CN109415749A - 在木霉属中生产发酵产物的方法 - Google Patents

在木霉属中生产发酵产物的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了使用蔗糖作为碳源使包含异源转化酶基因的重组里氏木霉发酵的方法。

Description

在木霉属中生产发酵产物的方法
序列表的引用
本申请含有计算机可读取形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及在包含蔗糖的发酵培养基中在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞中生产发酵产物的方法。发酵产物可以是蛋白质产物，例如酶产物。
背景技术
里氏木霉是一种众所周知的丝状真菌，其近年来经常用于发酵过程，例如用于生产蛋白质产物的发酵过程，特别是用于生产酶的发酵过程。
已知里氏木霉产生许多种纤维素酶和半纤维素酶，并且这种生物经常用于生产包括纤维素酶和/或半纤维素酶的酶产物。然而，里氏木霉的用途不限于生产纤维素酶和半纤维素酶，还包括生产其他酶产物。
蔗糖典型地用作许多微生物发酵过程的碳源，这些发酵过程包括细菌(例如芽孢杆菌属(Bacillus)物种)和丝状真菌(例如曲霉属(Aspergillus)物种)中的蛋白质生产。然而，里氏木霉菌株不能有效地利用蔗糖作为碳源。
蔗糖具有有益的高水溶性，这意味着它可以有利地用作分批补料发酵中的高浓缩的进料，因为该碳源以适当的量递送而不会使发酵液稀释太多。
另外，糖蜜(一种糖产生的副产物)含有大量的蔗糖并且因此可以用作发酵过程的相对便宜的碳源，特别是在接近于炼糖厂的地方。
Dernt等人,2013,Biotechnology for Biofuels[用于生物燃料的生物技术]6:62公开了木聚糖酶调节因子1(xyr1)的突变，该突变导致在里氏木霉中的葡萄糖盲(glucoseblind)水解酶表达表型，即该菌株不能感测到影响基因表达的葡萄糖的存在。该突变被鉴定为在xyr1的位置824处的丙氨酸被缬氨酸取代。
希望使用蔗糖作为里氏木霉发酵的碳源以从这种方便的营养素中受益。
发明内容
本发明提供了一种生产发酵产物的方法，该方法包括使重组里氏木霉细胞在包含蔗糖的培养基中发酵。
定义
异源多肽：术语“异源多肽”意指不是由里氏木霉天然产生的多肽。异源多肽可以衍生自不同的生物体或者它可以是变体，即包含取代、插入或缺失的与天然存在的多肽不同的多肽。术语“异源多肽”包括融合蛋白、嵌合蛋白和变体。
转化酶：术语“转化酶”意指具有转化酶活性的多肽。转化酶(EC 3.2.1.26)催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。转化酶的系统名称是β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶，但该酶也称作其他名称，例如β-呋喃果糖苷酶、蔗糖酶(saccharase)、蔗糖酶(sucrase)和β-果糖苷酶。根据糖苷水解酶分类，在糖苷水解酶家族32(GH-32)中发现转化酶(Henrissat,1991,Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316和cazy.org)。转化酶基因的实例是编码来自黑曲霉(Aspergillus niger)的胞外转化酶的基因，该基因具有SEQ ID NO:1的成熟蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，SEQ ID NO:1的成熟蛋白质是SEQ ID NO:1的氨基酸54至589。
天然多肽：术语“天然多肽”意指由里氏木霉天然产生的多肽。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下配置：控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，这样使得所述控制序列引导所述编码序列的表达。
蛋白质产物：术语“蛋白质产物”意指通过发酵制备并包含一种或多种目的多肽的产物。蛋白质产物可以是包含若干种不同目的多肽的产物，例如，用于降解纤维素的蛋白质产物可以包含至少一种内切葡聚糖酶、至少一种纤维二糖水解酶和至少一种β-葡糖苷酶。除了一种或多种目的多肽外，蛋白质产物还可包含另外的多肽、衍生自发酵液的其他组分以及在产物回收和配制中添加的组分。
重组体：术语“重组体”意指其中已经引入了编码一种或多种多肽的一种或多种基因的里氏木霉细胞。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性由参数“序列同一性”描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且计算如下：
(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且计算如下：
(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
附图说明
图1示出了在实例6中描述的实验中由里氏木霉细胞产生的相对蛋白质浓度作为发酵时间的函数。
具体实施方式
本发明涉及生产发酵产物的方法，这些方法包括使重组里氏木霉细胞在产生异源转化酶和发酵产物的条件下、在包含蔗糖的发酵培养基中发酵，其中该重组里氏木霉细胞包含一种或多种编码异源转化酶的基因。
本发明还涉及生产发酵产物的方法，这些方法包括使里氏木霉细胞在生产发酵产物的条件下和在形成槐糖的条件下、在包含蔗糖和β-葡糖苷酶的发酵培养基中发酵。
里氏木霉细胞
里氏木霉是具有分泌大量纤维素分解酶的能力的嗜常温丝状真菌，并且出于这样的目的，它已经在发酵工业中使用了许多年。它是子囊菌纲(ascomecetes)红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型，并且在本说明书和权利要求中，所有的红褐肉座菌和里氏木霉的菌株都被认为是里氏木霉菌株，无论事实是从严格分类学角度来看一些菌株应被认为是红褐肉座菌菌株。
根据本发明可以使用里氏木霉的任何菌株，然而，优选使用产生大量的胞外酶的里氏木霉菌株，例如基于QM6a、QM9414和RutC30的菌株。这些菌株和衍生自这些菌株的多种菌株都在本领域中进行了描述。
在一些实施例中，里氏木霉菌株具有降低的分解代谢物阻遏系统。这种菌株具有以下益处：与野生型菌株相比，在葡萄糖存在下阻遏野生型菌株的启动子将在具有降低的分解代谢物阻遏系统的菌株中受到较少的阻遏。真菌分解代谢物阻遏系统是本领域已知的，并且在如下领域普通从业者的技能范围内，该领域鉴定导致降低的分解代谢物阻遏的合适的突变并选择合适的里氏木霉菌株用于本发明的目的。导致降低的分解代谢物阻遏的一个突变是creI基因的突变(Strauss等人,1995,FEBS Letters[欧洲生物化学学会联盟通讯]376:103-107)。具有creI突变的里氏木霉菌株的一个实例是里氏木霉RutC30，其也已在文献中被广泛描述，并且该菌株或衍生自该菌株的菌株也适用于根据本发明的用途。
在一些实施例中，里氏木霉包含木聚糖酶调节因子1(xyr1)中的突变，该突变导致葡萄糖盲表型，例如在位置824处丙氨酸被缬氨酸取代(A824V)(Derntl等人,2013,Biotechnology for Biofuels[用于生物燃料的生物技术]6:62，通过引用结合)。xyr1中的A824V突变造成内切木聚糖酶的表达强烈失调和里氏木霉菌株中纤维素酶表达的基础水平高度地升高，并且如果重组里氏木霉菌株用于生产天然纤维素酶和/或半纤维素酶或用于通过使用衍生自纤维素酶或半纤维素酶基因的里氏木霉启动子生产异源蛋白，则该突变是特别有益的。
在其他实施例中，重组里氏木霉细胞包含导致降低的分解代谢物阻遏的突变和xyr1中的导致葡萄糖盲表型的突变，例如包含cre1突变和xyr1中的A824V突变的里氏木霉菌株。
发酵产物
发酵产物可以是蛋白质产物，例如酶。在一些实施例中，发酵产物是一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。特别地，发酵产物是一种或多种纤维素酶(纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、和/或β-葡糖苷酶)和/或一种或多种半纤维素酶(乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、木聚糖酶、和/或木糖苷酶)。
在一些实施例中，蛋白质产物仅包含天然多肽。
在其他实施例中，蛋白质产物包含异源多肽，任选地除天然多肽外。
在一些实施例中，发酵产物是全培养液产物。
转化酶
在一些实施例中，里氏木霉细胞包含一种或多种编码具有转化酶活性的异源多肽的基因。所述一种或多种基因可以是编码具有转化酶活性的异源多肽的任何此类基因。
转化酶基因可以是细菌基因或真菌基因，其中真菌基因是优选的。合适的转化酶基因的实例包括来自黑曲霉、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、乳酸克鲁弗酵母(Kluveromyces lactis)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、多毛青霉(Penicillium hirsutum)、意大利青霉(Penicillium italicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、朱黄踝节菌(Talaromyces minoluteus)和太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)的转化酶基因。
优选的转化酶包括具有SEQ ID NO:1的成熟蛋白的氨基酸序列的转化酶，或与SEQID NO:1具有至少80％序列同一性的转化酶，例如与SEQ ID NO:1的成熟蛋白具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，例如至少98％序列同一性，例如至少99％序列同一性的转化酶。在一个实施例中，SEQ ID NO.1的成熟蛋白是由SEQ ID NO:1的氨基酸54-589组成的多肽。
其他合适的转化酶包括来自棘孢曲霉(SEQ ID NO:4)、多毛青霉(SEQ ID NO:5)、意大利青霉(SEQ ID NO:6)和朱黄踝节菌(SEQ ID NO:7)的转化酶或包括如下任何多肽，该任何多肽具有转化酶活性并与这些序列中的任何一个具有至少60％序列同一性，例如至少70％序列同一性，例如至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，例如至少98％序列同一性，例如至少99％序列同一性。
其他转化酶包括具有SEQ ID NO:1的成熟蛋白的氨基酸序列的转化酶，和与SEQID NO:1的成熟蛋白相差1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变(例如取代、插入或缺失，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守取代)的转化酶。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979在The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中进行了描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
转化酶基因可以是天然基因或非天然基因(即使用重组DNA技术在至少一个位置上已经改变氨基酸和/或核苷酸序列的基因)。
转化酶基因应可操作地连接至启动子、终止子和/或指导该基因在里氏木霉菌株中的表达所必需的其他调节元件。
转化酶基因可以使用其自身的启动子、终止子和/或其他调节元件表达，或者可以使用异源启动子、终止子和/或其他调节元件表达。在这一点上，异源启动子、终止子和/或其他调节元件被理解为本质上未发现可操作地连接至基因的启动子、终止子和/或其他调节元件。
可以使用如本领域已知的转化里氏木霉的方法将转化酶基因插入里氏木霉菌株中。
里氏木霉的转化
里氏木霉菌株可以用编码一种或多种异源转化酶的一种或多种基因和/或编码一种或多种多肽的一种或多种基因进行转化，并分离包含所述一种或多种基因的转化体。可以将编码所述一种或多种多肽的基因的两个或更多个拷贝(例如，两个、三个或四个拷贝)引入里氏木霉菌株中。用于转化里氏木霉的技术是本领域已知的，并且本发明不以任何方式受所选择的转化技术的限制。用于转化木霉属宿主细胞的合适的方法描述于EP 238 023和Yelton等人,1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474中，并且这些参考文献通过引用并入本说明书中。
所述一种或多种基因应可操作地连接至能够在里氏木霉中表达所述基因的启动子、终止子和/或其他调节元件。本发明不限于任何特定的启动子、终止子和/或其他调节元件，但优选使用已知在木霉属中指导高表达水平的启动子、终止子和/或其他调节元件。这在本领域中都是已知的，并且选择根据本发明的用途的合适的启动子、终止子和/或其他调节元件完全在普通从业者的技能范围内。
在一个具体的实施例中，指导一种或多种另外的基因的表达的一种或多种启动子经受分解代谢物阻遏，例如衍生自编码纤维素酶和半纤维素酶的基因的启动子；并且里氏木霉细胞包含导致降低的分解代谢物阻遏的突变，例如creI中的突变。在另外的实施例中，指导一种或多种另外的基因的表达的一种或多种启动子衍生自编码纤维素酶和半纤维素酶的基因，并且里氏木霉细胞进一步包含xyr1突变，该突变使细胞变成葡萄糖盲，例如xyr1的A824V取代。
发酵培养基
发酵培养基包含蔗糖，该蔗糖被水解成葡萄糖和果糖，例如使用具有转化酶活性的多肽或使用pH为1-3(例如pH 2)的酸(例如，乙酸、柠檬酸、盐酸、磷酸或硫酸)。
与不能有效利用蔗糖作为碳源的野生型里氏木霉细胞相反，包含一种或多种编码转化酶的基因的重组里氏木霉细胞在蔗糖上生长良好，并且因此能够在发酵过程中使用蔗糖作为碳源。
蔗糖是通过从某些作物(例如甜菜和甘蔗)中提取而产生的丰富来源。因此，蔗糖在许多国家是容易获得的，作为一种由超过99％的蔗糖组成的纯精炼的产物，或者以糖蜜(甘蔗或甜菜精炼的副产物)的形式获得。另外，蔗糖具有高水溶性的益处，这意味着高度浓缩的蔗糖溶液可以用作分批补料发酵过程中的进料，由此可以向发酵中提供大量可用的碳源，而不会过高稀释具有溶解进料中的碳源所必需的水的发酵液。因此，蔗糖在发酵工业中具有若干优势，并且本发明使这些益处可用于里氏木霉菌株的发酵。
在一些实施例中，发酵培养基包含β-葡糖苷酶。β-葡糖苷酶可以外源添加至发酵培养基中，或者可以由里氏木霉细胞产生。β-葡糖苷酶催化葡萄糖转化为槐糖，槐糖是产生纤维素分解酶和半纤维素分解酶的诱导物。
发酵
本发明不以任何方式限于所进行的发酵过程，但可以应用于任何发酵过程，例如分批发酵、分批补料发酵或连续发酵。本发明甚至可以应用于固态发酵，在固态发酵中蔗糖或含蔗糖材料用于发酵。
里氏木霉细胞是在适合于使用本领域已知的方法产生所述一种或多种多肽的营养培养基中培养的。例如，可通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)来培养细胞，所述培养在包含蔗糖的合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域已知的程序，在合适的营养培养基中进行培养，该营养培养基包含蔗糖和任选地其他碳，并且进一步包含氮源和无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果目的多肽被分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收该多肽。如果多肽不被分泌，那么其可从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的方法回收该发酵产物。例如，可以通过多种常规程序从所述营养培养基中回收该产物，这些常规程序包括但不限于：收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。在一个方面，回收包含该多肽的发酵液。
可通过本领域已知的多种方法纯化蛋白质产物以获得基本上纯的多肽，这些方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)。
在一个替代性方面，没有回收该多肽，而是使表达该多肽的本发明的宿主细胞形成蛋白质产物。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含目的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含用于发酵过程中的另外的成分，例如像细胞、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文所用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。通常，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物。
在一方面，该组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾以及本领域已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在允许蛋白质合成的碳限制条件下孵育里氏木霉细胞使其生长至饱和之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的全培养液或细胞组合物通常是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中描述的方法来产生。
实例
材料与方法
生长培养基：
发酵培养基
种子培养基NNCell1：
SOC培养基
20g/升胰蛋白胨
5g/升酵母提取物
4.8g/升MgSO4
3.603g/升右旋糖
0.5g/升NaCl
0.186g/升KCl
2XYT板
16g/升胰蛋白胨
10g/升酵母提取物
5g/升NaCl
15g/升琼脂
COVE板
342.3g蔗糖
20ml Cove盐溶液
10ml 1M乙酰胺
10ml 1.5M CsCl
25g琼脂(高贵级(Noble))
水至1升
COVE盐溶液
26g KCl
26g MgSO4 7H2O
76g KH2PO4
50ml COVE痕量元素
水至1升
COVE痕量元素
0.04g Nz2B4O7 10H2O
0.4g CuSO4 5H2O
1.2g FeSO4 7H2O
0.7g MnSO4H2O
0.8g Na2MoO2 2H2O
10g ZnSo4 7H2O
水至1升
COVE2板
30g蔗糖
20ml Cove盐溶液
10ml 1M乙酰胺
25g琼脂(高贵级)
水至1升
木霉属最小的板
10ml Cove盐溶液
0.3g CaCl2，2H2O
3g(NH4)2SO4
12.5g琼脂(高贵级)
水至480ml
将混合物在121℃高压灭菌30分钟并冷却至约50℃，并且添加作为50％水溶液的所需量的葡萄糖或蔗糖至终浓度为2％的葡萄糖或蔗糖。
DNA操作
用于DNA操作的酶(例如限制酶)由美国加利福尼亚州山景城科隆达实验室公司(Clontech Laboratories,Inc.Mountain View,CA,USA)提供，并根据制造商的说明书使用。
发酵
实例中使用的发酵罐是标准实验室规模(2升)发酵罐。
如WO 2012/104176的实例1中描述的制备红糖。
分析
根据制造商的说明书，使用PierceTMBCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)目录号23227，由欧洲生命科技公司(Life TechnologiesEurope BV)提供；奈鲁姆(Naerum)，丹麦)测量总蛋白质。
实例1克隆并制备编码黑曲霉suc1基因的质粒
将表达载体pMJ09(WO 2005/067531)用作本实例的表达载体的基础。
使用如下所示的PCR引物，从由黑曲霉ATCC 1015制备的基因组DNA来PCR扩增编码转化酶的黑曲霉suc1基因：
Suc1 F载体flk attacgaattgtttaaacgtgctttacttcactcgtgcatgggg(SEQ ID NO:2)
Suc1 R载体flk aaatggattgattgtctcaccacgtgcacattcatattccgc(SEQ ID NO:3)
加下划线的碱基对应于Suc1的基因序列，而未加下划线的碱基对应于载体序列。
反应混合物
PCR条件：
步骤1 98℃持续30秒
步骤2 98℃持续10秒
步骤3 56℃持续15秒
步骤4 72℃持续160秒
重复步骤2-4进行34个循环，然后将反应混合物保持在10℃。
使用TAE缓冲液将5μl反应混合物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，并且观察到预期大小(3886bp)的片段。
用限制性内切核酸酶AccI消化质粒pMJ09并纯化。将纯化的线性化载体和纯化的PCR扩增的suc1基因进行组装并使用Clontech输注克隆方案插入大肠杆菌(E.coli)中并电转化到Top10电感受态大肠杆菌细胞中(美国加利福尼亚州山景城科隆达实验室公司(Clontech Laboratories,Inc.Mountain View,CA,USA))。
将转化的细胞重悬于1ml的SOC培养基中，并且将20μl和200μl的转化细胞涂布到含有100mg/ml氨苄青霉素的2XYT板上，并在37℃孵育直至第二天出现转化的菌落。
选择八个菌落并使其生长过夜，然后从每种培养物制备质粒DNA。用限制性内切核酸酶AccI消化质粒制剂，其中具有插入到载体中的suc1基因的转化体将产生三个限制性片段(925、2000和6685个碱基对)，而没有插入的载体将产生两个片段(1528和5683个碱基对)。
选择具有正确限制性片段模式的两个转化体。对来自这些转化体的质粒进行测序并且证实一个转化体含有没有任何突变的suc1基因。来自该转化体的质粒被命名为pVCK12TRI001。
实例2用包含黑曲霉suc1基因的pVCK12TRI001转化里氏木霉
用限制性内切核酸酶PmeI将质粒pVCK12TRI001线性化，并基本上如WO 2008/151079的实例6中描述的转化到里氏木霉RutC30菌株中，并将转化涂布到COVE板上。
选择二十一个转化体并转移至COVE2+10mM尿苷的板上并且在28℃孵育22-26天。
将转化体传代培养到新的COVE2板、木霉属最小的板+2％蔗糖和木霉属最小的板+2％葡萄糖上，并在28℃孵育8天。所有转化体在木霉属最小的板+2％蔗糖、木霉属最小的板+2％葡萄糖和COVE2板上都生长良好。未转化的里氏木霉RutC30菌株不在木霉属最小的板+2％蔗糖上生长，但如所预期的在木霉属最小的板+2％葡萄糖上生长。
实例3里氏木霉RutC30菌株在包含蔗糖的发酵培养基中的发酵
三个发酵罐各自装有1.1kg发酵培养基，并且在123℃通过加热一小时进行灭菌。冷却至25℃后，使用H3PO4和/或氢氧化铵将pH调节至5.0。用具有里氏木霉RutC30突变株的预培养物的摇瓶接种发酵罐。
18小时后，将表1中所示的另外的碳源进料至三个发酵罐中。发酵罐维持在约40％的氧饱和水平。发酵运行持续6天。
表1
发酵罐 进料中的碳源
1 红糖
2 52％蔗糖
3 52％蔗糖+红糖(9:1)
测量生物质和CO2生产。蔗糖定量给料产生非常低的CO2生产和生物质形成。当部分蔗糖被红糖替代时，CO2产生和生物质形成增加，但仍低于仅定量给料红糖的情况。
蔗糖定量给料产生非常低的蛋白质和纤维素酶生产。当一部分蔗糖被红糖替代时，实现了更高的蛋白质和纤维素酶生产，但其水平远低于仅使用红糖获得的水平。这些结果显示蔗糖是由里氏木霉产生的纤维素酶的不良碳源。
实例4包含黑曲霉suc1基因的重组里氏木霉(xyr1)的发酵
根据实例2中描述的方法制备具有黑曲霉suc1基因和在木聚糖酶调节因子1(xyr1)基因中导致“葡萄糖盲”表型的A824V取代的重组里氏木霉RutC30突变体。
三个发酵罐如实例3中描述的进行制备并执行，并用重组里氏木霉突变体接种。发酵运行持续8天。18小时后，将如表2中所示的碳源使用1g/小时开始的进料速率进料至三个发酵罐中，进料25小时后增加至10g/小时，并且然后在进料162小时后降至4.5g/小时。由于氧气水平降为0，发酵罐2的进料速率在89小时后降低了80％，并且从96至136小时停止进料，并且发酵罐3的进料速率从89-101小时降低了80％并且然后增加到原始水平的50％。在发酵结束时收集总蛋白质的样品。
表2
发酵罐 进料中的碳源
1 红糖
2 52％蔗糖
3 52％蔗糖+红糖(9:1)
发酵罐2和3的生物质产量非常高(约100g干重/kg培养液)，而在发酵罐1中生物质产量为40g干重/kg培养液。
对于总胞外蛋白而言，发酵罐1较高，发酵罐2较低并且发酵罐3中等。
结果证明，蔗糖是包含suc1基因的重组里氏木霉突变体的非常好的碳源，并且生成高产量的生物质。
为了获得高胞外蛋白生产，需要在进料中包含诱导物(例如红糖)。
实例5使用调节的进料速率发酵包含黑曲霉suc1基因的重组里氏木霉突变体(xyr1)
以较低的进料速率重复实例4的发酵3(52％蔗糖+红糖(9:1))以避免不可接受的低氧水平。使用来自实例4的进料速率的约50％的进料速率，即以1g/小时开始的进料速率，进料25小时后增加至5g/小时，并且然后在进料162小时后降至2.5g/小时。
生物质产量为40g干重/kg培养液，其类似于在实例4的发酵1中获得的生物质产量，并且低于在实例4的发酵2和3中获得的生物质产量。获得的胞外蛋白产量略低于实例4的发酵1中的蛋白质产量，但高于实例4的发酵2和3中的蛋白质产量，尽管添加的进料量降低。
实例6
发酵培养基的制备：
通过将葡萄糖一水合物溶解在自来水中至55％w/w葡萄糖的浓度并通过在121℃高压灭菌60分钟进行灭菌来制备葡萄糖培养基。
通过将蔗糖溶解在自来水中至52％w/w蔗糖的浓度并通过在121℃高压灭菌60分钟进行灭菌来制备蔗糖培养基。
通过将3900g蔗糖和10.5g柠檬酸溶解于5升的自来水中来制备60％w/w BG-蔗糖培养基。将该溶液加热至>95℃持续30分钟(以水解蔗糖)，并且然后冷却至<50℃。使用NaOH将pH调节至4.5，并将溶液分成2.5升的两个部分。将25ml的Novozym 188(来自诺维信公司(Novozymes A/S)的商用β-葡糖苷酶产物)添加至第一部分(表3中的“Novozym 188蔗糖”)。将来自表达β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的重组里氏木霉菌株的发酵的5ml经过滤法灭菌的上清液添加至第二部分(表3中的“里氏木霉上清液蔗糖”)。将各个部分在50℃孵育4天，并通过在121℃高压灭菌60分钟进行灭菌。
发酵实验：
将里氏木霉菌株的孢子接种到含有200ml NNCell-1培养基的500ml摇瓶中，并在26℃在250rpm振荡下孵育2天。将种子培养液转移到包含含有大豆粉、蔗糖和盐的培养基的2升发酵罐中。发酵在28℃，pH 4.5-4.8(使用磷酸和氢氧化铵控制)和0.75-1.5L/分钟的通气下进行。当二氧化碳水平开始下降(表明主培养基中的蔗糖已被消耗)时，使用在“发酵培养基的制备”部分中描述的不同培养基开始进料。在前25小时内，进料速率从1增加至10g/小时，并且然后逐渐降低以维持10％-40％的溶解氧水平，以确保碳源在整个发酵过程中是培养物中的限制性组分。6-7天后终止发酵。使用BCA测定在整个发酵过程中测量胞外蛋白浓度(用作纤维素酶表达的指标)。表3中提供了相对于定量给料葡萄糖的发酵，这些发酵的最大蛋白质浓度，并且作为发酵时间的函数的相对蛋白质浓度显示在图1中。
表3
定量给料 相对最大蛋白质滴度 最大滴度下的发酵时间
Novozym 188蔗糖 184％ 161小时
里氏木霉上清液蔗糖 167％ 161小时
蔗糖 26％ 71小时
葡萄糖 100％ 140小时
图1显示用β-葡糖苷酶处理蔗糖改进了胞外蛋白的发酵产量，比用蔗糖获得的产量高6-7倍，并且比用葡萄糖获得的产量高1.7-1.8倍。这种改进的主要原因是由于被柠檬酸水解和高温，构成蔗糖的单糖(即果糖和葡萄糖)变得可用于里氏木霉，并且通过β-葡糖苷酶的作用形成的葡萄糖的二糖充当酶生产的诱导物。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
Jang, Abigail
Merino, Sandra
Hansen, Kim
Munkvold, Glenn
Ploch, Bogie
<120> 蔗糖作为木霉发酵中的碳源
<130> 14134-WO-PCT
<160> 7
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 628
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 1
Met Lys Leu Gln Thr Ala Ser Val Leu Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Met Gln Thr Arg Ala Ser Val Val Ile Asp Tyr Asn Val
20 25 30
Ala Pro Pro Asn Leu Ser Thr Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Glu Thr
35 40 45
Trp Arg Pro Arg Ala His Val Leu Pro Pro Asn Gly Gln Ile Gly Asp
50 55 60
Pro Cys Leu His Tyr Thr Asp Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Val Gly
65 70 75 80
Phe Leu His Asp Gly Ser Gly Ile Ser Ser Ala Thr Thr Asp Asp Leu
85 90 95
Ala Thr Tyr Lys Asp Leu Asn Gln Gly Asn Gln Val Ile Val Pro Gly
100 105 110
Gly Ile Asn Asp Pro Val Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser
115 120 125
Gly Ile Asn Gly Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu
130 135 140
Pro Ile His Trp Ser Ile Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ala Val Ser Ser Asp Gly Gly Ser Asn Phe Thr Lys Leu Asp Gln
165 170 175
Gly Pro Val Ile Pro Gly Pro Pro Phe Ala Tyr Asn Val Thr Ala Phe
180 185 190
Arg Asp Pro Tyr Val Phe Gln Asn Pro Thr Leu Asp Ser Leu Leu His
195 200 205
Ser Lys Asn Asn Thr Trp Tyr Thr Val Ile Ser Gly Gly Leu His Gly
210 215 220
Lys Gly Pro Ala Gln Phe Leu Tyr Arg Gln Tyr Asp Pro Asp Phe Gln
225 230 235 240
Tyr Trp Glu Phe Leu Gly Gln Trp Trp His Glu Pro Thr Asn Ser Thr
245 250 255
Trp Gly Asn Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Ala Phe Asn Phe Glu Thr
260 265 270
Gly Asn Val Phe Ser Leu Asp Glu Tyr Gly Tyr Asn Pro His Gly Gln
275 280 285
Ile Phe Ser Thr Ile Gly Thr Glu Gly Ser Asp Gln Pro Val Val Pro
290 295 300
Gln Leu Thr Ser Ile His Asp Met Leu Trp Val Ser Gly Asn Val Ser
305 310 315 320
Arg Asn Gly Ser Val Ser Phe Thr Pro Asn Met Ala Gly Phe Leu Asp
325 330 335
Trp Gly Phe Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Val Leu Pro Ser Thr
340 345 350
Ser Leu Pro Ser Thr Lys Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Tyr
355 360 365
Val Trp Leu Ser Gly Asp Leu Phe Glu Gln Ala Glu Gly Phe Pro Thr
370 375 380
Asn Gln Gln Asn Trp Thr Gly Thr Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Arg
385 390 395 400
Val Leu Tyr Ile Pro Asn Val Val Asp Asn Ala Leu Ala Arg Glu Ser
405 410 415
Gly Ala Ser Trp Gln Val Val Ser Ser Asp Ser Ser Ala Gly Thr Val
420 425 430
Glu Leu Gln Thr Leu Gly Ile Ser Ile Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala
435 440 445
Leu Leu Ser Gly Thr Ser Phe Thr Glu Ser Asp Arg Thr Leu Asn Ser
450 455 460
Ser Gly Val Val Pro Phe Lys Arg Ser Pro Ser Glu Lys Phe Phe Val
465 470 475 480
Leu Ser Ala Gln Leu Ser Phe Pro Ala Ser Ala Arg Gly Ser Gly Leu
485 490 495
Lys Ser Gly Phe Gln Ile Leu Ser Ser Glu Leu Glu Ser Thr Thr Val
500 505 510
Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn Glu Ser Ile Ile Val Asp Arg Ser Asn Thr
515 520 525
Ser Ala Ala Ala Arg Thr Thr Asp Gly Ile Asp Ser Ser Ala Glu Ala
530 535 540
Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val Leu Asn Gly Gly Glu Gln Ala Ile
545 550 555 560
Glu Thr Leu Asp Leu Thr Leu Val Val Asp Asn Ser Val Leu Glu Ile
565 570 575
Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu Ser Thr Trp Val Arg Ser Trp Tyr
580 585 590
Ala Asn Ser Thr Asn Ile Ser Phe Phe Gln Asn Gly Val Gly Gly Val
595 600 605
Ala Phe Ser Asn Val Thr Val Ser Glu Gly Leu Tyr Asp Ala Trp Pro
610 615 620
Asp Arg Gln Ser
625
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
attacgaatt gtttaaacgt gctttacttc actcgtgcat gggg 44
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
aaatggattg attgtctcac cacgtgcaca ttcatattcc gc 42
<210> 4
<211> 654
<212> PRT
<213> 棘孢曲霉
<400> 4
Met Lys Leu Pro Thr Thr Thr Leu Ala Leu Ala Thr Gly Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Tyr His Leu Asp Thr Thr Ala Pro Pro Pro Thr Asn
20 25 30
Leu Ser Thr Leu Pro Asn Asn Thr Leu Phe His Leu Trp Arg Pro Arg
35 40 45
Ala His Ile Leu Pro Ala Glu Gly Gln Ile Gly Asp Pro Cys Ala His
50 55 60
Tyr Thr Asp Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asp
65 70 75 80
Gly Asp Gly Ile Ala Gly Ala Thr Thr Ala Asn Leu Ala Thr Tyr Thr
85 90 95
Asp Thr Ser Gly Asn Gly Ser Phe Leu Ile Gln Pro Gly Gly Lys Asn
100 105 110
Asp Pro Val Ala Val Phe Asp Gly Ala Val Ile Pro Val Gly Val Asn
115 120 125
Asn Thr Pro Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu Pro Ile His
130 135 140
Trp Ser Ile Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val
145 150 155 160
Ala Arg Asp Gly Gly Arg Arg Phe Glu Lys Leu Asp Gln Gly Pro Val
165 170 175
Ile Ala Asp His Pro Phe Ala Val Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro
180 185 190
Phe Val Phe Arg Ser Ala Arg Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Asn Glu
195 200 205
Glu Val Ala Gly Asn Glu Thr Ala Val Gln Gln Ala Val Asp Gly Trp
210 215 220
Thr Glu Lys Asn Ala Pro Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val His
225 230 235 240
Gly Val Gly Pro Ala Gln Phe Leu Tyr Arg Gln Asn Gly Gly Asn Gly
245 250 255
Ser Glu Phe Gln Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gln Glu Ala
260 265 270
Thr Asn Ser Ser Trp Gly Glu Glu Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Gly
275 280 285
Phe Asn Phe Glu Thr Gly Asn Val Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His
290 295 300
Asp Pro Gln Thr Gly Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Thr Glu Gly Ser
305 310 315 320
Gly Leu Pro Ile Val Pro Gln Val Ser Ser Ile His Asp Met Leu Trp
325 330 335
Ala Ala Gly Glu Val Gly Val Gly Ser Glu Glu Glu Gly Ala Lys Val
340 345 350
Glu Phe Ser Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser Ala
355 360 365
Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Ala Val Ser Lys
370 375 380
Thr Ser Gly Val Asp Val Asp Arg Tyr Val Ser Phe Val Trp Leu Thr
385 390 395 400
Gly Asp Gln Tyr Glu Gln Ala Asp Gly Phe Pro Thr Ala Gln Gln Gly
405 410 415
Trp Thr Gly Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Lys Val Gln Thr Val
420 425 430
Glu Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Val Arg Glu Glu Gly Val Ser Trp
435 440 445
Val Val Gly Glu Ser Asn Asn Lys Thr Ala Thr Leu Arg Thr Leu Gly
450 455 460
Ile Thr Ile Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala Leu Leu Ala Asn Gly Ser
465 470 475 480
Val Thr Thr Glu Glu Ala Arg Thr Leu Gln Thr Ala Ala Val Val Pro
485 490 495
Phe Ala Gln Ser Pro Gly Ser Lys Phe Phe Val Leu Thr Ala Gln Leu
500 505 510
Glu Phe Pro Ala Ser Ala Arg Ser Ser Asn Leu Gln Ser Gly Phe Glu
515 520 525
Ile Leu Ala Ser Glu Leu Glu Arg Thr Thr Val Tyr Tyr Gln Phe Ser
530 535 540
Asn Glu Ser Leu Val Val Asp Arg Ser Gln Thr Ser Ala Ala Ala Pro
545 550 555 560
Thr Asn Pro Gly Leu Asp Ser Phe Thr Glu Ser Gly Lys Leu Arg Leu
565 570 575
Phe Asp Val Val Glu Asn Gly Gln Glu Lys Val Glu Thr Leu Asp Leu
580 585 590
Thr Val Val Val Asp Asn Ser Val Val Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg
595 600 605
Phe Ala Leu Ser Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Asp Asn Ser Thr Gln
610 615 620
Ile Arg Phe Phe His Asn Gly Glu Gly Glu Val Gln Phe Lys Asn Val
625 630 635 640
Ser Val Ser Glu Gly Leu Tyr Asn Ala Trp Pro Glu Arg Asn
645 650
<210> 5
<211> 621
<212> PRT
<213> 多毛青霉
<400> 5
Met Lys Leu Ser Ser Val Met Thr Val Gly Leu Ala Asn Arg Val Leu
1 5 10 15
Ala Ala Asn Pro His Ala Ser Pro Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Pro Pro
20 25 30
Asn Leu Ser Thr Leu Ala Asn Glu Thr Leu Phe Asp Thr Trp Arg Pro
35 40 45
Lys Ala His Leu Leu Pro Pro Ser Gly Lys Ile Gly Asp Pro Cys Gly
50 55 60
His Tyr Thr Asp Pro Lys Thr Gly Leu Phe His Val Gly Trp Leu His
65 70 75 80
Asp Gly Ile Ala Gly Ala Thr Thr Asp Asp Leu Ala Thr Tyr Lys Asp
85 90 95
Leu Asn Pro Asp Gly Ala Pro Val Ile Ile Ala Gly Gly Lys Asn Asp
100 105 110
Pro Leu Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser Gly Ile Asn Gly
115 120 125
Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Tyr Leu Pro Ile His Trp
130 135 140
Ser Ile Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val Ser
145 150 155 160
His Asp Gly Gly Arg Asn Phe Thr Lys Leu Asn Gln Gly Pro Val Ile
165 170 175
Pro Thr Pro Pro Phe Ala Val Asn Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Phe
180 185 190
Ala Phe Gln Ser Ser Ile Leu Asp Lys Ser Val Asn Ser Thr Lys Gly
195 200 205
Thr Trp Tyr Val Ala Ile Ser Gly Gly Val His Asp Val Gly Pro Thr
210 215 220
Gln Phe Leu Tyr Arg Gln His Asp Ala Asp Phe Gln Tyr Trp Glu Tyr
225 230 235 240
Leu Gly Gln Trp Trp Asn Glu Pro Val Asn Thr Thr Trp Gly Lys Gly
245 250 255
Asp Trp Ala Gly Gly Trp Gly Phe Asn Phe Glu Val Gly Asn Val Phe
260 265 270
Gly Leu Asn Ala Glu Gly Tyr Ser Glu Asp Gly Glu Ile Phe Ile Thr
275 280 285
Leu Gly Thr Glu Gly Ser Gly Leu Pro Ile Val Pro Gln Val Ser Ser
290 295 300
Ile His Asp Met Leu Trp Ala Thr Gly Asn Val Thr Asn Asp Asp Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Lys Pro Thr Met Ala Gly Val Leu Asp Trp Gly Leu Ser
325 330 335
Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Gln Ala Ser
340 345 350
Glu Lys Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Tyr Val Trp Leu Thr
355 360 365
Gly Asp Leu Phe Glu Leu Ala Lys Gly Phe Pro Thr Ala Gln Gln Asn
370 375 380
Trp Thr Gly Thr Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Asn Ile Arg Thr Ile
385 390 395 400
Pro Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Ser Arg Glu Ser Leu Thr Ser Trp
405 410 415
Arg Val Ala Arg Glu Gly Ser Gly Glu Val Asp Leu Glu Thr Met Gly
420 425 430
Ile Ser Ile Ala Arg Glu Thr Tyr Ser Ala Leu Thr Ser Gly Pro Ser
435 440 445
Phe Val Glu Ser Gly Lys Thr Leu Ser Lys Ala Gly Ser Val Pro Phe
450 455 460
Asn Thr Ser Pro Ser Thr Lys Phe Phe Ala Leu Thr Ala Asn Ile Ser
465 470 475 480
Phe Pro Ala Ser Ala Arg Asp Ser Gly Ile Gln Ala Gly Phe Gln Val
485 490 495
Leu Ser Ser Gly Leu Glu Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn
500 505 510
Glu Ser Ile Ile Ile Asp Arg Ser Asn Thr Ser Ala Ala Ser Lys Thr
515 520 525
Thr Asn Gly Ile Leu Ser Asp Asn Glu Ala Gly Arg Leu Arg Leu Phe
530 535 540
Asp Val Leu Glu Asn Gly Lys Glu Lys Val Glu Thr Leu Glu Leu Thr
545 550 555 560
Val Val Val Asp Asn Gly Val Leu Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe
565 570 575
Ala Leu Gly Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Ala Asn Ser Thr Glu Ile
580 585 590
Lys Phe Phe His Asn Gly Val Gly Glu Ala Thr Phe Gly Asn Val Thr
595 600 605
Ile Phe Glu Gly Leu Tyr Asp Ala Trp Pro Gln Arg Lys
610 615 620
<210> 6
<211> 687
<212> PRT
<213> 意大利青霉
<400> 6
Met Lys Ala Thr Thr Ala Ala Ser Val Leu Ala Leu Val Trp Glu Gly
1 5 10 15
Ala Thr Ala Gln Asp Tyr Asn Ala Ala Pro Pro Asp Leu Ala Thr Leu
20 25 30
Pro Glu Leu Ser Leu Phe Glu Thr Trp Arg Pro His Thr His Val Leu
35 40 45
Pro Pro Asn Gly Gln Ile Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Val Asp Pro
50 55 60
Glu Thr Gly Arg Phe His Val Gly Phe Leu His Asn Gly Thr Gly Ile
65 70 75 80
Ala Ala Val Leu Thr Glu Asp Leu Val His Tyr Tyr Asp Val Arg Pro
85 90 95
Asn Gly Asn Tyr Ser Ile Val Ala Gly Gly Pro Asn Asp Pro Val Ala
100 105 110
Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser Gly Val Asp Gly Lys Pro Thr
115 120 125
Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Ser Leu Pro Ile His Trp Thr Leu Ala
130 135 140
Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Ser Gln Ser Leu Ala Val Thr Tyr Asp Gly
145 150 155 160
Glu Lys Asn Phe Thr Lys Leu Asp Ile Pro Pro Val Ile Pro Val Pro
165 170 175
Pro Glu Gly Val Asn Val Thr Gly Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe Gln
180 185 190
Asn Ala Ala Leu Asp Gln Ser Ile Gly Asn Ala Glu Gly Thr Trp Tyr
195 200 205
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Val His Glu Val Gly Pro Gly Met Phe Leu
210 215 220
Tyr Gln Asn Thr Ser Pro Asp Phe Glu His Trp Glu Tyr Leu Gly Glu
225 230 235 240
Trp Tyr His Glu Pro Ala Asn Ser Thr Trp Gly Asn Gly Asp Trp Ser
245 250 255
Lys Val Phe Gly Tyr Asn Phe Glu Thr Thr Asn Phe Phe Gly Leu Thr
260 265 270
Arg Gln Gly Tyr Ser Tyr Ser Gly Ser Pro Phe Phe Thr Ile Ala Val
275 280 285
Glu Ser Ser Tyr Val Pro Ile Gln Pro Ser Val Ser Ser Leu His Ala
290 295 300
Gln Leu Trp Ala Ala Gly Ser Val Gly Val Pro Glu Gly Gly Asn Val
305 310 315 320
Thr Phe Thr Pro Asp Met Val Gly Val Phe Asp Trp Gly Leu Ala Ser
325 330 335
Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Val Val Pro Ala Ser Ser Gln Ala Ser Thr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gln Asn Thr Leu Leu Thr Ser Arg Glu Leu Tyr Ile Lys Ala Ile Pro
385 390 395 400
Asn Val Val Asn Asn Asp Leu Val Lys Glu Thr Gly Ser Trp Arg Leu
405 410 415
Ala Ala Asp Ser Asp Ser Thr Arg Asn Cys Val Glu Leu Glu Thr Leu
420 425 430
Gly Ile Asp Ile Ala Arg Glu Thr Tyr Asp Ala Met Thr Ala Ala Pro
435 440 445
Ser Phe Ser Glu Pro Asp Lys Thr Leu Thr Ser Ala Gly Val Ile Pro
450 455 460
Phe Thr Arg Ser Pro Lys Thr Lys Phe Phe Ile Leu Glu Ala Asp Ile
465 470 475 480
Ser Phe Asp Ala Arg Ala Ser Asp Leu Gln Thr Gly Phe Gln Ile Leu
485 490 495
Ala Ser Glu Phe Glu Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn Glu
500 505 510
Ser Ile Met Ile Asp Arg Ser Lys Thr Ser Ala Ala Ala Gly Thr Thr
515 520 525
Thr Gly Ile Asp Ala Ser Pro Glu Ser Gly Arg Leu Arg Leu Phe Asp
530 535 540
Ile Asn Asp Ser Cys Gly Asn Asn Gly Gly Asn Asn Gly Gly His Gly
545 550 555 560
Gly Lys Gly Val Tyr Gly Gly His Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Ala Gly
565 570 575
His Gly Gly His Asp Cys Gly Glu Lys Asp Gly Gln Gly Glu His His
580 585 590
Ser Thr Asn Cys Lys Pro Asp Asp Lys Ser Gly Ser Asn Ala His Ala
595 600 605
Ser Arg Ser Ser Glu Val Gly Gly Glu His Ile Glu Thr Leu Ser Leu
610 615 620
Thr Val Val Val Asp Asn Ser Val Leu Glu Val Tyr Ala Asn Ser Arg
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660 665 670
Arg Val Ala Asp Gly Leu Tyr Asp Ala Tyr Pro Asp Arg Asp Gln
675 680 685
<210> 7
<211> 649
<212> PRT
<213> 朱黄踝节菌
<400> 7
Met Arg Ser Trp Cys Ala Gly Thr Ala Phe Ala Val Ala Leu Ala Val
1 5 10 15
Gly Val Ser Ala Gln Asn Tyr Asn Glu Pro Pro Pro Asp Leu Ser Thr
20 25 30
Leu Pro Thr Gly Ser Leu Phe Glu Thr Trp Arg Pro Lys Ile His Val
35 40 45
Leu Pro Pro Asp Gly Val Val Gly Asp Pro Cys Gly His Tyr Asp Asp
50 55 60
Pro Glu Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asn Gly Thr Gly
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Glu Thr Ala Asp Leu Val Phe Tyr Tyr Asp Val Asn
85 90 95
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180 185 190
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260 265 270
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340 345 350
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Gly Asp Gln Asn Cys Val Gln Leu Glu Thr Leu Gly Ile Asp Ile Ala
435 440 445
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580 585 590
Ser Val Leu Glu Val Phe Ala Asn Ser Arg Phe Gly Val Ser Thr Trp
595 600 605
Ala Arg Pro Trp Tyr Ala Asn Ser Thr Glu Ile Arg Phe Phe Gln Asn
610 615 620
Gly Asp Gly Glu Val Thr Phe Ser Asn Ile Ala Val Tyr Asp Gly Leu
625 630 635 640
Tyr Asp Ala Tyr Pro Asp Arg Asp Arg
645

Claims (29)

1.一种生产发酵产物的方法，该方法包括使重组里氏木霉细胞在产生异源转化酶和发酵产物的条件下、在包含蔗糖的发酵培养基中发酵，其中该重组里氏木霉细胞包含一种或多种各自编码异源转化酶的基因。
2.如权利要求1所述的方法，其中编码转化酶的该一种或多种基因中的每一种衍生自一种或多种微生物。
3.如权利要求2所述的方法，其中编码转化酶的该一种或多种基因中的至少一种是真菌基因。
4.如权利要求3所述的方法，其中编码转化酶的该一种或多种基因中的每一种与SEQID NO:1具有至少60％序列同一性，例如至少70％序列同一性，例如至少80％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少96％序列同一性；例如至少97％序列同一性；例如至少98％序列同一性；例如至少99％序列同一性。
5.如权利要求4所述的方法，其中编码转化酶的该一种或多种基因中的每一种具有SEQID NO:1的序列，或者与SEQ ID NO:1相差一个或若干个取代，优选地相差一个或若干个保守取代。
6.一种生产发酵产物的方法，该方法包括使里氏木霉细胞在生产发酵产物的条件下和在形成槐糖的条件下、在包含蔗糖和β-葡糖苷酶的发酵培养基中发酵。
7.如权利要求6所述的方法，其中将该蔗糖在pH为1-3，例如pH 2下用酸(例如乙酸、柠檬酸、盐酸、磷酸或硫酸)水解成果糖和葡萄糖。
8.如权利要求6所述的方法，其中该蔗糖被转化酶水解成果糖和葡萄糖。
9.如权利要求8所述的方法，其中该转化酶被外源添加至发酵培养基中。
10.如权利要求8所述的方法，其中该转化酶由里氏木霉细胞重组产生。
11.如权利要求6-10中任一项所述的方法，其中该β-葡糖苷酶被外源添加至发酵培养基中。
12.如权利要求6-10中任一项所述的方法，其中该β-葡糖苷酶由里氏木霉细胞重组产生。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与不具有以下这样的突变的相应里氏木霉细胞相比，该重组里氏木霉细胞具有提供降低的分解代谢物应答的突变。
14.如权利要求13所述的方法，其中该提供降低的分解代谢物应答的突变是creI基因中的突变。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该重组里氏木霉细胞进一步包含在xyr1基因座中的突变，该突变导致重组里氏木霉细胞变成葡萄糖盲。
16.如权利要求15所述的方法，其中该xyr1基因座中的突变是在xyr1中的位置824处丙氨酸被缬氨酸取代(A824V)。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该发酵产物是包含一种或多种多肽的蛋白质产物。
18.如权利要求17所述的方法，其中该一种或多种多肽对里氏木霉细胞是天然的。
19.如权利要求17所述的方法，其中该一种或多种多肽对里氏木霉细胞是异源的。
20.如权利要求17所述的方法，其中该一种或多种多肽是天然的，并且该一种或多种多肽对里氏木霉细胞是异源的。
21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中该重组里氏木霉细胞包含编码该一种或多种多肽的一种或多种基因的两个或更多个拷贝，例如两个、三个或四个拷贝。
22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，其中该一种或多种多肽是一种或多种酶。
23.如权利要求22所述的方法，其中该一种或多种酶独立地选自下组，该组由以下组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
24.如权利要求23所述的方法，其中这些酶是一种或多种纤维素酶，即纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、和/或β-葡糖苷酶。
25.如权利要求23所述的方法，其中这些酶是一种或多种半纤维素酶，即乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，该方法进一步包括回收该发酵产物。
27.如权利要求26所述的方法，其中该发酵产物是全培养液产物。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该蔗糖以水溶液的形式添加。
29.如权利要求28所述的方法，其中该蔗糖以糖蜜的形式添加。
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