JP2003511066A - ファミリーG/11キシラナーゼの安定性を向上させ、pH領域を広域化する方法 - Google Patents
ファミリーG/11キシラナーゼの安定性を向上させ、pH領域を広域化する方法Info
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Abstract
Description
該酵素をコードする遺伝子に関する。具体的には、本発明はエンド−1,4−β
−キシラナーゼ(EC 3.2.1.8)をコードするTrichoderma reesei XYNII遺伝子
に関する。本発明は部位特異的突然変異誘発を用い、酵素の特性を向上させ、そ
れを用いる工業条件に適合させ得る方法を記載する。キシラナーゼの熱活性およ
び熱安定性を向上させ、またそのpH領域を広域化するのに、タンパク質工学を
用いることができる。
解酵素である。キシラナーゼは少なくとも百種の異なる生物に見出されている。
これらは、他の糖加水分解酵素と共に、40以上の異なる酵素ファミリーを含む
スーパーファミリーを形成する(HenrissatおよびBairoch、1993)。ファミリー1
1(以前は、G)キシラナーゼは、それらの遺伝子配列、タンパク質の立体構造お
よび触媒作用の類似性により規定される。このファミリーのメンバーに共通の特
徴は、高い遺伝子相同性、約20kDaの大きさ、および二重置換触媒機構であ
る(Tenkanen等、1992 ; Wakarchuk等、1994)。
ランド、および1つのα−ヘリックスから主に形成される。これらは、部分的に
閉じた(partly-closed)右手に似る構造を形成し、そのβ−シートはA−および
B−シートと呼ばる(ToerroenenおよびRouvinen、1997)。このファミリー11キ
シラナーゼは、構造が安定で、タンパク質分解酵素活性に対して感受性ではない
ために、特に産業上の応用に関心がある。更に、キシラナーゼは工業規模におい
て経済的に製造できる。Trichoderma reeseiは、キシラナーゼIおよびII(Xyn
IおよびXynII)が最も特徴的な3つの異なるキシラナーゼを産生すると知られ
ている(Tenkanen等、1992)。XynIは19kDaの大きさであり、XynIIと
比較して等電点および最適pHが低い(pI5.5、pH3〜4)。XynIIは2
0kDaの大きさであり、pIは9.0、および最適pHは5.0〜5.5である(
ToerroenenおよびRouvinen、1995)。
び動物給餌におけるその消化を改良するバイオマス改変である(Prade、1996)。
これら全ての応用に共通する事項(nominator)は、この酵素が直面する過酷な条
件である。高温および多くのキシラナーゼの最適pHと実質的に異なるpHによ
り産業上の応用に現在使用できるキシラナーゼの効果的な利用性が減じられてい
る。
0℃にて2〜5分)直面する。しかし、この酵素の事実上の触媒活性には、低温(
例えば、〜37℃)を要する。それ故、この酵素は高温において不可逆的に不活
性化されるべきではない上に、比較的低温において活性でなければならない。
(>10)である。商業的に利用できるキシラナーゼで、これらの条件において残
存するものはない。現在利用できるキシラナーゼを用いてパルプを処理するには
、パルプを冷却し、アルカリ性pHを中性化しなければならない。これはコスト
高になることを意味する。キシラナーゼを安定にし、高温および高pHの変性効
果に対して耐性にするために、タンパク質工学が用いられている(これは時折、
成功している)。
発見され、クローニングされた(Bodie等、1995; Fukunaga等、1998)。しかし、
これらの酵素を経済的な量で生産することは、多くの場合困難であることが明ら
かにされている。従って、それ自体は熱安定でないT. reeseiキシラナーゼIIが
低コストで大量に生産できるため、工業的に使用される。新規キシラナーゼを単
離する、または生産過程を開発する代わりに、現在用いられているキシラナーゼ
を巧みに処理することにより、過酷な条件に対してより安定化させることができ
る。
に結合させること、およびα−ヘリックスのN末端部分を隣接するβ−ストラン
ドに結合させることによって、ジスルフィド架橋により向上された(Wakarchuk等
、1994)。また、Campbell等(1995)は、熱安定性を増大させるために分子間およ
び分子内ジスルフィド結合により、Bacillus circulansキシラナーゼを改変した
。他方、T. reeseiキシラナーゼIIの安定性はN末端領域を好熱性キシラナーゼ
の対応部分に変更することにより向上された(Sung等、1998)。この酵素の活性領
域は、熱安定性の向上に加え、アルカリ性pH側に広がった。また、Bacillus p
umilusキシラナーゼの安定性を増大させるため、単一点突然変異誘発も用いられ
ている(Arase等、1993)。安定性に対する突然変異誘発の影響が、他の多くの酵
素について研究されている。好熱性および中温性酵素の構造を比較することで、
情報が豊富に得られた(Vogt等、1997)。また、好熱性キシラナーゼの構造情報に
よって、キシラナーゼの熱安定性に影響を及ぼす因子に関する情報が得られてい
る(Gruber等、1998;Harris等、1997)。
関する。本発明はキシラナーゼの熱安定性、熱活性を変更するように改変したキ
シラナーゼ、および/またはそれらのpH領域を広域化したキシラナーゼを提供
する。
以下の変更: (1)N末端領域をジスルフィド架橋(例えば、T2CとT28C;P5CとN
19C;T7CとS16C;N10CとN29Cの突然変異の組みにより形成さ
れる架橋)によって、該タンパク質本体に結合させることによって、当該酵素の
安定性を増大させ、 (2)アルギニン58(野生型酵素中のリシン58をアルギニンに変更した(K
58R))と塩橋を形成する付加したアスパラギン酸(+191D)により伸張する
ことによって、C末端を安定化し、 (3)α−へリックスをジスルフィド架橋により該酵素本体(例えば、L105
CおよびQ162C)に結合させることによって、当該酵素の安定性を増大させ
、 (4)種々の位置(N11D、T26R、G30H、N67R、N97R、A1
32R、N157R、A160R、T165N、M169H、S186R)に点
突然変異を誘発し、キシラナーゼの安定性を向上させること を単独または組み合わせることのいずれかによって行なう。
8をアルギニンに変更し、そしてアスパラギン酸を該酵素のC末端に付加(+1
91D)することで、アミノ酸T2CとT28Cとの間にジスルフィド架橋、お
よびアミノ酸K58Rと+191Dとの間に塩橋を形成させた改変Trichoderma r
eeseiキシラナーゼを提供する。
構造を有する。そのようなキシラナーゼの例としては、以下: Aspergillus niger XynA Aspergillus kawachii XynC Aspergillus tubigensis XynA Bacillus circulans XynA Bacillus pumilus XynA Bacillus subtilis XynA Neocallimastix patriciarum XynA Streptomyces lividans XynB Streptomyces lividans XynC Streptomyces thermoviolaceus XynII Thermomonospora fusca XynA Trichoderma harzianum Xyn Trichoderma reesei XynI、Trichoderma reesei XynII Trichoderma viride Xyn がある。
扱う。
ゼにおける、A−およびB−シート、(Gruber等、1998))の一部であり、第一の
β−ストランド(T. reesei XynIIにおける、アミノ酸5〜10)、またはその
N末端がジスルフィド架橋により隣接するβ−ストランド(T. reesei XynII
における、アミノ酸13〜19)、若しくは他の隣接する領域と結合できる酵素
。
reesei XynIIにおけるアミノ酸183〜190)を形成し、そのC末端領域が
ジスルフィド架橋により隣接するβ−ストランドに、または塩橋により該酵素本
体に結合できる酵素。
クスを有し、該α−へリックスまたは隣接する領域がジスルフィド架橋によって
、該タンパク質本体により密接に結合できる酵素。
H安定性および熱活性は、これらの特性に基づいて改変できる。以下の変更を、
T. reeseiのキシラナーゼ遺伝子(XYNII)に対して行なった。
せる:* スレオニン2および28をシステインに変更することにより、それら(T2Cと
T28C)の間にジスルフィド架橋を形成させる。* プロリン5およびアスパラギン19をシステインに変更することにより、それ
ら(P5CとN19C)の間にジスルフィド架橋を形成させる。* スレオニン7およびセリン16をシステインに変更することにより、それら(T
7CとS16C)の間にジスルフィド架橋を形成させる。* アスパラギン10およびアスパラギン29をシステインに変更することにより
、それら(N10CとN29C)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
に対し、1つのアミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)を加える
ことで、C末端から該酵素本体に対する塩橋を形成させ、C末端を該酵素本体に
更に密接に結合させる。適切な場合、塩橋が形成するように、該タンパク質本体
に適当なアミノ酸置換を行なうことができる。 *アスパラギン酸(+191D)をC末端セリン(S190)に付加する。これに
より、野生型リシンをアルギニンに置換(K58R)したアルギニン58と塩橋を
形成させる。
α−ヘリックスに近接する領域に、少なくとも1つのジスルフィド架橋を形成さ
せ、当該酵素を安定にする。 *ロイシン105およびグルタミン162をシステインに変更し、それら(L1
05CとQ162C)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
H、N67R、N97R、A132R、N157R、A160R、T165N、
M169H、S186Rが、T. reeseiキシラナーゼIIの安定性を増大させる。
た。
LK143(ROAL、フィンランド、ラジャメキ(Rajamaeki))を用い、大腸菌
株XLI-BlueまたはRv308において、T. reeseiキシラナーゼIIを産生
した。T. reesei XYNII遺伝子は、T. resseiのcDNAからPCRによりベ
クターpKKtac(IPTGによる発現誘導)に、直接クローニングした。その
代わりとして、T. reesei XYNII遺伝子を含有するプラスミドpALK143
を用いた。ベクターpKKtacのペクチン酸リアーゼ(pelB)シグナル配列
およびベクターpALK143のアミラーゼシグナル配列により、両ベクターは
培地中にキシラナーゼを分泌する。
以下のように行なった:変更コドンに対する配列を含むオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、突然変異を誘発した。用
いたオリゴヌクレオチドの例としては、図1並びに配列1〜12として添付する
配列表がある。プライマー(所望の突然変異を含む)を用いるPCRは、クイック
チェンジ法(Quick Change method)(ストラタジーン(Stratagene)、オランダ、レ
ウゼン(Leusden)、ウェストバーグ(Westburg))および遺伝的に既知の方法によっ
て行った。Pfu Turbo(ストラタジーン、米国、カルフォルニア、ラ・ホーヤ)を
DANポリメラーゼとして用いた。クローニングした大腸菌株を、レマゾ−ルブ
リリアントブルー(Rhemazol Brilliant Blue)にカップリングされたキシラン(ビ
ーチウッド(birchwood)キシラン:シグマ(Sigma)、ドイツ、シュタインハイム)
を含むプレート上にて培養した。キシラナーゼ活性はコロニー周辺のハローとし
て見ることができた(Biely等、1985)。
元糖の量を測定することで決定した。還元糖は50mMクエン酸−リン酸緩衝液
中にてDNS法(Bailey等、1992)により測定した。標準的な活性決定はpH5お
よび50℃にて行なった。
とにより試験した。酵素を55℃または65℃にて様々な時間インキュベートし
、残基活性を上述のように測定した。様々な温度にて、酵素を10分間インキュ
ベートし、次いでDNS法により残基活性を測定することによって、高温におけ
る安定性もまた測定した。pH依存性のキシラナーゼ活性は、様々なpH値にお
いて酵素活性を決定することによって測定した。酵素の最適温度は、様々な温度
(10分、pH5)にて活性を測定することにより決定した。突然変異型酵素の特
性を野生型 T. reesei XYNII酵素と比較した。
を、上述の方法を用いてT. reesei XynII中に生成させた。突然変異型酵素を
Y5と称する。該突然変異型酵素を大腸菌中において発現させ、培養培地として
ルリアブロース(Luria Broth)を用いて振とうフラスコ中37℃にて、この大腸
菌を培養した。培養後、この細胞を遠心分離により除去し、培地中に分泌された
キシラナーゼを、上述のように様々な条件において特徴づけした。図2には、突
然変異型Y5(T2C、T28C、K58R、+191D)および野生型酵素(T.
reesei XynII)を様々な温度においてビーチウッドキシランと共に10分間イ
ンキュベートし、遊離した還元糖の相対量を、DNS法を用いて測定した場合の
酵素活性に対する温度効果を示す。該突然変異体はキシラナーゼの最適温度が約
15℃高まった。
+191D)を、クエン酸−リン酸緩衝液中50℃にて、1%ビーチウッドキシ
ラン中、様々なpH値において10分間インキュベートした。図3は突然変異型
および野生型キシラナーゼについて放出された還元糖の相対量を示す。この突然
変異は酵素のpH依存性活性を、わずかにアルカリ性側へ広げた。この突然変異
型酵素は、pH7〜8において野生型酵素よりも、より活性(突然変異型酵素の
活性はpH8(50℃)において約20%高かった)であった。
素を様々な温度にて10分間インキュベートした。インキュベート後、この試料
を冷却し、残基活性を標準的な条件にて決定した。野生型酵素を、予め55〜6
0℃にて完全にインキュベートした。この突然変異型酵素は、65℃においてさ
え、その活性の約50%が残存していた(図4)。以下に示す表1において、55
℃および65℃における突然変異型(Y5)および野生型キシラナーゼの半減期(
T1/2)を示す。
させ、α−ヘリックスのC末端を隣接するβ−ストランドに結合させた。この酵
素を大腸菌中に産生させ、その特性を決定した。図5では、種々の温度にて、野
生型酵素と比較した突然変異型酵素の不活性化を示す。55℃における突然変異
型酵素の安定性は、野生型酵素に対して約20倍に増大し、それにより半減期は
5分(野生型酵素)から約1.5時間(突然変異型酵素)に増大した。
。ランダム突然変異誘発によるキシラナーゼの安定化。FEBS Letters 316,123-7
。 Bailey, J. M., Biely, P. & Poutanen, K. (1992)。キシラナーゼ活性の検定法
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ゼおよびエンド-1,4-β-グルカナーゼ検定についての可溶性色素基質。Analytic
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95)。米国特許第5,405,769号。 Fukunaga, N., Iwasaki, Y., Kono. S., Kita, Y. & Izumi, Y. (1998)。米国特
許第5,736,384号。 Gruber, K., Klintschar, G., Hayn, M., Schlacher, A., Steiner. W. & Kratk
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よびイオン対。Journal of Molecular Biology 269,631-43。
ヌクレオチドの組みである。また、この配列は添付する配列表中、配列1〜12
としても提供する。
C、K58Rおよび+191Dの効果を示すグラフである(WTは野生型酵素で
あり、Y5は突然変異型T. reesei XynIIである)。
T28C、K58Rおよび+191Dの効果を示すグラフである(WTおよびY
5は図2と同様である)。
然変異T2C、T28C、K58Rおよび+191Dの効果を示すグラフである
(WTおよびY5は図2と同様である)。
然変異Q162CおよびL105Cの効果を示すグラフである(W.t.は野生型酵
素である)。
Claims (13)
- 【請求項1】 ファミリーG/11の野生型キシラナーゼ酵素に相当する野
生型キシラナーゼに対して熱安定性またはpH安定性が増大されたファミリーG
/11の改変キシラナーゼ酵素であって、当該野生型酵素のN末端領域をジスル
フィド架橋により該タンパク質本体に結合させること、および/または、当該野
生型酵素のC末端領域を塩橋により該タンパク質本体に結合させること、または
、当該野生型酵素のα−へリックスをジスルフィド架橋により該タンパク質本体
に結合させること、または、該タンパク質に単一アミノ酸突然変異を誘発するこ
とにより、当該野生型キシラナーゼ酵素が改変されている、ファミリーG/11
の改変キシラナーゼ酵素。 - 【請求項2】 該キシラナーゼがTrichoderma reeseiキシラナーゼである、
請求項1に記載の改変キシラナーゼ。 - 【請求項3】 該キシラナーゼがTrichoderma reeseiキシラナーゼII(Xy
nII)である、請求項2に記載の改変キシラナーゼ。 - 【請求項4】 当該酵素のC末端領域にアスパラギン酸またはグルタミン酸
を付加した結果、付加したアミノ酸と該タンパク質本体中の適当なアミノ酸との
間に塩橋が形成されることによって、当該酵素のC末端領域が該タンパク質本体
と結合している、請求項1〜3のいずれかに記載の改変キシラナーゼ。 - 【請求項5】 Trichoderma reeseiキシラナーゼII(XynII)のアミノ酸T
2CとT28Cとの間に、またはファミリーG/11の他のキシラナーゼの相当
するアミノ酸間にジスルフィド架橋が形成されることによって、当該酵素のN末
端領域が該タンパク質本体に結合している、請求項1〜4のいずれかに記載の改
変キシラナーゼ。 - 【請求項6】 T. reeseiキシラナーゼII(XynII)のアミノ酸T2および
T28をシステインに変更し、K58をアルギニンに変更し、そしてアスパラギ
ン酸を当該酵素のC末端に付加(+191D)することによって、アミノ酸T2C
とT28Cとの間にジスルフィド架橋が、およびアミノ酸K58Rと+191D
との間に塩橋が形成されている、請求項1に記載の改変キシラナーゼ。 - 【請求項7】 Trichoderma reeseiキシラナーゼII(XynII)のアミノ酸L
105CとQ162Cとの間、またはファミリーG/11の他のキシラナーゼの
相当するアミノ酸間のジスルフィド架橋により、α−へリックスのC末端部分を
隣接するβ−ストランドに結合させることによって、当該酵素のC末端領域がジ
スルフィド架橋により該タンパク質本体に結合している、請求項1〜3のいずれ
かに記載の改変キシラナーゼ。 - 【請求項8】 ファミリーG/11キシラナーゼの熱安定性を向上させ、お
よび/またはpH領域を広域化する方法であって、当該酵素のN末端領域をジス
ルフィド架橋により該タンパク質本体に結合させること、および/または、当該
酵素のC末端領域を塩橋により該タンパク質本体に結合させること、または、当
該酵素のα−へリックスをジスルフィド架橋により該タンパク質本体に結合させ
ること、または、該タンパク質中に単一アミノ酸突然変異を誘発する過程を含む
方法。 - 【請求項9】 アスパラギン酸またはグルタミン酸を当該C末端領域に付加
することにより、付加したアミノ酸と該タンパク質本体中の適当なアミノ酸との
間に塩橋を形成させる、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 T. reeseiキシラナーゼ(XynII)において、付加したア
スパラギン酸またはグルタミン酸が、リシンまたはアルギニンに変更したアミノ
酸58間で塩橋を形成する、請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 T. reeseiキシラナーゼ(XynII)において、アミノ酸T
2およびT28をシステインに変更し、K58をアルギニンに変更し、そしてア
スパラギン酸を当該酵素のC末端に付加(+191D)することで、アミノ酸T2
CとT28Cとの間にジスルフィド架橋、およびアミノ酸K58Rと+191D
との間に塩橋を形成させる、請求項8に記載の方法。 - 【請求項12】 単一アミノ酸突然変異を誘発する、請求項8に記載の方法
。 - 【請求項13】 T. reesei XynIIにおいてN11D改変を行なう、請求
項12に記載の方法。
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