CN112921022B - 一种利用重组大肠杆菌生产1,4-丁二胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌生产1,4‑丁二胺的方法，属于基因工程技术，利用高拷贝质粒pXMJ19，将精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶成功表达，构建得到重组菌。全细胞转化结果表明，原始菌不具有过量积累1,4‑丁二胺的能力，而重组菌可以实现过量积累1,4‑丁二胺；同时基于此基因工程菌株可过量积累1,4‑丁二胺的特性，成功采用酶法转化以精氨酸为底物生产1,4‑丁二胺。在细胞培养过程中添加IPTG诱导酶的表达，根据精氨酸脱羧酶酶学性质在转化体系中添加镁离子和辅酶磷酸吡哆醛。最终24h转化可以积累72.6g·L‑1 1,4‑丁二胺，中间产物胍基丁胺产量为0.14g/L。

Description

一种利用重组大肠杆菌生产1,4-丁二胺的方法
技术领域
本发明涉及一种利用重组大肠杆菌生产1,4-丁二胺的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
1,4-丁二胺(也称1,4-二氨基丁烷或腐胺)属于氨基酸衍生物，作为聚合物，药物，农用化学品，表面活性剂和其他添加剂的组分，具有许多工业应用。1,4-丁二胺目前用于通过与己二酸的缩聚反应合成尼龙-4,6。尼龙-4,6因其高熔点、高结晶度、高耐热性和高机械强度以及出色的耐溶剂性而成为一种优异的工程塑料，在纺织、机械化工、电子电器、汽车制造等领域都有着广泛的应用。因此，1,4-丁二胺具有十分广阔的市场应用前景。
工业规模上1,4-丁二胺的生产主要依赖于琥珀腈加氢的化学合成，琥珀腈通过在丙烯腈中添加氰化氢产生。化学路线需要不可再生的石油化工产品作为原材料和相对苛刻的反应条件，以及昂贵的催化剂。由于反应物具有剧毒和易燃性，因此从环境和人类健康的角度来看，化学合成路线并不可取。生物法生产1,4-丁二胺具有以下优点：环境友好且安全性高、产物可持续生产、利用低价值底物，降低生产成本等。因此，越来越需要开发一条从价格低廉、绿色环保、可再生的原料出发，生产1,4-丁二胺的生物技术方法，用于解决目前工业规模生产过程存在的问题。
生物酶法转化生产1,4-丁二胺有两种路径：1、利用精氨酸脱羧酶与胍丁胺酶串联表达将精氨酸转化为1,4-丁二胺；2、利用鸟氨酸脱羧酶将鸟氨酸转化为1,4-丁二胺。与化学合成法相比，利用酶法转化生产1,4-丁二胺具有步骤简单、副产物少以及绿色环保等优势，相比于鸟氨酸，以精氨酸为底物，价格更加低廉，成本更加便宜。但是目前采用精氨酸为底物，合成1,4-丁二胺，存在产量低等缺点，例如：Yu Deng等人研究公开的方法中，是采用通过过表达精氨酸脱羧酶和胍丁胺酶并结合良好控制的发酵策略的技术方案，但是生成的1,4-丁二胺的产量仅为26.21g·L-1，并且存在产率低、转化周期长(至少48小时)等缺点(公开于“Highly efficient whole-cell biosynthesis of putrescine by recombinantEscherichia coli”论文当中)。
因此，如何采用精氨酸为底物，高效、且节约成本的合成1,4-丁二胺成为研究的热点和难点。
发明内容
技术问题：
本发明要解决的技术问题是：提供一种精氨酸脱羧酶突变体，及提供一种表达了精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶的重组大肠杆菌及其应用，并且提供了一种产率高、周期短、成本低的制备1,4-丁二胺的方法。
技术方案：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种精氨酸脱羧酶突变体，所述精氨酸脱羧酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶的第533位突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶的第533位由丙氨酸突变成脯氨酸得到的，命名为A533P。
在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了编码上述精氨酸脱羧酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，编码所述精氨酸脱羧酶突变体A533P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
本发明还提供了携带上述基因，或上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌同时表达了上述精氨酸脱羧酶突变体和来源于Escherichia coli str.K-12substr.MG1655的胍丁胺酶。
在本发明的一种实施方式中，以pXMJ19为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述胍丁胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述胍丁胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以Escherichia coli BL21为表达宿主。
本发明还提供了构建上述重组大肠杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将编码上述精氨酸脱羧酶突变体的基因A533P与胍丁胺酶基因speB串联克隆到表达载体pXMJ19上，构建重组表达型质粒pXMJ19-A533P-speB。
(2)将步骤(1)得到的重组载体pXMJ19-A533P-speB用化学转化法转化到Escherichia coli BL21中，制备得到重组大肠杆菌，使精氨酸脱羧酶突变体A533P和胍丁胺酶能够在IPTG诱导下过表达。
在本发明的一种实施方式中，重组大肠杆菌可产生有活性的精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶。
本发明还提供了一种生产1,4-丁二胺的方法，将上述重组大肠杆菌添加至含有L-精氨酸的反应体系中进行反应，制备得到1,4-丁二胺。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌在反应体系中的OD600至少为70。
在本发明的一种实施方式中，上述重组大肠杆菌的培养方法如下：将重组大肠杆菌接种至LB固体培养基中进行培养，制备得到单菌落，将制备得到的单菌落转接到LB液体培养基活化培养12h后，得到种子液，将制备得到的种子液以1％(v/v)的接种量转接到200mL/500mL TB液体培养基中，在37℃，200rpm摇床中培养2h时，添加终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，在16℃，200rpm继续培养10h，得到培养液，离心收集菌体，将菌体加入反应体系。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系为：MgSO4 4mM，磷酸吡哆醛7mM，曲拉通2％(v/v)，Tris 50mM，L-精氨酸50-90g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，反应条件为：于37℃转化24h。
本发明还提供了一种生产1,4-丁二胺的方法，将上述精氨酸脱羧酶突变体和氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的胍丁胺酶同时添加至含有L-精氨酸的反应体系中进行反应，制备得到1,4-丁二胺。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的组成为：MgSO4 2mM；磷酸吡哆醛5mM；Tris 50mM；精氨酸10-30g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，反应条件为：于37℃转化24h。
本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌在制备含有1,4-丁二胺的产品中的应用。
有益效果
(1)本发明提供了一种以精氨酸为底物酶法转化合成1,4-丁二胺的公认安全菌株Escherichia coli BL21/pXMJ19-A533P-speB。以模式菌株Escherichia coli BL21为出发菌株，构建具有精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶活性的重组大肠杆菌Escherichia coliBL21/pXMJ19-A533P-speB，无需以价格更高的鸟氨酸为原料，能够利用低价的精氨酸为原料进行1,4-丁二胺的生产，从而有效的降低1,4-丁二胺的生产成本。
(2)本发明构建了一种比酶活提高的精氨酸脱羧酶突变体，野生型精氨酸脱羧酶的比酶活为46.39U·mg-1，而本发明中构建的精氨酸脱羧酶突变体A533P的比酶活可达75.63U·mg-1，较野生型精氨酸脱羧酶提高了1.6倍，可见，本发明构建的精氨酸脱羧酶突变体的比酶活较野生型有了明显的提高。
(3)本发明基于精氨酸脱羧酶突变体、胍丁胺酶的特点和Escherichia coli BL21的特性确定反应体系成分，最终得到的反应液中1,4-丁二胺的积累量由Escherichia coliBL21/pXMJ19-speA-speB的56.01g·L-1提高到Escherichia coli BL21/pXMJ19-A533P-speB的72.6g·L-1；摩尔转化率由79.77％提高到96.97％。
附图说明
图1：精氨酸脱羧酶粗酶液蛋白胶图。
图2：精氨酸脱羧酶纯酶液蛋白胶图。
图3：1g·L-1精氨酸标准品的HPLC液相图。
图4：1g·L-1胍基丁胺标准品的HPLC液相图。
图5：1g·L-1 1，4-丁二胺标准品的HPLC液相图。
图6：转化过程中转化液液相图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pXMJ19质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心(上述菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g/L。
TB液体培养基：酵母粉24.0g·L-1、胰蛋白胨12.0g·L-1、甘油4g·L-1、KH2PO42.31g·L-1、K2HPO4 12.54g·L-1。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
精氨酸脱羧酶酶活测定方法：
(1)酶活测定体系：L-精氨酸5g·L-1、MgSO4 2.5mM、磷酸吡哆醛0.6mM、酶蛋白0.05mg·mL-1。所有物质均配成高浓度母液，以50mM Tris缓冲液溶解，用HCl将pH调为8.0。酶活检测体系总体积为2mL。
(2)酶活检测方法：检测酶活时，在37℃600rpm高通量摇床上预热除酶液外的其他组分，预热时间为5min。加入酶液，精确反应10min。加入200μL甲醇终止反应，冰浴冷却反应液。12000rpm高速离心10min，取上清稀释20倍后过0.22μm滤膜，HPLC检测。
HPLC检测条件：安捷伦C18，5μm，4.6×250mm色谱柱；流速为1.0mL·min-1；柱温40℃；检测波长338nm；流动相：A相：8.0g乙酸钠(13.3g三水合乙酸钠)溶于1000mL水，加入225μL三乙胺，用5％的乙酸将pH调到7.20±0.05，最后加入5mL四氢呋喃，混合；B相：称取6.0g乙酸钠于200mL水溶解，用5％乙酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入400mL的HPLC级甲醇和400mL的HPLC级乙腈，混合。
酶活定义：在标准反应条件下，每1min催化产生1μmol胍基丁胺所需的酶量为1个酶活单位。
精氨酸脱羧酶比酶活测定方法：
测定纯化后的精氨酸脱羧酶的酶活(U·mL-1)，并且，采用Bradford法测定纯化后的精氨酸脱羧酶的蛋白含量(mg·mL-1)，以计算精氨酸脱羧酶的比酶活；
其中，精氨酸脱羧酶比酶活的计算公式如下：
精氨酸脱羧酶比酶活(U·mg-1)＝纯化后的精氨酸脱羧酶的酶活(U·mL-1)/纯化后的精氨酸脱羧酶的蛋白含量(mg·mL-1)。
下述实施例中所涉及的胍基丁胺、1,4-丁二胺的含量的检测方法：
高效液相色谱法；安捷伦C18，5μm，4.6×250mm色谱柱；流速为1.0mL·min-1；柱温40℃；检测波长338nm；流动相：A相：8.0g乙酸钠(13.3g三水合乙酸钠)溶于1000mL水，加入225μL三乙胺，用5％的乙酸将pH调到7.20±0.05，最后加入5mL四氢呋喃，混合；B相：称取6.0g乙酸钠于200mL水溶解，用5％乙酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入400mL的HPLC级甲醇和400mL的HPLC级乙腈，混合。
实施例1：重组菌Escherichia coli BL21/pXMJ19-speA-speB、Escherichia coliBL21/pXMJ19-A533P-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-D531R-speB和Escherichiacoli BL21/pXMJ19-I534G-speB的构建
(1)根据NCBI中Escherichia coli str.K-12substr.MG1655全基因组核酸序列中speA(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和speB的基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，设计精氨酸脱羧酶基因的PCR引物F1和R1、胍丁胺酶基因的PCR引物F2和R2。
F1：5’-ggtcgactctagaggatccaaaggaggaaaatcatgtctgacgacatgtctatggg-3’
R1：5’-ttccacacattatacgagccgatgattaattgtcaagaattcttactcatcttcaagataagtataaccg-3’
F2：5’-gtataatgtgtggaattgtgagcggataacaaaaaggaggacaaccatgagcaccttaggtcatcaatac-3’
R2：5’-gtatcaggctgaaaatcttctctcatccgaattcttactcgccctttttcgccgcctg-3’
(2)精氨酸脱羧酶基因和胍丁胺酶基因的克隆
以Escherichia coli str.K-12substr.MG1655总DNA为模板，利用上述引物做PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，55℃退火，30s，72℃延伸，90s，30个循环；72℃终延伸5min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，灭菌的双蒸馏水22μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
(3)精氨酸脱羧酶突变体A533P、D531R、I534G的构建
根据NCBI中Escherichia coli str.K-12substr.MG1655全基因组核酸序列中speA基因序列，设计精氨酸脱羧酶突变体A533P的PCR引物A533P-F1、A533P-F2、A533P-F3和A533P-F4。
A533P-F1：5’-ggtcgactctagaggatccaaaggaggaaaatCatgtctgacgacatgtctatggg-3’
A533P-F2：5’-ccatcaatatagtggtcgatcggaccgtcagagtcacagg-3’
A533P-F3：5’-cctgtgactctgacggtccgatcgaccactatattgatgg-3’
A533P-F4：5’-ttccacacattatacgagccgatgattaattgtcaagaattcttactcatcttcaagataagtataaccg-3’
根据NCBI中Escherichia coli str.K-12substr.MG1655全基因组核酸序列中speA基因序列，设计精氨酸脱羧酶突变体D531R的PCR引物D531R-F1、D531R-F2、D531R-F3和D531R-F4。
D531R-F1：5’-ggtcgactctagaggatccAAAGGAGGAAAATCatgtctgacgacatgtctatggg-3’
D531R-F2：5’-caatatagtggtcgatagcaccgcgagagtcacaggtaatatcc-3’
D531R-F3：5’-ggatattacctgtgactctcgcggtgctatcgaccactatattg-3’
D531R-F4：5’-ttccacacattatacgagccgatgattaattgtcaagaattcttactcatcttcaagataagtataaccg-3’
根据NCBI中Escherichia coli str.K-12substr.MG1655全基因组核酸序列中speA基因序列，设计精氨酸脱羧酶突变体I534G的PCR引物I534G-F1、I534G-F2、I534G-F3和I534G-F4。
I534G-F1：5’-ggtcgactctagaggatcctgtctgacgacatgtctatggg-3’
I534G-F2：5’-caccatcaatatagtggtcaccagcaaaaggaggaaaatcaccgtcagagtcac-3’
I534G-F3：5’-gtgactctgacggtgctggtgaccactatattgatggtg-3’
I534G-F4：5’-ttccacacattatacgagccgatgattaattgtcaagaattcttactcatcttcaagataagtataaccg-3’
利用融合PCR技术，以A533P-F1、A533P-F2、A533P-F3和A533P-F4；D531R-F1、D531R-F2、D531R-F3和D531R-F4；I534G-F1、I534G-F2、I534G-F3和I534G-F4为引物，以获得的重组质粒pXMJ19-speA-speB为模板进行定点突变，融合PCR扩增条件为：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，55℃退火，30s，8个循环；之后加入F1和F4引物，95℃预变性，5min；95℃变性，30s，55℃退火，30s，72℃延伸，90s，30个循环；72℃终延伸5min。PCR扩增体系：上下段2μL，F1和F4引物各1μL，灭菌的双蒸馏水19μL，2×Phanta Max Master Mix25μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，检测回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
(4)重组质粒pXMJ19-speA-speB与pXMJ19-A533P-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-D531R-speB和Escherichia coli BL21/pXMJ19-I534G-speB的构建；
分别将(2)、(3)中获得的基因片段经融合PCR融合得到串联片段，提取保存于E.coli JM109中的质粒pXMJ19，并用BamH I和EcoR I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后与串联片段进行连接，连接体系:ExnaseⅡ2μL,5×CEⅡBuffer 4μL,载体及片段分别按照连接酶ExnaseⅡ说明书计算后添加，灭菌的双蒸馏水将总体积补齐至20μL，之后在30℃条件下酶连30min。
分别将连接好的pXMJ9-speA-speB与pXMJ19-A533P-speB、pXMJ19-D531R-speB和pXMJ19-I534G-speB重组质粒转化到E.coli BL21感受态中，并用加入浓度为10μg·mL-1氯霉素抗性的LB固体培养基筛选阳性转化子。
挑取验证正确的转化子接种于加入浓度为10μg·mL-1氯霉素抗性的10ml LB液体培养基，于37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证，测序正确后，得到正确的重组菌株Escherichia coli BL21/pXMJ19-speA-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-A533P-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-D531R-speB和Escherichia coli BL21/pXMJ19-I534G-speB，加入甘油至终浓度15％～20％(v/v)，-70℃冰箱保藏备用。
实施例2：精氨酸脱羧酶突变体的比酶活测定
具体步骤如下：
(1)野生型的精氨酸脱羧酶和突变体A533P、D531R和I534G粗酶液的获得
分别将实施例1制备得到的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pXMJ19-speA-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-A533P-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-D531R-speB和Escherichia coli BL21/pXMJ19-I534G-speB在加入浓度为10μg·mL-1氯霉素抗性的LB固体培养基平板上划线培养，挑取单菌落分别接种至加入浓度为10μg·mL-1氯霉素抗性的10mL LB液体培养基中，于温度37℃、200rpm的条件下摇瓶培养12h，得到种子液。
将种子液以1％(v/v)的接种量接种至加入浓度为10μg·mL-1氯霉素抗性的50mLLB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下培养2h后加入IPTG，终浓度为0.5mM，于16℃、200rpm的条件下低温诱导12h，分别得到重组菌Escherichia coli BL21/pXMJ19-speA-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-A533P-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-D531R-speB和Escherichia coli BL21/pXMJ19-I534G-speB培养液，将培养液于8000rpm，4℃的条件下离心收集菌体。
将菌体经细胞破碎仪破碎后于12000rpm、4℃的条件下离心10min，分别得到粗酶液(如图1所示)。
(2)纯酶液的获得
将(1)中获得的粗酶液用0.22μm滤膜过滤，然后利用AKTA蛋白纯化仪和Ni-NTA纯化柱进行纯化。
具体过程如下：
上样及平衡缓冲液A(20mM Tris，500mM NaCl，pH 7.4)，洗脱缓冲液B(20mM Tris，500mM NaCl，700mM咪唑，pH 7.4)。纯化柱为1mL的His TrapTMFF，流速为1mL·min-1，采用梯度洗脱(20min，缓冲液B浓度0％～100％)的洗脱方式，收集蛋白峰，通过SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度(如图2所示)并测定酶活及酶学性质。
经镍柱纯化后测定精氨酸脱羧酶的酶活，检测结果如表1所示。
表1：不同精氨酸脱羧酶的酶活
比酶活(U·mg<sup>-1</sup>) 最适温度(℃) 最适pH
野生型 46.39 50 8.0
突变体A533P 75.63 50 8.0
突变体D531R 42.02 50 7.5
突变体I534G 26.67 50 8.0
由表1可知在精氨酸脱羧酶引入突变体A533P后获得的突变体的比酶活有了明显提升，突变体A533P的比酶活达到75.63U·mg-1。
实施例3：重组大肠杆菌全细胞生产1,4-丁二胺
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1构建的重组菌Escherichia coli BL21/pXMJ19-speA-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-A533P-speB、Escherichia coli BL21/pXMJ19-D531R-speB和Escherichia coli BL21/pXMJ19-I534G-speB于LB固体平板划线活化后，挑取单菌落，接种于10mL添加了浓度为10μg·mL-1氯霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养12h，得到种子液；
(2)将制备得到的种子液以1％(v/v)的接种量转接至200mL TB液体培养基，于37℃、200rpm的条件下培养2h后加入IPTG，终浓度为0.5mM，于16℃、200rpm的条件下低温诱导12h，得到培养液；
(3)将培养液于8000rpm、4℃条件下离心5min收集菌体。取离心后的菌体溶于全细胞转化缓冲液中，其中，菌体的添加量为OD600＝70，于37℃条件下转化24h；结果如表2所示：
其中，转化缓冲液(均是按照终浓度计)为：L-精氨酸50-90g·L-1、MgSO4 4mM、曲拉通X-100 2％(v/v)、磷酸吡哆醛7mM、Tris 50mM，用HCl调至pH 8.0。
表2：不同重组大肠杆菌生产1,4-丁二胺的产量、摩尔转化率及中间产物胍基丁胺产量
1,4-丁二胺产量(g·L<sup>-1</sup>) 胍基丁胺产量(g·L<sup>-1</sup>) 摩尔转化率(％)
含有野生型speA的重组菌 56.0 0.22 79.77
含有突变体A533P的重组菌 72.6 0.14 96.97
含有突变体D531R的重组菌 44.5 0.27 78.53
含有突变体I534G的重组菌 28.9 0.34 64.89
结果表明，重组菌Escherichia coli BL21/pXMJ19-A533P-speB在上述条件中转化可积累72.6g·L-1 1,4-丁二胺，摩尔转化率达到96.97％，中间产物胍基丁胺产量为0.14g·L-1，转化液相结果如图3～6所示。
实施例4：酶法制备1,4-丁二胺
具体步骤如下：
分别将实施例2制备得到的经纯化后的各个纯酶液添加至缓冲液体系中，添加量为：3mg·mL-1，于37℃条件下转化24h。
转化缓冲液(均是按照终浓度计)为：L-精氨酸10-30g·L-1、MgSO4 2mM、磷酸吡哆醛5mM、Tris 50mM，用HCl调至pH 8.0。
结果如表3所示：
表3：不同纯酶生产1,4-丁二胺的产量、摩尔转化率及中间产物胍基丁胺产量
Figure BDA0002986934010000091
其中，NT表示未检出。
结果表明，精氨酸脱羧酶突变体A533P在上述条件中转化可积累22.14g·L-1 1,4-丁二胺，摩尔转化率达到98.27％。中间产物胍基丁胺未检出。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用重组大肠杆菌生产1,4-丁二胺的方法
<130> BAA210042A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 658
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Asp Asp Met Ser Met Gly Leu Pro Ser Ser Ala Gly Glu His
1 5 10 15
Gly Val Leu Arg Ser Met Gln Glu Val Ala Met Ser Ser Gln Glu Ala
20 25 30
Ser Lys Met Leu Arg Thr Tyr Asn Ile Ala Trp Trp Gly Asn Asn Tyr
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Glu Leu Gly His Ile Ser Val Cys Pro Asp Pro Asp
50 55 60
Val Pro Glu Ala Arg Val Asp Leu Ala Gln Leu Val Lys Thr Arg Glu
65 70 75 80
Ala Gln Gly Gln Arg Leu Pro Ala Leu Phe Cys Phe Pro Gln Ile Leu
85 90 95
Gln His Arg Leu Arg Ser Ile Asn Ala Ala Phe Lys Arg Ala Arg Glu
100 105 110
Ser Tyr Gly Tyr Asn Gly Asp Tyr Phe Leu Val Tyr Pro Ile Lys Val
115 120 125
Asn Gln His Arg Arg Val Ile Glu Ser Leu Ile His Ser Gly Glu Pro
130 135 140
Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ser Lys Ala Glu Leu Met Ala Val Leu Ala
145 150 155 160
His Ala Gly Met Thr Arg Ser Val Ile Val Cys Asn Gly Tyr Lys Asp
165 170 175
Arg Glu Tyr Ile Arg Leu Ala Leu Ile Gly Glu Lys Met Gly His Lys
180 185 190
Val Tyr Leu Val Ile Glu Lys Met Ser Glu Ile Ala Ile Val Leu Asp
195 200 205
Glu Ala Glu Arg Leu Asn Val Val Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Arg
210 215 220
Leu Ala Ser Gln Gly Ser Gly Lys Trp Gln Ser Ser Gly Gly Glu Lys
225 230 235 240
Ser Lys Phe Gly Leu Ala Ala Thr Gln Val Leu Gln Leu Val Glu Thr
245 250 255
Leu Arg Glu Ala Gly Arg Leu Asp Ser Leu Gln Leu Leu His Phe His
260 265 270
Leu Gly Ser Gln Met Ala Asn Ile Arg Asp Ile Ala Thr Gly Val Arg
275 280 285
Glu Ser Ala Arg Phe Tyr Val Glu Leu His Lys Leu Gly Val Asn Ile
290 295 300
Gln Cys Phe Asp Val Gly Gly Gly Leu Gly Val Asp Tyr Glu Gly Thr
305 310 315 320
Arg Ser Gln Ser Asp Cys Ser Val Asn Tyr Gly Leu Asn Glu Tyr Ala
325 330 335
Asn Asn Ile Ile Trp Ala Ile Gly Asp Ala Cys Glu Glu Asn Gly Leu
340 345 350
Pro His Pro Thr Val Ile Thr Glu Ser Gly Arg Ala Val Thr Ala His
355 360 365
His Thr Val Leu Val Ser Asn Ile Ile Gly Val Glu Arg Asn Glu Tyr
370 375 380
Thr Val Pro Thr Ala Pro Ala Glu Asp Ala Pro Arg Ala Leu Gln Ser
385 390 395 400
Met Trp Glu Thr Trp Gln Glu Met His Glu Pro Gly Thr Arg Arg Ser
405 410 415
Leu Arg Glu Trp Leu His Asp Ser Gln Met Asp Leu His Asp Ile His
420 425 430
Ile Gly Tyr Ser Ser Gly Ile Phe Ser Leu Gln Glu Arg Ala Trp Ala
435 440 445
Glu Gln Leu Tyr Leu Ser Met Cys His Glu Val Gln Lys Gln Leu Asp
450 455 460
Pro Gln Asn Arg Ala His Arg Pro Ile Ile Asp Glu Leu Gln Glu Arg
465 470 475 480
Met Ala Asp Lys Met Tyr Val Asn Phe Ser Leu Phe Gln Ser Met Pro
485 490 495
Asp Ala Trp Gly Ile Asp Gln Leu Phe Pro Val Leu Pro Leu Glu Gly
500 505 510
Leu Asp Gln Val Pro Glu Arg Arg Ala Val Leu Leu Asp Ile Thr Cys
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ala Ile Asp His Tyr Ile Asp Gly Asp Gly Ile Ala
530 535 540
Thr Thr Met Pro Met Pro Glu Tyr Asp Pro Glu Asn Pro Pro Met Leu
545 550 555 560
Gly Phe Phe Met Val Gly Ala Tyr Gln Glu Ile Leu Gly Asn Met His
565 570 575
Asn Leu Phe Gly Asp Thr Glu Ala Val Asp Val Phe Val Phe Pro Asp
580 585 590
Gly Ser Val Glu Val Glu Leu Ser Asp Glu Gly Asp Thr Val Ala Asp
595 600 605
Met Leu Gln Tyr Val Gln Leu Asp Pro Lys Thr Leu Leu Thr Gln Phe
610 615 620
Arg Asp Gln Val Lys Lys Thr Asp Leu Asp Ala Glu Leu Gln Gln Gln
625 630 635 640
Phe Leu Glu Glu Phe Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu
645 650 655
Asp Glu
<210> 2
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtctgacg acatgtctat gggtttgcct tcgtcagcgg gcgaacacgg tgtactacgc 60
tccatgcagg aggttgcaat gagctcccag gaagccagca agatgctgcg tacttacaat 120
attgcctggt ggggcaataa ctactatgac gttaacgagc tgggccacat tagcgtgtgc 180
ccggacccgg acgtcccgga agctcgcgtc gatctcgcgc agttagtgaa aactcgtgaa 240
gcacagggcc agcgtctgcc tgcactgttc tgtttcccac agatcctgca gcaccgtttg 300
cgttccatta acgccgcgtt caaacgtgcg agggaatcct acggctataa cggcgattac 360
ttccttgttt atccgatcaa agttaaccag caccgccgcg tgattgagtc cctgattcat 420
tcgggcgaac cgctgggtct ggaagccggt tccaaagccg agttgatggc agtactggca 480
catgctggca tgacccgtag cgtcatcgtc tgcaacggtt ataaagaccg cgaatatatc 540
cgcctggcat taattggcga gaagatgggg cacaaggtct atctggtcat tgagaagatg 600
tcagaaatcg ccattgtgct ggatgaagca gaacgtctga atgtcgttcc tcgtctgggc 660
gtgcgtgcac gtctggcttc gcagggttcg ggtaaatggc agtcctccgg cggggaaaaa 720
tcgaagttcg gcctggctgc gactcaggta ctgcaactgg ttgaaaccct gcgtgaagcc 780
gggcgtctcg acagcctgca actactgcac ttccacctcg gttcgcagat ggcgaatatt 840
cgcgatatcg cgacaggcgt tcgtgaatcc gcgcgtttct atgtggaact gcacaagctg 900
ggcgtcaata ttcagtgctt cgacgtcggc ggcggtctgg gcgtggatta tgaaggtact 960
cgttcgcagt ccgactgttc ggtgaactac ggcctcaatg aatacgccaa caacattatc 1020
tgggcgattg gcgatgcgtg tgaagaaaac ggtctgccgc atccgacggt aatcaccgaa 1080
tcgggtcgtg cggtgactgc gcatcacacc gtgctggtgt ctaatatcat cggcgtggaa 1140
cgtaacgaat acacggtgcc gaccgcgcct gcagaagatg cgccgcgcgc gctgcaaagc 1200
atgtgggaaa cctggcagga gatgcacgaa ccgggaactc gccgttctct gcgtgaatgg 1260
ttacacgaca gtcagatgga tctgcacgac attcatatcg gctactcttc cggcatcttt 1320
agcctgcaag aacgtgcatg ggctgagcag ctttatttga gcatgtgcca tgaagtgcaa 1380
aagcagctgg atccgcaaaa ccgtgctcat cgtccgatta tcgacgagct gcaggaacgt 1440
atggcggaca aaatgtacgt caacttctcg ctgttccagt cgatgccgga cgcatggggg 1500
atcgaccagt tgttcccggt tctgccgctg gaagggctgg atcaagtgcc ggaacgtcgc 1560
gctgtgctgc tggatattac ctgtgactct gacggtgcta tcgaccacta tattgatggt 1620
gacggtattg ccacgacaat gccaatgccg gagtacgatc cagagaatcc gccgatgctc 1680
ggtttcttta tggtcggcgc atatcaggag atcctcggca acatgcacaa cctgttcggt 1740
gataccgaag cggttgacgt gttcgtcttc cctgacggta gcgtagaagt agaactgtct 1800
gacgaaggcg ataccgtggc ggacatgctg caatatgtac agctcgatcc gaaaacgctg 1860
ttaacccagt tccgcgatca agtgaagaaa accgatcttg atgctgaact gcaacaacag 1920
ttccttgaag agttcgaggc aggtttgtac ggttatactt atcttgaaga tgagtaa 1977
<210> 3
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ser Thr Leu Gly His Gln Tyr Asp Asn Ser Leu Val Ser Asn Ala
1 5 10 15
Phe Gly Phe Leu Arg Leu Pro Met Asn Phe Gln Pro Tyr Asp Ser Asp
20 25 30
Ala Asp Trp Val Ile Thr Gly Val Pro Phe Asp Met Ala Thr Ser Gly
35 40 45
Arg Ala Gly Gly Arg His Gly Pro Ala Ala Ile Arg Gln Val Ser Thr
50 55 60
Asn Leu Ala Trp Glu His Asn Arg Phe Pro Trp Asn Phe Asp Met Arg
65 70 75 80
Glu Arg Leu Asn Val Val Asp Cys Gly Asp Leu Val Tyr Ala Phe Gly
85 90 95
Asp Ala Arg Glu Met Ser Glu Lys Leu Gln Ala His Ala Glu Lys Leu
100 105 110
Leu Ala Ala Gly Lys Arg Met Leu Ser Phe Gly Gly Asp His Phe Val
115 120 125
Thr Leu Pro Leu Leu Arg Ala His Ala Lys His Phe Gly Lys Met Ala
130 135 140
Leu Val His Phe Asp Ala His Thr Asp Thr Tyr Ala Asn Gly Cys Glu
145 150 155 160
Phe Asp His Gly Thr Met Phe Tyr Thr Ala Pro Lys Glu Gly Leu Ile
165 170 175
Asp Pro Asn His Ser Val Gln Ile Gly Ile Arg Thr Glu Phe Asp Lys
180 185 190
Asp Asn Gly Phe Thr Val Leu Asp Ala Cys Gln Val Asn Asp Arg Ser
195 200 205
Val Asp Asp Val Ile Ala Gln Val Lys Gln Ile Val Gly Asp Met Pro
210 215 220
Val Tyr Leu Thr Phe Asp Ile Asp Cys Leu Asp Pro Ala Phe Ala Pro
225 230 235 240
Gly Thr Gly Thr Pro Val Ile Gly Gly Leu Thr Ser Asp Arg Ala Ile
245 250 255
Lys Leu Val Arg Gly Leu Lys Asp Leu Asn Ile Val Gly Met Asp Val
260 265 270
Val Glu Val Ala Pro Ala Tyr Asp Gln Ser Glu Ile Thr Ala Leu Ala
275 280 285
Ala Ala Thr Leu Ala Leu Glu Met Leu Tyr Ile Gln Ala Ala Lys Lys
290 295 300
Gly Glu
305
<210> 4
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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ccgttcgata tggccacttc tggtcgtgcg ggtggtcgcc acggtccggc agcgatccgt 180
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ggcaccggta cgccagtgat tggcggcctg acctccgatc gcgctattaa actggtacgc 780
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<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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tccatgcagg aggttgcaat gagctcccag gaagccagca agatgctgcg tacttacaat 120
attgcctggt ggggcaataa ctactatgac gttaacgagc tgggccacat tagcgtgtgc 180
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tcagaaatcg ccattgtgct ggatgaagca gaacgtctga atgtcgttcc tcgtctgggc 660
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tcgaagttcg gcctggctgc gactcaggta ctgcaactgg ttgaaaccct gcgtgaagcc 780
gggcgtctcg acagcctgca actactgcac ttccacctcg gttcgcagat ggcgaatatt 840
cgcgatatcg cgacaggcgt tcgtgaatcc gcgcgtttct atgtggaact gcacaagctg 900
ggcgtcaata ttcagtgctt cgacgtcggc ggcggtctgg gcgtggatta tgaaggtact 960
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gataccgaag cggttgacgt gttcgtcttc cctgacggta gcgtagaagt agaactgtct 1800
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Claims (9)

1.一种精氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的精氨酸脱羧酶第533位的丙氨酸突变成脯氨酸得到的。
2.编码权利要求1所述精氨酸脱羧酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述重组载体的重组菌。
5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，同时表达了权利要求1所述的精氨酸脱羧酶突变体和氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示的胍丁胺酶。
6.如权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pXMJ19为表达载体。
7.如权利要求5或6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以Escherichia coli BL21为表达宿主。
8.一种生产1，4-丁二胺的方法，其特征在于，将权利要求5~7任一所述的重组大肠杆菌，或同时将权利要求1所述的精氨酸脱羧酶突变体和氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示的胍丁胺酶，添加至含有L-精氨酸的反应体系中进行反应，制备得到1,4-丁二胺。
9.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4所述的重组菌，或权利要求5~7任一所述的重组大肠杆菌在制备含有1,4-丁二胺的产品中的应用。
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