+Syn的编码基因pncB和nadE。
4.权利要求1所述的重组大肠杆菌在制备蒜糖醇或葡萄糖酸上的应用。
5.使用权利要求1所述的重组大肠杆菌高效制备蒜糖醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，以D-葡萄糖为原料，加入所述的重组大肠杆菌湿菌体进行全细胞催化反应后制取葡萄糖糖酸和蒜糖醇。
6.根据权利要求4所述的制备葡萄糖糖酸和蒜糖醇的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌湿菌体制备按以下操作进行：将所述的重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养，采用诱导剂IPTG在20℃，pH为7.0条件下诱导20-24h,收集得到湿菌体。
7.根据权利要求4所述的制备葡萄糖糖酸和蒜糖醇的方法，其特征在于，所述的将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养的接种量为：5ml菌液/50ml LB培养基。
8.根据权利要求5所述的制备葡萄糖糖酸和蒜糖醇的方法，其特征在于，所述的LB培养基按以下组分制备：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠。
9.根据权利要求4所述的制备葡萄糖糖酸和蒜糖醇的方法，其特征在于，所述全细胞催化反应，以D-葡萄糖为底物，底物浓度为20～30g/L，加入金属离子Co2+，所述的Co2+添加量为1mMol/L。
10.根据权利要求9所述的制备葡萄糖糖酸和蒜糖醇的方法，其特征在于，所述催化条件为温度为45℃以及pH为8.5。
CN202210471906.6A 2022-04-29 2022-04-29 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法 Active CN114921392B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210471906.6A CN114921392B (zh) 2022-04-29 2022-04-29 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210471906.6A CN114921392B (zh) 2022-04-29 2022-04-29 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114921392A true CN114921392A (zh) 2022-08-19
CN114921392B CN114921392B (zh) 2023-10-03

Family

ID=82805812

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210471906.6A Active CN114921392B (zh) 2022-04-29 2022-04-29 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114921392B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116162673A (zh) * 2023-04-21 2023-05-26 山东福洋生物科技股份有限公司 一种多种功能糖联产的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952358A (zh) * 2014-05-06 2014-07-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株生物转化生产蒜糖醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用
CN106480125A (zh) * 2016-10-14 2017-03-08 山东大学 一种低成本生产d‑阿洛酮糖的方法
CN108949852A (zh) * 2018-08-24 2018-12-07 南京工业大学 一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法
CN111712570A (zh) * 2018-01-25 2020-09-25 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用
CN113897382A (zh) * 2021-09-01 2022-01-07 浙江工业大学 辅酶自足型大肠杆菌及其构建方法与应用
CN114350727A (zh) * 2022-01-18 2022-04-15 广西大学 联合磷酸化与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952358A (zh) * 2014-05-06 2014-07-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株生物转化生产蒜糖醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用
CN106480125A (zh) * 2016-10-14 2017-03-08 山东大学 一种低成本生产d‑阿洛酮糖的方法
CN111712570A (zh) * 2018-01-25 2020-09-25 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用
CN108949852A (zh) * 2018-08-24 2018-12-07 南京工业大学 一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法
CN113897382A (zh) * 2021-09-01 2022-01-07 浙江工业大学 辅酶自足型大肠杆菌及其构建方法与应用
CN114350727A (zh) * 2022-01-18 2022-04-15 广西大学 联合磷酸化与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116162673A (zh) * 2023-04-21 2023-05-26 山东福洋生物科技股份有限公司 一种多种功能糖联产的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114921392B (zh) 2023-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114874964A (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN112662709A (zh) 一种双酶偶联合成(r)-香茅醇的方法
CN114921392A (zh) 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法
CN113337495B (zh) 一种提高唾液酸产量的方法与应用
CN111206009B (zh) 一种高产d-阿洛酮糖的基因工程菌及其应用
CN109679978B (zh) 一种用于制备l-2-氨基丁酸的重组共表达体系及其应用
CN109295023B (zh) 谷氨酸氧化酶突变体、核酸分子及应用和制备酮戊二酸的方法
CN116376950A (zh) 一种核酸构建体、细胞和四氢姜黄素的制备方法及应用
CN112126608A (zh) 一种生产羟基酪醇的工程菌
CN113061562B (zh) 一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺的方法
CN111518853B (zh) 一种利用全细胞转化合成d-阿洛酮糖的方法
CN114717276A (zh) 联合磷酸糖酶与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法
CN114921429A (zh) 一种乙酰化调控的乳酸脱氢酶突变体及其应用
JP2008283917A (ja) 乳酸の製造方法
CN112143692A (zh) 一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用
CN110982771A (zh) 一种合成对羟基扁桃酸的方法
CN115976135A (zh) 一种高效联产d-阿洛酮糖和葡萄糖酸的方法
CN114134136B (zh) 一种高反应浓度下的异麦芽酮糖快速制备方法及其蔗糖异构酶
CN113957065B (zh) 一种高转化率的蔗糖异构酶及其应用
CN118207172B (zh) 双功能谷胱甘肽合酶突变体及其应用
CN114395542B (zh) 一种蔗糖磷酸化酶及其应用
CN114317476B (zh) 葡萄糖基甘油的生物催化生产工艺及其蔗糖磷酸化酶
CN114574454B (zh) 一种短链脱氢酶及其突变体和应用
CN118185887A (zh) Co2活化关键酶及其应用
CN107955805B (zh) 一种稳定性提高的nadh氧化酶及其在乙偶姻生产中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230615

Address after: Ma Lu Zhen Chan Ping Cun, Anhua County, Yiyang City, Hunan Province 413506

Applicant after: HUNAN CHENGDA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 530004 100 East University Road, XiXiangTang District, Nanning, the Guangxi Zhuang Autonomous Region

Applicant before: GUANGXI University

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant