CN100378217C - 改进G/11家族木聚糖酶的稳定性并且扩展其pH范围的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质工程，具体涉及G/11木聚糖酶家族，以及编码所述酶的基因。本发明具体涉及编码内-1，4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)的TrichodermareeseiXYNII基因。本发明描述了如何利用定点诱变改进酶的性质，以使其符合所要应用的工业条件。可利用蛋白质工程改进木聚糖酶的热活性和热稳定性，以及扩展它们的pH范围。

Description

改进G/11家族木聚糖酶的稳定性并且扩展其pH范围的方法
发明领域
本发明涉及蛋白质工程，具体涉及G/11家族木聚糖酶，以及编码所述酶的基因。本发明具体涉及编码内-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)的Trichodermareesei XYNII基因。本发明描述了如何利用定点诱变改进酶的性质，以使其符合所要应用的工业条件。可利用蛋白质工程改进木聚糖酶的热活性和热稳定性，以及扩展它们的pH范围。
发明背景
木聚糖酶是水解β-1，4连接的吡喃木糖苷链的糖基水解酶。已发现木聚糖酶存在于至少一百种不同的生物中。它们与其它糖基水解酶一起形成了包括超过40种不同酶家族的超家族(Henrissat和Bairoch，1993)。木聚糖酶家族11(以前称G)根据它们在基因序列，蛋白质结构，催化机制的相似性来确定。此家族成员的共同特点是高度的基因同源性，大小约20kDa，具有双取代催化机制(Tenkanen等，1992；Wakarchuk等，1994)。
木聚糖酶家族11主要由形成2个大β-折叠的β-链和1个α-螺旋组成。它们形成了一个类似半握的右手的结构，其中的β-折叠称为A-折叠和B-折叠(Torronen & Rouvinen，1997)。由于木聚糖酶家族11的结构稳定并且不易受蛋白酶活性的影响，所以它们在工业应用方面特别有用。此外，木聚糖酶可以经济地大规模生产。已知Trichoderma reesei可以产生三种不同的木聚糖酶，其中木聚糖酶I和II(XynI和XynII)具有最好的特点(Tenkanne等，1992)。XynI分子量19kDa，与XynII相比，它的等电点和最适pH较低(pI5.5，pH3-4)。XynII分子量20kDa，它的等电点为9.0，最适pH5.0-5.5(Torronen& Rouvinen，1995)。
木聚糖酶最重要的工业应用是纸浆漂白，织物纤维的改良，生物质的改良以促进动物饲料中它的消化(Prade，1996)。所有这些应用中的共同问题是该酶面临的极端条件。在工业应用中的高温以及与许多木聚糖酶的最适pH不同的pH条件降低了现有木聚糖酶在工业上的有效利用。
在饲料应用中，该酶面临饲料制备期间的短时高温(例如90℃下2-5分钟)。但是，该酶的催化活性需要的温度较低(例如约37℃)。这样，该酶应在较低温下保持活性，它不应在高温下不可逆地失活。
在应用于纸浆漂白的过程中，来自于碱洗的物料具有较高的温度(＞80℃)和pH(＞10)。没有一种当今市售的木聚糖酶可以在这样的条件下不失活。必须将纸浆冷却，将碱性pH中和，这样才能用当今可得的木聚糖酶进行纸浆处理。但这意味着费用提高。已有人利用蛋白质工程-有时是成功的-稳定木聚糖酶，使之耐受较高温度和pH的变性效应。
已从嗜热生物中发现并克隆了几种耐热的，嗜碱和嗜酸的木聚糖酶(Bodie等，1995；Fukunaga等，1998)。但是，在大多数情况下，证明经济数量地生产这些酶是困难的。因此，工业上一般应用不那么耐热的T.reesei木聚糖酶II，因为它可以大量低成本地生产。作为分离新的木聚糖酶或开发生产方法的替代方法，可以设想对当今使用的木聚糖酶进行工程改造，使之在极端条件下更为稳定。
环状芽胞杆菌木聚糖酶可以通过二硫桥将其N-末端与C-末端结合，将α-螺旋的N-末端部分与邻近的β-链结合而改进其稳定性(Wakarchuk等，1994)。Campbell等(1995)也通过分子间或分子内二硫键对环状芽胞杆菌木聚糖酶进行了修饰以提高其热稳定性。另一方面，T.reesei木聚糖酶II通过将N-末端区改变为嗜热木聚糖酶的相应部分而改进了稳定性(Sung等，1998)。除热稳定性得到改进外，所述酶也扩展了在碱性pH条件下的活性范围。单点突变(single point mutation)也用于提高短小芽胞杆菌木聚糖酶的稳定性(Arase等，1993)。还对许多其它酶进行了诱变对稳定性影响的研究。通过对比嗜热和嗜温酶的结构，得到了大量信息(Vogt等，1997)。嗜热木聚糖酶的结构信息也给出了影响木聚糖酶热稳定性因素的信息(Gruber等，1998；Harris等，1997)。
发明概述
本发明涉及属于糖基水解酶家族11(以前称G)的木聚糖酶。本发明提供了经过修饰的木聚糖酶，所述修饰使它们的热稳定性，热活性得到了改变，和/或扩展了它们的pH范围。
对Trichoderma reesei木聚糖酶结构的各种修饰，不管是单独的，或者组合的，都产生了本发明所述的改变：
(1)通过用二硫桥(例如，由突变对T2C和T28C；P5C和N19C；T7C和S16C；N10C和N29C形成的桥)将N-末端区结合到该蛋白主体上而提高了该酶的稳定性；
(2)通过延伸一个额外的天冬氨酸(+191D)而稳定C-末端，其中该天冬氨酸与第58位的精氨酸(野生型酶中第58位的赖氨酸已换成精氨酸(K58R))形成盐桥；
(3)将α-螺旋通过二硫桥与该酶的主体结合而提高该酶的稳定性(例如L105C和Q162C)；
(4)在不同位置进行点突变以改进木聚糖酶的稳定性(N11D，T26R，G30H，N67R，N97R，A132R，N157R，A160R，T165N，M169H，S186R)。
具体地，本发明提供了经过修饰的Trichoderma reesei木聚糖酶，其中氨基酸T2和T28被改变为半胱氨酸，K58改变为精氨酸，在该酶的C-末端添加了一个天冬氨酸(+191D)，这样在氨基酸T2C和T28C之间形成了二硫桥，在氨基酸K58R和+191D之间形成了盐桥。
附图说明
图1：木聚糖酶诱变中所用的一组寡核苷酸(密码子改变以下划线标记)。这些序列在所附序列表中为序列1到12。
图2：表示突变T2C，T28C，K58R，和+191D对T.reesei XynII温度最适值的影响(WT＝野生型酶；Y5＝突变型T.reesei XynII)。
图3：表示突变T2C，T28C，K58R，和+191D对T.reesei XynII的pH依赖性活性的影响(WT和Y5如图2)。
图4：表示在不同温度下突变T2C，T28C，K58R，和+191D对T.reeseiXynII的失活效应(WT和Y5如图2)。
图5：表示在不同温度下突变Q162C和L105C对T.reesei XynII的失活效应(W.t.＝野生型酶)。
发明详述
源于细菌，酵母和真菌的G/11家族木聚糖酶有共同的分子结构。这样的木聚糖酶例如有：
黑曲霉(Aspergillus niger)XynA
川地曲霉(Aspergillus kawachii)XynC
塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)XynA
环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)XynA
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)XynA
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XynA
Neocallimastix patriciarum XynA
浅青紫链霉菌(Sreptomyces lividans)XynB
浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)XynC
热紫链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)XynII
赭色嗜热单孢菌(Thermomonospora fusca)XynA
Trichoderma harzianum Xyn
Trichoderma reesei XynI，Trichoderma reesei XynII
绿色木霉(Trichoderma viride)Xyn
本发明涉及具有下列共同特点的木聚糖酶家族G/11：
(i)一类酶，其中N-末端序列是双层β-折叠(木聚糖酶家族11中的A-和B-折叠，(Gruber等，1998))的一部分，且第一β-链(T.reesei XynII中的氨基酸5-10)或N-末端可通过二硫桥与邻近的β-链(T.reesei XynII中的氨基酸13-19)或其它邻近区相连。
(ii)一类酶，其中C-末端肽链形成β-链(T.reesei XynII中的氨基酸183-190)，它是更大的β-折叠的一部分，并且C-末端区可通过二硫桥与邻近的β-链相连或通过盐桥与酶的主体相连。
(iii)一类酶，其在酶结构中催化凹沟的另一侧具有α-螺旋，并且该α-螺旋或邻近区可通过二硫桥更紧密地与该蛋白的主体相连。
T.reesei木聚糖酶II具有上述性质，并且可在这些性质的基础上对该酶的热稳定性，pH稳定性和热活性进行改变。下列是对T.reesei的木聚糖酶基因(XynII)作出的改变：
1.通过定点诱变，在N-末端区形成二硫桥：
*第2和28位的苏氨酸改变为半胱氨酸，使得在它们之间形成二硫桥(T2C和T28C)。
*第5位的脯氨酸和第19位的天冬酰胺改变为半胱氨酸，使得在它们之间形成二硫桥(P5C和N19C)。
*第7位的苏氨酸和第16位的丝氨酸改变为半胱氨酸，使得在它们之间形成二硫桥(T7C和S16C)。
*第10位和第29位的天冬酰胺改变为半胱氨酸，使得在它们之间形成二硫桥(N10C和N29C)。
2.通过定点诱变，在该木聚糖酶的C-末端加入一个重组改变的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，使得在C-末端和酶主体之间形成盐桥，导致该C-末端更紧地与酶主体连接。如果合适，可在该蛋白的主体中进行恰当的氨基酸取代从而形成盐桥。
*将一个天冬氨酸(+191D)添加到C-末端的丝氨酸(S190)。这使得与第58位的精氨酸(此处的野生型赖氨酸已被精氨酸取代(K58R))间形成盐桥。
3.通过定点诱变，形成至少一个二硫桥以通过α-螺旋或α-螺旋的邻近区稳定该酶的C-末端部分。
*第105位的亮氨酸和第162位的谷氨酰胺改变为半胱氨酸，使得在它们之间形成二硫桥(L105C和Q162C)。
4.通过定点诱变进行点突变以提高T.reesei木聚糖酶II的稳定性：N11D，T26R，G30H，N67R，N97R，A132R，N157R，A160R，T165N，M169H，S186R。
本发明方法
通过下列常规方法生产突变和重组的XYNII基因
1.表达载体和所述酶的产生
利用载体pKKtac(VTT，Espoo，芬兰)或载体pALK143(ROAL，Rajam ki，芬兰)在大肠杆菌菌株XL1-Blue或Rv308中生产T.reesei木聚糖酶II。T.reesei XYNII基因通过PCR直接从T.reesei的cDNA克隆到载体pKKtac(由IPTG诱导表达)。可选地，使用含有T.reesei XYNII基因的质粒pALK143。这两种载体都分泌所述木聚糖酶到培养基中；载体pKKtac通过果胶酸裂解酶(pelB)信号序列，载体pALK143通过淀粉酶信号序列。
2.定点诱变和重组XYNII基因的产生
本发明实施例中所用的突变的T.reesei XYNII基因如下产生：采用含有改变的密码子序列的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应(PCR)产生突变。所用寡核苷酸的例子在图1中给出，也就是所附序列列表中的序列1到12。利用所述引物(含有所要的突变)，通过快速改变(Quick Change)法(Stratagene，Westburg，Leusden，荷兰)以及众所周知的方法进行PCR。用PfuTurbo作为DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，Ca，美国)。将克隆的大肠杆菌菌株培养在含耦合了Rhemazol Brilliant Blue的木聚糖(桦木(birchwood)木聚糖：Sigma，Steinheim，德国)的平板上。通过环绕菌落的晕圈可以观察到木聚糖酶活性(Biely等，1985)。
3.木聚糖酶活性的测定
通过测定从水解的木聚糖纤维释放出的还原糖量可以测定酶样品的木聚糖酶活性。通过DNS法在50mM柠檬酸-磷酸缓冲液中测定还原糖(Bailey等，1992)。在pH5和50℃下进行标准活性测定。
4.酶稳定性的测定
通过测定在不同温度下修饰型酶的半衰期来检测所述木聚糖酶的稳定性。所述酶在55或65℃下保温不同的时间，如上测定其残余活性。也在不同温度下温育所述酶10分钟，再通过DNS法测定残余活性来测定高温下的稳定性。通过测定不同pH值下的酶活性来测定pH依赖性木聚糖酶活性。通过测定不同温度下的活性(10mm，pH 5)可以确定该酶的最适温度。将突变的酶的性质与野生型T.reesei XynII酶的相对比。
突变实施例
实施例1
通过如上所述方法对T.reesei XynII进行三重突变(T2C，T28C和K58R)和重组改变(+191D)。突变的酶命名为Y5。该突变酶在大肠杆菌中表达，所述大肠杆菌培养在+37℃摇瓶中，以Luria Broth作为生长培养基。培养完成后，离心去除细胞，如上所述对分泌到培养液中的木聚糖酶在各种条件下进行鉴定。图2表示当突变型Y5(T2C，T28C和K58R，+191D)和野生型(T.reesei XynII)酶在不同温度下与桦木木聚糖保温10分钟，并采用DNS法测定释放的还原糖的相对数量时，温度对酶活性的影响。所述突变使木聚糖酶的最适温度有约15℃的改善。
实施例2
50℃下，将实施例1中所述的三重突变型木聚糖酶(T2C，T28C，K58R，+191D)在1％桦木木聚糖的不同pH值的柠檬酸-磷酸缓冲液中保温10分钟。图3表示突变酶和野生型木聚糖酶释放的还原糖的相对量。突变使该酶的活性的pH适应范围略向碱性条件扩展。在pH 7-8时突变酶活性高于野生型酶；在pH 8(50℃)下，突变酶的活性约高20％。
实施例3
上述三重突变型酶(T2C，T28C，K58R，+191D)和野生型酶在不同温度下保温10分钟。保温后，冷却样品，在标准条件下测定残余活性。所述野生型酶在55-60℃下已完全失活。而所述突变型酶即使在65℃下还保留约50％的活性(图4)。下表1表示突变型(Y5)和所述野生型木聚糖酶在55℃和65℃下的半衰期(T1/2)。
表1
  pH 5   pH 8
 55℃
 Y5   稳定   稳定
 野生型XynII   ～5min   ～2min
 65℃
 Y5   20-25min   ～10min
 野生型XynII   40sec
实施例4
采用上述方法形成二硫桥(L105C和Q162C)，以便将α-螺旋的C-末端与邻近的β-链连接。由大肠杆菌生产所述酶并确定其性质。图5表示不同温度下，与所述野生型酶相比该突变型酶的失活。55℃下，与野生型酶相比，所述突变酶的稳定性提高约20倍，而半衰期从5分钟(所述野生型酶)提高到约1.5小时(所述突变酶)。
文献
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突变T2C中所用寡核苷酸
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<223>人工序列的描述：
突变N10C中所用寡核苷酸
<400>9
ccggcacggg ctactgcaac ggctacttct actc              34
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
突变N29C中所用寡核苷酸
<400>10
ggcgtgacgt acacctgcgg tcccggcggg c                 31
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
突变L105C中所用寡核苷酸
<400>11
ggcgccacca agtgcggcga ggtcacc                      27
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
突变Q162C中所用寡核苷酸
<400>12
gcgtgggctc agtgcggcct gacgctcg                     28

Claims (2)

1.一种经过修饰的Trichoderma reesei木聚糖酶II(XynII)，与对应的野生型Trichoderma reesei木聚糖酶II(XynII)相比，这种经过修饰的Trichoderma reesei木聚糖酶II(XynII)的热稳定性和pH稳定性已提高，所述修饰是通过(i)在L105C和Q162C氨基酸之间形成二硫桥将该酶的N-末端序列与相邻的β-链相连而进行的，或者是通过(ii)在T2C和T28C氨基酸之间形成二硫桥将该酶的N-末端序列与相邻的β-链相连，并且将氨基酸K58变为精氨酸，天冬氨酸添加到所述酶的C-末端，即+191D，从而在氨基酸K58R和+191D之间形成盐桥而进行的，此氨基酸的编号基于Trichoderma reesei木聚糖酶II(XynII)的氨基酸编号。
2.一种改进Trichoderma reesei木聚糖酶II(XynII)的热稳定性和pH稳定性的方法，其包括进行下列步骤：
通过(i)在L105C和Q162C氨基酸之间形成二硫桥将该酶的N-末端序列与相邻的β-链相连，或者通过(ii)在T2C和T28C氨基酸之间形成二硫桥将该酶的N-末端序列与相邻的β-链相连，并且将氨基酸K58变为精氨酸，天冬氨酸添加到所述酶的C-末端，即+191D，从而在氨基酸K58R和+191D之间形成盐桥，此氨基酸的编号基于Trichoderma reesei木聚糖酶II(XynII)的氨基酸编号。
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