CN113061562B - 一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4‑丁二胺的方法，属于基因工程技术领域。通过大肠杆菌和钝齿棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将精氨酸脱羧酶编码基因经突变后与胍丁胺酶编码基因串联成功并在精氨酸高产菌株中过表达。摇瓶发酵结果表明，原始菌不具有生产有活性的精氨酸脱羧酶和胍丁胺酶的能力，而重组工程菌可以完成L‑精氨酸到1,4‑丁二胺的转化。同时基于此基因工程菌株具有高产L‑精氨酸的特性，成功采用一步发酵法以葡萄糖为底物生产1,4‑丁二胺。本发明方法生产1,4‑丁二胺，具有效率高、副产物L‑精氨酸、胍基丁胺和其他杂酸余量低的优点，后期对于产物1,4‑丁二胺的分离纯化更加容易。

Description

一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺的方法
技术领域
本发明涉及一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
1,4-丁二胺(也称1,4-二氨基丁烷或腐胺)属于氨基酸衍生物，作为聚合物，药物，农用化学品，表面活性剂和其他添加剂的组分，具有许多工业应用。由于它作为合成高性能聚酰胺尼龙-4,6的单体而倍受关注，尼龙-4,6因其高熔点、高结晶度、高耐热性和高机械强度以及出色的耐溶剂性而成为一种优异的工程塑料。因此，1,4-丁二胺具有十分广阔的市场应用前景。
工业规模上1,4-丁二胺的生产主要是采用琥珀腈加氢的化学合成法，琥珀腈通过在丙烯腈中添加氰化氢产生。化学路线需要不可再生的石油化工产品作为原材料和相对苛刻的反应条件，以及昂贵的催化剂。由于反应物具有剧毒和易燃性，因此从环境和人类健康的角度来看，化学合成路线并不可取。
而目前具有应用前景的生物法制备1,4-丁二胺的方法主要是酶转化法，酶法转化有两种路径：1、利用精氨酸脱羧酶与胍丁胺酶串联表达将精氨酸转化为1,4-丁二胺；2、利用鸟氨酸脱羧酶将鸟氨酸转化为1,4-丁二胺。与化学合成法相比，利用酶法转化生产1,4-丁二胺具有步骤简单、副产物少以及绿色环保等优势，但是酶法转化需要以价格昂贵的精氨酸或鸟氨酸为底物，具有成本高的缺陷，这大大阻碍了酶法转化生产1,4-丁二胺的工业化进程。
虽然现有报道当中，有采用葡萄糖直接合成1,4-丁二胺，但是最终产量不高、产率低等缺点，例如：Volker F.Wendisch等人研究公开的方法中，是采用通过优化启动子和RBS元件，建立了ArgF精确调控策略的技术方案，但是生成的1,4-丁二胺的产量仅为19g·L-1，并且存在产率低等缺点，仅有0.16g·g-1葡萄糖(记载于“Improving putrescineproduction by Corynebacterium glutamicum by fine-tuning ornithinetranscarbamoylase activity using a plasmid addiction system”论文中)；JianZhongLiu等人研究公开的方法中，是通过过表达CgmA转运蛋白，并系统集成前体合成模块和OdhA调控模块的强度优化的技术方案，使得生产率达到0.29g·g-1葡萄糖，但是生成的1,4-丁二胺的产量仅为12.4g·L-1(记载于“Metabolic evolution and a comparative omicsanalysis of Corynebacterium glutamicum for putrescine production”论文中)。
为此，创造以廉价葡萄糖为底物直接合成高价值1,4-丁二胺的绿色合成路线十分重要，并且，如何提高以葡萄糖为底物合成1,4-丁二胺的产量成为研究的热点。
发明内容
技术问题：
本发明要解决的技术问题是提供一种可低成本且高效合成1,4-丁二胺的重组菌株及其构建方法，及提供一种能够以葡萄糖为底物高产1,4-丁二胺的方法。
技术方案：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌同时表达了精氨酸脱羧酶突变体A533P和胍丁胺酶。
所述精氨酸脱羧酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的精氨酸脱羧酶的第533位由丙氨酸突变成脯氨酸得到的，命名为A533P。
在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述胍丁胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述胍丁胺酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO 3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述精氨酸脱羧酶突变体A533P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组钝齿棒杆菌以C.crenatum SYPA5-5为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组钝齿棒杆菌以pXMJ19或pDXW10为表达载体。
本发明还提供了上述重组钝齿棒杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将化学合成的精氨酸脱羧酶突变体基因speA和胍丁胺酶基因speB串联后连接到表达载体pXMJ19上，构建重组质粒；
(2)将步骤(1)制备得到的重组质粒转化到C.crenatum SYPA5-5中，制备得到重组钝齿棒杆菌。
本发明还提供了一种生产1,4-丁二胺的方法，所述方法为将上述重组钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将所述重组钝齿棒杆菌接种至种子培养基中，培养得到种子液，将得到的种子液接种至发酵培养基中发酵制备得到1,4-丁二胺。
在本发明的一种实施方式中，所述重组钝齿棒杆菌接种至种子培养基中，在28-32℃，180-250r/min条件下培养24h，制备得到种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述制备得到的种子液按照10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，在28-32℃，180-250rpm条件下发酵培养72-96h。
在本发明的一种实施方式中，将种子液接种至发酵培养基进行发酵培养时，接种24h后加入IPTG，终浓度为0.5mM。
本发明还提供了上述重组钝齿棒杆菌在制备含有1,4-丁二胺的产品中的应用。
有益效果
(1)本发明构建了一种以葡萄糖为底物一步发酵法合成1,4-丁二胺的公认安全菌株C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB。以高产精氨酸的GRAS菌株C.crenatum SYPA5-5为出发菌株，构建具有精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶活性的重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB，无需以价格昂贵的L-精氨酸为原料，能够直接利用廉价的葡萄糖为原料进行1,4-丁二胺的生产，从而有效的降低1,4-丁二胺的生产成本。
(2)发酵生产1,4-丁二胺时，含有野生酶的C.crenatum 5-5/pXMJ19-speA-speB发酵液中仅积累到10.9g·L-1的1,4-丁二胺，而含有突变体A533P的菌株C.crenatum5-5/pXMJ19-A533P-speB发酵液中积累到15.43g·L-1的1,4-丁二胺，是含有野生酶的1,4-丁二胺的1.4倍。
(3)采用本发明提供的方法进行发酵罐培养时，重组菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-A533P-speB发酵罐发酵液中可积累35.28g·L-1的1,4-丁二胺，实现无精氨酸添加，一步发酵法由葡萄糖到1,4-丁二胺的直接合成，并且发酵后测得精氨酸含量为0.78g·L-1，胍基丁胺含量为0.84g·L-1。
附图说明
图1：1g·L-1精氨酸标准品的HPLC液相图。
图2：1g·L-1胍基丁胺标准品的HPLC液相图。
图3：1g·L-1 1,4-丁二胺标准品的HPLC液相图。
图4：发酵过程发酵液液相图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pXMJ19质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。下述实施例中涉及的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5记载于公开号为CN1441055A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCC NO.0890(此菌株在专利申请文本中的菌株编号为SDNN403，发明人在实验过程中将其重新编号为SYPA5-5)。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g·L-1。
BHI液体培养基：脑心浸液肉汤37g·L-1。
BHI固体培养基：脑心浸液肉汤37g·L-1、琼脂15g·L-1。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
精氨酸脱羧酶酶活测定方法：
(1)酶活测定体系：5g·L-1L-精氨酸、2.5mM MgSO4、0.6mM PLP、0.05mg·mL-1酶蛋白。所有物质均配成高浓度母液，以50mM Tris缓冲液溶解，用HCl将pH调为8.0。酶活检测体系总体积为2mL。
(2)酶活检测方法：
检测酶活时，在37℃，600rpm高通量摇床上预热除酶液外的其他组分，预热时间为5min。加入酶液，精确反应10min。加入200μL甲醇终止反应，冰浴冷却反应液。12000rpm高速离心10min，取上清稀释20倍数后过0.22μm滤膜，HPLC检测。
HPLC检测条件：安捷伦C18，5μm，4.6×250mm色谱柱；流速为1.0mL·min-1；柱温40℃；检测波长338nm；流动相：A相：8.0g乙酸钠(13.3g三水合乙酸钠)溶于1000mL水，加入225μL三乙胺，用5％的乙酸将pH调到7.20±0.05，最后加入5mL四氢呋喃，混合；B相：称取6.0g乙酸钠于200mL水溶解，用5％乙酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入400mL的HPLC级甲醇和400mL的HPLC级乙腈，混合。
酶活定义：在标准反应条件下，每1min催化产生1μmol胍基丁胺所需的酶量为1个酶活单位。
精氨酸脱羧酶比酶活测定方法：
测定纯化后的精氨酸脱羧酶的酶活(U·mL-1)，并且，采用Bradford法测定纯化后的精氨酸脱羧酶的蛋白含量(mg·mL-1)，以计算精氨酸脱羧酶的比酶活；
其中，精氨酸脱羧酶比酶活的计算公式如下：
精氨酸脱羧酶比酶活(U·mg-1)＝纯化后的精氨酸脱羧酶的酶活(U·mL-1)/纯化后的精氨酸脱羧酶的蛋白含量(mg·mL-1)。
下述实施例中所涉及的精氨酸、胍基丁胺、1,4-丁二胺的含量的检测方法如下：高效液相色谱法；安捷伦C18，5μm，4.6×250mm色谱柱；流速为1.0mL·min-1；柱温40℃；检测波长338nm；流动相：A相：8.0g乙酸钠(13.3g三水合乙酸钠)溶于1000mL水，加入225μL三乙胺，用5％的乙酸将pH调到7.20±0.05，最后加入5mL四氢呋喃，混合；B相：称取6.0g乙酸钠于200mL水溶解，用5％乙酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入400mL的HPLC级甲醇和400mL的HPLC级乙腈，混合。
实施例1：重组菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA-speB、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-D531R-speB的构建
(1)根据NCBI中Escherichia coli str.K-12substr.MG1655全基因组核酸序列中speA(核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示)和speB的基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示)，设计精氨酸脱羧酶基因的PCR引物F1和R1、胍丁胺酶基因的PCR引物F2和R2。
F1：5’-ggtcgactctagaggatccaaaggaggaaaatcatgtctgacgacatgtctatggg-3’；
R1：5’-ttccacacattatacgagccgatgattaattgtcaagaattcttactcatcttcaagataagtataaccg-3’；
F2：5’-gtataatgtgtggaattgtgagcggataacaaaaaggaggacaaccatgagcaccttaggtcatcaatac-3’；
R2：5’-gtatcaggctgaaaatcttctctcatccgaattcttactcgccctttttcgccgcctg-3’。
(2)精氨酸脱羧酶基因和胍丁胺酶基因的克隆
以Escherichia coli str.K-12substr.MG1655总DNA为模板，利用上述引物做PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，55℃退火，30s，72℃延伸，90s，30个循环；72℃终延伸5min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，灭菌的双蒸馏水22μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，检测回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
(3)精氨酸脱羧酶突变体A533P、D531R的构建
根据NCBI中Escherichia coli str.K-12substr.MG1655全基因组核酸序列中speA基因序列，设计精氨酸脱羧酶突变体A533P的PCR引物A533P-F1、A533P-F2、A533P-F3和A533P-F4。
A533P-F1：5’-ggtcgactctagaggatccaaaggaggaaaatcatgtctgacgacatgtctatggg-3’；
A533P-F2：5’-ccatcaatatagtggtcgatcggaccgtcagagtcacagg-3’；
A533P-F3：5’-cctgtgactctgacggtccgatcgaccactatattgatgg-3’；
A533P-F4：5’-ttccacacattatacgagccgatgattaattgtcaagaattcttactcatcttcaagataagtataaccg-3’。
根据NCBI中Escherichia coli str.K-12substr.MG1655全基因组核酸序列中speA基因序列，设计精氨酸脱羧酶突变体D531R的PCR引物D531R-F1、D531R-F2、D531R-F3和D531R-F4。
D531R-F1：5’-ggtcgactctagaggatccaaaggaggaaaatcatgtctgacgacatgtctatggg-3’；
D531R-F2：5’-caatatagtggtcgatagcaccgcgagagtcacaggtaatatcc-3’；
D531R-F3：5’-ggatattacctgtgactctcgcggtgctatcgaccactatattg-3’；
D531R-F4：5’-ttccacacattatacgagccgatgattaattgtcaagaattcttactcatcttcaagataagtataaccg-3’。
利用融合PCR技术，以A533P-F1、A533P-F2、A533P-F3和A533P-F4；D531R-F1、D531R-F2、D531R-F3和D531R-F4为引物，以获得的重组质粒pXMJ19-speA-speB为模板进行定点突变，融合PCR扩增条件为：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，55℃退火，30s，8个循环；之后加入F1和F4引物，95℃预变性，5min；95℃变性，30s，55℃退火，30s，72℃延伸，90s，30个循环；72℃终延伸5min。PCR扩增体系：上下段2μL，F1和F4引物各1μL，灭菌的双蒸馏水19μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，检测回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
(4)重组质粒pXMJ19-speA-speB、pXMJ19-A533P-speB、pXMJ19-D531R-speB的构建
分别将(2)、(3)中获得的基因片段经融合PCR融合得到串联片段，提取保存于E.coli JM109中的质粒pXMJ19，并用BamH I和EcoR I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后与串联片段进行连接，连接体系：ExnaseⅡ2μL,5×CEⅡBuffer 4μL,载体及片段分别按照连接酶ExnaseⅡ说明书计算后添加，灭菌的双蒸馏水将总体积补齐至20μL，之后在30℃条件下酶连30min。
分别将连接好的重组质粒转化到E.coli BL21感受态中，并用加入浓度为10μg·mL-1的氯霉素抗性的LB固体培养基筛选阳性转化子。
挑取验证正确的转化子接种于加入浓度为10μg·mL-1的氯霉素抗性的10ml LB液体培养基，于37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证、测序正确后，得到正确的重组菌株Escherichia coli BL21/pXMJ19-speA、Escherichia coli BL21/pXMJ19-speA-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-A533P-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-D531R-speB，并提取得到重组质粒：pXMJ19-speA、pXMJ19-speA-speB、pXMJ19-A533P-speB、pXMJ19-D531R-speB。
(5)重组质粒pXMJ19-speA、pXMJ19-speA-speB、pXMJ19-A533P-speB、pXMJ19-D531R-speB转化C.crenatum SYPA 5-5
感受态制备：挑取C.crenatum SYPA 5-5接种于10mL BHI液体培养基，30℃摇床培养24h，取培养后的菌液转接入含3g·L-1甘氨酸和0.1％吐温-80的100mL液体LBG培养基中，使得初始细胞OD600达到0.3。30℃，200rpm条件下培养到细胞OD600达到0.9。细胞培养结束后将菌液预冷30min，然后离心收集菌体。用预冷的10％甘油洗涤菌体3次，最后用0.2mL10％甘油重悬细胞，用1.5mL管分装，每管60μL直接用于电转化。
电转：1850V电转5ms，电转后加入800μL BHI培养基30℃，200rpm培养1-2h。
重组菌获得：分别将步骤(2)制备得到的重组质粒转化至C.crenatum SYPA 5-5感受态细胞中，得到转化子，并将转化子涂布于含有浓度为10μg·mL-1氯霉素抗性BHI固体培养基，30℃培养，挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，分别得到重组菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA-speB、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-D531R-speB。
实施例2：重组菌湿菌体发酵产酶及酶活测定
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1构建的重组菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA-speB，C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-D531R-speB与出发菌株C.crenatum SYPA 5-5于BHI固体平板划线活化后，得到单菌落；分别挑取单菌落接种于10mL BHI液体培养基(出发菌株)和10mL含有浓度为10μg·mL-1的氯霉素抗性的BHI液体培养基(重组菌)中；在30℃培养24h后，得到种子液；
(2)将制备得到的重组菌株的种子液以2％(v/v)的接种比例分别转接至50mL含有浓度为10μg·mL-1氯霉素抗性的BHI液体培养基中，出发菌株种子液转接至50mL BHI液体培养基；30℃培养10h后加入IPTG诱导，诱导剂的终浓度为0.5mM，在30℃培养12h，收集菌体。
(3)向酶活检测转化缓冲液中加入培养后收集的菌体：C.crenatum SYPA5-5、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA-speB与C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-D531R-speB；在30℃条件下转化12h，得到发酵液。
其中，酶活检测转化缓冲液(按照终浓度计)：L-精氨酸20g·L-1、MgSO4 4mM、曲拉通X-100 2％(v/v)、磷酸吡哆醛PLP 7mM，Tris 50mM，用HCl调至pH 8.0。
将发酵液离心取上清，分别用HPLC检测精氨酸、胍基丁胺和1,4-丁二胺含量，结果如表1所示。
表1：不同的重组菌转化产物产量
Figure BDA0002987387430000071
Figure BDA0002987387430000081
其中，NT表示未检出。
结果表明重组菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA-speB与C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-A533P-speB、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-D531R-speB对比出发菌株C.crenatum SYPA 5-5和C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA具有将精氨酸转化为1,4-丁二胺的酶活性，从而证明成功表达胍丁胺酶和精氨酸脱羧酶或精氨酸脱羧酶突变体。
实施例3：重组菌摇瓶发酵法产1,4-丁二胺
具体步骤如下：
(1)配制培养基：
种子培养基(g·L-1)：葡萄糖50，(NH4)2SO4 20，酵母浸粉20，KH2PO4 1.5，MgS04·7H2O 1.0，MnS04·H2O 0.3，CaCO3 1.0；
发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖120，(NH4)2SO4 40，酵母浸粉12，KH2PO4 1.5，KCl1.0，MgS04·7H2O 1.0，MnS04·H2O 0.3，FeS04·7H2O 0.02，CaCO3 20。
(2)分别将实施例1构建的重组菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA-speB、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB、C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-D531R-speB与出发菌株C.crenatum SYPA 5-5分别于BHI固体培养基划线活化后，挑取单菌落接种于步骤(1)配制的种子培养基中，培养24h，制备得到种子液；
(3)将制备得到的种子液以10％(v/v)的转接量转接到250mL装有30mL的步骤(1)配制的发酵培养基的摇瓶中，在30℃，220rpm的往复式摇床中进行培养96h，并且在发酵培养24h后加入IPTG，终浓度为0.5mM；
待发酵结束后收集发酵液，用HPLC分别检测精氨酸、胍基丁胺和1,4-丁二胺含量(如图1～3所示)，结果如表2所示。
表2：不同的重组菌摇瓶发酵生产1,4-丁二胺的含量
Figure BDA0002987387430000082
Figure BDA0002987387430000091
其中，NT表示未检出。
结果表明，重组菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA-speB在上述发酵过程及条件中可积累10.9g·L-1的1,4-丁二胺，而带有突变体的重组菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB则可积累15.43g·L-1的1,4-丁二胺，实现无精氨酸添加，一步发酵法由葡萄糖到1,4-丁二胺的直接合成，并且发酵后测得中间产物精氨酸与胍基丁胺含量均少于1g·L-1，转化液相结果如图4所示。
实施例4：重组菌发酵罐发酵产1,4-丁二胺
具体步骤如下：
(1)配制培养基
种子培养基(g·L-1)：葡萄糖40，玉米浆55，(NH4)2SO4 10，酵母浸粉10，KH2PO40.5，K2HPO4 1.5，MgS04·7H2O 0.4，尿素1.0；
发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖120，玉米浆50，酵母浸粉20，(NH4)2SO4 30，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 1.0，尿素1.0，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，ZnSO4·7H2O0.02。
(2)将实施例1构建的重组菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB在BHI固体培养基中划线活化后，挑取单菌落接种于30mL/250mL步骤(1)制备得到的种子培养基中，在30℃，200rpm摇床中培养24h，制备得到一级种子液；
将一级种子液以10％(v/v)的转接量转接到200ml/1000mL步骤(1)制备得到的种子培养基中，在30℃，200rpm摇床中培养20h，制备得到二级种子液；
(3)将步骤(1)制备得到的二级种子液转接到2L/5L步骤(1)制备得到的发酵培养基中，以30℃，600rpm，通气量3L/min，pH 7.0的条件下发酵96h；其中在培养15h时添加终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导。
(4)发酵结束后收集发酵液，用HPLC分别检测精氨酸、胍基丁胺和1,4-丁二胺含量。
结果表明，重组菌C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB在上述发酵过程及条件中可积累35.28g·L-1的1,4-丁二胺，实现无精氨酸添加，一步发酵法由葡萄糖到1,4-丁二胺的直接合成，并且发酵后测得精氨酸含量为0.78g·L-1，胍基丁胺含量为0.84g·L-1。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺的方法
<130> BAA210041A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 658
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Asp Asp Met Ser Met Gly Leu Pro Ser Ser Ala Gly Glu His
1 5 10 15
Gly Val Leu Arg Ser Met Gln Glu Val Ala Met Ser Ser Gln Glu Ala
20 25 30
Ser Lys Met Leu Arg Thr Tyr Asn Ile Ala Trp Trp Gly Asn Asn Tyr
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Glu Leu Gly His Ile Ser Val Cys Pro Asp Pro Asp
50 55 60
Val Pro Glu Ala Arg Val Asp Leu Ala Gln Leu Val Lys Thr Arg Glu
65 70 75 80
Ala Gln Gly Gln Arg Leu Pro Ala Leu Phe Cys Phe Pro Gln Ile Leu
85 90 95
Gln His Arg Leu Arg Ser Ile Asn Ala Ala Phe Lys Arg Ala Arg Glu
100 105 110
Ser Tyr Gly Tyr Asn Gly Asp Tyr Phe Leu Val Tyr Pro Ile Lys Val
115 120 125
Asn Gln His Arg Arg Val Ile Glu Ser Leu Ile His Ser Gly Glu Pro
130 135 140
Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ser Lys Ala Glu Leu Met Ala Val Leu Ala
145 150 155 160
His Ala Gly Met Thr Arg Ser Val Ile Val Cys Asn Gly Tyr Lys Asp
165 170 175
Arg Glu Tyr Ile Arg Leu Ala Leu Ile Gly Glu Lys Met Gly His Lys
180 185 190
Val Tyr Leu Val Ile Glu Lys Met Ser Glu Ile Ala Ile Val Leu Asp
195 200 205
Glu Ala Glu Arg Leu Asn Val Val Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Arg
210 215 220
Leu Ala Ser Gln Gly Ser Gly Lys Trp Gln Ser Ser Gly Gly Glu Lys
225 230 235 240
Ser Lys Phe Gly Leu Ala Ala Thr Gln Val Leu Gln Leu Val Glu Thr
245 250 255
Leu Arg Glu Ala Gly Arg Leu Asp Ser Leu Gln Leu Leu His Phe His
260 265 270
Leu Gly Ser Gln Met Ala Asn Ile Arg Asp Ile Ala Thr Gly Val Arg
275 280 285
Glu Ser Ala Arg Phe Tyr Val Glu Leu His Lys Leu Gly Val Asn Ile
290 295 300
Gln Cys Phe Asp Val Gly Gly Gly Leu Gly Val Asp Tyr Glu Gly Thr
305 310 315 320
Arg Ser Gln Ser Asp Cys Ser Val Asn Tyr Gly Leu Asn Glu Tyr Ala
325 330 335
Asn Asn Ile Ile Trp Ala Ile Gly Asp Ala Cys Glu Glu Asn Gly Leu
340 345 350
Pro His Pro Thr Val Ile Thr Glu Ser Gly Arg Ala Val Thr Ala His
355 360 365
His Thr Val Leu Val Ser Asn Ile Ile Gly Val Glu Arg Asn Glu Tyr
370 375 380
Thr Val Pro Thr Ala Pro Ala Glu Asp Ala Pro Arg Ala Leu Gln Ser
385 390 395 400
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405 410 415
Leu Arg Glu Trp Leu His Asp Ser Gln Met Asp Leu His Asp Ile His
420 425 430
Ile Gly Tyr Ser Ser Gly Ile Phe Ser Leu Gln Glu Arg Ala Trp Ala
435 440 445
Glu Gln Leu Tyr Leu Ser Met Cys His Glu Val Gln Lys Gln Leu Asp
450 455 460
Pro Gln Asn Arg Ala His Arg Pro Ile Ile Asp Glu Leu Gln Glu Arg
465 470 475 480
Met Ala Asp Lys Met Tyr Val Asn Phe Ser Leu Phe Gln Ser Met Pro
485 490 495
Asp Ala Trp Gly Ile Asp Gln Leu Phe Pro Val Leu Pro Leu Glu Gly
500 505 510
Leu Asp Gln Val Pro Glu Arg Arg Ala Val Leu Leu Asp Ile Thr Cys
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ala Ile Asp His Tyr Ile Asp Gly Asp Gly Ile Ala
530 535 540
Thr Thr Met Pro Met Pro Glu Tyr Asp Pro Glu Asn Pro Pro Met Leu
545 550 555 560
Gly Phe Phe Met Val Gly Ala Tyr Gln Glu Ile Leu Gly Asn Met His
565 570 575
Asn Leu Phe Gly Asp Thr Glu Ala Val Asp Val Phe Val Phe Pro Asp
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Gly Ser Val Glu Val Glu Leu Ser Asp Glu Gly Asp Thr Val Ala Asp
595 600 605
Met Leu Gln Tyr Val Gln Leu Asp Pro Lys Thr Leu Leu Thr Gln Phe
610 615 620
Arg Asp Gln Val Lys Lys Thr Asp Leu Asp Ala Glu Leu Gln Gln Gln
625 630 635 640
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Asp Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
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1 5 10 15
Phe Gly Phe Leu Arg Leu Pro Met Asn Phe Gln Pro Tyr Asp Ser Asp
20 25 30
Ala Asp Trp Val Ile Thr Gly Val Pro Phe Asp Met Ala Thr Ser Gly
35 40 45
Arg Ala Gly Gly Arg His Gly Pro Ala Ala Ile Arg Gln Val Ser Thr
50 55 60
Asn Leu Ala Trp Glu His Asn Arg Phe Pro Trp Asn Phe Asp Met Arg
65 70 75 80
Glu Arg Leu Asn Val Val Asp Cys Gly Asp Leu Val Tyr Ala Phe Gly
85 90 95
Asp Ala Arg Glu Met Ser Glu Lys Leu Gln Ala His Ala Glu Lys Leu
100 105 110
Leu Ala Ala Gly Lys Arg Met Leu Ser Phe Gly Gly Asp His Phe Val
115 120 125
Thr Leu Pro Leu Leu Arg Ala His Ala Lys His Phe Gly Lys Met Ala
130 135 140
Leu Val His Phe Asp Ala His Thr Asp Thr Tyr Ala Asn Gly Cys Glu
145 150 155 160
Phe Asp His Gly Thr Met Phe Tyr Thr Ala Pro Lys Glu Gly Leu Ile
165 170 175
Asp Pro Asn His Ser Val Gln Ile Gly Ile Arg Thr Glu Phe Asp Lys
180 185 190
Asp Asn Gly Phe Thr Val Leu Asp Ala Cys Gln Val Asn Asp Arg Ser
195 200 205
Val Asp Asp Val Ile Ala Gln Val Lys Gln Ile Val Gly Asp Met Pro
210 215 220
Val Tyr Leu Thr Phe Asp Ile Asp Cys Leu Asp Pro Ala Phe Ala Pro
225 230 235 240
Gly Thr Gly Thr Pro Val Ile Gly Gly Leu Thr Ser Asp Arg Ala Ile
245 250 255
Lys Leu Val Arg Gly Leu Lys Asp Leu Asn Ile Val Gly Met Asp Val
260 265 270
Val Glu Val Ala Pro Ala Tyr Asp Gln Ser Glu Ile Thr Ala Leu Ala
275 280 285
Ala Ala Thr Leu Ala Leu Glu Met Leu Tyr Ile Gln Ala Ala Lys Lys
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305
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<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgcctgccga tgaacttcca gccgtatgac agcgatgcag actgggtgat tactggcgtg 120
ccgttcgata tggccacttc tggtcgtgcg ggtggtcgcc acggtccggc agcgatccgt 180
caggtttcga cgaatctggc ctgggaacac aaccgcttcc cgtggaattt cgacatgcgt 240
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atgagcgaaa agctgcaggc gcacgccgag aagctgctgg ctgccggtaa gcgtatgctc 360
tctttcggtg gtgaccactt tgttacgctg ccgctgctgc gtgctcatgc gaagcatttc 420
ggcaaaatgg cgctggtaca ctttgacgcc cacaccgata cctatgcgaa cggttgtgaa 480
tttgaccacg gcactatgtt ctataccgcg ccgaaagaag gtctgatcga cccgaatcat 540
tccgtgcaga ttggtattcg taccgagttt gataaagaca acggctttac cgtgctggac 600
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cagtcggaaa tcactgctct ggcagcggca acgctggcgc tggaaatgct gtatattcag 900
gcggcgaaaa agggcgagta a 921
<210> 4
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgtctgacg acatgtctat gggtttgcct tcgtcagcgg gcgaacacgg tgtactacgc 60
tccatgcagg aggttgcaat gagctcccag gaagccagca agatgctgcg tacttacaat 120
attgcctggt ggggcaataa ctactatgac gttaacgagc tgggccacat tagcgtgtgc 180
ccggacccgg acgtcccgga agctcgcgtc gatctcgcgc agttagtgaa aactcgtgaa 240
gcacagggcc agcgtctgcc tgcactgttc tgtttcccac agatcctgca gcaccgtttg 300
cgttccatta acgccgcgtt caaacgtgcg agggaatcct acggctataa cggcgattac 360
ttccttgttt atccgatcaa agttaaccag caccgccgcg tgattgagtc cctgattcat 420
tcgggcgaac cgctgggtct ggaagccggt tccaaagccg agttgatggc agtactggca 480
catgctggca tgacccgtag cgtcatcgtc tgcaacggtt ataaagaccg cgaatatatc 540
cgcctggcat taattggcga gaagatgggg cacaaggtct atctggtcat tgagaagatg 600
tcagaaatcg ccattgtgct ggatgaagca gaacgtctga atgtcgttcc tcgtctgggc 660
gtgcgtgcac gtctggcttc gcagggttcg ggtaaatggc agtcctccgg cggggaaaaa 720
tcgaagttcg gcctggctgc gactcaggta ctgcaactgg ttgaaaccct gcgtgaagcc 780
gggcgtctcg acagcctgca actactgcac ttccacctcg gttcgcagat ggcgaatatt 840
cgcgatatcg cgacaggcgt tcgtgaatcc gcgcgtttct atgtggaact gcacaagctg 900
ggcgtcaata ttcagtgctt cgacgtcggc ggcggtctgg gcgtggatta tgaaggtact 960
cgttcgcagt ccgactgttc ggtgaactac ggcctcaatg aatacgccaa caacattatc 1020
tgggcgattg gcgatgcgtg tgaagaaaac ggtctgccgc atccgacggt aatcaccgaa 1080
tcgggtcgtg cggtgactgc gcatcacacc gtgctggtgt ctaatatcat cggcgtggaa 1140
cgtaacgaat acacggtgcc gaccgcgcct gcagaagatg cgccgcgcgc gctgcaaagc 1200
atgtgggaaa cctggcagga gatgcacgaa ccgggaactc gccgttctct gcgtgaatgg 1260
ttacacgaca gtcagatgga tctgcacgac attcatatcg gctactcttc cggcatcttt 1320
agcctgcaag aacgtgcatg ggctgagcag ctttatttga gcatgtgcca tgaagtgcaa 1380
aagcagctgg atccgcaaaa ccgtgctcat cgtccgatta tcgacgagct gcaggaacgt 1440
atggcggaca aaatgtacgt caacttctcg ctgttccagt cgatgccgga cgcatggggg 1500
atcgaccagt tgttcccggt tctgccgctg gaagggctgg atcaagtgcc ggaacgtcgc 1560
gctgtgctgc tggatattac ctgtgactct gacggtccga tcgaccacta tattgatggt 1620
gacggtattg ccacgacaat gccaatgccg gagtacgatc cagagaatcc gccgatgctc 1680
ggtttcttta tggtcggcgc atatcaggag atcctcggca acatgcacaa cctgttcggt 1740
gataccgaag cggttgacgt gttcgtcttc cctgacggta gcgtagaagt agaactgtct 1800
gacgaaggcg ataccgtggc ggacatgctg caatatgtac agctcgatcc gaaaacgctg 1860
ttaacccagt tccgcgatca agtgaagaaa accgatcttg atgctgaact gcaacaacag 1920
ttccttgaag agttcgaggc aggtttgtac ggttatactt atcttgaaga tgagtaa 1977
<210> 5
<211> 1977
<212> DNA
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<400> 5
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tccatgcagg aggttgcaat gagctcccag gaagccagca agatgctgcg tacttacaat 120
attgcctggt ggggcaataa ctactatgac gttaacgagc tgggccacat tagcgtgtgc 180
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atggcggaca aaatgtacgt caacttctcg ctgttccagt cgatgccgga cgcatggggg 1500
atcgaccagt tgttcccggt tctgccgctg gaagggctgg atcaagtgcc ggaacgtcgc 1560
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ttccttgaag agttcgaggc aggtttgtac ggttatactt atcttgaaga tgagtaa 1977

Claims (8)

1.一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于，同时表达了精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶，所述精氨酸脱羧酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的精氨酸脱羧酶第533位的丙氨酸突变成脯氨酸得到的，所述胍丁胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，所述重组钝齿棒杆菌以C. crenatum SYPA5-5为表达宿主。
2.如权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌以pXMJ19为表达载体。
3.构建权利要求1或2所述的重组钝齿棒杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将化学合成的精氨酸脱羧酶突变体基因和胍丁胺酶基因串联后连接到表达载体pXMJ19上，构建重组质粒；
（2）将步骤（1）制备得到的重组质粒转化到C. crenatum SYPA5-5 中，制备得到重组钝齿棒杆菌。
4.一种生产1,4-丁二胺的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的重组钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述重组钝齿棒杆菌接种至种子培养基中，培养得到种子液，将得到的种子液接种至发酵培养基中发酵制备得到1,4-丁二胺。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法为：所述重组钝齿棒杆菌接种至种子培养基中，在30 °C，220 rpm条件下培养24 h，制备得到种子液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将制备得到的种子液按照10%的接种量接种至发酵培养基中，在30℃，220 rpm条件下发酵培养96 h。
8.权利要求1或2所述的重组钝齿棒杆菌在制备含有1,4-丁二胺的产品中的应用。
CN202110317317.8A 2021-03-22 2021-03-22 一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺的方法 Active CN113061562B (zh)

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