CN105950597B - 一种提高酸性脲酶热稳定性的方法 - Google Patents

一种提高酸性脲酶热稳定性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高酸性脲酶热稳定性的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过融合酸性脲酶结构基因，获得了最适温度降低,由70℃降解到60℃,而热稳定性提高的脲酶突变体。在70℃加热30min,脲酶残留活力由80％提高到96％。本发明首次提出，通过融合酸性脲酶结构基因UreA、UreB、UreC的方法来提高酸性脲酶热稳定性的策略，并且获得了热稳定性提高的酸性脲酶，更有利于酸性脲酶的工业化应用。

Description

一种提高酸性脲酶热稳定性的方法
技术领域
本发明涉及一种提高酸性脲酶热稳定性的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
脲酶(Urease,EC3.5.1.5)，广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等中,其能专一性的催化尿素水解产生两分子氨和一分子碳酸。脲酶是世界上首次成功获得的结晶态的酶，它于1926年由Summer首次从刀豆中提取出。根据脲酶作用的最适pH值,可将脲酶分为酸性脲酶、中性脲酶和碱性脲酶。
脲酶主要应用于发酵食品(尤其是酒精饮料如黄酒)中尿素的降解。氨基甲酸乙酯(简称EC)，具有遗传毒性及致癌性，广泛存在于多种发酵食品(如酱油、食醋、泡菜)和酒精饮料(如黄酒、白酒、葡萄酒等)中。研究证实发酵食品(如黄酒、酱油等)中尿素是EC形成的主要前体物质，它和乙醇自发的反应生成EC，从而严重影响人类的健康。酸性脲酶可以高效消除发酵食品(如酒精类饮料)中的尿素，从而可以有效的减少了EC的形成。
目前来说，日本已经实现了脲酶的商业化应用，但脲酶的热稳定性使得其在商业化应用中依然具有一定的局限性。热稳定性高的脲酶更有益于脲酶的工业化应用。因此，有必要寻找能够提高脲酶热稳定性的方法，获得热稳定性更高的脲酶。
本发明首次提出，通过融合酸性脲酶结构基因UreA、UreB、UreC的方法来提高酸性脲酶热稳定性的策略，并且获得了热稳定性提高的酸性脲酶，更有利于酸性脲酶的工业化应用。
发明内容
本发明解决第一个技术问题是提供一种提高酸性脲酶热稳定性的方法，所述方法是将脲酶结构基因融合，插入重组表达载体并进行表达。
在本发明的一个实施方式中，所述方法是将脲酶结构基因UreA和UreB融合，插入重组表达载体并进行表达。
在本发明的一个实施方式中，所述方法是将脲酶结构基因UreA、UreB和UreC融合，插入重组表达载体并进行表达。
所述酸性脲酶结构基因UreA序列如SEQ ID NO.1所示，结构基因UreB序列如SEQID NO.2所示，结构基因UreC序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一个实施方式中，所述UreA与UreB融合后的基因片段UreAB序列如SEQID NO.4所示。
在本发明的一个实施方式中，所述融合是先将UreA与UreB融合，获得融合后的基因片段UreAB，再将UreAB与UreC融合。
在本发明的一个实施方式中，所述UreAB与UreC融合后的基因片段UreABC序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一个实施方式中，所述的方法包括如下步骤：(1)PCR扩增或合成UreA基因片段和UreB基因片段；(2)以所获得的UreA和Ure B基因片段为模板，通过融合PCR方法获得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；(3)将所获得的UreAB片段与载体连接，构建重组表达载体；(5)将重组表达载体导入目的菌株进行表达。
在本发明的一个实施方式中，所述的方法包括如下步骤：(1)PCR扩增或合成脲酶结构基因UreA基因片段、UreB基因片段和UreC基因片段；(2)以所获得的UreA和Ure B基因片段为模板，通过融合PCR方法获得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；(3)以所获得的UreAB和UreC基因片段为模板，通过融合PCR方法获得UreAB和UreC融合在一起的UreABC片段；(4)将所获得的UreABC片段与载体连接，构建重组表达载体；(5)将重组表达载体导入目的菌株进行表达。
在本发明的一个实施方式中，所述载体为pNZ8148-ureLR。
在本发明的一个实施方式中，所述酸性脲酶结构基因通过连接肽进行融合。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽由甘氨酸和丝氨酸组成。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽序列为GGGSGGGS。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽序列为GGGGGGGS。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽序列为GSGSGSGG。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽序列为GGGSGG。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽序列为GSGSGS。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽序列为GSGSGG。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽序列为GGGGGSGS。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽序列为GGGSGSGS。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽由甘氨酸组成。
在本发明的一种实施方式中，所述连接肽序列为GGGGGG。
在本发明的一个实施方式中，所述连接肽还包括(EAAAK)n连接肽和PT连接肽；所述(EAAAK)n连接肽由谷氨酸和丙氨酸组成；所述PT连接肽由脯氨酸和苏氨酸组成。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体步骤如下：
1)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank登录号:AAPZOZ000001.1,GI:194454092-19445409，设计引物。以pNZ8148ureLR(pNZ8148ureLR的构建方法参见申请号为201310524588.6的专利申请，该质粒含有完整脲酶基因簇UreLR，由脲酶基因簇ABCEFGD组成)为模板，通过PCR的方法，获得UreA基因片段和UreB基因片段。
2)以步骤1所获得的UreA和Ure B基因片段为模板，通过融合PCR的方法获得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段。
3)步骤2所获得的UreAB片段经NcoI及PstI双酶切，胶回收后与经NcoI及PstI双酶切并且胶回收的载体pNZ8148-ureLR于16℃过夜连接，构建重组表达载体pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)。
4)步骤3)所获得的重组表达载体pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)，电转化乳酸乳球菌L.lactis NZ9000，培养重组菌表达得到脲酶活力高的突变体。
在本发明的一个实施方式中，所述方法还可以是：(1)PCR扩增或合成UreA基因片段和UreB基因片段；(2)以所获得的UreA和Ure B基因片段为模板，通过融合PCR方法获得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；(3)将所获得的UreAB片段与UreC基因片段通过融合PCR的方法获得UreA和UreC融合在一起的UreAB片段；(4)将融合后的UreABC片段与载体连接，构建重组表达载体；(5)将重组表达载体导入目的菌株进行表达。
在本发明的一个实施方式中，所述连接肽序列为SGGSSS。
在本发明的一个实施方式中，所述提高酸性脲酶热稳定性的方法，具体步骤如下：
(1)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZOZ000001.1,GI:194454092-19445409，设计引物。以pNZ8148-ureLR(申请号为201310524588.6，公开日为2014年2月12日的专利中构建，含有完整脲酶基因簇UreLR，由结构基因UreABCEFGD组成)为模板，通过PCR的方法，获得UreA基因片段和UreB基因片段。
(2)以步骤1所获得的UreA和Ure B基因片段为模板，通过融合PCR的方法获得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段，其序列如SEQ ID NO.4所示。
(3)步骤2所获得的UreAB片段经NcoI及PstI双酶切，胶回收后与经NcoI及PstI双酶切并且胶回收的载体pNZ8148-ureLR于16℃过夜连接，构建重组表达载体pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD),该载体含有AB基因融合后的完整脲酶基因簇AB-CEFGD。
(3)以pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)为模板，通过PCR的方法,获得UreAB基因片段和UreC基因片段。
(4)以步骤3所获得的UreAB及UreC基因片段为模板，通过融合PCR方法获得ABC融合在一起的UreABC片段，序列如SEQ ID NO.5所示。
(5)步骤4所获得的UreABC片段经NcoI及PstI双酶切，胶回收后与经NcoI及PstI双酶切并且胶回收的载体pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)于16℃过夜连接，构建重组表达载体pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD)。
(6)步骤5所获得的重组表达载体pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD)，电转化乳酸乳球菌L.lactisNZ9000，培养重组菌表达得到脲酶活力高的突变体。
本发明的第二个目的是提供根据所述方法获得的脲酶突变体。
有益效果：本发明通过采用不同长度的连接肽，融合酸性脲酶结构基因UreA、UreB、UreC，从而获得了热稳定性提高的脲酶突变体UreAB和UreABC，融合UreA和UreB基因的突变体UreAB能够在70℃保温30min后酶活力保持在90％以上，融合UreAB和UreC基因的突变体UreABC能够在70℃保温30min后酶活力保持在96％以上，为脲酶的工业化应用奠定了基础。
附图说明
图1从左往右分别为UreAB融合表达脲酶、UreABC融合表达脲酶及UreA、UreB、UreC未融合的脲酶WT纯化过程SDS-PAGE电泳图；M，标准分子量蛋白；1，粗酶液；2，硫酸氨沉淀；3，DEAE离子交换层析；4，凝胶过滤层析。
图2为UreAB融合表达脲酶、UreABC融合表达酶、UreAB融合表达酶和未融合UreA、UreB、UreC基因的脲酶WT的最适温度及温度稳定性；A,最适温度曲线，B,温度稳定性曲线。
具体实施方式
材料与方法：
培养基：
GM17肉汤培养基(g·L-1)：植物蛋白胨5，酵母抽提物5，聚蛋白胨5，抗坏血酸0.5，牛肉膏2.5，MgSO4·7H2O 0.01，β-甘油磷酸二钠19，葡萄糖5。
G/L-SGM17B(g·L-1)：GM17肉汤培养基，蔗糖171.15，甘氨酸25。
恢复培养基(g·L-1)：GM17肉汤培养基，MgCl2·6H2O 4.06，CaCl20.22。
发酵培养基(g·L-1)：蛋白胨15，酵母抽提物10，葡萄糖50，MgSO4·7H2O 0.246，MnSO4·H2O 0.0169。
分子生物学操作方法：
质粒提取，参考SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)使用说明书。
DNA片段回收，参考GeneJET Gel Extraction Kit和GeneJET PCR PurificationKit(Thermo)使用说明书。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法，参考Competent Cell Preparation Kit(大连宝生物)使用说明书。
乳酸菌感受态细胞制备及电转化，参考MoBiTec GmbH公司ExpressionSystem for Lactococcus lactis操作手册。
脲酶酶活力测定方法：
1)氯化铵标准曲线的绘制：用超纯水配制0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的NH4+标准溶液。用移液管准确移取1mL NH4+标准梯度液分别置于顺序编号的10mL比色管中。37℃下恒温保温30min，立即用吸1mL终止剂于比色管中，振荡混匀。再依次加入1mL显色剂I和显色剂II，强烈振荡，使之充分混匀，反应20min。超纯水定容至10mL，在625nm下比色测定OD值，以OD值为纵坐标，NH4+梯度为横坐标作图，得到标准曲线。
2)脲酶酶活测定方法：取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和1mL灭活的酶液。然后在两管中分别加入1mL 3％尿素(用20mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液配制)，在37℃恒温水浴箱中反应30min后，在两管各加入1mL终止剂(10％三氯乙酸)，混匀后加入1mL的显色剂I(15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL)和1mL显色剂II(13.125g NaOH和7.5mLNaClO用超纯水定容至250mL)，强烈震荡，继续在37℃恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，625nm处比色，测定OD值，计算酶活(采用氯化铵绘制标准曲线)。
3)脲酶酶活单位定义：在常压，20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及37℃条件下，每分钟降解尿素生成2μmol NH4 +所需要的酶量为一个酶活力单位。
实施例1：UreAB融合文库构建
(1)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZOZ000001.1,GI:194454092-19445409，设计引物。以pNZ8148-ureLR(专利CN201310524588.6中构建，含有完整脲酶基因簇UreLR,由结构基因ABCEFGD组成)为模板，以正向引物A-F及反向引物A-R6,A-R8，A-R10为引物，通过PCR的方法,获得UreA基因片段；以正向引物B-F及反向引物B-R10为引物，获得UreB基因片段。扩增体系及扩增条件均按照PrimerSTAR HSDNAPolymerase(TAKARA)试剂盒说明书进行。PCR产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，回收0.3kb(UreA基因)和1.1kb(UreB基因)的片段，回收方法参照胶回收试剂盒(TAKARA)说明书进行。
(2)以步骤1)所获得的UreA,UreB基因片段为模板，以A-F,B-R为引物通过融合PCR方法获得融合在一起的UreAB片段。扩增体系及扩增条件均按照PrimerSTAR HSDNAPolymerase(TAKARA)试剂盒说明书进行。PCR产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，回收1.4kb的片段，回收方法参照胶回收试剂盒(TAKARA)说明书进行。
表1序列表
实施例2：UreAB融合文库构建
(1)重组表达质粒pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)构建
实施例1所获得的UreAB片段经NcoI及PstI双酶切，胶回收后与经NcoI及PstI双酶切并且胶回收的载体pNZ8148-ureLR于16℃过夜连接，构建重组表达载体pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)。
(2)重组乳酸菌L.lactisNZ9000(pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD))构建
上述步骤1)所获得的重组表达载体pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)，电转化乳酸乳球菌L.lactis NZ9000，30℃培养1天后对长出的菌落进行菌落PCR鉴定，菌落PCR呈阳性的菌株即为重组乳酸菌L.lactis NZ9000(pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD))。由此便得到了UreAB融合后的脲酶突变体文库。
实施例3：UreAB融合文库的筛选及鉴定
1)UreAB融合文库初筛：挑取UreAB融合文库中的菌接种到装有1mL GM17培养基的1.5mL离心管中，过夜培养16h后按照2％的接种量转接到新的1.5mL离心管中，当OD600＝0.4左右加入10ng/mL Nisin和1mmol/LNiCl2，继续培养8h后10000r/min离心2min后收集菌体，用柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)洗涤菌体两次，然后测定其酶活大小，如图1所示。
2)UreAB融合文库摇瓶复筛及测序鉴定
以步骤1)中初筛的脲酶活性较高的菌株进行摇瓶复筛。接种初筛菌株单菌落于含氯霉素的GM17培养基中，培养16h之后按2％的接种量进行转接，50mL的装液量为20mL，当OD600＝0.4左右加入10ng/mLNisin和1mmol/LNiCl2，继续培养8h后收集菌体并测定酶活，相应的测序结果和酶活大小如表2所示。结果显示，编号为10的菌株的酶活较其他融合子菌株是最高的，其氨基酸序列为GGGGGGGS。将编号为10的菌株命名为L.lactisNZ9000(pNZ8ure-UreAB)。
表2重组乳酸菌L.lactisNZ9000(pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD))脲酶酶活力大小及其对应连接肽的氨基酸序列
实施例3：UreABC融合子的构建
步骤1)：根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZOZ000001.1,GI:194454092-19445409，设计引物，引物序列如表1所示。以pNZ8148-ureLR(申请号为201310524588.6，公开日为2014年2月12日的专利中构建，含有完整脲酶基因簇UreLR，由结构基因UreABCEFGD组成)为模板，以正向引物A-F及反向引物A-R6,A-R8，A-R10为引物，通过PCR的方法,获得UreA基因片段；以正向引物B-F及反向引物B-R10为引物，获得UreB基因片段。
步骤2)：以步骤1)所获得的UreA和Ure B基因片段为模板，以A-F,B-R为引物通过融合PCR方法获得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段，序列如SEQ ID NO.4所示。
步骤3)：将步骤2)所获得的AB片段经NcoI及PstI双酶切，胶回收后与经NcoI及PstI双酶切并且胶回收的载体pNZ8148-ureLR于16℃过夜连接，构建重组表达载体pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD),该载体含有AB基因融合后的完整脲酶基因簇AB-CEFGD。
步骤4)：以步骤3)构建的重组表达载体pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)为模板，以正向引物AB-F及反向引物AB-R6,AB-R8，AB-R10为引物，通过PCR的方法,获得UreAB基因片段；以正向引物C-F及反向引物C-R为引物，获得UreC基因片段。扩增体系及扩增条件均按照PrimerSTARHS DNAPolymerase(TAKARA)试剂盒说明书进行。PCR产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，回收方法参照胶回收试剂盒(TAKARA)说明书进行。
步骤5)：以步骤4)所获得的AB及C基因片段为模板，以AB-F,C-R为引物通过融合PCR方法获得UreAB、UreC融合在一起的UreABC片段,其序列如SEQ ID NO.5所示。扩增体系及扩增条件均按照PrimerSTARHS DNAPolymerase(TAKARA)试剂盒说明书进行。PCR产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，回收1.4kb的片段，回收方法参照胶回收试剂盒(TAKARA)说明书进行。
实施例4：UreABC融合文库构建
步骤1)重组表达质粒pNZ8148ureLR(ABC-EFGD)构建
实施例1所获得的UreABC片段经NcoI及PstI双酶切，胶回收后与经NcoI及PstI双酶切并且胶回收的载体pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)于16℃过夜连接，构建重组表达载体pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD)。
步骤2)重组乳酸菌L.lactis NZ9000(pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD))构建
上述步骤1)所获得的重组表达载体pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD)，电转化乳酸乳球菌L.lactis NZ9000，30℃培养1天后对长出的菌落进行菌落PCR鉴定，菌落PCR呈阳性的菌株即为重组乳酸菌L.lactis NZ9000(pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD))。由此便得到了UreABC融合后的脲酶突变体文库。
实施例5：UreABC融合文库的筛选及鉴定
步骤1)UreABC融合文库初步筛选：挑取UreABC融合文库中的菌接种到装有1mLGM17培养基的1.5mL离心管中，过夜培养16h后按照2％的接种量转接到新的1.5mL离心管中，当OD600＝0.4左右加入10ng/mL Nisin和1mmol/L NiCl2，继续培养8h后10000r/min离心2min后收集菌体，用柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)洗涤菌体两次，然后测定其酶活。共挑选了88株菌，仅挑选到一株有脲酶活力的突变株。
步骤2)UreABC融合文库摇瓶复筛及测序鉴定
以步骤1)中初筛的具有脲酶活力的菌株进行摇瓶复筛。接种初筛菌株单菌落于含氯霉素的GM17培养基中，培养16h之后按2％的接种量进行转接，50mL的装液量为20mL，当OD600＝0.4左右加入10ng/L Nisin和1mmol/LNiCl2，继续培养8h后收集菌体并测定酶活，相应的测序结果和酶活大小如表3所示。结果显示，此菌株其氨基酸序列为SGGSSS，并将其命名为L.lactisNZ9000(pNZ8ure-UreABC)。
表3对照菌和重组乳酸菌L.lactis NZ9000(pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD))脲酶酶活及其对应连接肽氨基酸序列
实施例6：UreAB、UreABC融合酶和未融合结构基因的重组酶的纯化
(1)粗酶液的制备
分别挑取L.lactisNZ9000(pNZ8ureLR)、L.lactis NZ9000(pNZ8ure-UreAB)和L.lactis NZ9000(pNZ8ure-UreABC)单菌落接种于含氯霉素的GM17培养基中，30℃静置培养16h之后按2％的接种量进行转接，50mL的装液量为20mL，当OD600＝0.4左右加入10ng·mL-1Nisin和1mmol·L-1NiCl2，继续培养8h后10000r/min离心5min,弃上清，冲洗菌体并重悬于50mM pH4.5的柠檬酸缓冲液中，菌体终浓度为0.1g/ml。将菌体置于冰水浴中进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率70W，工作2s间隔4s，重复工作30min，至菌体溶液变清澈为止。将破碎液于4℃12000rpm离心10min，转移上清液于干净的离心管中低温保存。
(2)乙醇分级沉淀
在冰浴条件下进行乙醇沉淀，利用蠕动泵匀速向上清液中加入预冷的无水乙醇并使用磁力搅拌器对其进行搅拌，当乙醇浓度达到20％(v/v)时，在水浴中放置30min后10000r·min-1离心10min，收集上清和沉淀。继续向上清中加入无水乙醇至终浓度为40％(v/v)，离心后收集上清和沉淀。以此得到终浓度为20％、40％、60％和80％的沉淀，并分别测定各乙醇浓度下的酸性脲酶活性。脲酶主要集中在20％的乙醇沉淀中。将20％乙醇沉淀上下来的蛋白溶解于适量20mmol/LpH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，用透析袋在相同的缓冲溶液中对蛋白样品透析。
(3)离子交换层析
起始缓冲液A：20mmol/LpH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。洗脱缓冲液B：含1mol/LNaCl的20mmol/LpH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。采用HiTrap DEAE HL 5mL阴离子交换柱，先用起始缓冲液平衡柱子，流速为5mL·min-1，上样后用洗脱缓冲液梯度洗脱蛋白，采用梯度20％，40％，60％，80％，100％B液。经酶活力测定，脲酶主要在40％B条件下被洗脱下来。
(4)凝胶过滤层析
Superdex-200prep grade凝胶柱，进样量为0.5mL，柱体积120mL，缓冲液为20mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液，流速0.35mL·min-1。收集出峰处，测定不同出峰处酶活。
纯化过程SDS-PAGE如图1所示。
实施例7：UreAB和UreABC融合酶的最适温度以及温度稳定性
测定最适反应温度时，在20-60℃范围内每隔10℃测定酶对尿素的酶活，缓冲液为柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)。测定结果如图2A所示，未融合结构基因的脲酶WT对尿素的最适温度为70℃,而UreAB和UreABC融合酶对尿素的最适温度为60℃，最适温度的降低，使得该酶在工业化应用时可以在更低的温度下达到更高的降解效果，从而降解工业化应用的成本。
测定温度稳定性时，在20℃-90℃温度范围内每隔10℃使酸性脲酶在相应的温度下保温30min后，冰浴10min后按材料与方法中的酶活测定方法，测定脲酶酶活力。测定结果如图2B所示，脲酶WT在70℃保温30min后，其酶活力保持在80％左右,UreAB融合的脲酶，在相同条件下(70℃保温30min)，其酶活力保持在90％以上，而UreABC融合的酸性脲酶在相同条件下(70℃保温30min)，其酶活力保持在96％以上。UreABC融合的脲酶热稳定性高于WT及UreAB融合的酸性脲酶。温度稳定性的提高，更有利于酶的工业化应用。

Claims (2)

1.一种提高酸性脲酶热稳定性的方法，其特征在于，将酸性脲酶结构基因UreA、UreB融合，插入重组表达载体pNZ8148-ureLR并进行表达，得到的融合片段UreAB替换质粒pNZ8148-ureLR的完整脲酶基因簇UreLR中的原有的UreA和UreB基因，然后进行表达；所述酸性脲酶结构基因通过连接肽进行融合，所述连接肽序列为GGGGGGGS；所述UreA与UreB融合后的基因片段UreAB序列如SEQ ID NO.4所示；
所述酸性脲酶结构基因UreA序列如SEQ ID NO.1所示，结构基因UreB序列如SEQ IDNO.2所示；所述pNZ8148-ureLR的构建方法为将酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZOZ000001.1,GI:194454092-19445409，连接到载体pNZ8148中得到。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)PCR扩增或合成脲酶结构基因UreA基因片段和UreB基因片段；(2)以所获得的UreA和Ure B基因片段为模板，通过融合PCR方法获得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；(3)将所获得的UreAB片段与载体连接，构建重组表达载体；(4)将重组表达载体导入目的菌株进行表达。
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