KR20020044161A - 계통 Ｇ/11 크실라나아제의 안정성을 향상시키고 ｐＨ범위를 확장시키기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 공학과 관련된 것이며, 특히 계통 G/11 크실라나아제 및 상기 효소를 인코딩하는 유전자와 관련된 것이다. 특히, 본 발명은 엔도-1,4-β-크실라나아제(EC 3.2.1.8)을 인코딩하는Trichoderma reesei XYNII유전자에 관한 것이다. 본 발명은 효소가 사용되는 산업분야의 산업적 조건에 부합하도록 효소의 특성을 향상시키는데 부위-특이적 돌연변이유발을 사용하는 방법을 개시한다. 크실라나아제의 열활성 및 열안정성을 향상시키고 그들의 pH 범위를 확장시키는데 단백질 공학을 사용할 수 있다.

Description

계통 Ｇ/11 크실라나아제의 안정성을 향상시키고 ｐＨ 범위를 확장시키기 위한 방법{METHOD TO IMPROVE THE STABILITY AND BROADEN THE PH RANGE OF FAMILY G/11 XYLANASES}

크실라나아제(xylanases)는 β-1,4-연결 크실로피라노사이드 사슬(β-1,4-linked xylopyranoside chains)를 가수분해시키는 글리코실 가수분해효소이다. 크실라나아제는 적어도 100 종류 이상의 상이한 생물체에서 발견된다. 크실라나아제는, 다른 글리코실 가수분해효소와 함께, 40 가지 이상의 상이한 효소계통(family)을 포함하는 초계통(superfamily)을 형성한다(Henrissat and Bairoch, 1993). 계통 11 (이전의 G) 크실라나아제는 이들의 유전자 서열, 단백질 구조 및 촉매 메카니즘에 있어서의 유사성에 의하여 정의될 수 있다. 이들 계통 구성원의 공통적인 특징은 고도의 유전적 동일성, 약 20 kDa 크기 및 이중 치환 촉매 메카니즘(double displacement catalytic mechanism)이다(Tenkanen 등, 1992; Wakarchuk 등, 1994).

계통 11 크실라나아제는 주로 두 개의 커다란 β-시트(sheet)를 형성하는 β-가닥들(strands)과 하나의 α-나선(helix)으로 구성된다. 이들은 부분적으로 주먹쥔 오른손과 유사한 구조를 형성하며, 이 때, β-시트를 A-시트 및 B-시트로 칭한다. 계통 11 크실라나아제는 구조가 안정적이고 단백질 분해효소 작용에 민감하지 않기 때문에 산업적 적용에 있어서 특별한 이점을 갖는다. 게다가, 크실라나아제는 경제적으로 산업적 규모로 생산가능하다. 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei)는 3 가지의 상이한 크실라나아제를 생산하는 것으로 알려져 있으며, 이 중에서 크실라나아제 I 및 II(XynI와 XynII)가 가장 잘 특징지워져 있다(Tenkanen 등, 1992). XynI은 19 kDa의 크기를 가지며, XynII와 비교해서 낮은 등전점과 최적 pH(pI 5.5, pH 3-4)를 갖는다. XynII는 20 kDa의 크기를 가지며 등전점이 9.0이고 최적 pH가 5.0 내지 5.5이다(Trrnen and Rouvinen, 1995).

크실라나아제의 가장 중요한 산업상 적용분야는 펄프 표백, 방직 섬유의 변형, 및 동물 섭식시의 소화를 향상시키는 생체량 변형이다(Prade, 1996). 이들 모든 적용에 있어서 공통된 노미네이터는 상기 효소가 직면하는 극단적 조건이다. 높은 온도와 다수의 크실라나아제의 최적 pH와 실질적으로 다른 pH는 산업상 적용에 있어서 현재 사용가능한 크실라나아제의 효용성을 감소시킨다.

사료 적용에 있어서, 상기 효소는 사료 제조 중 짧은 시간(예컨대, 90℃에서 2-5 분)동안 고온 조건에 직면한다. 그러나, 효소의 실제 촉매 활성은 보다 낮은 온도를 요구한다(예컨대, ~37℃). 결론적으로, 상기 효소는 고온에서 비가역적으로 불활성화되는 반면, 상대적으로 낮은 온도에서는 활성화된다.

펄프 표백에 있어서 알칼리 세척을 거친 물질은 높은 온도(>80℃)와 pH(>10)를 갖는다. 상업적으로 시판되는 크실라나아제 중에서 이와 같은 조건을 견뎌낼 수 있는 것은 없다. 현재 사용가능한 크실라나아제를 사용하여 펄프를 처리기 위해서는 펄프를 냉각시키고 알칼리성 pH를 중화시켜야 한다. 이는 비용의 증가를 초래한다. 높은 온도와 pH의 변성 작용에 내성을 부여하기 위하여 크실라나아제를 안정화 시키는데 -종종 연속적으로- 단백질 공학을 사용한다.

열안정적, 호알칼리성(alkaliphilic) 및 호산성(acidophylic)인 몇 가지 크실라나아제가 발견되어 고온성 생물체(thermophilic organisms)로부터 클로닝되었다(Bodie 등, 1995; Fukunaga 등, 1998). 그러나, 대부분의 경우에 있어서, 이들 효소를 경제적 규모로 생산하는 것에는 어려움이 있다. 따라서, 상기와 같이 열안정적이지는 못하지만, 적은 비용으로도 대량으로 생산가능하기 때문에, 트리코데르마 레세이(T. reesei) 크실라나아제 II를 산업적으로 이용한다. 새로운 크실라나아제를 분리하거나, 또는 생산공정을 발전시키기 위한 대안으로서, 현재 사용되는 크실라나아제를 극단적 조건에서 보다 안정적이게 하는 공학적 접근이 가능하다.

디설파이드 브리지(disulfide bridges)와 단백질의 N-말단과 C-말단과의 결합 및 α-나선의 N-말단 부분과 이웃하는 β-가닥과의 결합에 의하여, 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) 크실라나아제를 향상시킬 수 있다(Wakarchuk 등, 1994). 또한, 열안정성을 향상시키기 위하여, Campbell 등(1995)은 분자간 및 분자내 디설파이드 결합에 의하여 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) 크실라나아제를 변형시켰다. 한편, N-말단 부위를 고온성 크실라나아제(thermophilic xylanase)의 각 부분으로 변형시킴으로써 트리코데르마 레세이(T. reesei) 크실라나아제 II의 안정성을 향상시켰다(Sung 등, 1998). 열안정성의 향상 이외에도, 알칼리성 pH에 있어서의 효소의 활성 범위를 확장시켰다. 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) 크실라나아제의 안정성을 증가시키기 위하여, 단일 점 돌연변이(single point mutations)를 사용하였다(Arase 등, 1993). 안정성에 대한 돌연변이유발의 영향이 많은 효소들에 대하여 연구되어왔다. 고온성 효소 및 중온성(mesophilic) 효소의 구조를 비교함으로써 많은 정보들을 얻었다(Vogt 등, 1997). 또한, 고온성 크실라나아제의 구조적 정보로부터 크실라나아제의 열안정성에 영향을 미치는 인자에 관한 정보를 얻었다.

발명의 요약

본 발명은 계통 11(이전의 G) 글리코실 가수분해효소에 속하는 크실라나아제에 관한 것이다. 본 발명은 열안정성, 열활성의 변화 및/또는 pH 범위의 확장을 위하여 변형된 크실라나아제를 제공한다.

트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 크실라나아제 구조에 있어서의 다양한 변형은, 이들 변형 단독 또는 조합으로서, 본 발명에 개시된 변화를 야기한다.

(1) 디설파이드 브리지(예컨대, 돌연변이 쌍 T2C와 T28C; P5C와 N19C; T7C와 S16C; N10C와 N29C에 의하여 형성된 다리)에 의한 N-말단 부위와 단백질체와의 결합에 의하여 효소의 안정성이 증가된다.

(2) 아르기닌 58(야생형 효소의 리신 58이 아르기닌(K58R)으로 변형됨)과 염다리를 형성하는 추가적인 아스파르트산(aspartic acid, +191D)을 사용하여 신장됨으로써 C-말단이 안정화된다.

(3) 디설파이드 브리지에 의하여 α-나선을 효소체에 결합(예컨대, L105C와 Q162C)시킴으로써 효소의 안정성이 증가된다.

(4) 상이한 위치에서 점 돌연변이가 발생되어 크실라나아제(N11D, T26R, G30H, N67R, N97R, A132R, N157R, A160R, T165N, M169H, S186R)의 안정성을 향상시킨다.

특히, 본 발명은 T2 및 T28 아미노산이 시스테인으로 변형되고, K58이 아르기닌으로 변형되고, 효소의 C-말단에 아스파르트산(+191D)이 첨가됨으로써, T2C와 T28C 아미노산 사이에 디설파이드 브리지가 형성되고, K58과 +191D 아미노산 사이에 염다리가 형성된, 변형된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 크실라나아제를 제공한다.

본 발명은 단백질 공학에 관련된 것이며, 특히 계통 G/11 크실라나아제(family G/11 Xylanases), 및 상기 효소를 인코딩하는 유전자와 관련된 것이다. 특히, 본 발명은 엔도-1,4-β-크실라나아제(EC 3.2.1.8)를 인코딩하는 트리코데르마 레세이XYNII유전자(Trichoderma reesei XYNIIgene)와 관련된 것이다. 본 발명은 효소의 특성을 향상시켜 그 효소가 사용되는 산업 조건과 부합하도록 하는데 부위특이적 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)을 사용하는 방법을 개시한다. 크실라나아제의 열활성(thermoactivity)과 열안정성(thermostability)를 향상시키고, 또한, 크실라나아제의 pH 범위를 확장시키는데 단백질 공학적 방법을 사용할 수 있다.

도 1은 크실라나아제의 돌연변이유발에 사용된 올리고뉴클레오타이드 세트를 나타낸 것이다(코돈 변화를 밑줄로 나타냄). 상기 서열은 또한 첨부된 서열목록의서열번호 1 내지 12에 나타내었다.

도 2는 트리코데르마 레세이(T. reesei) XynII의 열적 최적조건에 대한 T2C, T28C, K58R 및 +191D 돌연변이의 효과를 나타낸 그래프이다(WT=야생형 효소; Y5=돌연변이된T. reeseiXynII).

도 3은 트리코데르마 레세이(T. reesei) XynII의 pH-의존성 활성에 대한 T2C, T28C, K58R 및 +191D 돌연변이의 효과를 나타낸 그래프이다(WT=야생형 효소; Y5=돌연변이된T. reeseiXynII).

도 4는 상이한 온도에서의 트리코데르마 레세이(T. reesei) XynII의 불활성화에 대한 T2C, T28C, K58R 및 +191D 돌연변이의 효과를 나타낸 그래프이다(WT=야생형 효소; Y5=변이된T. reeseiXynII).

도 5는 상이한 온도에서의 트리코데르마 레세이(T. reesei) XynII의 불활성화에 대한 Q162C 및 L105C 돌연변이의 효과를 나타낸 그래프이다(W.t.=야생형 효소).

박테리아, 효모 및 진균류 기원의 계통 G/11 크실라나아제는 공통적인 분자구조를 갖는다. 이러한 크실라나아제의 예로서 다음과 같은 것이 있다:

아스페길루스 니거(Aspergillus niger) XynA

아스페길루스 카와키(Aspergillus kawachii) XynC

아스페길루스 투비겐시스(Aspergillus tubigensis) XynA

바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) XynA

바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) XynA

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) XynA

네오칼리마스틱스 파트리시아룸(Neocallimastix patriciarum) XynA

스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) XynB

스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) XynC

스트렙토마이세스 터모비올라세우스(Streptomyces thermoviolaceus) XynII

터모모노스포라 푸스카(Thermomonospora fusca) XynA

트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum) Xyn

트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) XynI

트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) XynII

트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) Xyn.

본 발명은 다음과 같은 공통적 특성을 갖는 계통 G/11의 크실라나아제를 사용하였다:

(i) N-말단 서열이 이중층 β-시트(계통 11 크실라나아제에 있어서는 A-시트 및 B-시트, (Gruber 등, 1998))의 일부분이고, 디설파이드 브리지에 의하여 첫 번째 β-가닥(T. reeseiXynII에 있어서는 아미노산 5-10) 또는 N-말단 끝을 인접하는 β-가닥(T. reeseiXynII에 있어서는 아미노산 13-19) 또는 다른 이웃하는 부위에 연결시킬 수 있는 효소.

(ii) C-말단 펩타이드 사슬이 β-가닥(T. reeseiXynII에 있어서는 아미노산 183-190)을 형성하고, 큰 β-시트의 일부분이고, C-말단 부위를 디설파이드 브리지에 의하여 인접하는 β-가닥에 연결 가능하거나 또는 염다리에 의해서 효소체에 연결시킬 수 있는 효소.

(iii) 촉매 캐니온(catalytic canyon)에 관여하는 효소 구조의 반대편 상에 α-나선을 갖고, 상기 α-나선 또는 이웃하는 부위를 디설파이드 브리지에 의하여 단백질체에 보다 밀착하여 결합시킬 수 있는 효소.

T. reeseiXynII는 상기한 바와 같은 특성을 가지며, 상기 효소에 있어서의 열안정성, pH-안정성 및 열활성은 이들 특성에 기초하여 변형 가능하다.T. reesei의 크실라나아제 유전자XYNII에 다음과 같은 변형을 가하였다:

1. N-말단 부위에 부위특이적 돌연변이유발 디설파이드 브리지를 형성한다:

* 트레오닌 2 및 28을 시스테인으로 변형시켜서, 이들(T2C와 T28C) 사이에 디설파이드 브리지를 형성시킨다.

* 프롤린 5와 아스파라긴 19를 시스테인으로 변형시켜, 이들(P5C와 N19C) 사이에 디설파이드 브리지를 형성시킨다.

* 트레오닌 7과 세린 16을 시스테인으로 변형시켜, 이들(T7C와 S16C) 사이에 디설파이드 브리지를 형성시킨다.

* 아스파라긴 10과 아스파라긴 29를 시스테인으로 변형시켜, 이들(N10C와 N29C) 사이에 디설파이드 브리지를 형성시킨다.

2. 부위특이적 돌연변이유발에 의하여, 재조합체 변형으로서 한 가지 아미노산(예컨대, 아스파르트산 또는 글루타민산)을 크실라나아제의 C-말단에 첨가하고 나서, C-말단에서부터 효소체까지 염다리를 형성시킴으로써, C-말단을 효소체에 보다 밀착하여 결합시킨다. 적절하다면, 염다리 형성을 가능하게 하기 위하여, 단백질체에서 적절한 아미노산 치환도 가능하다.

* C-말단 세린(S190)에 아스파르트산(+191D)을 첨가한다. 이로 인하여, 야생형 리신이 아르기닌으로 치환된 위치 58(K58R)에 아르기닌과의 염다리가 형성된다.

3. 부위특이적 돌연변이유발에 의하여, 적어도 하나 이상의 디설파이드 브리지가 형성되어 α-나선 또는 상기 α-나선과 인접한 부위를 통하여 C-말단에 있어서 효소를 안정화시킨다.

* 루신 105와 글루타민 162를 시스테인으로 변형시켜, 이들(L105C과 Q162C) 사이에 디설파이드 브리지를 형성한다.

4. 부위특이적 돌연변이유발에 의하여, 점 돌연변이를 유발시켜T. reesei크실라나아제 II: N11D, T26R, G30H, N67R, N97R, A132R, N157R, A160R, T165N, M169H, S186R의 안정성을 증가시킨다.

본 발명의 방법들

돌연변이되고 재조합된XYNII유전자를 다음과 같은 일반적인 방법을 사용하여 제조하였다:

1. 발현벡터와 효소의 제조

pKKtac 벡터(VTT, Espo, 핀랜드) 또는 pALK143 벡터(ROAL, Rajamaki, 핀랜드)를 사용하여 대장균(E. coli) 계통의 XL1-Blue 또는 Rv308에서T. reesei크실라나아제 II를 생산하였다. PCR을 이용하여T. reesei XYNII유전자를T. reesei의 cDNA로부터 pKKtac 벡터로 직접적으로 클로닝하였다(IPTG에 의한 발현 도입). 또한,T. reesei XYNII유전자를 포함하는 플라즈미드 pALK143을사용한다. 두 벡터 모두 배지로 크실라나아제를 분비하며; 벡터 pKKtac는 펙테이트 리아제(pectate lyase, pelB) 신호 서열에 의하여, 벡터 pALK143은 아밀라아제 신호 서열에 의하여 분비한다.

2. 부위-특이적 돌연변이유발과 재조합 XYNII 유전자의 제조

본 발명의 실시예에 사용되는 변이된T. reesei XYNII유전자는 다음과 같이 제조한다: 변화된 코돈에 대응하는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의하여 변이를 일으켰다. 사용된 올리고뉴클레오타이드의 예를 도 1 및 첨부된 서열목록의 서열번호 1 내지 12에 나타내었다. 퀵 체인지법(Quick Change method; Stratagene, Westburg, Leusden, 네덜란드)와 통상적으로 알려진 방법을 사용하여 프라이머(원하는 변이를 포함하는)를 사용하는 PCR을 수행하였다. DNA 중합효소로서 Pfu Turbo(Stratagene, La Jolla, Ca, 미국)를 사용하였다. 클로닝된E. coli를 레마졸 브릴리언트 블루(Rhemazol Brilliant Blue)와 결합된 크실렌(자작나무 크실렌: Sigma, Steinheim, 독일)를 포함하는 플레이트에서 인큐베이팅시켰다. 콜로니 주변의 할로에서 크실라나아제 활성을 관찰할 수 있었다(Biely 등, 1985).

3. 크실라나아제 활성의 확인

크실렌 섬유의 가수분해로부터 방출되는 당의 감소량을 측정함으로써, 효소샘플의 크실라나아제 활성을 확인하였다. 50 mM 시트레이트-포스페이트 버퍼(Bailey 등, 1992)에서 DNS법을 사용하여 당의 감소량을 측정하였다. 표준 활성 확인을 pH 5 및 50℃에서 수행하였다.

4. 효소의 안정성 확인

상이한 온도에서의 변형된 효소의 반감기를 측정함으로써, 크실라나아제의 안정성을 시험하였다. 효소를 55℃ 또는 65℃에서 다양한 시간동안 인큐베이팅하고 상기와 같은 방법으로 잔류 활성을 측정하였다. 또한, 효소를 다양한 온도에서 10분 동안 배양한 후 DNS법을 사용하여 잔류 활성을 측정함으로써, 고온에서의 안정성을 측정하였다. 다양한 pH 값에서의 효소 활성을 측정함으로써, pH-의존 크실레나아제 활성을 측정하였다. 다양한 온도(10분, pH 5)에서 활성을 측정함으로써, 효소의 최적온도를 확인하였다. 변이된 효소의 특성을 야생형T. reeseiXynII 효소와 비교하였다.

돌연변이 예

실시예 1

상기한 방법을 사용하여 3중(three-fold) 돌연변이(T2C, T28C 및 K58R) 및 재조합 변이(+191D)를T. reeseiXynII에서 수행하였다. 이러한 변이체 효소를 Y5라고 명명하였다. +37℃에서 성장배지로서 루리아 브로스(Luria Broth)를 사용하여 진탕 플라스크에서 인큐베이팅시킨E. coli에서 상기 변이체 효소를 발현시켰다. 인큐베이션 후, 원심분리하여 세포를 제거시키고, 배지로 분비된 크실라나아제의 특성을 상기한 바와 같이 다양한 조건에서 확인하였다. 도 2는 변이체 Y5(T2C,T28C, K58R, +191D)와 야생형 효소(T. reeseiXynII)를 다양한 온도에서 자작나무 크실란과 함께 10 분동안 인큐베이팅시키고, 방출된 당의 상대적 감소량을 DNS법으로 측정했을 때의 효소활성에 대한 온도의 영향을 나타낸다. 상기 돌연변이는 크실라나아제의 최적 온도를 약 15℃ 정도 상승시켰다.

실시예 2

실시예 1과 같은 3중 변이체 크실라나아제(T2C, T28C, K58R, +191D)를 시트레이트-포스페이트 버퍼에서 50℃ 온도로 1% 자작나무 크실렌과 함께 10분 동안 다양한 pH 값에서 인큐베이팅하였다. 도 3은 변이체 및 야생형 크실라나아제에 대한 방출되는 당의 상대적 감소량을 보여준다. 이러한 돌연변이는 효소의 pH-의존 활성을 알칼리성 쪽으로 약간 확장시켰다. 변이체 효소는 pH 7-8에서 야생형 효소보다 더 높은 활성을 보였으며; pH 8 (50℃)에서 변이체 효소의 활성은 약 20% 정도 더 높았다.

실시예 3

상기한 바와 같은 3중 변이체 효소(T2C, T28C, K58R, +191D) 및 야생형 효소를 다양한 온도에서 10 분동안 인큐베이팅시켰다. 인큐베이션 후, 샘플을 냉각시키고 표준 상태에서 잔류 활성을 측정하였다. 야생형 효소는 55 - 60 ℃에서 이미 완전히 불활성화되었다. 변이체 효소는 65℃에서도 자신의 활성의 약 50%를 유지하고 있었다(도 4). 다음의 표 1은 55℃ 및 65℃에서의 변이체 효소(Y5)와 야생형 크실라나아제의 반감기(T1/2)를 보여준다.

	pH 5	pH 8
55 ℃
Y5	안정	안정
야생형 XynII	~ 5 분	~ 2 분
65 ℃
Y5	20 - 25 분	~ 10 분
야생형 XynII	40 초

실시예 4

상기한 방법으로 디설파이드 브리지를 형성시켜(L105C 및 Q162C), α-나선의 C-말단을 인접하는 β-가닥에 결합시켰다.E. coli에서 효소가 생성되었고 그 특성을 측정하였다. 도 5는 상이한 온도에서의 변이체 효소의 인큐베이팅을 야생형 효소와 비교하여 나타낸 것이다. 55℃에서, 변이체 효소의 안정성은 야생형 효소와 비교하여 약 20 배 정도 증가하였으며, 이 때, 반감기는 5 분(야생형 효소)에서 약 1,5 시간(변이체 효소)로 증가하였다.

본 발명은 적용되는 산업 조건에 부합하는 특성을 갖도록 부위특이적 돌연변이유발됨으로써, 열활성 및 열안정성이 증진되고 pH 범위가 확장되어, 펄프 표백, 방직 섬유 변형 및 사료와 관련된 분야에 보다 용이하게 적용가능한 크실라나아제 변이체 효소를 제공한다.

참고문헌

Claims (13)

1. 야생형 효소가

   - 디설파이드 브리지에 의하여 효소의 N-말단 부위를 단백질체에 결합시킴으로써, 및/또는

   - 염다리에 의하여 효소의 C-말단 부위를 단백질체에 결합시킴으로써, 또는

   - 디설파이드 브리지에 의하여 효소의 α-나선을 단백질체에 결합시킴으로써, 또는

   - 단백질 내의 단일 아미노산 돌연변이를 발생시킴으로써 변형된, 상응하는 야생형 크실라나아제와 비교하여 증가된 열안정성 또는 pH 안정성을 갖는 계통 G/11의 변형된 크실라나아제 효소.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 크실라나아제가 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 크실라나아제인 변형된 크실라나아제.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 크실라나아제가 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 크실라나아제 II(XynII)인 변형된 크실라나아제.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소의 C-말단 부위를 단백질체에 결합시키는 것이 아스파르트산(aspartic acid) 또는 글루타민산(glutamicacid)을 C-말단에 첨가하여 상기 첨가된 아미노산과 단백질체 내의 적절한 아미노산 사이에 염다리를 형성시킴으로써 달성되는 변형된 크실라나아제.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소의 N-말단 부위를 효소체에 결합시키는 것이 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 크실라나아제 II(XynII)의 아미노산 T2C와 T28C 사이 또는 G/11 계통의 다른 크실라나아제의 상응하는 아미노산들 사이에 디설파이드 브리지를 형성시킴으로써 달성되는 변형된 크실라나아제.
6. 제 1 항에 있어서, 트리코데르마 레세이(T. reesei) 크실라나아제 II(XynII)의 아미노산 T2와 T28이 시스테인으로 변형되고, K58이 아르기닌으로 변형되고, 효소의 C-말단에 아스파르트산이 첨가(+191D)됨으로써, 아미노산 T2C와 T28C 사이에 디설파이드 브리지가 형성되고 아미노산 K58R과 +191D 사이에 염다리가 형성된 변형된 크실라나아제.
7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 디설파이드 브리지에 의하여 효소의 C-말단을 단백질체에 결합시키는 것이 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 크실라나아제 II(XynII)의 아미노산 L105C와 Q162C 사이, 또는 G/11 계통의 다른 크실라나아제의 상응하는 아미노산들 사이의 디설파이드 브리지에 의하여 α-나선의 C-말단 부위를 인접하는 β-가닥에 결합시킴으로써 달성되는 변형된 크실라나아제.
8. - 디설파이드 브리지에 의하여 효소의 N-말단 부위를 단백질체에 결합시키는 단계, 및/또는

   - 염다리에 의하여 효소의 C-말단 부위를 단백질체에 결합시키는 단계, 또는

   - 디설파이드 브리지에 의하여 효소의 α-나선을 단백질체에 결합시키는 단계, 또는

   - 단백질 내의 단일 아미노산 돌연변이를 발생시키는 단계를 수행하는 것을 포함하는, 계통 G/11 크실라나아제의 열안정성을 향상시키고/또는 pH 범위를 확장시키기 위한 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 아스파르트산 또는 글루타민산을 C-말단에 첨가하여, 첨가된 아미노산과 단백질체의 적절한 아미노산 사이에 염다리를 형성시키는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 트리코데르마 레세이(T. reesei) 크실라나아제 II(XynII) 에서, 첨가된 아스파르트산 또는 글루타민산이 리신 또는 아르기닌으로 변형된 아미노산 58과 염다리는 형성하는 방법.
11. 제 8 항에 있어서, 트리코데르마 레세이(T. reesei) 크실라나아제 II(XynII)에서, 아미노산 T2와 T28을 시스테인으로 변형시키고, K58을 아르기닌으로 변형시키고, 효소의 C-말단에 아스파르트산을 첨가(+191D)함으로써, 아미노산 T2C와 T28C 사이에 디설파이드 브리지를 형성시키고 아미노산 K58R과 +191D 사이에 염다리를 형성시키는 방법.
12. 제 8 항에 있어서, 단일 아미노산 돌연변이를 발생시켜 수행하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 트리코데르마 레세이(T. reesei) 크실라나아제 II(XynII)에서 N11D 변형을 발생시켜 수행하는 방법.