JP4647169B2 - ファミリーＧ／１１キシラナーゼの安定性を向上させ、ｐＨ領域を広域化する方法 - Google Patents

ファミリーＧ／１１キシラナーゼの安定性を向上させ、ｐＨ領域を広域化する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP4647169B2
JP4647169B2 JP2001530457A JP2001530457A JP4647169B2 JP 4647169 B2 JP4647169 B2 JP 4647169B2 JP 2001530457 A JP2001530457 A JP 2001530457A JP 2001530457 A JP2001530457 A JP 2001530457A JP 4647169 B2 JP4647169 B2 JP 4647169B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
xylanase
enzyme
xylanases
xynii
trichoderma reesei
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2001530457A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2003511066A (ja
Inventor
フレッド・フェネル
オッシ・トゥルネン
マッティ・レイソラ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danisco US Inc
Original Assignee
Danisco US Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Danisco US Inc filed Critical Danisco US Inc
Publication of JP2003511066A publication Critical patent/JP2003511066A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4647169B2 publication Critical patent/JP4647169B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【０００１】
【発明の技術分野】
本発明はタンパク質工学に関し、特にファミリーＧ／１１キシラナーゼおよび該酵素をコードする遺伝子に関する。具体的には、本発明はエンド−１,４−β−キシラナーゼ(EC 3.2.1.8)をコードするTrichoderma reesei ＸＹＮII遺伝子に関する。本発明は部位特異的突然変異誘発を用い、酵素の特性を向上させ、それを用いる工業条件に適合させ得る方法を記載する。キシラナーゼの熱活性および熱安定性を向上させ、またそのｐＨ領域を広域化するのに、タンパク質工学を用いることができる。
【０００２】
【発明の技術背景】
キシラナーゼはβ−１,４−連結キシロピラノシド鎖を加水分解する糖加水分解酵素である。キシラナーゼは少なくとも百種の異なる生物に見出されている。これらは、他の糖加水分解酵素と共に、４０以上の異なる酵素ファミリーを含むスーパーファミリーを形成する(HenrissatおよびBairoch、1993)。ファミリー１１(以前は、Ｇ)キシラナーゼは、それらの遺伝子配列、タンパク質の立体構造および触媒作用の類似性により規定される。このファミリーのメンバーに共通の特徴は、高い遺伝子相同性、約２０ｋＤａの大きさ、および二重置換触媒機構である(Tenkanen等、1992 ; Wakarchuk等、1994)。
【０００３】
ファミリー１１キシラナーゼは、２つの大きいβ−シートを形成するβ−ストランド、および１つのα−ヘリックスから主に形成される。これらは、部分的に閉じた(partly-closed)右手に似る構造を形成し、そのβ−シートはＡ−およびＢ−シートと呼ばる(ToerroenenおよびRouvinen、1997)。このファミリー１１キシラナーゼは、構造が安定で、タンパク質分解酵素活性に対して感受性ではないために、特に産業上の応用に関心がある。更に、キシラナーゼは工業規模において経済的に製造できる。Trichoderma reeseiは、キシラナーゼIおよびII(ＸｙｎIおよびＸｙｎII)が最も特徴的な３つの異なるキシラナーゼを産生すると知られている(Tenkanen等、1992)。ＸｙｎIは１９ｋＤａの大きさであり、ＸｙｎIIと比較して等電点および最適ｐＨが低い(ｐＩ５.５、ｐＨ３〜４)。ＸｙｎIIは２０ｋＤａの大きさであり、ｐＩは９.０、および最適ｐＨは５.０〜５.５である(ToerroenenおよびRouvinen、1995)。
【０００４】
キシラナーゼの最も重要な産業上の応用は、パルプ漂白、織物繊維改変、および動物給餌におけるその消化を改良するバイオマス改変である(Prade、1996)。これら全ての応用に共通する事項(nominator)は、この酵素が直面する過酷な条件である。高温および多くのキシラナーゼの最適ｐＨと実質的に異なるｐＨにより産業上の応用に現在使用できるキシラナーゼの効果的な利用性が減じられている。
【０００５】
給餌応用において、この酵素は給餌調製の間、高温状態に短時間(例えば、９０℃にて２〜５分)直面する。しかし、この酵素の事実上の触媒活性には、低温(例えば、〜３７℃)を要する。それ故、この酵素は高温において不可逆的に不活性化されるべきではない上に、比較的低温において活性でなければならない。
【０００６】
パルプ漂白において、アルカリ洗浄由来の物質は高温(＞８０℃)および高ｐＨ(＞１０)である。商業的に利用できるキシラナーゼで、これらの条件において残存するものはない。現在利用できるキシラナーゼを用いてパルプを処理するには、パルプを冷却し、アルカリ性ｐＨを中性化しなければならない。これはコスト高になることを意味する。キシラナーゼを安定にし、高温および高ｐＨの変性効果に対して耐性にするために、タンパク質工学が用いられている(これは時折、成功している)。
【０００７】
幾らかの熱安定、好アルカリ性および好酸性キシラナーゼが、好熱性生物から発見され、クローニングされた(Bodie等、1995; Fukunaga等、1998)。しかし、これらの酵素を経済的な量で生産することは、多くの場合困難であることが明らかにされている。従って、それ自体は熱安定でないT. reeseiキシラナーゼIIが低コストで大量に生産できるため、工業的に使用される。新規キシラナーゼを単離する、または生産過程を開発する代わりに、現在用いられているキシラナーゼを巧みに処理することにより、過酷な条件に対してより安定化させることができる。
【０００８】
Bacillus circulansキシラナーゼの安定性が、該タンパク質のＮ末端をＣ末端に結合させること、およびα−ヘリックスのＮ末端部分を隣接するβ−ストランドに結合させることによって、ジスルフィド架橋により向上された(Wakarchuk等、1994)。また、Campbell等(1995)は、熱安定性を増大させるために分子間および分子内ジスルフィド結合により、Bacillus circulansキシラナーゼを改変した。他方、T. reeseiキシラナーゼIIの安定性はＮ末端領域を好熱性キシラナーゼの対応部分に変更することにより向上された(Sung等、1998)。この酵素の活性領域は、熱安定性の向上に加え、アルカリ性ｐＨ側に広がった。また、Bacillus pumilusキシラナーゼの安定性を増大させるため、単一点突然変異誘発も用いられている(Arase等、1993)。安定性に対する突然変異誘発の影響が、他の多くの酵素について研究されている。好熱性および中温性酵素の構造を比較することで、情報が豊富に得られた(Vogt等、1997)。また、好熱性キシラナーゼの構造情報によって、キシラナーゼの熱安定性に影響を及ぼす因子に関する情報が得られている(Gruber等、1998；Harris等、1997)。
【０００９】
【発明の概要】
本発明はファミリー１１(以前は、Ｇ)糖加水分解酵素に属するキシラナーゼに関する。本発明はキシラナーゼの熱安定性、熱活性を変更するように改変したキシラナーゼ、および／またはそれらのｐＨ領域を広域化したキシラナーゼを提供する。
【００１０】
Trichoderma reeseiキシラナーゼ構造における種々の改変は、本発明に記載の以下の変更：
(１）Ｎ末端領域をジスルフィド架橋(例えば、Ｔ２ＣとＴ２８Ｃ；Ｐ５ＣとＮ１９Ｃ；Ｔ７ＣとＳ１６Ｃ；Ｎ１０ＣとＮ２９Ｃの突然変異の組みにより形成される架橋)によって、該タンパク質本体に結合させることによって、当該酵素の安定性を増大させ、
(２）アルギニン５８(野生型酵素中のリシン５８をアルギニンに変更した(Ｋ５８Ｒ))と塩橋を形成する付加したアスパラギン酸(＋１９１Ｄ)により伸張することによって、Ｃ末端を安定化し、
(３）α−へリックスをジスルフィド架橋により該酵素本体(例えば、Ｌ１０５ＣおよびＱ１６２Ｃ)に結合させることによって、当該酵素の安定性を増大させ、
(４）種々の位置(Ｎ１１Ｄ、Ｔ２６Ｒ、Ｇ３０Ｈ、Ｎ６７Ｒ、Ｎ９７Ｒ、Ａ１３２Ｒ、Ｎ１５７Ｒ、Ａ１６０Ｒ、Ｔ１６５Ｎ、Ｍ１６９Ｈ、Ｓ１８６Ｒ)に点突然変異を誘発し、キシラナーゼの安定性を向上させること
を単独または組み合わせることのいずれかによって行なう。
【００１１】
具体的には、本発明はアミノ酸Ｔ２およびＴ２８をシステインに変更し、Ｋ５８をアルギニンに変更し、そしてアスパラギン酸を該酵素のＣ末端に付加(＋１９１Ｄ)することで、アミノ酸Ｔ２ＣとＴ２８Ｃとの間にジスルフィド架橋、およびアミノ酸Ｋ５８Ｒと+１９１Ｄとの間に塩橋を形成させた改変Trichoderma reeseiキシラナーゼを提供する。
【００１２】
【本発明の詳しい説明】
細菌、酵母および菌類由来のファミリーＧ／１１キシラナーゼは、共通の分子構造を有する。そのようなキシラナーゼの例としては、以下：
Aspergillus niger XynA
Aspergillus kawachii XynC
Aspergillus tubigensis XynA
Bacillus circulans XynA
Bacillus pumilus XynA
Bacillus subtilis XynA
Neocallimastix patriciarum XynA
Streptomyces lividans XynB
Streptomyces lividans XynC
Streptomyces thermoviolaceus XynII
Thermomonospora fusca XynA
Trichoderma harzianum Xyn
Trichoderma reesei XynI、Trichoderma reesei XynII
Trichoderma viride Xyn
がある。
【００１３】
本発明は、以下の共通する特徴を有するファミリーＧ／１１のキシラナーゼを扱う。
【００１４】
（ｉ）Ｎ末端配列が二重の層になったβ−シート(ファミリー１１キシラナーゼにおける、Ａ−およびＢ−シート、(Gruber等、1998))の一部であり、第一のβ−ストランド(T. reesei ＸｙｎIIにおける、アミノ酸５〜１０)、またはそのＮ末端がジスルフィド架橋により隣接するβ−ストランド(T. reesei ＸｙｎIIにおける、アミノ酸１３〜１９)、若しくは他の隣接する領域と結合できる酵素。
【００１５】
（ii）Ｃ末端ペプチド鎖が大きいβ−シートの一部であるβ−ストランド(T. reesei ＸｙｎIIにおけるアミノ酸１８３〜１９０)を形成し、そのＣ末端領域がジスルフィド架橋により隣接するβ−ストランドに、または塩橋により該酵素本体に結合できる酵素。
【００１６】
（iii）触媒性キャニオン(canyon)に関して、酵素構造の反対側にα−へリックスを有し、該α−へリックスまたは隣接する領域がジスルフィド架橋によって、該タンパク質本体により密接に結合できる酵素。
【００１７】
T. reeseiキシラナーゼIIが上記特性を有し、該酵素において、熱安定性、ｐＨ安定性および熱活性は、これらの特性に基づいて改変できる。以下の変更を、T. reeseiのキシラナーゼ遺伝子(ＸＹＮII)に対して行なった。
【００１８】
１．部位特異的突然変異誘発により、ジスルフィド架橋をＮ末端領域に形成させる：
*スレオニン２および２８をシステインに変更することにより、それら(Ｔ２ＣとＴ２８Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
*プロリン５およびアスパラギン１９をシステインに変更することにより、それら(Ｐ５ＣとＮ１９Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
*スレオニン７およびセリン１６をシステインに変更することにより、それら(Ｔ７ＣとＳ１６Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
*アスパラギン１０およびアスパラギン２９をシステインに変更することにより、それら(Ｎ１０ＣとＮ２９Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
【００１９】
２．部位特異的突然変異により、組換え的変更として、キシラナーゼのＣ末端に対し、１つのアミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)を加えることで、Ｃ末端から該酵素本体に対する塩橋を形成させ、Ｃ末端を該酵素本体に更に密接に結合させる。適切な場合、塩橋が形成するように、該タンパク質本体に適当なアミノ酸置換を行なうことができる。
*アスパラギン酸(＋１９１Ｄ)をＣ末端セリン(Ｓ１９０)に付加する。これにより、野生型リシンをアルギニンに置換(Ｋ５８Ｒ)したアルギニン５８と塩橋を形成させる。
【００２０】
３．部位特異的突然変異により、α−へリックスを介する該Ｃ末端部分またはα−ヘリックスに近接する領域に、少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成させ、当該酵素を安定にする。
*ロイシン１０５およびグルタミン１６２をシステインに変更し、それら(Ｌ１０５ＣとＱ１６２Ｃ)の間にジスルフィド架橋を形成させる。
【００２１】
４．部位特異的突然変異誘発による点突然変異: Ｎ１１Ｄ、Ｔ２６Ｒ、Ｇ３０Ｈ、Ｎ６７Ｒ、Ｎ９７Ｒ、Ａ１３２Ｒ、Ｎ１５７Ｒ、Ａ１６０Ｒ、Ｔ１６５Ｎ、Ｍ１６９Ｈ、Ｓ１８６Ｒが、T. reeseiキシラナーゼIIの安定性を増大させる。
【００２２】
【本発明の方法】
突然変異および組換えＸＹＮII遺伝子の産生は、以下の基本手順により行なった。
【００２３】
１．発現ベクターおよび酵素産生
ベクターｐＫＫｔａｃ(ＶＴＴ、フィンランド、エスポー)またはベクターｐＡＬＫ１４３(ＲＯＡＬ、フィンランド、ラジャメキ(Rajamaeki))を用い、大腸菌株ＸＬI-ＢｌｕｅまたはＲｖ３０８において、T. reeseiキシラナーゼIIを産生した。T. reesei ＸＹＮII遺伝子は、T. resseiのｃＤＮＡからＰＣＲによりベクターｐＫＫｔａｃ(ＩＰＴＧによる発現誘導)に、直接クローニングした。その代わりとして、T. reesei ＸＹＮII遺伝子を含有するプラスミドｐＡＬＫ１４３を用いた。ベクターｐＫＫｔａｃのペクチン酸リアーゼ(ｐｅｌＢ)シグナル配列およびベクターｐＡＬＫ１４３のアミラーゼシグナル配列により、両ベクターは培地中にキシラナーゼを分泌する。
【００２４】
２．部位特異的突然変異誘発および組換えＸＹＮII遺伝子の生産
本発明の実施例において用いた突然変異T. ressei ＸＹＮII遺伝子の産生は、以下のように行なった：変更コドンに対する配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、突然変異を誘発した。用いたオリゴヌクレオチドの例としては、図１並びに配列１〜１２として添付する配列表がある。プライマー(所望の突然変異を含む)を用いるＰＣＲは、クイックチェンジ法(Quick Change method)(ストラタジーン(Stratagene)、オランダ、レウゼン(Leusden)、ウェストバーグ(Westburg))および遺伝的に既知の方法によって行った。Pfu Turbo(ストラタジーン、米国、カルフォルニア、ラ・ホーヤ)をＤＡＮポリメラーゼとして用いた。クローニングした大腸菌株を、レマゾ−ルブリリアントブルー(Rhemazol Brilliant Blue)にカップリングされたキシラン(ビーチウッド(birchwood)キシラン：シグマ(Sigma)、ドイツ、シュタインハイム)を含むプレート上にて培養した。キシラナーゼ活性はコロニー周辺のハローとして見ることができた(Biely等、1985)。
【００２５】
３．キシラナーゼ活性の決定
酵素試料のキシラナーゼ活性は、加水分解したキシラン繊維から分離された還元糖の量を測定することで決定した。還元糖は５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液中にてＤＮＳ法(Bailey等、1992)により測定した。標準的な活性決定はｐＨ５および５０℃にて行なった。
【００２６】
４．酵素の安定性の決定
キシラナーゼの安定性は、種々の温度にて改変した酵素の半減期を測定することにより試験した。酵素を５５℃または６５℃にて様々な時間インキュベートし、残基活性を上述のように測定した。様々な温度にて、酵素を１０分間インキュベートし、次いでＤＮＳ法により残基活性を測定することによって、高温における安定性もまた測定した。ｐＨ依存性のキシラナーゼ活性は、様々なｐＨ値において酵素活性を決定することによって測定した。酵素の最適温度は、様々な温度(１０分、ｐＨ５)にて活性を測定することにより決定した。突然変異型酵素の特性を野生型 T. reesei ＸＹＮII酵素と比較した。
【００２７】
【突然変異の実施例】
実施例１
三重突然変異(Ｔ２Ｃ、Ｔ２８ＣとＫ５８Ｒ)および組換え的変更(＋１９１Ｄ)を、上述の方法を用いてT. reesei ＸｙｎII中に生成させた。突然変異型酵素をＹ５と称する。該突然変異型酵素を大腸菌中において発現させ、培養培地としてルリアブロース(Luria Broth)を用いて振とうフラスコ中３７℃にて、この大腸菌を培養した。培養後、この細胞を遠心分離により除去し、培地中に分泌されたキシラナーゼを、上述のように様々な条件において特徴づけした。図２には、突然変異型Ｙ５(Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒ、＋１９１Ｄ)および野生型酵素(T. reesei ＸｙｎII)を様々な温度においてビーチウッドキシランと共に１０分間インキュベートし、遊離した還元糖の相対量を、ＤＮＳ法を用いて測定した場合の酵素活性に対する温度効果を示す。該突然変異体はキシラナーゼの最適温度が約１５℃高まった。
【００２８】
実施例２
実施例１に記載の三重突然変異キシラナーゼ(Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒ、＋１９１Ｄ)を、クエン酸−リン酸緩衝液中５０℃にて、１％ビーチウッドキシラン中、様々なｐＨ値において１０分間インキュベートした。図３は突然変異型および野生型キシラナーゼについて放出された還元糖の相対量を示す。この突然変異は酵素のｐＨ依存性活性を、わずかにアルカリ性側へ広げた。この突然変異型酵素は、ｐＨ７〜８において野生型酵素よりも、より活性(突然変異型酵素の活性はｐＨ８(５０℃)において約２０％高かった)であった。
【００２９】
実施例３
上記三重突然変異(Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒ、＋１９１Ｄ)および野生型酵素を様々な温度にて１０分間インキュベートした。インキュベート後、この試料を冷却し、残基活性を標準的な条件にて決定した。野生型酵素を、予め５５〜６０℃にて完全にインキュベートした。この突然変異型酵素は、６５℃においてさえ、その活性の約５０％が残存していた(図４)。以下に示す表１において、５５℃および６５℃における突然変異型(Ｙ５)および野生型キシラナーゼの半減期(Ｔ１／２)を示す。
【表１】
Figure 0004647169
【００３０】
実施例４
上述の方法を用いて、ジスルフィド架橋(Ｌ１０５ＣおよびＱ１６２Ｃ)を形成させ、α−ヘリックスのＣ末端を隣接するβ−ストランドに結合させた。この酵素を大腸菌中に産生させ、その特性を決定した。図５では、種々の温度にて、野生型酵素と比較した突然変異型酵素の不活性化を示す。５５℃における突然変異型酵素の安定性は、野生型酵素に対して約２０倍に増大し、それにより半減期は５分(野生型酵素)から約１.５時間(突然変異型酵素)に増大した。
【００３１】
【文献】
Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y. & Okada, H. (1993)。ランダム突然変異誘発によるキシラナーゼの安定化。FEBS Letters 316,123-7。
Bailey, J. M., Biely, P. & Poutanen, K. (1992)。キシラナーゼ活性の検定法の研究室内試験。J. Biotech. 23,257-270。
Biely, P., Mislovicova, D. & Toman, R. (1985)。エンド-1,4-β-キシラナーゼおよびエンド-1,4-β-グルカナーゼ検定についての可溶性色素基質。Analytical Biochemistry 144,142-6。
Bodie, E., Cuevas, W. A. & Koljonen, M. (1995)。米国特許第5,437,992号。
Campbell, R.L., Rose, D.R., Sung, W.L., Yaguchi, M. & Wakarchuck, W. (1995)。米国特許第5,405,769号。
Fukunaga, N., Iwasaki, Y., Kono. S., Kita, Y. & Izumi, Y. (1998)。米国特許第5,736,384号。
Gruber, K., Klintschar, G., Hayn, M., Schlacher, A., Steiner. W. & Kratky, C. (1998)。Thermomyces lanuginosus由来の好熱性キシラナーゼ：高分解Ｘ線構造およびモデリング研究。Biochemistry 37,13475-13485。
Harris, G. W., Pickersgill, R. W., Connerton, I., Debeire, P., Touzel, J. P, Breton, C. & Perez, S. (1997)。産業的に関連のある好熱性キシラナーゼの特性についての構造的基礎。Proteins 29,77-86。
Henrissat, B. & Bairoch, A. (1993)。アミノ酸配列の類似性に基づく糖加水分解酵素分類における新規ファミリー。Biochemical Journal 293,781-8。
Prade, R. A. (1996)。キシラナーゼ：生物学から生物工学へ。Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13,101-31。
Sung, W. L., Yaguchi, M., Ishikawa, K., Huang, F., Wood, M. & Zahab, D. M. (1998)。米国特許第5,759,840号。
Tenkanen, M, Puls, J. & Poutanen, K. (1992)。Trichoderma reeseiの２つの主要キシラナーゼ。Enzyme Microb. Technol. 14,566-574。
Toerroenen, A. & Rouvinen, J. (1995)。Trichoderma reesei由来の２つの主要なエンド-1,4-キシラナーゼの構造比較。Biochemistry 34,847-56。
Toerroenen, A. & Rouvinen, J. (1997)。低分子量エンド-1,4-β-キシラナーゼの構造および機能特性。Journal of Biotechnology 57,137-49。
Wakarchuk, W. W., Sung, W. L., Campbell, R. L., Cunningham, A., Watson, D. C. & Yaguchi, M. (1994)。ジスルフィド結合の導入によるバシラスシークランス(Bacillus circulans)キシラナーゼの熱安定性。Protein Engineering 7,1379-86。
Vogt, G, Woell, S. & Argos, P. (1997)。タンパク質の熱安定性、水素結合およびイオン対。Journal of Molecular Biology 269,631-43。
【図面の簡単な説明】
【図１】 キシラナーゼの突然変異誘発(下線のコドン変更)に用いたオリゴヌクレオチドの組みである。また、この配列は添付する配列表中、配列１〜１２としても提供する。
【図２】 T. reesei ＸｙｎIIの最適温度における突然変異Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒおよび＋１９１Ｄの効果を示すグラフである（ＷＴは野生型酵素であり、Ｙ５は突然変異型T. reesei ＸｙｎIIである）。
【図３】 T. reesei ＸｙｎIIのｐＨ依存性活性における突然変異Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒおよび＋１９１Ｄの効果を示すグラフである（ＷＴおよびＹ５は図２と同様である）。
【図４】 種々の温度についてのT. reesei ＸｙｎIIの不活性化における突然変異Ｔ２Ｃ、Ｔ２８Ｃ、Ｋ５８Ｒおよび＋１９１Ｄの効果を示すグラフである（ＷＴおよびＹ５は図２と同様である）。
【図５】 種々の温度についてのT. reesei ＸｙｎIIの不活性化における突然変異Ｑ１６２ＣおよびＬ１０５Ｃの効果を示すグラフである（W.t.は野生型酵素である）。
【配列表】
Figure 0004647169
Figure 0004647169
Figure 0004647169

Claims (2)

  1. Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)のアミノ酸Ｔ２およびＴ２８をシステインに変更し、Ｋ５８をアルギニンに変更し、そしてアスパラギン酸を当該酵素のＣ末端に付加(＋１９１Ｄ)することにより、該アミノ酸Ｔ２ＣとＴ２８Ｃとの間にジスルフィド架橋、および該アミノ酸Ｋ５８Ｒと＋１９１Ｄとの間に塩橋を形成している改変Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)(番号付けは、Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)のアミノ酸番号に基づく)。
  2. Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)のアミノ酸Ｔ２およびＴ２８をシステインに変更し、Ｋ５８をアルギニンに変更し、そしてアスパラギン酸を当該酵素のＣ末端に付加(＋１９１Ｄ)することで、アミノ酸Ｔ２ＣおよびＴ２８Ｃとの間にジスルフィド架橋、およびアミノ酸Ｋ５８Ｒと＋１９１Ｄとの間に塩橋を形成させることを含む、Trichoderma reesei キシラナーゼII(ＸｙｎII)の熱安定性およびｐＨ安定性を改変する方法(番号付けは、Trichoderma reesei キシラナーゼ(ＸｙｎII)のアミノ酸番号に基づく)。
JP2001530457A 1999-10-12 2000-10-12 ファミリーＧ／１１キシラナーゼの安定性を向上させ、ｐＨ領域を広域化する方法 Expired - Lifetime JP4647169B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI992186 1999-10-12
FI19992186 1999-10-12
US16328399P 1999-11-03 1999-11-03
US60/163,283 1999-11-03
FI20001586 2000-07-03
FI20001586A FI108728B (fi) 1999-10-12 2000-07-03 Menetelmä perheen G/11 ksylanaasien stabiilisuuden parantamiseksi ja optimaalisen pH-alueen muuttamiseksi
PCT/FI2000/000877 WO2001027252A1 (en) 1999-10-12 2000-10-12 Method to improve the stability and broaden the ph range of family g/11 xylanases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003511066A JP2003511066A (ja) 2003-03-25
JP4647169B2 true JP4647169B2 (ja) 2011-03-09

Family

ID=39618081

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001530457A Expired - Lifetime JP4647169B2 (ja) 1999-10-12 2000-10-12 ファミリーＧ／１１キシラナーゼの安定性を向上させ、ｐＨ領域を広域化する方法

Country Status (16)

Country Link
US (3) US8426181B2 (ja)
EP (1) EP1222256B1 (ja)
JP (1) JP4647169B2 (ja)
CN (2) CN101173262A (ja)
AT (1) ATE295879T1 (ja)
AU (1) AU781296B2 (ja)
BR (1) BR0014833A (ja)
CA (1) CA2385937C (ja)
DE (1) DE60020255T2 (ja)
DK (1) DK1222256T3 (ja)
ES (1) ES2239046T3 (ja)
FI (1) FI108728B (ja)
IL (1) IL149061A0 (ja)
NO (1) NO20021723D0 (ja)
WO (1) WO2001027252A1 (ja)
ZA (1) ZA200202894B (ja)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI108728B (fi) * 1999-10-12 2002-03-15 Carbozyme Oy Menetelmä perheen G/11 ksylanaasien stabiilisuuden parantamiseksi ja optimaalisen pH-alueen muuttamiseksi
US20070243595A1 (en) * 2006-04-14 2007-10-18 Clarkson Kathleen A Modified enzymes, methods to produce modified enzymes and uses thereof
BRPI0414370A (pt) * 2003-09-15 2006-11-14 Genencor Int enzimas modificadas, processos para produzir enzimas modificadas e usos das mesmas
EP2497377A3 (en) 2005-10-12 2013-09-04 Danisco US Inc. Stable, durable granules with active agents
WO2007115391A1 (en) * 2006-04-12 2007-10-18 National Research Council Of Cananda Modification of xylanases to increase thermophilicity, thermostability and alkalophilicity
RU2464313C2 (ru) * 2006-04-12 2012-10-20 Нэйшенл Рисерч Каунсил Оф Кэнэда Модифицированная ксиланаза
CN101289668B (zh) * 2007-04-16 2010-09-08 屏东科技大学 高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因及其点突变方法
WO2008150376A1 (en) 2007-05-21 2008-12-11 Danisco Us, Inc., Genencor Division Use of an aspartic protease (nsp24) signal sequence for heterologous protein expression
WO2012019169A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. Production of isoprene under neutral ph conditions
AR082578A1 (es) 2010-08-06 2012-12-19 Danisco Us Inc SACARIFICACION Y FERMENTACION A pH NEUTRO
EP2739742A1 (en) 2011-08-05 2014-06-11 Danisco US Inc. PRODUCTION OF ISOPRENOIDS UNDER NEUTRAL pH CONDITIONS
EP3342867B1 (en) 2011-11-25 2020-07-29 Mitsui Chemicals, Inc. Mutant xylanase, manufacturing method and use therefor, and method for manufacturing saccharified lignocellulose
US20140329309A1 (en) 2011-12-09 2014-11-06 Danisco Us Inc. Ribosomal Promoters for Production in Microorganisms
WO2013192043A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 Danisco Us Inc. Sandwich granule
CN104470371A (zh) 2012-07-18 2015-03-25 丹尼斯科美国公司 熔化延迟的颗粒
EP3058055A1 (en) 2013-10-15 2016-08-24 Danisco US Inc. Clay granule
BR112016009416A2 (pt) 2013-10-28 2017-10-03 Danisco Us Inc Levedura seca ativa geneticamente modificada de grande escala
CN103627686B (zh) * 2013-11-14 2015-03-18 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种木聚糖酶突变体及其应用
EP3068879B1 (en) 2013-11-14 2019-12-25 Danisco US Inc. Stable enzymes by glycation reduction
CN103642777A (zh) * 2013-12-10 2014-03-19 江南大学 一种提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法
GB201401648D0 (en) * 2014-01-31 2014-03-19 Dupont Nutrition Biosci Aps Protein
US9681386B2 (en) * 2014-03-06 2017-06-13 Apple Inc. Wi-Fi low energy preamble
WO2016072448A1 (ja) * 2014-11-05 2016-05-12 東レ株式会社 エンドキシラナーゼ変異体、バイオマス分解用酵素組成物及び糖液の製造方法
CN104560920B (zh) * 2015-01-26 2017-07-18 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种酸性木聚糖酶突变体及其应用
CN107250365A (zh) 2015-02-19 2017-10-13 丹尼斯科美国公司 增强的蛋白质表达
EP3270893B1 (en) 2015-03-19 2021-07-28 Danisco US Inc. Stable granules with low internal water activity
EP3192866A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias Endocellulases and uses thereof
CN105524904B (zh) * 2016-02-29 2019-03-08 四川农业大学 一种耐热的重组木聚糖酶及其制备方法和用途
DK3419991T3 (da) 2016-03-04 2023-01-16 Danisco Us Inc Modificerede ribosomale genpromotorer til proteinproduktion i mikroorganismer
CN109402091B (zh) * 2017-08-18 2022-02-11 潍坊康地恩生物科技有限公司 木聚糖酶突变体
WO2019089898A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Danisco Us Inc Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes
EP3502126A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias Ancestral cellulases and uses thereof
CN109320593A (zh) * 2018-11-05 2019-02-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抑制hiv感染的螺旋多肽及其用途
EP3872173A1 (en) 2020-02-28 2021-09-01 CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias Method for producing crystalline nanocellulose
EP3872172A1 (en) 2020-02-28 2021-09-01 CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias Conductive cellulose composite materials and uses thereof
KR20230021903A (ko) * 2021-08-06 2023-02-14 씨제이제일제당 (주) 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5405769A (en) * 1993-04-08 1995-04-11 National Research Council Of Canada Construction of thermostable mutants of a low molecular mass xylanase
JPH10179155A (ja) * 1996-09-09 1998-07-07 Nat Res Council Of Canada 好熱性、好アルカリ性及び熱安定性を改善するためのキシラナーゼの修飾

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5437992A (en) 1994-04-28 1995-08-01 Genencor International, Inc. Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp
DE69527924T2 (de) 1994-06-14 2003-01-09 Genencor Int Hitzebeständige xylanasen
JP3435946B2 (ja) 1994-12-21 2003-08-11 王子製紙株式会社 耐熱性キシラナーゼ
WO1997027292A1 (en) 1996-01-22 1997-07-31 Novo Nordisk A/S An enzyme with xylanase activity
AU2523597A (en) 1996-03-29 1997-10-22 Pacific Enzymes Limited A xylanase
CA2385245C (en) 1998-11-16 2011-04-12 Iogen Bio-Products Corporation Thermostable xylanases
US7718411B1 (en) * 2004-08-05 2010-05-18 Danisco Us Inc. Trichoderma reesei G/11 xylanases with improved stability
FI108728B (fi) * 1999-10-12 2002-03-15 Carbozyme Oy Menetelmä perheen G/11 ksylanaasien stabiilisuuden parantamiseksi ja optimaalisen pH-alueen muuttamiseksi
CN102676675B (zh) 1999-12-30 2015-11-18 金克克国际有限公司 Trichoderma reesei木聚糖酶

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5405769A (en) * 1993-04-08 1995-04-11 National Research Council Of Canada Construction of thermostable mutants of a low molecular mass xylanase
JPH10179155A (ja) * 1996-09-09 1998-07-07 Nat Res Council Of Canada 好熱性、好アルカリ性及び熱安定性を改善するためのキシラナーゼの修飾

Also Published As

Publication number Publication date
ES2239046T3 (es) 2005-09-16
CN101173262A (zh) 2008-05-07
BR0014833A (pt) 2002-06-18
US20130288335A1 (en) 2013-10-31
EP1222256B1 (en) 2005-05-18
WO2001027252A1 (en) 2001-04-19
CN100378217C (zh) 2008-04-02
AU7925000A (en) 2001-04-23
NO20021723L (no) 2002-04-11
ZA200202894B (en) 2003-04-14
US8426181B2 (en) 2013-04-23
US20080171374A1 (en) 2008-07-17
US9481874B2 (en) 2016-11-01
DE60020255D1 (de) 2005-06-23
JP2003511066A (ja) 2003-03-25
NO20021723D0 (no) 2002-04-11
DK1222256T3 (da) 2005-09-05
FI108728B (fi) 2002-03-15
CA2385937C (en) 2010-07-27
ATE295879T1 (de) 2005-06-15
US8846364B2 (en) 2014-09-30
CN1379813A (zh) 2002-11-13
CA2385937A1 (en) 2001-04-19
FI20001586A0 (fi) 2000-07-03
EP1222256A1 (en) 2002-07-17
IL149061A0 (en) 2002-11-10
AU781296B2 (en) 2005-05-12
US20150011743A1 (en) 2015-01-08
DE60020255T2 (de) 2006-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4647169B2 (ja) ファミリーＧ／１１キシラナーゼの安定性を向上させ、ｐＨ領域を広域化する方法
Breccia et al. Purification and characterization of a thermostable xylanase from Bacillus amyloliquefaciens
JP3307947B2 (ja) キシラナーゼを含有する動物飼料添加剤
US8415130B2 (en) Polypeptides of Alicyclobacillus sp. having acid endoglucanase or acid cellulase activity
He et al. Expression of endo-1, 4-beta-xylanase from Trichoderma reesei in Pichia pastoris and functional characterization of the produced enzyme
Paës et al. Engineering increased thermostability in the thermostable GH-11 xylanase from Thermobacillus xylanilyticus
Stephens et al. Directed evolution of the thermostable xylanase from Thermomyces lanuginosus
SHIBUYA et al. Enhancement of the thermostability and hydrolytic activity of xylanase by random gene shuffling
CA2576110C (en) Polypeptides of botryosphaeria rhodina
WO2005066339A2 (en) Polypeptides of alicyclobacillus sp.
US7314743B2 (en) Modified enzymes, methods to produce modified enzymes and use thereof
Lisov et al. Xylanases of Cellulomonas flavigena: expression, biochemical characterization, and biotechnological potential
Gallardo et al. Characterization of a Paenibacillus cell-associated xylanase with high activity on aryl-xylosides: a new subclass of family 10 xylanases
US7718411B1 (en) Trichoderma reesei G/11 xylanases with improved stability
Lee et al. Cloning and characterization of the xyn11A gene from Lentinula edodes
Lee et al. Purification and characterization of two thermostable xylanases from Paenibacillus sp. DG-22
US20100062511A1 (en) Modified enzymes, methods to produce modified enzymes and uses thereof
Liu et al. Expression, characterization and its deinking potential of a thermostable xylanase from Planomicrobium glaciei CHR43
Weng et al. Construction, expression, and characterization of a thermostable xylanase
Class et al. Patent application title: METHOD TO IMPROVE THE STABILITY AND BROADEN THE PH RANGE OF FAMILY G/11 XYLANASES
KR20020044161A (ko) 계통 Ｇ/11 크실라나아제의 안정성을 향상시키고 ｐＨ범위를 확장시키기 위한 방법
CA2136784A1 (en) Method of increasing the catalytic activity of a glycanase having two or more catalytic domains

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20071003

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20080911

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100713

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101013

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20101013

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20101013

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20101109

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101208

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131217

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 4647169

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250