CN104073481B - 一种耐酸性提高的l-阿拉伯糖异构酶突变体 - Google Patents
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Abstract
一种耐酸性提高的L‑阿拉伯糖异构酶的22位突变体酶，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了由来源于微生物Alicyclobacillus hesperidum的L‑阿拉伯糖异构酶（简称Alhe‑LAI酶）作为亲本，利用基因突变技术，将其22位的亮氨酸Leu替换为缬氨酸Val，获得单突变体酶L22V，其耐酸性得到提高；酶反应的最适pH由原来的7.0降至6.0；在酸性条件下，酶反应的底物D‑半乳糖平衡转化率由10%提高至24%，更适于产物D‑塔格糖的生成，具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明公开一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶，属于酶的基因工程技术领域。
背景技术
D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂。D-塔格糖属于天然稀有糖的一种，在许多食品中都发现少量存在，如高温灭菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶制品等。2000年美国食品与药物管理局（FDA）确定D-塔格糖为普遍公认安全食品（GRAS），并正式批准作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中；随后JECFA（联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂委员会）第57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂；欧盟也于2003年批准D-塔格糖在欧洲上市。
目前，国内对于D-塔格糖生产的研究还处于起步阶段，国外对其研究已较为深入，生产方法主要有两种：化学法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化学法生产的。由于一方面化学法生产存在许多不利因素，如化学污染物多，碱性条件下异构化反应副产物多，分离困难等；另一方面由于消费者消费观念的转变，天然食品的需求日益增长，因此近年来对D-塔格糖生产的研究集中在生物法上。研究发现L-阿拉伯糖异构酶可以催化D-半乳糖转化为D-塔格糖，是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。D-半乳糖与D-塔格糖之间异构反应的平衡受温度影响很大，较高温条件下（60℃以上）更有利于D-塔格糖的生成，因此耐热性的L-阿拉伯糖异构酶将具有更好的应用前景。
目前，已有很多菌属被鉴定具有L-阿拉伯糖异构酶的基因（araA），例如Mycobacterium smegmatis (J Bacteriol, 1978, 133(1):413–414)、Escherichia coli(World J Microbiol Biotechnol, 2003, 19(1):47–51)、B. stearothermophilus US100(Biochim Biophys Acta, 2006, 1760: 191-199)、Lactobacillus sakei 23K(Bioresource Technology 101, 2010, 9171–9177)及Bifidobacterium longum(Bioprocess Biosyst Eng, 2013, 36:489–497)等菌属均具有L-阿拉伯糖异构酶的基因，被鉴定出来具有表达L-阿拉伯糖异构酶的功能。近年来，对于L-阿拉伯糖异构酶的研究热点集中在嗜热及耐酸微生物。因为温度和酸性环境是催化反应的一个重要因素，高温及酸性环境利于D-塔格糖的合成，并减少副产物的生成。因此，为获得更适合的生物催化剂，通过定点突变的方法，对来自嗜热菌的Alhe-LAI酶进行分子改造，进一步提高其耐酸性，以期得到酶学性质更适合工业应用的Alhe-LAI酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶，对D-塔格糖的生产有重要的意义。
本发明的技术方案：一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶L22V，将来源于Alicyclobacillus hesperidum的L-阿拉伯糖异构酶，进行突变所得的单突变体酶；将原来Alhe-LAI酶基因中第22位的亮氨酸Leu替换为缬氨酸Val，命名为L22V。
与野生型酶Alhe-LAI相比，所述Alhe-LAI的突变体酶L22V的耐酸性获得提高，酶反应的最适pH由原来的7.0降低至6.0；在酸性条件下，酶反应的底物D-半乳糖平衡转化率由10%提高至24%。
一种重组表达质粒，其中含有所述的Alhe-LAI的突变体酶L22V基因。
一种表达宿主，其被含有Alhe-LAI的突变体酶L22V基因的重组表达质粒转化。
所述来源于微生物Alicyclobacillus hesperidum的Alhe-LAI基因在GenBank的编号为NZ_AKZN01000011.1，基因全长1497个核苷酸，见序列表中 SEQ ID No：1，编码498个氨基酸，见序列表中 SEQ ID No：2。
所述Alhe-LAI的突变体酶是将其22位氨基酸亮氨酸Leu突变为缬氨酸Val，命名为L22V，见序列表中 SEQ ID No：4。L22V的核苷酸序列见SEQ ID No：3。
本发明还提供Alhe-LAI酶的突变体酶L22V的制备方法，其具体步骤为：
（1）在Alicyclobacillus hesperidum 的Alhe-LAI酶模拟结构的基础上确定突变位点；
（2）设计定点突变的突变引物，以携带Alhe-LAI酶基因的载体为模板进行定点突变构建突变质粒pET-22b(+)-L22V；
（3）将突变质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养；
（4）离心菌体，重悬后超声破碎，阴离子交换柱纯化得到突变体L22V。
本发明的有益效果：本发明提供一种具有较好耐酸性的Alhe-LAI酶的突变体酶L22V，其最适反应pH为6.0，明显低于野生型Alhe-LAI酶的最适反应pH7.0；在酸性条件下，底物的平衡转化率明显提高，较适于D-塔格糖的工业化生产，在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。
附图说明
图1突变体酶L22V与野生型Alhe-LAI相比，酶反应的最适pH由7.0降至6.0，有显著降低。
图2突变体酶L22V与野生型Alhe-LAI相比，在酸性pH条件下酶的稳定性。
图3突变体酶L22V与野生酶Alhe-LAI，突变体酶L22V对底物的转化率明显提高。
具体实施方式
实施例1：Alhe-LAI酶耐酸性突变体制备方法
利用快速PCR定点突变的方法构建pET-22b(+)-L22V突变质粒；
pET-22b(+)-L22V突变质粒的构建：以pET-22b(+)-Alhe-LAI质粒为模板，经PCR1，PCR2及PCR3，引入L22V定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pET-22b(+)-L22V构建成功。
突变引物如下所示：（下划线为突变点）
上游外侧引物：5’-TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3’，
下游外侧引物：5’-TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3’，
正向突变引物：5’-CAGTTTGTGT ACGGGCCGGA GGT-3’，下划线为突变碱基，
反向突变引物：5’-GCCCGTACAC AAACTGACTG C-3’， 下划线为突变碱基，
PCR 1：反应体系的组成：
以带有L-阿拉伯糖异构酶目的基因的克隆载体pMD-araA为模版。
PCR 2：反应体系的组成：
PCR1、PCR2扩增条件为：
94 oC预变性4 min；随后94 oC变性1 min，56 oC退火l min，72 oC延伸1 min，进行35个循环；最后72 oC保温10 min。
PCR1、PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化；
PCR 3反应体系的组成：
PCR3扩增条件为：
94 oC变性1 min，56 oC退火l min，72 oC延伸5 min；然后 94 oC变性1 min，56 oC退火l min，72 oC延伸1 min，进行35个循环；最后72 oC保温10 min。
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ消化后连接至载体pET-22b(+)，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养，后提取突变质粒，将突变质粒转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，突变质粒经测序鉴定为正确的突变。
实施例2：Alicyclobacillus hesperidum的Alhe-LAI的突变体酶的表达纯化方法。
将测序验证后的突变质粒pET-22b(+)-L22V转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑取阳性转化子在LB培养基中37℃、200rpm摇培过夜，后接入LB培养基37℃培养3-4h至OD值为0.6-0.8，降温至30℃，加入IPTG终浓度为0.6mM诱导6h。
发酵液于4℃、10000rpm离心20min，取菌体。加入20 mL 缓冲液（50 mM Tris，200mM NaCl，HCl调节pH至7.5）充分重悬浮菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间1 s，停止时间2s，共计20 min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000 rpm离心30 min，所得即粗酶液。用微孔滤膜过滤，备用。
准备阴离子交换柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子（约3~4倍柱体积），然后用低盐浓度的缓冲液（50 mM Tris，HCl调节pH至7.5）平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时（约需5倍柱体积缓冲液），将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用上述低盐浓度缓冲液冲洗杂蛋白至基线平衡，再用梯度混合器将高盐浓度缓冲液（50 mM Tris，1,000 mM NaCl，HCl调节pH至7.5）与低盐浓度缓冲液混合，进行梯度洗脱。收集各吸收峰的洗脱液，并测定其酶活，获得目的蛋白。纯化后Alhe-LAI的突变体酶L22V达到电泳纯。
实施例3：pH对Alhe-LAI及L22V酶活的影响
Alhe-LAI酶活测定方法：250 μL的 36 g/L D-半乳糖，200 μL稀释酶液，20 μL终浓度为1 mM的Co2+离子，分别以500μL醋酸钠缓冲液(50mM，pH5.0~5.5)，磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.0~7.0 )，Tris-盐酸缓冲液(50mM，pH 7.5~9.0)进行反应。65 °C保温30 min，冰浴10 min以终止酶反应。
结果突变体酶L22V与野生型Alhe-LAI相比，酶反应的最适pH由7.0降至6.0，有显著降低（如图1），适于工业化生产D-塔格糖的要求，有广泛的应用背景及经济价值。
实施例4： Alhe-LAI及L22V的pH稳定性测定
Alhe-LAI及L22V分别在不同pH的缓冲溶液（同实施例3）中保存12h，测定残余酶活。残余酶活的测定分别在实施例3中所测最适pH条件下进行。
结果显示L22V与野生型Alhe-LAI相比，在酸性pH条件下，酶的稳定性显著提高（如图2）。
实施例5：酸性条件下底物D-半乳糖的平衡转化率测定
在pH 6.0磷酸盐缓冲液中，分别加入适当稀释的Alhe-LAI及L22V酶液，反应温度为65℃，在36g/L的D-半乳糖浓度下进行反应，结果显示，在pH6.0条件下，反应达平衡后，相比于野生酶Alhe-LAI，突变体酶L22V对底物的转化率明显提高，由原来的10%提高至24%，见图3。
<160> 4
<210> SEQ ID NO：1
<211> 1494
<212> DNA
<213>Alicyclobacillus hesperidum的Alhe-LAI酶核苷酸序列
<400> 1
atggaggatg caaacatgca tttgaagtct tatgagtttt ggttcgctgt aggcagtcag 60
tttctctacg ggccggaggt cgtggaagaa gtcgaacgac atgctcgcga ggtcgcgcag 120
acgcttaccc aagtcgtcca gccggctcat gctattacct ttaaggccgt gctcaaagac 180
tcggaggaaa ttcggcgctt ttgtctggag gccaatgcgg acgatcgctg tgcgggggta 240
atcgtctgga tgcatacgtt ctctccggca aagatgtgga ttcatggttt gtcggtgcta 300
cacaaaccca tgttgcacct gcatacgcag tttaatcgcg acattccgtg ggacagcatc 360
gacatggatt ttatgaacct gaatcagtct gcgcatggcg atcgcgagtt tggtttcatg 420
gtcagccgca tgaacattgc gcgcaaagtc gtggttggcc actggcagaa cgaagctgtg 480
caggcgcgta ttcgcgattg ggcgcagacg gcggcggcct ttgcggagag caggcagatc 540
cgcgtcgctc gctttggtga taacatgcga caggtggccg tcaccgaggg agataaggtg 600
gaggcggagc tgcaactggg ctggtcggtc aacggctatg gtgttggcga tcttgtcgaa 660
cgcgttcagg ctatctctga gcaacaggtc gatcaattga tggacgagta tgagacgttg 720
tacgacttcg atccggcggc gcgatcggaa ggggcactgc gcgatgcggt tcgcgagcag 780
gcgcgtatcg aactagggtt gcgtgccttt ctggaagagg gcggatttca tgcattcacg 840
acaacctttg aagatttgca tgggttgcgg caattgcctg gtttggctgt acagcgcttg 900
atggcagacg gctatgggtt cggtggcgaa ggagattgga agacggcggc actcgtccgc 960
ttgatgaagg ttatggcgcg cggcgaaggc acgtccttca tggaggatta cacctaccac 1020
ttcgaaccgg ggaatgaatt ggtgctcggt gcacacatgt tggaagtttg tccgacgatt 1080
gcagcgacgc gcccacgtat cgaggttcac cccctgtcga ttggtggtaa ggaagatccg 1140
gcacgccttg tgttcgacgg ggcgagtggc cgcgccgtgc aggcgaccct cgtcgatctc 1200
gggcatcgtt tccgccttgt ggtcaacgaa gtggatgcgg tacaacccga tagggacatg 1260
cccaaattgc cagttgcacg cgtattgtgg cgaccgttgc cttcgctatc cacagctgcg 1320
gagagttgga ttttggctgg gggcgcgcac cacacttgtt tttcgtatcg cgtgcacgtc 1380
gagcaacttc gggattttgc gcaaatggca ggcgtggaat gcatcgtgat cgaccagacg 1440
acgaatccgg tctctattca aaatgagctg cgctggaatg aagtgtgtta tcgg 1494
<210> SEQ ID NO：2
<211> 498
<212> PRT
<213>Alicyclobacillus hesperidum的Alhe-LAI酶氨基酸序列
<400> 2
Met Glu Asp Ala Asn Met His Leu Lys Ser Tyr Glu Phe Trp Phe
5 10 15
Ala Val Gly Ser Gln Phe Leu Tyr Gly Pro Glu Val Val Glu Glu
20 25 30
Val Glu Arg His Ala Arg Glu Val Ala Gln Thr Leu Thr Gln Val
35 40 45
Val Gln Pro Ala His Ala Ile Thr Phe Lys Ala Val Leu Arg Asp
50 55 60
Ser Glu Glu Ile Arg Arg Phe Cys Leu Glu Ala Asn Ala Asp Asp
65 70 75
Arg Cys Ala Gly Val Ile Val Trp Met His Thr Phe Ser Pro Ala
80 85 90
Lys Met Trp Ile His Gly Leu Ser Val Leu His Lys Pro Met Leu
95 100 105
His Leu His Thr Gln Phe Asn Arg Asp Ile Pro Trp Asp Ser Ile
110 115 120
Asp Met Asp Phe Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His Gly Asp Arg
125 130 135
Glu Phe Gly Phe Met Val Ser Arg Met Asn Ile Ala Arg Lys Val
140 145 150
Val Val Gly His Trp Gln Asn Glu Ala Val Gln Ala Arg Ile Arg
155 160 165
Asp Trp Ala Gln Thr Ala Ala Ala Phe Ala Glu Ser Arg Gln Ile
170 175 180
Arg Val Ala Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Gln Val Ala Val Thr
185 190 195
Glu Gly Asp Lys Val Glu Ala Glu Leu Gln Leu Gly Trp Ser Val
200 205 210
Asn Gly Tyr Gly Val Gly Asp Leu Val Glu Arg Val Gln Ala Ile
215 220 225
Ser Glu Gln Gln Val Asp Gln Leu Met Asp Glu Tyr Glu Thr Leu
230 235 240
Tyr Asp Phe Asp Pro Ala Ala Arg Ser Glu Gly Ala Leu Arg Asp
245 250 255
Ala Val Arg Glu Gln Ala Arg Ile Glu Leu Gly Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Glu Gly Gly Phe His Ala Phe Thr Thr Thr Phe Glu Asp
275 280 285
Leu His Gly Leu Arg Gln Leu Pro Gly Leu Ala Val Gln Arg Leu
290 295 300
Met Ala Asp Gly Tyr Gly Phe Gly Gly Glu Gly Asp Trp Lys Thr
305 310 315
Ala Ala Leu Val Arg Leu Met Lys Val Met Ala Arg Gly Glu Gly
320 325 330
Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His Phe Glu Pro Gly Asn
335 340 345
Glu Leu Val Leu Gly Ala His Met Leu Glu Val Cys Pro Thr Ile
350 355 360
Ala Ala Thr Arg Pro Arg Ile Glu Val His Pro Leu Ser Ile Gly
365 370 375
Gly Lys Glu Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly Ala Ser Gly
380 385 390
Arg Ala Val Gln Ala Thr Leu Val Asp Leu Gly His Arg Phe Arg
395 400 405
Leu Val Val Asn Glu Val Asp Ala Val Gln Pro Asp Arg Asp Met
410 415 420
Pro Lys Leu Pro Val Ala Arg Val Leu Trp Arg Pro Leu Pro Ser
425 430 435
Leu Ser Thr Ala Ala Glu Ser Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ala His
440 445 450
His Thr Cys Phe Ser Tyr Arg Val His Val Glu Gln Leu Arg Asp
455 460 465
Phe Ala Gln Met Ala Gly Val Glu Cys Ile Val Ile Asp Gln Thr
470 475 480
Thr Asn Pro Val Ser Ile Gln Asn Glu Leu Arg Trp Asn Glu Val
485 490 495
Cys Tyr Arg
498
<210> SEQ ID NO：3
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<213>Alicyclobacillus hesperidum的Alhe-LAI的突变体酶L22V的核苷酸序列
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Leu Ser Thr Ala Ala Glu Ser Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ala His
440 445 450
His Thr Cys Phe Ser Tyr Arg Val His Val Glu Gln Leu Arg Asp
455 460 465
Phe Ala Gln Met Ala Gly Val Glu Cys Ile Val Ile Asp Gln Thr
470 475 480
Thr Asn Pro Val Ser Ile Gln Asn Glu Leu Arg Trp Asn Glu Val
485 490 495
Cys Tyr Arg
498
Claims (3)
1.一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶L22V，其特征在于将来源于Alicyclobacillus hesperidum的L-阿拉伯糖异构酶进行突变所得的单突变体酶；将原来Alhe-LAI酶第22位的亮氨酸Leu替换为缬氨酸Val，命名为L22V，其氨基酸序列如SEQ IDNo：4所示。
2.一种重组表达质粒，其特征在于其中含有权利要求1所述Alhe-LAI的突变体酶L22A的编码基因。
3.一种表达宿主，其特征在于其被权利要求2所述的重组表达质粒转化。
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| D-塔格糖与L－阿拉伯糖异构酶的研究进展;沐万孟 等;《食品与发酵工程》;20070630;第33卷(第6期);84-90 * |
| Thermoanaerobacter mathranii 来源的L-阿拉伯糖异构酶（TaMAI）及其转化D-塔格糖的研究;梁敏;《中国优秀硕士论文全文数据库 工程科技I辑》;20130215(第2期);全文 * |
| 基于同源建模和定点突变技术研究嗜热型 L-阿拉伯糖异构酶与 D-半乳糖的亲和作用;李贵祥 等;《催化学报》;20121031;第33卷(第10期);1717-1723 * |
| 解纤维热酸菌L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达、性质研究及分子改造;程丽芳 等;《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20110615(第6期);全文 * |
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