CN105524904B - 一种耐热的重组木聚糖酶及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明还公开了表达重组木聚糖酶的工程菌及其制备方法。本发明用基因工程的方法制备得到具有热稳定性和pH稳定性好，而且酶活也非常高的重组木聚糖酶，作为饲料添加剂时能更好的发挥作用，在造纸时也能有效保持酶活，工业应用前景良好。

Description

一种耐热的重组木聚糖酶及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组木聚糖酶及其制备方法和用途。
背景技术
木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。在木聚糖水解酶系中，β-1,4-内切木聚糖酶是最关键的水解酶，它通过水解木聚糖分子的β-1,4-糖苷键，将木聚糖水解为小寡糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。
随着社会的发展，木聚糖酶得到了广泛的工业应用，同时也对木聚糖酶的稳定性(耐热、耐酸碱)有了更高的要求。在饲料工业中，木聚糖在饲料中的添加能够显著提高饲料的消化性，也有利于非常规饲料代替常规粮食饲料，能够有效避免人畜争粮。而作为一种饲料添加剂时，木聚糖酶需要在较广泛的pH范围内有较好的耐受能力，以适应动物消化道内变化的pH环境。其次在饲料的混合制粒过程中会产生大量热量，这也要求木聚糖酶有较好的耐热能力。同时在造纸行业木聚糖酶的使用可以提高漂白率以及降低漂白成本。但纸张漂白时的碱性环境，则需要耐碱性木聚糖酶的开发。
随着生物技术的发展，人们可以通过蛋白质化学修饰，功能基团修饰、稳定剂、包被剂等方式来间接提高木聚糖酶在生产应用时的稳定性。但能从根本上提高蛋白质工业性能需要从蛋白质分子自身结构出发，对蛋白质的结构进行改造。目前解决木聚糖酶稳定性的手段，主要集中在三个方向。一、利用易错PCR筛选方法获得木聚糖酶突变基因。二、通过定点突变技术，理性改造木聚糖酶基因。三、将两种木聚糖酶进行嵌合设计。
目前的研究发现了众多能分泌木聚糖酶的微生物，以曲霉属及木霉属的丝状真菌为主。基于木聚糖酶的结构，木聚糖酶主要可以被分成GH10和GH11两个家族。GH10家族的木聚糖酶一般结构较复杂，分子量较大，不利于工业生产，结构稳定性的研究也不如GH11族木聚糖深入。当前已有众多的研究证实GH11族木聚糖酶的N端对蛋白质的稳定有重要的意义。α螺旋区的稳定性也直接关系到蛋白质分子的稳定性，而分子表面的电荷分布则关系到蛋白质分子的pH耐受范围。总结已有研究表明引入二硫键对于增强蛋白质分子的稳定性是相对有效的方法，但二硫键的引入常常容易改变蛋白质的构象，从而使改造后的酶分子活性大大降低甚至消失，并且含二硫键的蛋白质不易表达，表达量低。因此，制备得到稳定且酶活高的木聚糖酶并非易事。
发明内容
本发明的目的是提供了一种热稳定性和pH稳定性良好的重组木聚糖酶。
本发明首先提供了一种重组木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
本发明还提供了SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组载体，它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
优选地，所述重组载体是重组pET32a。
本发明还提供了一种重组菌，它包括前述的重组载体.
优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌。
本发明还提供了一种制备前述重组木聚糖酶的方法，它包括如下步骤：
(1)菌体生长：将前述的重组菌接种到大肠杆菌培养基中培养至OD600＝1.0；
(2)诱导表达：取菌液，加入到大肠杆菌培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.5，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃，250rpm培养10h；
(3)离心，收集菌体，菌体破碎，纯化，即可。
步骤(3)中，纯化的方法是用镍柱纯化。
本发明还提供了所述重组木聚糖酶在制备饲料添加剂中的用途。
本发明用基因工程的方法制备得到具有热稳定性和pH稳定性好，而且酶活也非常高的重组木聚糖酶，作为饲料添加剂时能更好的发挥作用，在造纸时也能有效保持酶活，而且本发明方法的表达量高，工业应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1SDS-PAGE结果图，泳道1：未经DDT处理的Xyn2；泳道2：2mM DDT处理的Xyn2；泳道3：10mM DDT处理的Xyn2；泳道M：Mark；泳道4：未经DDT处理的Xyn2-14-52；泳道5：2mM DDT处理的Xyn2-14-52；泳道6：10mM DDT处理的Xyn2-14-52；
图2热稳定性结果图；
图3热稳定性结果图；
图4pH热稳定性结果图。
具体实施方式
实施例1制备含有目标基因片段的工程菌
将里氏木霉无菌孢子转接入诱导培养基中：0.3g Xylan from Oat spelts,0.4gKH2PO4,1.0g(NH4)2HPO4,1.0g Tryptone0.3g Yeast Extract。30℃，250rpm震荡培养7h。
提取里氏木霉总RNA：
取上述培养基离心收集菌丝，用液氮研磨成粉状。Trizol法提取里氏木霉总RNA。
合成cDNA:
取上述总RNA为模板，用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。
以上述所得cDNA为模板，用一对带有EcoRⅠ和NotⅠ的引物，酶切位点以下划线标注。
引物序列如下：
Up:5-GCTGAATTCCAGACGATTCAGCCCGGCA-3
Down:5-ATGCGGCCGCTTAGCTGACGGTGATGGAA-3
里氏木霉木聚糖酶基因(Xyn2)PCR扩增反应体系如下：
PCR 反应体系
反应程序如下
PCR 反应条件
取5μl，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小与预期一致。
PCR产物经TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit纯化，经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后，与同样双酶切的载体pET32a连接，得重组载体，命名为Xyn2。
连接体系及条件如下：
连接反应体系
突变基因的构建
以上述重组的载体为模板，分别用两对突变引物将14位的苯丙氨酸(F)和52位的谷氨酰胺(Q)替换成半胱氨酸(C)，得到本发明突变重组载体Xyn2-14-52。突变位点用下划线标注。实验步骤参照Trans Fast Mutagenesis System Kit。
引物序列如下：
V59C
MF1：5-CTGCCCGAGAAGTTGATGCACTTGTTCTTGGTGCCGG-3
MR2:5-TGCATCAACTTCTCGGGCAGCTACAACCCCAACGG-3
V59C
MF3：5-CTGCCCGAGAAGTTGATGCACTTGTTCTTGGTGCCGG-3
MR3:5-TGCATCAACTTCTCGGGCAGCTACAACCCCAACGG-3
上述重组载体Xyn2、突变的重组载体Xyn2-14-52送至上海生工测序鉴定显示Xyn2序列与数据库一致，Xyn2-14-52序列与预期突变序列相符。
本发明突变重组载体Xyn2-14-52中重组木聚糖酶对应的基因片段的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为：
CAGACGATTCAGCCCGGCACGGGCTACAACAACGGCTACTGCTACTCGTACTGGAACGATGGCCACGGCGGCGTGACGTACACCAATGGTCCCGGCGGGCAGTTCTCCGTCAACTGGTCCAACTCGGGCAACTTTGTCGGCGGCAAGGGATGGTGTCCCGGCACCAAGAACAAGGTCATCAACTTCTCGGGCAGCTACAACCCCAACGGCAACAGCTACCTCTCCGTGTACGGCTGGTCCCGCAACCCCCTGATCGAGTACTACATCGTCGAGAACTTTGGCACCTACAACCCGTCCACGGGCGCCACCAAGCTGGGCGAGGTCACCTCCGACGGCAGCGTCTACGACATTTACCGCACGCAGCGCGTCAACCAGCCGTCCATCATCGGCACCGCCACCTTTTACCAGTACTGGTCCGTCCGCCGCAACCACCGCTCGAGCGGCTCCGTCAACACGGCGAACCACTTCAACGCGTGGGCTCAGCAAGGCCTGACGCTCGGGACGATGGATTACCAGATTGTTGCCGTGGAGGGTTACTTTAGCTCTGGCTCTGCTTCCATCACCGTCAGCTAA。
本发明重组载体Xyn2-14-52也可以采用如下方式制备：按照SEQ ID NO.1所示序列合成基因片段，在两端添加EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点，经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后，与同样双酶切的载体pET32a连接，即可。
实施例2本发明重组木聚糖酶的表达纯化
1、重组蛋白的制备
本发明重组木聚糖酶Xyn2-14-52的制备：
(1)表达
取实施例1得到的突变重组载体载体Xyn2-14-52，转入Origami B(DE3)，并涂布与含有100mg/ml Amp的LB平板上37℃培养过夜。
挑取单克隆，接种于10ml含100mg/ml Amp的液体LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝1.0。取1ml菌液转接至50ml含100mg/ml Amp的液体LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.5，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃，250rpm培养10h。10000g离心1min收集菌体，取10ml PBS重悬细胞，超声波破碎细胞，10000g离心10min收集上清，即为粗酶液。
表达条件的优化
使用单因素分析法对表达温度，IPTG浓度，以及时间依次进行优化。超声波破碎分别收集可溶目的蛋白以及包涵体目的蛋白(沉淀)。结果显示在25℃的条件下，使用终浓度为0.8nmol/L的IPTG，诱导10h后获得可溶蛋白含量最高。
(2)纯化：
粗纯化：将诱导表达后的菌液于4℃、1000g离心1min收集菌体。用1/10菌液体积pH＝7.0的磷酸缓冲液(PBS)洗涤并重悬菌体。使用浓度为0.1nM的溶菌酶(Lysozyme)于4℃破碎细胞12h后，于4℃、1000g离心10min，收集上清液。用10KD的超滤管浓缩粗酶液，并除去大小约为10KD的溶菌酶(Lysozyme)。获得的液体无需进一步处理即可获得纯度>90％的目的蛋白。
进一步纯化：为了进一步获得蛋白质纯品，采用载体上的组氨酸标签进一步纯化目的蛋白。具体是：将粗酶液过45μm滤膜除去大颗粒物质；过滤后的粗酶液加入经平衡缓冲液(平衡缓冲液为含有浓度为20mM咪唑的pH 7.4的磷酸缓冲液)平衡好的镍柱(镍柱购自北京康为世纪生物科技有限公司，型号为CW0894)，后加入10倍体积的平衡缓冲液除去不含组氨酸标签的非目的蛋白；最后用含有浓度为500mM咪唑的pH 7.4的磷酸缓冲液(PBS)洗脱并收集，即得纯品的本发明重组木聚糖酶Xyn2-14-52。
原酶Xyn2-14-52的制备方法同重组木聚糖酶Xyn2-14-52的制备方法，即将实施例1制备的重组载体Xyn2转入Origami B(DE3)中，按照最佳表达条件表达，然后纯化。
2、检测
取粗纯化产品，用SDS-PAGE鉴定。
以牛血清为标准品，采用碧云天BCA试剂盒测定纯化后的目的蛋白。如图所示。
木聚糖酶酶活力测定：将40μl稀释到适宜浓度的木聚糖酶加入至360μl,pH＝6.0的1％(w/v)Beech-wood xylan与50℃孵育10min。加入600μl DNS终止反应，在沸水浴中煮沸10min，待冷却至室温后加入1ml去离子水，测定溶液595nm处的吸光度。空白对照用PBS代替酶液。以D-木糖制作标准曲线。酶活力单位定义：木聚糖酶每分钟从1％(w/v)木聚糖底物中水解生成1μmol还原糖的量为一个酶活力单位(U)。
2、检测结果
如图1所示，蛋白质SDS-PAGE电泳显示，蛋白质大小略大于35KD的标准蛋白，与预期大小37KD相符，是目的蛋白质。经软件分析目的蛋白占总蛋白含量91％；蛋白质中二硫键的存在能改变蛋白质在SDS-PAGE中的迁移速率，不含二硫键的蛋白质能结合更多的SDS所以其迁移速率慢于含有二硫键的蛋白质。通过不同浓度的还原剂DDT可以不同程度的打开蛋白质内部的二硫键，实验显示经2mM DDT处理Xyn2-14-52后显示出迁移速率不同的两条带，而未经DDT和经10mM DDT处理的Xyn2-14-52分辨展示出较快和较慢的迁移速率，表明本发明重组蛋白Xyn2-14-52的二硫键正确形成。由于原酶Xyn2不含二硫键，所以还原剂DDT处理对其在SDS-PAGE中的迁移速率没有影响，呈现3条迁移速率一致的条带。此结果显示，本发明成功获得了目标蛋白Xyn2-14-52。
实验结果说明，本发明获得了重组木聚糖酶Xyn2-14-52，其分子量为37KD，可以有效降解木聚糖，酶活佳，且氨基酸序列(SEQ ID NO.2所示)为：
QTIQPGTGYNNGYCYSYWNDGHGGVTYTNGPGGQFSVNWSNSGNFVGGKGWCPGTKNKCINFSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPLIEYYIVENFGTYNPSTGATKLGEVTSDGSVYDIYRTQRVNQPSIIGTATFYQYWSVRRNHRSSGCVNTANHFNAWAQQGLTLGTMDYQIVAVEGYFSSGSASITVS
以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：
实验例1本发明重组木聚糖酶的酶活稳定性
本发明突变酶Xyn2-14-52：按照实施例2的方法制备；
原酶Xyn2：按照实施例2的方法制备。
木聚糖酶酶活力测定：将40μl稀释到适宜浓度的木聚糖酶加入至360μl,pH＝6.0的1％(w/v)Beech-wood xylan与50℃孵育10min。加入600μl DNS终止反应，在沸水浴中煮沸10min，待冷却至室温后加入1ml去离子水，测定溶液595nm处的吸光度。空白对照用PBS代替酶液。以D-木糖制作标准曲线。酶活力单位定义：木聚糖酶每分钟从1％(w/v)木聚糖底物中水解生成1μmol还原糖的量为一个酶活力单位(U)
1、热稳定性
将两种酶分别于不同的温度(60-75℃)下孵育10min，于冰上冷却后在标准体系下测定其残留酶活力。以不做预处理的酶作对照(100％酶活)。
结果如图2所示，在60-75℃条件下孵育10min后，原酶Xyn2仅保留了0-20％的酶活力，而本发明突变酶Xyn2-14-52则保留了18-32％的酶活力，稳定性显著提高，其中，在65℃孵育10min后，原酶Xyn2几乎没有残余酶活力(约4.5％)，而本发明突变酶Xyn2-14-52则保留了32％的酶活力，在75℃条件下孵育10min后，原酶Xyn2没有残余酶活力，而本发明突变酶Xyn2-14-52残余了23％的酶活力。
将两种酶分别于60℃下孵育10-30min，于冰上冷却后在标准体系下测定其残留酶活力。以不做预处理的酶作对照(100％酶活)。
结果如图3显示，在60℃下孵育10-30min后，原酶Xyn2仅保留了0-20％的酶活力，而本发明突变酶Xyn2-14-52则保留了10-30％的酶活力，其中，在60℃孵育15min后，原酶Xyn2就几乎残余酶活力，而本发明突变酶Xyn2-14-52保留了20％的酶活力，且本发明突变酶Xyn2-14-52在处理30min后还仍然保留了10％的酶活力。
2、pH稳定性
将木聚糖酶于60℃，pH 2.0-10.0的缓冲液中孵育10分钟。在标准体系下测定其残留酶活力(与最适pH(pH 6.0)相比)。
结果如图4所示，在pH为2-4以及pH为6-10条件下，本发明突变酶Xyn2-14-52酸性条件下的稳定性均明显优于原酶，如，在pH 2.060℃的缓冲液中孵育10min后，原酶Xyn2则保留16％的酶活力，而本发明突变酶Xyn2-14-52则残留67％的酶活力。
实验结果说明，与原酶相比，采用本发明工程菌发酵得到的重组的木聚糖酶Xyn2-14-52，其热稳定性和pH稳定性均大大提高。
本发明用基因工程的方法制备得到具有热稳定性和pH稳定性好，而且酶活也非常高的重组木聚糖酶，作为饲料添加剂时能更好的发挥作用，在造纸时也能有效保持酶活，工业应用前景良好。

Claims (10)

1.一种重组木聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的重组木聚糖酶，其特征在于：编码所述重组木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.一种重组载体，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是带有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组pET32a。
6.一种重组菌，其特征在于：它包括权利要求4或5所述的重组载体.
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组大肠杆菌。
8.一种制备权利要求1所述重组木聚糖酶的方法，它包括如下步骤：
(1)菌体生长：将权利要求6或7所述的重组菌接种到大肠杆菌培养基中培养至OD600＝1.0；
(2)诱导表达：取菌液，加入到大肠杆菌培养基中，37℃、250rpm条件下培养至OD600＝0.5，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃、250rpm条件下培养10h；
(3)离心，收集菌体，菌体破碎，纯化，即可。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述纯化的方法是镍柱纯化。
10.权利要求1或2所述重组木聚糖酶在制备饲料添加剂中的用途。
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