JPH10179155A

JPH10179155A - 好熱性、好アルカリ性及び熱安定性を改善するためのキシラナーゼの修飾

Info

Publication number: JPH10179155A
Application number: JP9244409A
Authority: JP
Inventors: Wing L Sung; エル．サングウィング; Makoto Yaguchi; ヤグチマコト; Kazuhiko Ishikawa; イシカワカズヒコ
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1996-09-09
Filing date: 1997-09-09
Publication date: 1998-07-07
Also published as: CN1177639A; CA2210247C; BR9706843A; CN100595276C; EP0828002A3; CA2210247A1; NZ328680A; EP0828002B1; DE69712003D1; US5759840A; CN1550548A; US5866408A; CN1155700C; EP0828002A2; AR009574A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】パルプの漂白における性能が優れているキシラ
ナーゼ酵素の製造。より具体的には、天然キシラナーゼ
と比較して改善された好熱性、好アルカリ性、及び熱安
定性を示す修飾第１１族キシラナーゼの提供。【解決手段】この修飾キシラナーゼは、（１）トリコダ
ーマ・レエセイ・キシラナーゼＩＩのアミノ酸１０、２
７、及び２９又は他の第１１族キシラナーゼの対応アミ
ノ酸の変更であって、これらのアミノ酸がそれぞれヒス
チジン、メチオニン、及びロイシンに変えられている変
更；（２）他のキシラナーゼ酵素に由来するアミノ酸で
のＮ−末端領域のアミノ酸の置換。好ましい態様におい
ては、トリコダーマ・フュスカ・キシラナーゼに由来す
る短いアミノ酸配列での天然バチルス・サーキュランス
又はトリコダーマ・レエセイ・キシラナーゼの置換によ
り高い好熱性及び好アルカリ性を有するキメラキシラナ
ーゼが形成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明の分野は、タンパク質
加工処理によるタンパク質の修飾である。特には、本発
明は、高温及び高ｐＨの条件での性能が改善された修飾
キシラナーゼ酵素に関する。キシラナーゼ酵素は、白色
の紙を作製するためのパルプの漂白を強化するのに用い
られる。本発明は、第１１族キシラナーゼに関連付けら
れる強化された漂白の利点を有しながら、現在利用可能
なキシラナーゼよりもパルプの粉砕操作の必要性に適す
る高温及び高ｐＨでの活性を有するキシラナーゼ酵素の
生成を可能にする。

【０００２】

【従来の技術】キシラナーゼ酵素は、１９９１年以来、
純白の紙を作製するためのパルプの漂白の強化に商業的
に用いられている。これらの酵素はパルプが漂白される
前にパルプに添加され、パルプ中のキシランの一部を除
去する。この作用は、続いて、塩素、二酸化塩素、過酸
化水素、酸素、オゾン、及び水酸化ナトリウム含む漂白
化学物質が、キシラナーゼ処理がないものよりも効率的
にパルプを漂白することを可能にする。この強化された
漂白効率は、工場が用いる塩素ベースの化学物質の量を
減少させ、これは、より白いパルプを製造し、あるいは
工場がその漂白化学物質にかける金額を節約させる他
に、その工場の廃液中の毒性有機塩素化合物の量を減少
させる。キシラナーゼ酵素の漂白への商業的な使用は、
Tolan, et al., Pulp and Paper Canada, December 199
5 によって評価されている。

【０００３】キシラナーゼ酵素は約１００種類の異なる
微生物から報告されている。キシラナーゼ酵素は、４０
族を超えるグリコシルヒドロラーゼ酵素の幾つかに分類
される。キシラナーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、β
−グルカナーゼ、セルラーゼ、及び他のカルボヒドラー
ゼを含むこのグリコシルヒドロラーゼは、アミノ酸、三
次元構造及び触媒部位の幾何のような特性に基づいて分
類される（Gilkes, etal., (1991) Microbiol. Reviews
55: 303-315 ）。

【０００４】パルプの漂白用途について特に関心がある
ものは、第１１族（Family 11 ）に分類される酵素であ
る。これらは全てキシラナーゼであり、“第１１族キシ
ラナーゼ”として公知である。刊行物の中にはこれらを
同義的にＧ族キシラナーゼと呼ぶものがあるが、我々は
第１１族という用語を用いる。

【０００５】現時点で公知の第１１族キシラナーゼを表
１に列挙する。それらの大部分は約２１，０００Ｄａの
分子量を有する。この第１１族キシラナーゼのうちに３
種類、クロストリジウム・ステルコラリウムＸｙｎＡ
（Clostridium Stercorarium XynA ）、ストレプトマイ
セス・リビダンスＸｙｎＢ（Streptomyces lividans Xy
nB）、及びサーモモノスポラ・フュスカＸｙｎＡ（Ther
momonospora fusca XynA）は、３１，０００ないし５
０，０００Ｄａの高い分子量を有する。しかしながら、
これらのキシラナーゼは、他の第１１族キシラナーゼに
類似する約２１，０００Ｄａの触媒性コア配列を有す
る。第１１族キシラナーゼのアミノ酸配列（又は、より
長い酵素についてはその触媒性コア）は、高い類似の程
度を示す（図１〜図３）。細菌、酵母、又は真菌起源の
第１１族キシラナーゼは、同じ一般分子構造を共有する
（CAMPBELLら、米国特許５，４０５、７６９号の図２を
参照）。

【０００６】表１．第１１族キシラナーゼ微生物キシラナーゼアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ） Xyn A アスペルギルス・カワチイ（Aspergillus kawachii） Xyn C アスペルギルス・ツビゲンシス（Aspergillus tubigensis） Xyn A バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans） Xyn A バチルス・プミラス（Bacillus pumilus） Xyn A バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis ） Xyn A セルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi ） Xyn D チャイニア種（Chainia spp.） Xyn クロストリジウム・アセトブチリカム Xyn B （Clostridium acetobutylicum）クロストリジウム・ステルコラリウム Xyn A （Clostridium stercorarium）フィブロバクター・スクシノゲネス Xyn C （Fibrobacter succinogenes）ネオカリマスチックス・パトリシアラム Xyn A （Neocallimastix patriciarum）ネオカルジオプシス・ダスソンビレイ Xyn II （Nocardiopsis dassonvillei）ルミノコッカス・フラベファシエンス Xyn A （Ruminococcus flavefaciens）シゾフィラム・コミュネ（Schizophyllum commune ） Xyn ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans ） Xyn B ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans ） XynC ストレプトマイセス種Ｎｏ．３６ａ Xyn （Streptomyces sp. No. 36a）ストレプトマイセス・サーモビオラセウス Xyn II （Streptomyces thermoviolaceus）サーモモノスポラ・フュスカ（Thermomonospora fusca ） Xyn A トリコダーマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum ） Xyn トリコダーマ・レエセイ（Trichoderma reesei） Xyn I トリコダーマ・レエセイ（Trichoderma reesei） Xyn II トリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride） Xyn

【０００７】アミノ酸が、本質的な触媒性残基としての
機能を果たす２つのグルタミン酸（Ｅ）残基を含む第１
１族に共通のアミノ酸を有する場合、それは第１１族に
分類される。これらのＥ残基はトリコダーマ・レエセイ
ｘｙｎＩＩの番号付けを基準にしてアミノ酸８６及び１
７７である。他の第１１族キシラナーゼのこの鍵となる
Ｅ残基の対応する位置は、当該技術分野における熟練者
に馴染みのあるアミノ酸配列の整列化によって容易に決
定することができる。第１１族キシラナーゼに共通のア
ミノ酸は、図１〜図３においてボールド体で示されてい
る（Wakarchuk,et al., Protein Science 3:467-475 (1
994) ）。

【０００８】第１１族キシラナーゼは、パルプの漂白用
途において、他のキシラナーゼを凌駕する幾つかの利点
を有する。大部分の第１１族キシラナーゼは他の族のキ
シラナーゼよりも小さい。この相対的に他のキシラナー
ゼよりも小さいサイズは、おそらく、パルプの繊維に浸
透してパルプからキシランを放出させ、漂白を強化する
のに有益である。また、第１１族キシラナーゼは、その
触媒活性の観点から“純粋な”キシラナーゼである。他
の族のキシラナーゼとは異なり、これらの酵素はキシラ
ンだけを加水分解し、セルロースは加水分解しない。セ
ルロースの加水分解はパルプに損傷を与え、商用工場で
は受け入れることができない。第１１族キシラナーゼの
うち、木材腐敗菌トリコダーマによって生成されるキシ
ラナーゼがパルプの漂白の強化において最も広く用いら
れている。特に、分子量２１，０００及び答電点９．１
を有するトリコダーマ・レエセイ・キシラナーゼＩＩ
（ＸｙｎＩＩ）が広く用いられている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】第１１族キシラナーゼ
がパルプの漂白において利点を有するにもかかわらず、
これらの酵素は重大な欠点を有する。これらの酵素がパ
ルプに対して活性を示す温度及びｐＨの範囲は、４５℃
ないし５５℃及びｐＨ５．０ないし７．５である。工場
のうちの僅かな部分は歴史的にこれらの範囲内で操業し
ている。しかしながら、典型的には、パルプは６０℃な
いし７０℃の温度及び１０ないし１２のｐＨにある。工
場の中には、この温度及びｐＨの調整を受け入れること
が可能であり、これが日常的なものであるものもある。
しかしながら、所望の処理条件を達成する多くの工場は
深刻な問題を引き起こす。

【００１０】漂白がどのように行われるのかにより、パ
ルプを６０℃未満に冷却することで漂白の効率が受け入
れることができない程度まで低下することがある。例え
ば、工場が完全に二酸化塩素で漂白を行い、塩素化タワ
ーの保持時間が２０分未満である場合には、適度の漂白
のための最少温度は６０℃である。しばしば起こること
ではあるが、このような工場が酵素処理と塩素化との間
の温度にパルプを加熱できない場合には、酵素処理段階
のためのより低い温度を受け入れることはできない。

【００１１】パルプのｐＨの調節には硫酸が用いられ
る。装置の冶金学によっては、ｐＨの調節に硫酸を使用
することで鋼鉄パイプ及び他の装置が腐食することがあ
る。また、硫酸は安全を冒す要因である。

【００１２】これらの酵素を用いることによる他の些細
な問題は、特には、漂白用途のトリコダーマ・レエセイ
・キシラナーゼの熱安定性が低いことである。工場内の
暖かい周囲温度によって、数週間の貯蔵の後にこれらの
酵素が不活性になる可能性がある。この問題はパルプの
温度及びｐＨを調整する困難性ほどには重要ではない
が、冷蔵保存の使用又は酵素への安定化剤化合物の添加
によって考慮しなければならない。

【００１３】したがって、トリコダーマ・レエセイＸｙ
ｎＩＩよりも高いｐＨ及び温度範囲で活性なキシラナー
ゼ酵素、特には第１１族キシラナーゼ酵素の使用が望ま
しい。これは、トリコダーマ・キシラナーゼの活性範囲
外で操業する工場がキシラナーゼ処理を行い、その処理
に関連する利益を得ることを可能にする。また、これ
は、工場が現在よりも少ない硫酸及び冷却水を用いてキ
シラナーゼ処理を行うことを可能にし、製造コストを節
約して制御の可能性及び保存安定性を増加させる。

【００１４】キシラナーゼ酵素の特性を改善するために
取られているアプローチを論じる前に、以下の用語を定
義することが有用である。

【００１５】好熱性は、ここでは、高温で活性である酵
素の能力として定義される。例えば、キシラナーゼ＃１
は、これがキシラナーゼ＃２よりも高い温度でキシラン
を加水分化することが可能である場合、キシラナーゼ＃
２よりも好熱性である。好熱性は、基質の存在下におけ
る酵素活性に関連する。本発明においては、基質はパル
プのキシランであっても精製されたキシランであっても
よい。

【００１６】好熱性を定義するためには、基質を指定す
ることが重要である。大部分のキシラナーゼ酵素は、パ
ルプの処理よりも純粋なキシランの加水分解においてよ
り高い温で有効である。これは、基質に関連する因子
（例えば、パルプ中に存在する阻害物質）の組み合わ
せ、並びに時間の長さ、ｐＨ、及びその試験を行うのに
用いられる手順の他の側面によるものである。好熱性の
定量的な測定は、ここでは、他に示されない限り、純粋
なキシラン基質を指す。

【００１７】熱安定性は、キシラン基質が存在しない状
態で高温でインキュベートされて保存された後、標準検
定条件に戻されたときにキシラナーゼ活性を示す酵素の
能力として定義される。例えば、キシラナーゼ＃１は、
それを７０℃で２４時間保持してその活性を全てを維持
することが可能であり、これに対してキシラナーゼ＃２
が７０℃で２４時間後にはその活性の全てを失ってしま
う場合、キシラナーゼ＃２よりも熱安定である。好熱性
と対照的に、熱安定性は、キシラン基質が存在しない状
態でのインキュベーションの後に残る酵素活性に関連す
る。

【００１８】これらの２つの用語は、これらがしばしば
同義的に用いられ、もしくは互いを意味する文献におけ
る混同を解消するために明確に定義される。ここでのこ
れらの取扱いは、Mathrani and Ahring, Appl. Microbi
ol. Biotechnol. 38: 23-27(1992)と一致する。

【００１９】好アルカリ性は、ここでは、高（アルカリ
性）ｐＨで活性である酵素の能力として定義される。例
えば、キシラナーゼ＃１は、それがキシラナーゼ＃２よ
りも高いｐＨでキシランを加水分解することが可能であ
る場合、キシラナーゼ＃２よりも好アルカリ性である。
好アルカリ性は好熱性に類似し、キシラン酵素の存在下
における酵素活性に関連する。

【００２０】パルプ漂白用途のためにキシラナーゼを改
善するには、好熱性及び好アルカリ性が熱安定性よりも
かなり重要である。従来技術において記述される研究の
大部分は熱安定性の改善にのみ焦点を合わせている。

【００２１】より高いｐＨ及び温度範囲を有するキシラ
ナーゼ酵素を生成するのに２つの一般的なアプローチを
とることができる。これらは、（１）所望の特性を有す
る天然キシラナーゼ酵素をスクリーニングすること、及
び（２）タンパク質加工処理を用いて既に存在するキシ
ラナーゼ酵素の特性を改善すること、である。

【００２２】天然キシラナーゼのうち、熱安定性酵素
が、カルドセラム・サッカロリチカム（Caldocellum sa
ccharolyticum ）、サーマトガ・マリチマ（Thermatoga
maritima ）及びサーマトガ種ＦｊＳＳ−Ｂ．１株（こ
れらは全て８０−１００℃で成長する）のような好熱性
微生物から単離されている（Luthi ら、１９９０；Wint
erhalterら、１９９５；Simpson ら、１９９１）。しか
しながら、これらは全て３５−１２０ｋＤａ（３２０−
１１００残基）の高分子量を有し、サイズが比較的大き
い。これらのキシラナーゼの中には第１１族以外の族に
属し、キシラナーゼ及びセルラーゼ活性の両者を有する
ものがある（Ｃ．サッカロリチカム・キシラナーゼＡ）
（Luthi ら、１９９０）。このようなセルラーゼ活性は
パルプの漂白には望ましいものではない。さらに、通常
極度に高い温度で機能する過剰熱安定性キシラナーゼ
は、パルプ漂白のための比較的低い温度では活性が低
い。

【００２３】第１１族キシラナーゼの大部分は、４５℃
ないし５５℃でのパルプ漂白用途に有効である。しかし
ながら、第１１族には少なくとも２種類の熱安定性キシ
ラナーゼも含まれ、これらの両者は他の第１１族キシラ
ナーゼよりも大きな分子量を有する。これらのキシラナ
ーゼは、２９６アミノ酸及び３２，０００Ｄａを有する
サーモモノスポラ・フュスカ・キシラナーゼ（ＴｆｘＡ
として公知）（Irwinet al., (1994) Appl. Environ. M
icrobiol. 60: 763-770; Wilson et al., 1994, WO95/1
2668 ）並びに５１１アミノ酸及び５６，０００Ｄａを
有する最適温度７０℃のクロストリジウム・ステルコラ
リウム・キシラナーゼＡ（Sakka et al., (1993) Biosi
c. Biotech. Biochem. 57: 273-277）である。

【００２４】これらの熱安定性キシラナーゼ酵素は、パ
ルプ漂白用途における潜在的な問題である幾つかの特徴
を有する。第１に、その大きな分子量が酵素のパルプ繊
維への浸透を制限する。第２に、これらの酵素は、他の
第１１族キシラナーゼには存在しないセルロース結合ド
メイン（ＣＢＤ）のコピーを少なくとも１つ有する。こ
のＴｆｘＡの伸長Ｃ−末端に位置するＣＢＤは、このタ
ンパク質の沈殿及び保存の際の活性の損失を引き起こ
す。

【００２５】したがって、天然キシラナーゼ酵素には制
限がある。代わりのアプローチは、公知のキシラナーゼ
酵素に対してタンパク質加工処理を実施することであ
る。タンパク質加工処理を用いることにより、タンパク
質の溶解性のような二次的な特性を妥協することなく温
度又はｐＨ範囲のような所望の特性を改善する特定の変
更をタンパク質に対してなすことができる。

【００２６】タンパク質加工処理を行ってタンパク質の
特性を修正する場合、使用する一般法、次いで特定の部
位及び行う修飾を選択しなければならない。この一般法
には、（１）部位特異的変異生成、（２）無作為変異生
成、（３）キメラ修飾、（４）二量体化、及び（５）グ
リコシル化が含まれる。これらの一般法の各々には、行
うことができる、タンパク質に対する特定の修飾の数多
くのオプションがある。好熱性及び好アルカリ性を含む
酵素の特性に対する異なる変異の効果は、しばしば予測
不可能である。一般には、あるとしても、全ての可能性
のある修飾のうちの僅かな部分だけが重大な利益を提供
する。したがって、蛋白質加工処理によってタンパク質
の特性の改善を試みることは困難な冒険であり、現在ま
での第１１族キシラナーゼでの限られた成功はこれを反
映している。修飾キシラナーゼを用いる作業を以下に説
明する。

【００２７】部位特異的変異生成はタンパク質中の特定
のアミノ酸の修飾を含む。部位特異的変異生成に基づく
修飾は点変異として知られる。第１１族キシラナーゼの
部位特異的変異生成は、熱安定性が僅かに改善されたキ
シラナーゼ酵素の生成に用いられている。CAMPBELLら
（米国特許５，４０５，７６９号）は、２つのタイプの
修飾によるバチルス・サーキュランス・キシラナーゼ
（略してＢｃＸ）、第１１族のキシラナーゼ、を改善す
る１つの方法を記述している。これらは、（ｉ）分子内
ジスルフィド結合、及び（ｉｉ）Ｎ−末端での部位特異
的変異であった。CAMPBELLらは、バチルス・サーキュラ
ンス・キシラナーゼのアミノ酸の番号付けによるアミノ
酸＃９８と＃１５２、＃１００と＃１４８、及び＃（−
１）と＃１８７との間にどのようにジスルフィド結合を
挿入することができるのかを記述している。このジスル
フィド修飾は、６２℃でのキシラナーゼの熱安定性を改
善した。しかしながら、これらのジスルフィド修飾酵素
は好熱性においては何の利益も示さなかった（Wakarchu
ck et al., (1994) Protein Engineering 7: 1379-138
6）。したがって、熱安定性及び抗熱性は必ずしも対で
はない。

【００２８】また、CAMPBELLらは、ＢｃＸのＮ−末端近
傍の（Ｔ３Ｇ、Ｄ４Ｙ（Ｆ）及びＮ８Ｙ（Ｆ）と呼ばれ
る）３つの修飾によって、５７℃（２℃の小さな増加）
での熱安定性を有する変異キシラナーゼが生成したこと
を記述している。CAMPBELLらに関係するＰＣＴ公開ＷＯ
９４／２４２７０には、ＢｃＸの改善に有利な第４の修
飾、Ｓ２２Ｐ、の説明がある。（この文献中でＴＳ１９
ａと呼ばれる）この４つの修飾の組は、ＢｃＸよりも高
い熱安定性及び好熱性を示した。しかしながら、ある因
子がＢｃＸ以外の第１１族キシラナーゼにおけるこれら
の修飾の適用を制限する。残基３、４、８及び２２（Ｂ
ｃＸアミノ酸番号付け）をそれぞれグリシン、チロシン
（もしくはフェニルアラニン）、チロシン（もしくはフ
ェニルアラニン）及びプロリンに変換するこれらの変異
は、第１１族キシラナーゼの大部分が既にこれらの“良
好な”残基を有している（図１〜図３を参照）ため、そ
れらには関係のないものである。これらの修飾の不適切
さの最良の説明は、４つの“良好な”残基の全てを有す
るものの好熱性及び好アルカリ性においては平凡なトリ
コダーマ・レエセイのＸｙｎＩＩである。

【００２９】無作為変異生成は、全タンパク質内での無
作為のアミノ酸の修飾を含む。この方法は、ARASE ら
（(1993) FEBS Lett. 316: 123-127）によって熱安定性
が改善された第１１族キシラナーゼの生成に用いられ
た。これは、残基１２、２６、３８、４８及び１２６
（ＢｐＸアミノ酸番号付けによる）での修飾によるバチ
ルス・プミラス・キシラナーゼ（略してＢｐＸ）の熱安
定性の控えめな改善を記述する。しかしながら、ARASE
らは、それらの特定の修飾の結果としての好熱性又は好
アルカリ性の改善は何も報告していない。ＢｐＸキシラ
ナーゼにおける最も改善されたARASE らの例によって熱
安定性で得られるものは小さく、５７℃で２０分のイン
キュベーションの後に４０％の残留酵素活性が維持可能
であるだけである。Ｎ−末端の周辺の残基１２及び２６
が修飾された他の２つのＢｐＸキシラナーゼについて
は、熱安定性で得られるものは、それぞれ、インキュベ
ーションの後の１及び１１％の残留活性の維持に相当し
た。さらに、残基２６が修飾されたＢｐＸキシラナーゼ
は他にも修飾されており、そのため、熱安定性に対する
この修飾の単独の寄与は、それが存在するとして、ARAS
E らからは不明瞭である。

【００３０】キメラ修飾は、タンパク質のアミノ酸の幾
つかを他のタンパク質からのアミノ酸配列で置換するこ
とを包含する。我々の知見では、このようなアプローチ
は第１１族キシラナーゼでは行われていない。

【００３１】二量体化は２つの分子を単一のタンパク質
に結合することを包含する。この技術は、分子内ジスル
フィド結合による２つのＢｃＸ分子の結合に用いられて
いる（Wakarchuk, et al., Protein Engineering (199
4) ）。得られる二量体ＢｃＸは、上述の分子内ジスル
フィド結合を有するＢｃＸよりもはるかに小さい、熱安
定性のほんの僅かな改善しか示さなかった。

【００３２】天然のグリコシル化（タンパク質への炭水
化物の付着）が、時々、トリコダーマ・レエセイｘｙｎ
ＩＩの場合を含めて、タンパク質の熱安定性を改善する
ことがよく知られている。合成によるグリコシル化は、
第１１族キシラナーゼにおけるこれらの特性の改善には
用いられていない。

【００３３】タンパク質加工処理のどの方法が用いられ
るのかに関わらず、酵素の特性を改善する選択が僅かし
かないため、鍵となる局面はどのアミノ酸を修飾するの
かを決定することである。この点は、Sung, et al., Bi
ochem. Cell Biol. 73: 253-259 (1995)の研究によって
説明されており、彼はトリコダーマ・レエセイ・キシラ
ナーゼＩＩのアミノ酸＃１９をアスパラギン酸からリシ
ンに変更した。この変更により、この酵素の好熱性は３
℃低下した。

【００３４】したがって、第１１族キシラナーゼに関す
る多くの努力にもかかわらず、好熱性及び好アルカリ性
が大きく改善されて生成する修飾第１１族キシラナーゼ
はいまだに存在していない。このような酵素、特には加
工処理型のトリコダーマ・レエセイｘｙｎＩＩは、工場
のプロセス条件を満たしながら漂白化学物質の必要性が
低下した漂白パルプ製造の商用プロセスに直ちに適用で
きる。また、このような酵素は、他の領域における潜在
的な用途も有する。これらの例の幾つかは、多くの場合
において高温ペレット化が現行の酵素を不適切なものと
する、飼料の消化を助ける動物飼料添加物として、及び
高温によって現行の酵素が破壊される、デンプン製造の
ための小麦及びトウモロコシの処理である。

【００３５】

【課題を解決するための手段】本発明は、特定の第１１
族キシラナーゼを修飾して好熱性、好アルカリ性、及び
熱安定性を改善することに関する。本発明は、第１１族
キシラナーゼに関連することが知られるものの、現在利
用可能なあらゆるキシラナーゼよりも好ましい工場操業
パラメータに適切な高い温度及びｐＨ条件での強化され
た漂白の利益をパルプ工場が享受することを可能にする
酵素の作製に特に有用である。

【００３６】本発明の有用性は、以下の２つの本質的な
特性を有する第１１族キシラナーゼ酵素に特有のもので
ある。（ｉ）：この酵素はトリコダーマ、バチルス、アスペル
ギルス又はストレプトマイセスによって精製される。（ｉｉ）：この酵素は、トリコダーマ・レエセイ・キシ
ラナーゼＩＩの番号付けで１４位に、又は区分（ｉ）の
酵素の中の指定された他のキシラナーゼに用いられる通
常の番号付けによる等価の位置にチロシンもしくはフェ
ニルアラニンを有する。

【００３７】これらの特性の両者を有する第１１族キシ
ラナーゼについて、以下の２つのタイプの修飾のいずれ
かがその酵素の好熱性、好アルカリ性及び熱安定性を驚
くほど高めることが教示される。

【００３８】（１）部位特異的変異生成：（トリコダー
マ・レエセイ・キシラナーゼＩＩの番号付けによる）１
０位の上流のＮ−末端に少なくとも８個のアミノ酸残基
を有する選択されたキシラナーゼに対して、アミノ酸１
０の他のアミノ酸での置換を含む修飾。好ましい態様
は、アミノ酸１０を異なるアミノ酸で置換する必須工程
に加えて、アミノ酸２７及び２９もバリン、メチオニ
ン、イソロイシン又はロイシンで置換することである。
最も好ましい態様は、１０、２７及び２９位に見出され
る天然アミノ酸を、それぞれ、ヒスチジン、メチオニ
ン、及びロイシンに置換することである。

【００３９】（２）キメラ修飾：Ｎ−末端領域のアミノ
酸配列をサーモモノスポラ・フュスカ・キシラナーゼＡ
（Ｔｆｘ）からの相当する位置の配列で置き換えてキメ
ラ酵素を形成する。好ましい態様は、このキメラ酵素を
Ｎ−末端の上流にグリシン−アルギニン−アルギニンの
トリペプチド分、又はクロストリジウム・アセトブチリ
カム（ＣａＸ）のＮ−末端からの１０個のアミノ酸だけ
伸長させる。

【００４０】驚くべきことに、本発明によって修飾され
たキシラナーゼは、対応する非修飾酵素を大きく上回る
改善された好熱性、好アルカリ性、及び熱安定性を有す
る。これらの修飾キシラナーゼの中には、天然のキシラ
ナーゼを上回る好熱性における２８℃までの改善、及び
好アルカリ性の２ｐＨ単位の改善を示すことが見出され
ているものがある。さらに、修飾されたキシラナーゼの
うちの幾つかの８５℃及びｐＨ９で機能する能力は、Ｔ
ｆｘＡを含む確認されている好熱性第１１族キシラナー
ゼのあらゆるものよりも非常に良好である。

【００４１】本発明者らは、このような第１１族キシラ
ナーゼの好熱性、好アルカリ性、及び熱安定性の驚くべ
き改善を伴う第１１族のキシラナーゼの修飾は従来報告
されていないものと信じる。

【００４２】特に、本発明の修飾バチルス・サーキュラ
ンス・キシラナーゼは、ARASEら（その中のＢｐＸ）及
びCAMPBELLら（その中のＢｃＸ）に示される修飾バチル
ス・キシラナーゼについて開示される６０−７０℃の温
度範囲よりもかなり高い温度で活性である。

【００４３】さらに、本発明の修飾キシラナーゼは、パ
ルプ処理の問題に対する驚くほど改善された特性を示
す。また、この修飾キシラナーゼは、最適温度では第１
１族キシラナーゼに典型的なものであるが他のキシラナ
ーゼでは観察されないパルプ処理における全般的な効力
も示す。

【００４４】ここに教示されるタンパク質修飾は第１１
族キシラナーゼについては従来報告されておらず、ここ
に教示される改善が好熱性、好アルカリ性、又は熱安定
性を高めることが可能であることを示唆している開示は
従来存在しない。

【００４５】ARASE ら（(1993) FEBS Lett. 316:123-12
7 ）は、ＢｐＸのアミノ酸の番号付けに従って残基１
２、２６、３８、４８及び１２６での修飾による、バチ
ルス・プミラス・キシラナーゼ（略してＢｐＸ）の熱安
定性の控えめな改善を記述している。これらは、それぞ
れ、トリコダーマ・レエセイｘｙｎＩＩの残基１１、２
６、３８、４８及び１２１に対応し、本発明の原理によ
る残基ではない。さらに、本発明とは異なり、Arase は
彼らの技術の結果として好熱性又は好アルカリ性におけ
るいかなる改善も報告していない。最も改善されたAras
e のＢｐＸによって熱安定性で得られるものは小さく、
５７℃で２０分間のインキュベーションの後の４０％の
残留酵素活性の維持を可能にするだけである。残基１２
（ｘｙｎＩＩにおける１１）及び２６が修飾された他の
２つのＢｐＸキシラナーゼについては、熱安定性で得ら
れるものは、それぞれ、保存後の１及び１１％の残留活
性の維持に相当した。さらに、残基２６が修飾されたＢ
ｐＸキシラナーゼは他にも修飾されており、そのため、
熱安定性に対するこの修飾の単独の寄与は、それが存在
するとして、不明瞭である。

【００４６】CAMPBELLらは、CAMPBELLらのＰＣＴ出願と
同様に、バチルス・サーキュランス・キシラナーゼ（Ｂ
ｃＸ）に対してなし得る（Ｔ３Ｇ、Ｄ４Ｙ（Ｆ）、Ｎ８
Ｙ（Ｆ）、及びＳ２２Ｐと呼ばれる）４種類の修飾を説
明する。これらの変更はトリコダーマ・レエセイ・キシ
ラナーゼの番号付けでアミノ酸１２、１３、１７、及び
３１に対応する。CAMPBELLらによって教示されるこれら
のアミノ酸はトリコダーマ・キシラナーゼ及び他の第１
１族キシラナーゼの大部分には既に存在し、したがっ
て、これらのキシラナーゼの性能の改善に対しては本質
的に無関係であるものと思われる。

【００４７】また、バチルス・サーキュランス・キシラ
ナーゼに対するCAMPBELLらの修飾は、本発明の修飾Ｂ．
サーキュランス・キシラナーゼほどには酵素の性能を改
善しない。実施例６及び１０は、本発明の修飾バチルス
・サーキュランス・キシラナーゼがCAMPBELLらのキシラ
ナーゼの最善のものよりもかなり高い好熱性（＋１４
℃）及び好アルカリ性（＋１．５ｐＨ単位）を有するこ
とを示す。加えて、最適温度では、本発明の修飾バチル
ス・キシラナーゼはCAMPBELLらのものよりも３倍高い活
性を有する。

【００４８】アミノ酸１０、２７、及び２９が第１１族
キシラナーゼ酵素の性能に重要であることは従来示唆さ
れてはいない。驚くべきことに、本発明者らは、トリコ
ダーマｘｙｎＩＩ中のこれらのアミノ酸をそれぞれヒス
チジン、メチオニン、及びロイシンに変更することによ
り、この酵素の好熱性、好アルカリ性、及び熱安定性が
かなり高まることを示している。

【００４９】天然の第１１族キシラナーゼのうちの３種
（バチルス・プムリス、クロストリジウム・ステルコラ
リウム（ｘｙｎＡ）、及びサーモモノスポラ・フュスカ
によって生成されるキシラナーゼ）がこれらの特定のア
ミノ酸をそれらの位置に有するものの、これらの３種類
のキシラナーゼのいずれもが本発明に従うことによって
得られることが教示される所望の特性の組み合わせを示
さないことに注意すべきである。好熱性がこれらの３つ
のアミノ酸の存在によるものであろうと期待する根拠は
なく、天然のキシラナーゼがこれらの３つのアミノ酸を
酵素の性能の鍵として指し示すことはない。クロストリ
ジウム及びサーモモノスポラのキシラナーゼは好熱性で
あるが、Ｂ．プミリスのキシラナーゼは、それが４０℃
未満の最適温度を持つ（Nissenら、１９９２）ため、好
熱性ではない。既述の３つの共通の位置に加えて、これ
らの３種類のキシラナーゼには同じアミノ酸を有する７
５を超える位置がある。クロストリジウム及びサーモモ
ノスポラの両者は、他の族のキシラナーゼと同様に、熱
安定性を付与するものと仮定されている独自のセルロー
ス結合ドメインを有する（Fontes, et al., 1995, Bioc
hem. J. 307: 151-158）。

【００５０】本発明者らは、１０、２７、及び２９位に
好ましい残基を有するこれらの３種類の天然第１１族キ
シラナーゼを請求することを主張するものではない。本
発明は、Ｔ．レエセイｘｙｎＩＩを基準にして１４位、
又は他のキシラナーゼにおけるこれに対応する位置にチ
ロシン又はフェニルアラニンを有するキシラナーゼに限
定される。これは、この１４位にアスパラギン酸を有す
るＢ．プミリス・キシラナーゼを排除する。また、本発
明は、トリコダーマ、ストレプトマイセス、アスペルギ
ルス、及びバチルスによって生成されるキシラナーゼに
限定される。これは、サーモモノスポラ及びクロストリ
ジウム・キシラナーゼを排除する。

【００５１】これらの３種類のキシラナーゼに加えて、
第１１族の他の２つのものは２７位にメチオニン及び２
９位にロイシンを有する。これらは、クロストリジウム
・アセトブチリカムｘｙｎＢ（最適温度４３℃）及びス
トレプトマイセス・リビダンスｘｙｎＣ（最適温度５５
℃）である。しかしながら、これらの酵素はいずれも耐
熱性ではなく、したがって、２７位及び２９位の修飾が
有用であることを示唆するものはない。

【００５２】１０、２７、及び２９位でのヒスチジン、
メチオニン、及びロイシンの具体的な選択はトリコダー
マ・レエセイｘｙｎＩＩの安定性を改善する。この事実
を考慮すると、１０位に置換される多くのアミノ酸のう
ちのあらゆるものがこの酵素の特性を改善することが当
該技術分野における熟練者によって認められるであろ
う。また、２７位及び２９位のメチオニン及びロイシン
による改善を考慮すると、バリン、イソロイシン、ロイ
シン、及びメチオニンを含む疎水性の中サイズのアミノ
酸がこれらの位置で有益であることも認識されるであろ
う。

【００５３】本発明のこの側面における重要な発見は、
１０、２７、及び２９位がトリコダーマ・レエセイｘｙ
ｎＩＩの安定性に重要であることである。この教示に基
づくと、当該技術分野における熟練者は、この修飾が特
定の他の第１１族キシラナーゼに対して有益であり、か
つこの修飾からの利益を享受するには第１１族キシラナ
ーゼが２つの条件を満たさなければならないことを理解
するであろう。

【００５４】第１に、第１１族キシラナーゼは１０位の
上流に少なくとも８個のアミノ酸残基を有していなけれ
ばならない。この１０位に対する修飾は、Ｎ−末端が切
り詰められたキシラナーゼに対しては関係がない。

【００５５】第２に、第１１族キシラナーゼはトリコダ
ーマ・レエセイ・キシラナーゼＩＩの番号付けで１４
位、又は他のキシラナーゼの対応する位置にアミノ酸チ
ロシン又はフェニルアラニンを有していなければならな
い。１４位のチロシン又はフェニルアラニンの側鎖は、
直接そのタンパク質の活性部位に向く。チロシン及びフ
ェニルアラニンは同じようなサイズであって、それぞれ
六員芳香族環を有しており、これは、キシラン基質に結
合する際にキシロース環との重なり相互作用に潜在的に
関与し得る。このタンパク質中の他のアミノ酸の存在
は、このタンパク質の構造全体の大きな変化を引き起こ
す。したがって、１４位にこれらのアミノ酸のいずれか
を有する第１１族キシラナーゼ酵素だけが１０位の修飾
に適する。これに対して、対応する位置に他の残基を有
する第１１族キシラナーゼはこの修飾には馴染み難い。

【００５６】トリコダーマ、ストレプトマイセス、バチ
ルス、及びアスペルギルスの既知の第１１族キシラナー
ゼのうち、トリコダーマ・レエセイｘｙｎＩＩ、トリコ
ダーマ・ハルジアナムｘｙｎ、トリコダーマ・ビリデｘ
ｙｎ、ストレプトマイセス・リビダンスｘｙｎＢ、及び
ストレプトマイセス・リビダンスｘｙｎＣだけがこれら
２つの条件を満たす。したがって、現在、ここに教示さ
れる１０、２７、及び２９位に対する修飾に適すること
が知られる酵素はこれらだけである。

【００５７】本発明のキメラキシラナーゼは従来報告さ
れてはおらず、これらの特定のキメラキシラナーゼがキ
シラナーゼの性能に有益であることを示唆する刊行物は
ない。さらに驚くべきことに、キメラキシラナーゼの好
熱性及び好アルカリ性がそのキメラキシラナーゼを含む
個々のキシラナーゼのいずれかよりも良好な場合があ
る。これらの酵素の例は、実施例７及び１１における修
飾キシラナーゼＮＩ−ＢＸ６及びＮＩ−ＢＸ７である。

【００５８】本発明のこの側面における重大な発見は、
サーモモノスポラ・フュスカ・キシラナーゼＡを用いる
トリコダーマ・レエセイ・キシラナーゼＩＩ又はバチル
ス・サーキュランス・キシラナーゼＡのＮ−末端領域の
セグメントのキメラ修飾がその酵素の好熱性、好アルカ
リ性、及び熱安定性を高め得ることである。

【００５９】この教示に基づいて、１つの条件を満たす
という条件の下で、トリコダーマ、アスペルギルス、ス
トレプトマイセス、及びバチルス以外の第１１族キシラ
ナーゼ、サーモモノスポラ・フュスカｘｙｎＡを有する
株からなる、性能が改善されたキメラキシラナーゼを形
成できることを当該技術分野における熟練者は理解する
であろう。この第１１族キシラナーゼは、トリコダーマ
・レエセイ・キシラナーゼＩＩの番号付けで１４位に、
又は他のキシラナーゼの対応する位置にアミノ酸チロシ
ン又はフェニルアラニンを有してなければならない。１
４位のチロシン又はフェニルアラニンの側鎖はそのタン
パク質の活性側部に直接向いている。チロシン及びフェ
ニルアラニンは同じようなサイズであり、それらの六員
芳香族環はキシラン基質との結合の際のキシロース環と
の重なり相互作用に潜在的に関与する。Ｔ．フュスカ・
キシラナーゼＡはこの位置にフェニルアラニンを有す
る。１４位にチロシン又はフェニルアラニンのいずれか
を有する第１１族キシラナーゼ酵素のみが、Ｔ．フュス
カ・キシラナーゼＡとのキメラキシラナーゼの形成に適
する。対応する位置に他の残基を有する第１１族キシラ
ナーゼはこの修飾には馴染み難い。

【００６０】トリコダーマ、ストレプトマイセス、バチ
ルス、及びアスペルギルスの既知第１１族キシラナーゼ
のうち、トリコダーマ・レエセイｘｙｎＩＩ、トリコダ
ーマ・ハルジアナムｘｙｎ、トリコダーマ・ビリデｘｙ
ｎ、トリコダーマ・レエセイｘｙｎＩ、ストレプトマイ
セス・リビダンスｘｙｎＢ、ストレプトマイセス・リビ
ダンスｘｙｎＣ、バチルス・サーキュランスｘｙｎＡ、
バチルス・サブチリスｘｙｎＡ、アスペルギルス・ニガ
ーｘｙｎＡ、アスペルギルス・カワチイｘｙｎＡ、及び
アスペルギルス・ツビゲンシスｘｙｎＡだけがこの条件
を満たす。したがって、現在、ここに教示されるキメラ
修飾に適することが知られる酵素はこれらだけである。

【００６１】タンパク質の上流伸長が第１１族キシラナ
ーゼ酵素の性能を強化することは報告されておらず、他
の酵素において有益であることも報告されていない。Ｎ
−末端の上流にアミノ酸を追加することが好熱性、好ア
ルカリ性、又は熱安定性を改善するであろうと期待する
根拠はない。

【００６２】３個のアミノ酸グリシン−アルギニン−ア
ルギニンでの上流伸長がその酵素の性能を改善するであ
ろうと期待する根拠はない。天然第１１族キシラナーゼ
のうちの２種類、バチルス・プムリス及びクロストリジ
ウム・ステルコラリウムは、Ｎ−末端の直接上流に１個
のアルギニンのみを有する。両キシラナーゼには、修飾
ＢｃＸ及びＴｒＸの両者の改善された好熱性に必須であ
る他のアルギニン及びグリシンはない。このクロストリ
ジウム酵素は好熱性であるがバチルス酵素は好熱性では
なく、したがって天然の酵素がこの修飾を指し示すこと
はない。

【００６３】クロストリジウム・アセトブチリカムｘｙ
ｎＢ（ＣａＸ）に由来する１０個のアミノ酸の配列での
Ｎ−末端の上流配列が他の第１１族キシラナーゼの好熱
性を改善するであろうと期待する根拠はない。ＣａＸの
最適温度は僅か４３℃であり、これは他の第１１族キシ
ラナーゼに劣る。したがって、この酵素からのアミノ酸
の配列がこれらの他のキシラナーゼの好熱性を改善する
ことは驚くべきことである。

【００６４】ここに説明される上流伸長は、Ｎ−末端配
列をＴ．フュスカ・キシラナーゼＡからＴ．レエセイ由
来のキシラナーゼＩＩ及びＢ．サーキュランス由来のキ
シラナーゼＡに置き換えることにより形成されるキメラ
キシラナーゼで示された。この上流伸長が、Ｎ−末端配
列をＴ．フュスカ・キシラナーゼＡからトリコダーマ、
アスペルギルス、ストレプトマイセス、及びバチルスに
由来する第１１族キシラナーゼに置き換えることにより
形成することが可能なキメラキシラナーゼの性能を改善
するであろうことは当該技術分野における熟練者によっ
て理解されるであろう。

【００６５】まとめると、本発明者らは、パルプ処理に
商業的に利用してその漂白を改善するために望ましい特
性を有する独自の酵素を開発している。

【００６６】

【発明の実施の形態】本発明は、商業的なパルプ漂白用
途に重要な強化された特性、すなわち、好熱性、好アル
カリ性、及び熱安定性を示す修飾第１１キシラナーゼ酵
素を包含する。これらの修飾キシラナーゼは天然酵素に
関連する強化された特性を示す。これらの天然酵素は、
トリコダーマ、バチルス、ストレプトマイセス、及びア
スペルギルスに由来する第１１族キシラナーゼからなる
群より選択される。さらに、この天然キシラナーゼの選
択は、トリコダーマ・レエセイ・キシラナーゼＩＩにお
けるアミノ酸の番号付けに相当する１４位に、又は他の
第１１族キシラナーゼにおける等価の位置にチロシン又
はフェニルアラニンを有するキシラナーゼに限定され
る。

【００６７】選択されたキシラナーゼに対する修飾は下
記のいずれかもしくは両者を包含する。これらはトリコ
ダーマ・レエセイ・キシラナーゼＩＩのアミノ酸の番号
付けによってここに説明され、他の選択された第１１族
キシラナーゼの対応する整列化アミノ酸に適用される。

【００６８】（１）第１０位から上流のＮ−末端に少な
くとも８個のアミノ酸を有する選択されたキシラナーゼ
については、アミノ酸１０を他のアミノ酸で置換する。

【００６９】（２）Ｎ−末端領域のアミノ酸配列をサー
モモノスポラ・フュスカ・キシラナーゼＡ（Ｔｆｘ）に
由来する等価に位置する配列で置換してキメラキシラナ
ーゼを形成し、かつそのタンパク質をＮ−末端の上流で
他のキシラナーゼに由来する１０個までのアミノ酸の配
列を用いて伸長する。

【００７０】本発明は修飾キシラナーゼに関与し、天然
キシラナーゼは請求しない。本発明の実施において、出
発点は第１１族キシラナーゼである。酵素は、それが必
須触媒性残基としての役目を果たす２個のグルタミン酸
（Ｅ）を含む第１１族に共通のアミノ酸を有する場合、
第１１族に分類される。これらのＥ残基は、トリコダー
マ・レエセイｘｙｎＩＩの番号付けでアミノ酸８６及び
１７７である。他の第１１族キシラナーゼについての鍵
となるＥ残基の対応する位置はそのアミノ酸配列を整列
化することによって容易に決定され、その手順は当該技
術分野における熟練者には馴染みのものである。第１１
族キシラナーゼに共通のアミノ酸は図１〜図３にボール
ド体で示されている。（Wakarchuck, et al., ProteinS
cience 3: 467-475 (1994) ）。

【００７１】本発明の実施に用いられる天然第１１族キ
シラナーゼは、トリコダーマ、バチルス、ストレプトマ
イセス、及びアスペルギルスによって生成される第１１
族キシラナーゼの中からのものでなければならない。ま
た、この酵素は、トリコダーマ・キシラナーゼＩＩの番
号付けで１４位に、又は他のキシラナーゼの対応する位
置にチロシン又はフェニルアラニンを有していなければ
ならない。トリコダーマ・レエセイｘｙｎＩＩのアミノ
酸の番号付けは図１〜図３に示されている。

【００７２】アミノ酸１０の置換はトリコダーマ・レエ
セイ・キシラナーゼＩＩのこのアミノ酸を指す。この修
飾は、アミノ酸１０に対応する位置の上流のＮ−末端に
少なくとも８個のアミノ酸残基を有する選択されたキシ
ラナーゼ酵素についてのみ請求される。

【００７３】好ましい態様において、この修飾のために
選択されるキシラナーゼは、Ｔ．レエセイｘｙｎＩＩ、
Ｔ．ハルジアナムｘｙｎ、Ｔ．ビリデｘｙｎ、Ｓ．リビ
ダンスｘｙｎＢ、又はＳ．リビダンスｘｙｎＣからな
る。好ましい態様においては、アミノ酸１０の他のアミ
ノ酸での置換に加えて、アミノ酸２７及び２９がメチオ
ニン、イソロイシン、ロイシン、又はバリンで置換され
る。アミノ酸１０と同様に、アミノ酸２７及び２９は図
１〜図３に示されるトリコダーマ・レエセイ・キシラナ
ーゼＩＩの番号付けを用いて同定される。

【００７４】より好ましい態様においては、アミノ酸１
０、２７、及び２９がそれぞれヒスチジン、メチオニ
ン、及びロイシンで置換される。このタイプの修飾キシ
ラナーゼは実施例においてＮＩ−ＴＸ１１、ＮＩ−ＴＸ
１２及びＮＩ−ＴＸ１３として同定される。

【００７５】キシラナーゼのキメラ修飾は、選択された
キシラナーゼのＮ−末端領域からアミノ酸の配列を除去
し、サーモモノスポラ・フュスカ・キシラナーゼＡのＮ
−末端領域に由来するアミノ酸の配列と置き換えること
からなる。

【００７６】本発明を説明するためにここで用いられる
“Ｎ−末端領域”という用語は、Ｎ−末端に近いトリコ
ダーマ・レエセイ・キシラナーゼＩＩタンパク質の最初
の３１個のアミノ酸を指す。他の第１１族キシラナーゼ
については、Ｎ−末端領域は、これらの配列を整列化し
た際にトリコダーマ・レエセイ・キシラナーゼＩＩの最
初の３１個のアミノ酸に対応するアミノ酸からなる。当
該技術分野において用いられるＮ−末端領域の一般的な
定義はＮ−末端に近いタンパク質の最初の１／３であ
る。本発明において用いられるＮ−末端の定義はこの一
般的な定義と一致するが、必然的にこれよりも厳密であ
る。

【００７７】除去されたアミノ酸の置換は、その２種類
の微生物に由来するキシラナーゼのＮ−末端に対して同
じ位置に位置するアミノ酸配列によるものである。これ
らの２種類のキシラナーゼが異なる数のアミノ酸を有す
る場合には、置換アミノ酸配列は、それらの２種類の酵
素のアミノ酸配列ができる限り一致するように整列化し
た際に元のアミノ酸配列と一致する位置にある。このア
ミノ酸の整列化は当該技術分野における熟練者に馴染み
のものであり、第１１族キシラナーゼの幾つかについて
は図１〜図３に示されている。

【００７８】好ましい態様において、ＴｒＸに由来する
アミノ酸１０ないし２９の配列又は他の第１１族キシラ
ナーゼの等価整列化アミノ酸配列を、サーモモノスポラ
・フュスカ・キシラナーゼＡに由来するアミノ酸の対応
整列化配列によって置換する。この修飾キシラナーゼの
例は、実施例においてＮＩ−ＴＸ４として同定される。

【００７９】好ましい対応において、ＴｒＸに由来する
アミノ酸１ないし２９の配列又は他の第１１族キシラナ
ーゼの等価整列化アミノ酸配列を、サーモモノスポラ・
フュスカ・キシラナーゼＡに由来するアミノ酸の等価整
列化配列によって置換する。この修飾キシラナーゼの例
は、実施例においてＮＩ−ＴＸ３として同定される。

【００８０】他の好ましい態様においては、Ｔｆｘの１
ないし３１アミノ酸配列の代わりにバチルス・サーキュ
ランス・キシラナーゼ（ＢｃＸ）の１ないし２２アミノ
酸配列を用いる。これらの２つの配列を図１の配列に基
づいて整列化する。この修飾キシラナーゼの例は、実施
例においてＮＩ−ＢＸ２として同定される。

【００８１】好ましい態様において、この修飾のために
選択されるキシラナーゼは、トリコダーマ・レエセイｘ
ｙｎＩＩ、トリコダーマ・ハルジアナムｘｙｎ、トリコ
ダーマ・ビリデｘｙｎ、ストレプトマイセス・リビダン
スｘｙｎＢ、ストレプトマイセス・リビダンスｘｙｎ
Ｃ、バチルス・サーキュランスｘｙｎＡ、バチルス・サ
ブチリスｘｙｎＡ、アスペルギルス・ニガーｘｙｎＡ、
アスペルギルス・カワチイｘｙｎＡ、又はアスペルギル
ス・ツビゲンシスｘｙｎＡからなる。

【００８２】上流伸長は、１０個までのアミノ酸の配列
を低分子量第１１族キシラナーゼのＮ−末端の上流に付
加することからなる。この上流伸長は、ここに説明され
るＴ．フュスカ・キシラナーゼＡでの選択された第１１
族キシラナーゼのキメラ修飾と組み合わせて行われる。

【００８３】好ましい態様において、第１１族キシラナ
ーゼのＮ−末端からの上流伸長においてグリシン−アル
ギニン−（アルギニンもしくはリシン）を含むトリペプ
チドが付加され、この伸長はキメラ修飾と組み合わせて
行われる。これらの修飾を有する修飾キシラナーゼの例
はＮＩ−ＴＸ９及びＮＩ−ＢＸ７である。

【００８４】好ましい態様において、１ないし３個の塩
基性アミノ酸がＮ−末端と第１１族キシラナーゼクロ
ストリジウム・アセトブチリカムｘｙｎＢ（ＣａＸ）に
由来する５ないし９個のアミノ酸の配列との間に付加さ
れ、この伸長はキメラ修飾と組み合わせて行われる。こ
れらの修飾を有する修飾キシラナーゼの例は、実施例に
おいて同定されるＮＩ−ＴＸ８、ＮＩ−ＢＸ５、及びＮ
Ｉ−ＢＸ６である。

【００８５】好ましい態様において、アミノ酸配列ＡＳ
ＡＲ又はＡＳＡＫがＮ−末端の上流に付加され、この伸
長はキメラ修飾と組み合わせて行われる。これらの修飾
を有する修飾キシラナーゼの例は、ＮＩ−ＴＸ７、ＮＩ
−ＢＸ３、及びＮＩ−ＢＸ４である。

【００８６】他の好ましい態様の組は、本発明の修飾酵
素をパルプの処理に用いてその漂白性を改善することに
関与する。この酵素処理は５５℃ないし７５℃の温度で
行われ、これは天然の第１１族キシラナーゼを用いてパ
ルプの漂白を強化するのに許容できる範囲にはないもの
である。好ましい態様において、この酵素処理は７．５
ないし９．０のｐＨで行われ、これは天然の第１１族キ
シラナーゼを用いてパルプの漂白を強化するのに許容で
きる範囲にはないものである。

【００８７】本発明のキシラナーゼ酵素がパルプ漂白以
外の用途において有用であり得ることは当該技術分野に
おける熟練者にはよく知られている。例えば、これらの
酵素は、多くの場合において高温ペレット化が現行の酵
素を不適切なものとする、飼料の消化を助ける動物飼料
添加物として有用であり得る。加えて、これらの酵素
は、高温によって現行の酵素が破壊される、デンプン製
造のための小麦及びトウモロコシの処理において有用で
あり得る。これらの、又は他の用途において、本発明の
修飾キシラナーゼ酵素を、セルラーゼ、マンナナーゼ、
β−グルカナーゼ、及びアミラーゼを含むがこれらに限
定されるものではない他の酵素の存在下において用いる
ことができることは、当該技術分野における熟練者によ
く知られている。

【００８８】以下の例を詳細に説明することにより本発
明をさらに説明する。これらは、制限するものと解釈さ
れるものではない。実施例による修飾キシラナーゼを表
２及び３に列挙する。

【００８９】

【表２】

【００９０】

【表３】

【００９１】この後の実施例１ないし３は、本発明によ
る修飾キシラナーゼの生成及び精製を説明する。修飾キ
シラナーゼＮＩ−ＴＸ１ないしＮＩ−ＴＸ１１及びＮＩ
−ＢＸ１ないしＮＩ−ＢＸ７の驚くほど強化された好熱
性、好アルカリ性、及び熱安定性が、キシランを基質と
して用いて実施例４ないし１３において示される。この
キシラン基質に対するキシラナーゼの性能は、パルプの
実際の処理の間に観察される性能とよく相関することが
知られている。漂白前のパルプの処理における本発明に
よる修飾キシラナーゼを用いての驚くほど強化された性
能が、選択された修飾キシラナーゼについて実施例１４
及び１５において確認されている。

【００９２】

【実施例】

実施例１トリコダーマ・レエセイ修飾キシラナーゼＮＩ−ＴＸの
構築

【００９３】プラスミド調製、制限酵素消化、ポリメラ
ーゼ・チェイン・リアクション、オリゴヌクレオチドリ
ン酸化、ライゲーション、形質転換及びＤＮＡハイブリ
ダイゼーションのような基本的な組換えＤＮＡ法は、当
該技術分野における熟練者に馴染みのある十分に確立さ
れたプロトコル（Sungら、１９８６）に従い、又はその
酵素もしくはキットの製造者によって推奨される通りに
行った。多くの酵素用のバッファーはキットの一部とし
て供給され、又は製造者の指示に従って戻した。制限酵
素、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼはオンタリオ州ミシソーガのニューバイオラブス社
（New BioLabs LTD, Mississauga, Ont.）から購入し、
ジーンアンプ（GeneAmp ）ＰＣＲ試薬キットはパーキン
−エルマー（Perkin-Elmer）から購入した。バチルス・
サーキュランス・キシラナーゼ遺伝子が挿入されている
ｐＵＣ型のプラスミドである前駆体プラスミドｐＸＹｂ
ｃは従来調製され、公開されている（Sungら、１９９
３；Campbellら、１９９５年４月１１日に発行された米
国特許５，４０５，７６９号）。通常用いられる大腸菌
株、ＨＢ１０１（カリフォルニア州パロアルトのクロー
ンテック・ラブ（Clonetech Lab, Palo Alto, CA））を
全ての遺伝子構築体の形質転換及び発現ホストとして用
いた。ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡＨ）はアルドリッチ
（Aldricht）から購入した。オリゴヌクレオチドはアプ
ライド・バイオシステム（Applied Biosystem ）ＤＮＡ
シンセサイザー、モデル３８０Ｂを用いて調製した。キ
シラナーゼの検定は、変動が±０. １℃の覆いを付けた
循環水浴（ハーク（Haake ）型Ｆ４３９１）において行
った。この水浴の温度は熱電対で確認した。

【００９４】Ａ．前駆体プラスミドｐＴｖＸ（３−１９
０）の構築続く全ての変異のための前駆体プラスミドｐＴｖＸ（３
−１９０）は従来調製されており、その構築は既に公開
されている（Sungら、１９９５）。このプラスミドは、
プラスミドｐＸＹｂｃから、後者のバチルス・サーキュ
ランス・キシラナーゼ遺伝子を新たに組立てたトリコダ
ーマ・キシラナーゼ遺伝子によって置き換えることによ
り誘導される。このトリコダーマ・キシラナーゼ及び続
いて説明される他の変異キシラナーゼの発現はｌａｃプ
ロモーターの制御下にある。このトリコダーマ・キシラ
ナーゼ遺伝子の全体的な組立は、最初に（９２−１９
０）領域、次いで（１−９２）領域の２段階を必要とし
た。この遺伝子を構築するためのプロトコルは、キシラ
ナーゼをコードする重複合成オリゴヌクレオチドの酵素
的リン酸化、次いで適切に切断されたプラスミドへのそ
れらのライゲーションを用いる型通りのものであって、
多くの他の遺伝子のための標準的な公開された手順と同
じである。

【００９５】最初に、ＴｖＸ（９２−１９０）配列をコ
ードする１０個の重複オリゴヌクレオチド（ＸｙＴｖ−
１０１ないし１１０）（図５〜図６）を、大腸菌のそれ
を模倣するコドン使用頻度で消化した。２つの末端オリ
ゴヌクレオチドのＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩ粘着末端は、
この１０個の断片のＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ直線化プラス
ミドｐＸＹｂｃへの酵素的ライゲーションを可能にし
た。トリコダーマ・キシラナーゼの（９２−１９０）領
域をコードする１０個のオリゴヌクレオチドＸｙＴｖ−
１０１ないしＸｙＴｖ−１１０（５０ピコモル、各々１
μＬ）を、１０×標準キナーゼバッファー（０．４μ
Ｌ）、１ｍＭＡＴＰ（４μＬ）、Ｔ４ＤＡＮキナーゼ
（５単位）、及び水（３μＬ）を含む混合液中でリン酸
化した。リン酸化反応は３７℃で１時間行った。その
後、これらの溶液を合わせ、７０℃に１０分間加熱し
た。徐々に室温に冷却した後、この合わせた溶液を４ｍ
ＭＡＴＰ（３．５μＬ）、ＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ直線
化プラスミドｐＸＹｂｃ（０．１ピコモル）、及びＴ４
ＤＮＡリガーゼ（３．５μＬ）の混合液に添加し、１２
℃で２０時間インキュベートした。このライゲーション
混合液のアリコートを、アンピシリン（１００ｇｍ／
Ｌ）を含むＹＴプレート（水１Ｌ中に８ｇの酵母抽出
物、５ｇのバクトトリプトン、５ｇのＮａＣｌ、１５ｇ
の寒天）における大腸菌ＨＢ１０１の形質転換に用い
た。

【００９６】ハイブリダイゼーションプローブを調製す
るため、オリゴヌクレオチドＸｙＴｖ−１１０のうちの
１つ（１０ピコモル、１μＬ）を、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ
（１μＬ）、１０×キナーゼバッファー（１μＬ）、及
び水（４μＬ）中の３２Ｐ−ＡＴＰ（１０ピコモル、３
μＬ）を用いて３７℃で１時間リン酸化した。ハイブリ
ダイゼーション分析のため形質転換体を無作為に選択し
た。コロニーをアンピシリンを含むＹＴプレート上のナ
イロンフィルターで一晩成長させた。次いで、それらを
０．５ＮＮａＯＨ−１．５ＭＮａＣｌで変性させ
（１０分）、０．５Ｎトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）−
１．５ＭＮａＣｌで中和した（１０分）。２５４ｎｍ
のＵＶで８分間照射した後、これらのフィルターを６×
ＳＳＣ−０．５％トリトンＸ−１００で３０分間洗浄し
た。細胞の残滓を完全に廃棄した。新鮮な溶液中でさら
に３０分後、これらの複写フィルターを個別に６×ＳＳ
Ｃ−１％硫酸デキストラン−０．０５％トリトンＸ−１
００−１×デンハルト・ハイブリダイゼーション液の別
々の混合液に移した。前記３２Ｐ−標識プローブをこの
フィルターに添加した。４５℃で１６時間後、このフィ
ルターを６×ＳＳＣ−０．０５％トリトンＸ−１００を
用いて室温で５分間、次いで６５℃で３０分間、２回洗
浄した。中間プラスミドｐＢｃＸ．ＴｖＸを有する確実
にハイブリダイズしたクローンをオートラジオグラフ分
析によって同定した。

【００９７】合成重複オリゴヌクレオチドの酵素的リン
酸化及び直線化プラスミドへのライゲーションを含む上
記プロトコルは、ＴＸ（１−９２）領域の組立、並びに
本発明において説明される幾つかの一連の変異体ＮＩ−
ＴＸ及びＮＩ−ＢＸを引き続いて生成させるためのカセ
ット変異生成において再度用いられている。

【００９８】ＴＸ（１−９２）領域を組み立てて完全長
のトリコダーマ遺伝子を完成させるため、この中間プラ
スミドｐＢｃＸ．ＴｖＸをＮｈｅＩ及びＫｐｎＩエンド
ヌクレアーゼで直線化してＢｃＸ（１−８３）のＤＮＡ
インサートを放出させた。ＮｈｅＩ及びＫｐｎＩ粘着末
端を用いて、公開されているＴｖＸ（３−９１）配列を
コードする１０個の重複オリゴヌクレオチド（ＸｙＴｖ
−１ないし−１０）を、上記プロトコルにより、直線化
プラスミドｐＢｃＸ．ＴｖＸにライゲートした（図５〜
図６）。その結果、新規プラスミドｐＴｖＸ（３−１９
０）は合成ＴｖＸ（３−１９０）遺伝子を含んだ。天然
ＴｒＸと比較すると、この組換えＴｖＸ（３−１９０）
は５つの異なる残基：Ａｌａ−１、Ｓｅｒ−２、Ｇｌｙ
−４、Ｐｈｅ−９、Ｔｈｒ−６５及びＴｈｒ−１４３を
有する。

【００９９】比較のため、同じ方法で５つの天然残基を
用いて、天然ＴｒＸをコードする遺伝子も組み立てた。
これも公開されている（Sungら、１９９５）。大腸菌中
でのこの遺伝子の発現により、組換え型のＴｒＸ（ｒｅ
ｃ．ＴｒＸ）が生成した。下記及びSungらによる同じ報
告（１９９５）に示されるように、ＴｖＸ（３−１９
０）及びｒｅｃ．ＴｒＸの両者の性能特性は同じであっ
た。しかしながら、両大腸菌発現キシラナーゼは、おそ
らくは天然ＴｒＸの場合のような翻訳後修飾の欠如のた
め、好熱性及び熱安定性において天然ＴｒＸ（ｎａｔｌ
ＴｒＸ）に劣っていた。

【０１００】Ｂ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１の構築以下に説明される一連のＮＩ−ＴＸ及びＮＩ−ＢＸの両
者を含む全ての変異体キシラナーゼ遺伝子がカセット変
異生成の方法によって構築されている。このカセット変
異生成のプロトコルは上に十分に説明される遺伝子組立
のものと同じであった。このようなカセット変異生成
は、（ｉ）重複合成オリゴヌクレオチドの酵素的リン酸
化、（ｉｉ）直線化プラスミドとのそれらのライゲーシ
ョン、（ｉｉｉ）大腸菌Ｈ１０１コンピテント細胞への
形質転換、（ｉｖ）前記標識オリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いるハイブリダイゼーションによる変異形
質転換体の同定、及び（ｖ）ジデオキシヌクレオチド配
列決定による変異の確認を包含する。

【０１０１】変異体ＮＩ−ＴＸ１は１つの変異Ｑ１６２
Ｈを有するＴｖＸ（３−１９０）と同一であった。プラ
スミドｐＮＩ−ＴＸ１の構築は、カセット変異生成にお
いてＮｓｉＩ／ＡｖｒＩＩ直線化プラスミドｐＴｖＸ
（３−１９０）にオリゴヌクレオチドＴＸ−１６２Ｈ−
１及びＴＸ−１６２Ｈ−２（下記）をライゲートするこ
とによるものであった。

【０１０２】

【化１】

【０１０３】Ｃ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ２の構築変異体ＮＩ−ＴＸ２はＮＩ−ＴＸ１を修飾したものであ
り、（ｉ）Ｔｆｘ（１−２９）配列によって置換された
後者の（１−２９）配列、及び（ｉｉ）−４から−１位
においてテトラペプチドＡＳＨＡで上流に伸長されたＮ
−末端を有する。プラスミドｐＮＩ−ＴＸ２は、カセッ
ト変異生成において、Ｔｆｘ（１−２９）配列をコード
する重複オリゴヌクレオチドＴｆｘ−１、−２、−３及
び−４をｐＮＩ−ＴＸ１のＮｈｅＩ／ＡｐａＩ直線化プ
ラスミドにライゲートすることによって構築した。

【０１０４】

【化２】

【０１０５】Ｄ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ３の構築変異体ＮＩ−ＴＸ３はＮＩ−ＴＸ２を修飾したものであ
り、後者にある（−４）から（−１）位の余分のテトラ
ペプチドＡＳＨＡがない。プラスミドｐＮＩ−ＴＸ３
は、ＮＩ−ＴＸ２におけるＴｆｘ（１−６）に対するコ
ーディング配列をＴｒＸ（１−６）から余分の上流残基
を取り去ったものに対する新しいコーディング配列で置
換することにより調製した。これは、カセット変異生成
において、オリゴヌクレオチドＴｆｘ（１−６）−１及
びＴｆｘ（１−６）−２をＮｈｅＩ／ＰｉｎＡＩ直線化
プラスミドｐＮＩ−ＴＸ２にライゲートすることによっ
て達成した。

【０１０６】

【化３】

【０１０７】Ｅ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ４の構築変異体ＮＩ−ＴＸ４はＮＩ−ＴＸ１を修飾したものであ
り、後者の（１０−２９）配列がＴｆｘ（１０−２９）
配列で置換されている。プラスミドｐＮＩ−ＴＸ４は、
ＮＩ−ＴＸ２におけるＴｆｘ（１−６）のコーディング
配列をＴｒＸ（１−６）のものと置換することによって
調製した。これは、カセット変異生成において、オリゴ
ヌクレオチドＴＸ−１ｆ及びＴＸ−８ｆをＮｈｅＩ／Ｐ
ｉｎＡＩ直線化プラスミドｐＮＩ−ＴＸ２にライゲート
することによって達成した。

【０１０８】

【化４】

【０１０９】Ｆ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ５及びｐＴＸ
−２８Ｅ−２９Ｌ−１６２Ｈの構築変異体ＮＩ−ＴＸ５は、ＮＩ−ＴＸ１の（２６−２９）
領域におけるテトラペプチドＴＹＴＮアミノ酸配列がＴ
ｆｘの（２６−２９）領域における対応テトラペプチド
ＳＭＥＬで置換されていることを除いて、ＮＩ−ＴＸ１
と同一であった。プラスミドｐＮＩ−ＴＸ５の構築は、
カセット変異生成において、ヘテロ二本鎖オリゴヌクレ
オチドＴＸ−２６ＳＭＥＬ−１及びＴＸ−２８Ｅ／２９
Ｌ−１（下記）をＮｃｏＩ／ＡｐａＩ直線化プラスミド
ｐＮＩ−ＴＸ１にライゲートすることによるものであっ
た。このプラスミド調製品をサブクローン化することに
より、目的の２つのプラスミドを得た。

【０１１０】

【化５】

【０１１１】これら２つのオリゴヌクレオチドがヘテロ
二本鎖であるため、ＴＸ−２６ＳＭＥＬ−１及びＴＸ２
８Ｅ／２９Ｌ−１を用いるサブクローン化及びハイブリ
ダイゼーションにより、２つのプラスミド、（ｉ）（２
６−２９）領域にＳＭＥＬを有するｐＮＩ−ＴＸ５、及
び（ｉｉ）２８及び２９位にＥ及びＬを有するｐＴＸ２
８Ｅ−２９Ｌ−１６２Ｈが得られた。

【０１１２】Ｇ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ６変異体ＮＩ−ＴＸ６は、２つの単一の変異Ｙ２７Ｍ及び
Ｎ２９Ｌがあることを除いて、ＮＩ−ＴＸ１と同一であ
った。プラスミドｐＮＩ−ＴＸ６の構築は、カセット変
異生成において、オリゴヌクレオチドＴＸ−２７Ｍ／２
９Ｌ−１及びＴＸ−２７Ｍ／２９Ｌ−２（下記）をＮｃ
ｏＩ／ＡｐａＩ直線化プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１にライ
ゲートすることによるものであった。

【０１１３】

【化６】

【０１１４】Ｈ．プラスミドｐＴＸ−２７Ｍ−１６２Ｈ
の構築変異体ＴＸ−２７Ｍ−１６２Ｈは、さらに変異Ｙ２７Ｍ
があることを除いて、ＮＩ−ＴＸ１と同一であった。プ
ラスミドの構築は、カセット変異生成において、二本鎖
オリゴヌクレオチドＴＸ−２７Ｍ−１及びＴＸ−２７Ｍ
−２（下記）をＮｃｏＩ／ＡｐａＩ直線化プラスミドｐ
ＮＩ−ＴＸ１にライゲートすることによるものであっ
た。

【０１１５】

【化７】

【０１１６】Ｉ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ７の構築変異体ＮＩ−ＴＸ７はＮＩ−ＴＸ３を修飾したものであ
り、−４から−１位にテトラペプチドＡＳＡＲを有す
る。プラスミドｐＮＩ−ＴＸ７の構築は、カセット変異
生成において、オリゴヌクレオチドＴｆ−（−１）Ｒ−
１及びＴｆ−（−１）Ｒ−２をＮｈｅＩ／ＰｉｎＡＩ直
線化プラスミドｐＮＩ−ＴＸ２にライゲートすることに
よって達成した。

【０１１７】

【化８】

【０１１８】Ｊ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ８の構築変異体ＮＩ−ＴＸ８はＮＩ−ＴＸ３を修飾したものであ
り、後者のＮ−末端が（ｉ）（−１０）から（−２）位
のＣ．アセトブチリカムｘｙｎＢ（２３−３１）配列、
及び（ｉｉ）（−１）位のＡｒｇ残基（Ｔｆｘアミノ酸
の番号付け）で上流に伸長されている。プラスミドｐＮ
Ｉ−ＴＸ８の構築は、カセット変異生成において、オリ
ゴヌクレオチドＣａＴｆ−（−１）Ｒ−１及びＣａＴｆ
−（−１）Ｒ−２をＮｈｅＩ／ＰｉｎＡＩ直線化プラス
ミドｐＮＩ−ＴＸ２にライゲートすることによって達成
した。

【０１１９】

【化９】

【０１２０】Ｋ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ９の構築変異体ＮＩ−ＴＸ９はＮＩ−ＴＸ３を修飾したものであ
り、Ｎ−末端が（−３）から（−１）位（Ｔｆｘアミノ
酸の番号付け）のトリペプチドＧＲＲで上流に伸長され
ている。

【０１２１】トリペプチドＧＲＲを（−３）から（−
１）位に導入するため、ＰＣＲプライマーを構築した。
これらの５’及び３’プライマーは以下の通りである。
５’プライマー、ＧＲＲ−Ｔｆ（１−６）−１

【０１２２】

【化１０】

【０１２３】３’プライマー、Ｕｎｉ−ＰＣＲ−１ｒ

【０１２４】

【化１１】

【０１２５】このプラスミドｐＮＩ−ＴＸ２をＰＣＲの
テンプレートとして用いた。その反応溶液は、プラスミ
ドｐＮＩ−ＴＸ２ＤＮＡ（５０ｎｇ、１５μＬ）、５
μＬの１０×バッファー（１００ｍＭＫＣｌ、１００
ｍＭ硫酸アンモニウム、２００ｍＭトリス−ＨＣｌｐ
Ｈ８．８、４０ｍＭ硫酸マグネシウム、１％トリトンＸ
−１００、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）、５μＬの５ｍ
ＭｄＮＴＰ、５’プライマー溶液（２５ピコモル、
２．５μＬ）、３’プライマー溶液（２５ピコモル、
２．５μＬ）及び水（１９μＬ）を含んでいた。

【０１２６】反応物はパラフィン油（５０μＬ）で覆っ
て蒸発を防いだ。この反応混合物を予め酵素なしで９４
℃に５分間暖め、７２℃に冷却した後、酵素ＤＮＡポリ
メラーゼ（１μＬ、１Ｕ）を添加した。この反応物を、
９４℃で１分、５５℃で２分、及び７２℃で２分の温度
サイクルで３０サイクルインキュベートした。このＰＣ
Ｒ生成の収量は６００ｂｐ断片約１μｇであった。この
断片をアガロースゲルで精製した。

【０１２７】得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｓｔＩ及
びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、続いてカセット変異生成に
おいてＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ直線化プラスミドｐＮ
Ｉ−ＴＸ３にライゲートした。大腸菌ＨＢ１０１を形質
転換することによりプラスミドｐＮＩ−ＴＸ９を得た。

【０１２８】Ｌ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１０の構築変異体ＮＩ−ＴＸ１０は、２つの単一の変異Ｈ１０Ｎ及
びＤ１１Ｎがあることを除いて、ＮＩ−ｔＸ１と同一で
ある。プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１２の構築は、カセット
変異生成において、オリゴヌクレオチドＴＸ１０ＨＤ−
１及びＴＸ１０ＨＤ−２（下記）をＰｉｎＡＩ／Ａｐａ
Ｉ直線化プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１にライゲートするこ
とによるものであった。

【０１２９】

【化１２】

【０１３０】Ｍ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１１及びｐＮ
Ｉ−ＴＸ１２の構築変異体ＮＩ−ＴＸ１１及びＮＩ−ＴＸ１２は、それぞれ
３つ及び４つの単一の変異を有するＮＩ−ＴＸ１と同一
であった。ＮＩ−ＴＸ１１は３つの変異Ｎ１０Ｈ、Ｙ２
７Ｍ及びＮ２９Ｌを有する。ＮＩ−ＴＸ１２は４つの変
異Ｎ１０Ｈ、Ｎ１１Ｄ、Ｙ２７Ｍ及びＮ２９Ｌを有す
る。

【０１３１】所望の遺伝子がプラスミドｐＮＩ−ＴＸ６
をテンプレートとして用いるＰＣＲによって構築されて
いる。５’及び３’ＰＣＲプライマーＴＸ１０ＨＤ／Ｎ
−１及びＵｎｉ−ＰＣＲ−１ｒ、並びにトリペプチドＧ
ＲＲを導入するためのＰＣＲプロトコルはｐＮＩ−ＴＸ
９の構築において説明されている。

【０１３２】得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｉｎＡＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、続いて、カセット
変異生成において、ＰｉｎＡＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ直線化
プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１にライゲートした。大腸菌Ｈ
Ｂ１０１の形質転換により、プラスミドｐＮＩ−１１及
びｐＮＩ−１２の両者が得られた。ヌクレオチド配列決
定によりそれらの同一性を確かめた。

【０１３３】５’プライマーＴＸ１０ＨＤ／Ｎ−１

【０１３４】

【化１３】

【０１３５】Ｎ．プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１３の構築変異体ＮＩ−ＴＸ１３は、ＮＩ−ＴＸ１１において説明
される３つの変異Ｎ１０Ｈ、Ｙ２７Ｍ及びＮ２９Ｌがあ
ることを除いて、組換え野性型ＴｒＸと同一である。こ
の変異体の生成には、変異体ＮＩ−ＴＸ１１の１−４位
の残基をＴｒＸのそれに変換する必要がある。変異体Ｎ
Ｉ−ＴＸ１１の３つの残基Ａｌａ−１、Ｓｅｒ−２、Ｇ
ｌｙ−４がそれぞれＧｌｎ、Ｔｈｒ及びＧｌｎに変換さ
れている。プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１３の構築は、カセ
ット変異生成において、オリゴヌクレオチドＴｒＸ１ｆ
及びＴｒＸ８ｆ（下記）をＮｈｅＩ／ＰｉｎＡＩ直線化
プラスミドｐＮＩ−ＴＸ１１にライゲートすることによ
るものであった。

【０１３６】

【化１４】

【０１３７】実施例２バチルス・サーキュランス変異体キシラナーゼＮＩ−Ｂ
Ｘの構築

【０１３８】真菌トリコダーマ・キシラナーゼＮＩ−Ｔ
Ｘ２、ＮＩ−ＴＸ３、ＮＩ−ＴＸ７、ＮＩ−ＴＸ８及び
ＮＩ−ＴＸ９における修飾が細菌Ｂ．サーキュランス・
キシラナーゼ（ＢｃＸ）においても繰り返されている。
前駆体プラスミドｐＸＹｂｃは従来調製されて公開され
ており（Sungら、１９９３；Campbellら、１９９５年４
月１１日発行の米国特許５，４０５，７６９号）、簡単
に説明するに止める。Ｂ．サーキュランス・キシラナー
ゼ（ＢｃＸ）をコードする合成遺伝子は、ｐＸｙＴｖ
（３−１９０）について上で説明されるものと同じプロ
トコルで、Ｔ４ＤＮＡキナーゼによる酵素的リン酸化及
びＴ４ＤＮＡによる直線化プラスミドへの重複合成オリ
ゴヌクレオチドのライゲーションによって組立てた。

【０１３９】Ａ．プラスミドｐＮＩ−ＢＸ１の構築ＮＩ−ＢＸ１における修飾はＮＩ−ＴＸ２の調製におい
て適用されている。変異体ＮＩ−ＢＸ１はＢｃＸを修飾
したものであり、後者の（１−２９）領域がＴｆｘ（１
−３１）配列によって置換されている。プラスミドｐＮ
Ｉ−ＢＸ１は、カセット変異生成において、Ｔｆｘ（１
−３１）配列をコードする重複オリゴヌクレオチドＴｆ
ｘ−１、−２ｂ、−３及び−４ｂをｐＸＹＢｃのＮｈｅ
Ｉ／ＢｓｐＥＩ直線化プラスミドにライゲートすること
によって構築した。

【０１４０】

【化１５】

【０１４１】Ｂ．プラスミドｐＮＩ−ＢＸ２の構築ＮＩ−ＢＸ２における修飾はＮＩ−ＴＸ３の調製におい
て適用されている。変異体ＮＩ−ＢＸ２はＮＩ−ＢＸ１
を修飾したものであり、後者におけるもののような（−
４）から（−１）位の余分な残基がない。プラスミドｐ
ＮＩ−ＢＸ２は、ＮＩ−ＢＸ１遺伝子におけるＴｆｘ
（１−６）に対するコーディング配列をＴｒＸ（１−１
６）から上流の余分な残基を取り去ったものに対する新
しいコーディング配列で置換することによって調製し
た。これは、カセット変異生成において、オリゴヌクレ
オチドＴｆｘ（１−６）−１及びＴｆｘ（１−６）−２
をＮｈｅＩ／ＰｉｎＡＩ直線化プラスミドｐＮＩ−ＢＸ
１にライゲートすることにより達成した。

【０１４２】Ｃ．プラスミドｐＮＩ−ＢＸ３の構築ＮＩ−ＢＸ３における修飾はＮＩ−ＴＸ７の調製におい
て適用されている。変異体ＮＩ−ＢＸ３はＮＩ−ＢＸ１
を修飾したものであり、そのＮ−末端が（−１）位の１
個のＡｒｇ残基によって伸長されている。プラスミドｐ
ＮＩ−ＢＸ３の構築は、カセット変異生成において、オ
リゴヌクレオチドＴｆ−（−１）Ｒ−１及びＴｆ−（−
１）Ｒ−２をＮｈｅＩ／ＰｉｎＡＩ直線化プラスミドｐ
ＮＩ−ＢＸ１にライゲートすることによって達成した。

【０１４３】Ｄ．プラスミドｐＮＩ−ＢＸ４の構築変異体ＮＩ−ＢＸ４は、（−１）位でＡｒｇ残基がＬｙ
ｓ残基で置き換えられていることを除いて、ＮＩ−ＢＸ
３と同一である。プラスミドｐＮＩ−ＢＸ４の構築は、
カセット変異生成において、オリゴヌクレオチドＴｆ−
（−１）Ｋ−１及びＴｆ−（−１）Ｋ−２をＮｈｅＩ／
ＰｉｎＡＩ直線化プラスミドｐＮＩ−ＢＸ１にライゲー
トすることによって達成した。

【０１４４】

【化１６】

【０１４５】Ｅ．プラスミドｐＮＩ−ＢＸ４−Ｋ（−
１）Ｄ及びｐＮＩ−ＢＸ４−Ｋ（−１）Ｅの構築変異体ＮＩ−ＢＸ４−Ｋ（−１）Ｄ及びＮＩ−ＢＸ４−
Ｋ（−１）Ｅは、（−１）位の塩基性残基が酸性残基Ａ
ｓｐ又はＧｌｕによって置換されていることを除いて、
ＮＩ−ＢＸ４又はＮＩ−ＢＸ３と同一である。これらの
プラスミドの構築は、カセット変異生成において、ヘテ
ロ二本鎖オリゴヌクレオチドＴｆ−（−１）Ｄ−１及び
Ｔｆ−（−１）Ｅ−２をＮｈｅＩ／ＰｉｎＡＩ直線化プ
ラスミドｐＮＩ−ＢＸ１にライゲートすることによって
達成した。調製したこれらのプラスミドをサブクローン
化することにより目的のプラスミドを得た。

【０１４６】

【化１７】

【０１４７】Ｆ．プラスミドｐＮＩ−ＢＸ５の構築ＮＩ−ＢＸ５における修飾はＮＩ−ＴＸ８の調製におい
て適用されている。変異体ＮＩ−ＢＸ５は、（ｉ）Ｔｆ
ｘ（１−２９）アミノ酸配列によるその（１−２９）配
列の置換、（ｉｉ）（−１）位（Ｔｆｘアミノ酸の番号
付け）のＡｒｇ残基の伸長、及び（ｉｉｉ）（−１０）
から（−２）位のＣ．アセトブチリカムｘｙｎＢ（２３
−３１）配列による上流でのさらなる伸長を有する。プ
ラスミドｐＮＩ−ＢＸ５の構築は、カセット変異生成に
おいて、オリゴヌクレオチドＣａＴｆ−（−１）Ｒ−１
及びＣａＴｆ−（−１）Ｒ−２をＮｈｅＩ／ＰｉｎＡＩ
直線化プラスミドｐＮＩ−ＢＸ１にライゲートすること
によって達成した。

【０１４８】Ｇ．プラスミドｐＮＩ−ＢＸ６の構築ＮＩ−ＢＸ５の（−３）及び（−２）位での変種を生成
するためＰＣＲプライマーを構築した。混成塩基は（−
３）のＳｅｒ及びＧｌｙ、並びに（−２）のＰｒｏ、Ａ
ｌａ、Ｇｌｙ及びＡｒｇをコードした。５’及び３’プ
ライマーを以下に示す。

【０１４９】５’プライマー、ＣａＴｆ−ＰＣＲ−１

【０１５０】

【化１８】

【０１５１】ここで、Ｘ＝Ａ及びＧの混成Ｙ＝Ｇ及びＣの混成３’プライマー、Ｘｙ−１４ａ

【０１５２】

【化１９】

【０１５３】プラスミドｐＮＩ−ＢＸ１をＰＣＲのテン
プレートとして用いた。ＰＣＲのプロトコルはＮＩ−Ｔ
Ｘ９の構築において説明されている。ＰＣＲ生成の収量
は２００ｂｐ断片約１μｇであった。この断片をアガロ
ースゲルで精製した。

【０１５４】得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｈｅＩ及
びＢａｍＨＩで切断し、続いて、カセット変異生成にお
いてＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ直線化プラスミドｐＸＹＢｃ
にライゲートした。大腸菌ＨＢ１０１の形質転換によ
り、異なる（−３）及び（−２）位の残基をコードする
異なるキシラナーゼ遺伝子を有するプラスミドを得た。
下記実施例における発現キシラナーゼの酵素的特性の研
究によると、最も改善された変異体はＮＩ−ＢＸ６であ
った。ＮＩ−ＢＸ６のジデオキシヌクレオチド配列決定
により、Ｇｌｙ及びＡｒｇがそれぞれ（−３）及び（−
２）位にあることが明らかになった。

【０１５５】Ｈ．プラスミドｐＮＩ−ＢＸ７の構築変異体ＮＩ−ＢＸ７はＮＩ−ＢＸ２を修飾したものであ
り、Ｎ−末端が（−３）から（−１）位（Ｔｆｘアミノ
酸の番号付け）のトリペプチドＧＲＲで上流に伸長され
ている。

【０１５６】所望の遺伝子は、プラスミドｐＮＩ−ＢＸ
１をテンプレートとして用いるＰＣＲによって構築され
ている。ＰＣＲプライマーＧＲＲ−Ｔｆ（１−６）−１
及びＵｎｉ−ＰＣＲ−１ｒ、並びにトリペプチドＧＲＲ
を導入するためのＰＣＲプロトコルはＮＩ−ＴＸ９の構
築において説明されている。

【０１５７】得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｓｔＩ及
びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、続いて、カセット変異生成
においてＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ直線化プラスミドｐ
ＮＩ−ＴＸ３にライゲートした。大腸菌ＨＢ１０１の形
質転換によりプラスミドｐＮＩ−ＢＸ７を得た。

【０１５８】実施例３修飾キシラナーゼの生成及び検定

【０１５９】（Ａ）キシラナーゼの生成培養条件は、他の大腸菌発現キシラナーゼについて説明
される十分に確立されたプロトコルと同じであった。ア
ンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含む２ＹＴ培地（酵母
抽出物１６ｇ、バクトトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５
ｇ、水１Ｌ）中の一晩接種物５ｍｌを、アンピシリンを
含む２ＹＴ培地（１Ｌ）に添加した。この培養物を撹拌
しながら（２００ｒｐｍ）３７℃で成長させた。１６時
間後、細胞を回収した。

【０１６０】（Ｂ）修飾キシラナーゼの精製細胞からタンパク質試料を調製した。これは、まず、１
０ｇの細胞ペーストを２５ｇのアルミナ粉末と共に粉砕
することによって細胞抽出物を作製することにより行っ
た。混合物が滑らかになるまで粉砕した後、少量（５ｍ
Ｌ）の氷冷バッファーＡ（ＢｃＸ変異体のための１０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）又はバッファーＢ（Ｔ
Ｘ変異体のための１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．
６）を添加し、この添加の間には混合物を激しく粉砕し
た。この混合物を８０００×ｇで３０分間遠心すること
により、アルミナ及び細胞残滓を除去した。

【０１６１】カラムクロマトグラフィーに先立って、以
下の方法のうちの１つで修飾キシラナーゼの上清（２５
ｍＬ）を調製した。

【０１６２】（１）ＮＩ−ＢＸ１、ＮＩ−ＢＸ２、ＮＩ
−ＴＸ１、ＮＩ−ＴＸ２、ＮＩ−ＴＸ３、ＮＩ−ＴＸ
４、ＮＩ−ＴＸ６、ＮＩ−ＴＸ７、ＮＩ−ＴＸ１０、Ｎ
Ｉ−ＴＸ１１、ＮＩ−ＴＸ１２、ＮＩ−ＴＸ１３。透析
管（３５００分子量遮断）を用いて、３Ｌのバッファー
Ａに対して４℃で一晩透析する。透析バッグ内に僅かに
沈殿が形成される。これは８０００×ｇで１５分間遠心
することにより除去する。

【０１６３】（２）ＮＩ−ＢＸ３、ＮＩ−ＢＸ４、ＮＩ
−ＢＸ５、ＮＩ−ＢＸ６、ＮＩ−ＢＸ７６０℃で２０分、次いで６８℃で３０分間熱し、遠心し
て大量の沈殿を除去する。その上清をｐＨ４．６に酸性
化し、−２０℃で一晩凍結させて解凍し、遠心してさら
に沈殿を除去する。

【０１６４】（３）ＮＩ−ＴＸ８、ＮＩ−ＴＸ９６０℃で３０分間加熱し、遠心して大量の沈殿を除去す
る。その上清をｐＨ４．６に酸性化し、−２０℃で一晩
凍結させて解凍し、遠心してさらに沈殿を除去する。

【０１６５】（４）ＮＩ−ＴＸ５透析又は加熱を行うことなく、粗製上清を直接ｐＨ４．
６に酸性化し、−２０℃で一晩凍結させて解凍し、遠心
してさらに沈殿を除去する。

【０１６６】上記予備処理の後、その細胞抽出物を、バ
ッファーＡで平衡化した５０ｍＬの床容積のＳ−セファ
ロース・ファースト・フロー陽イオン交換カラム（カビ
−ファルマシア（Kabi-Pharmacia）、カナダ）に汲み上
げた。バッファーＡ中の０ないし０．３ＭＮａＣｌの
直線勾配３００ｍＬを用いて、３ｍＬ／分の流速で、キ
シラナーゼを溶出させた。キシラナーゼはこの勾配の１
００ないし１５０ｍＬで溶出する。その画分をＳＤＳ−
ＰＡＧＥでチェックしてキシラナーゼの大部分を含む画
分をプールし、３０００ダルトン分子量遮断膜（アミコ
ン（Amicon）ＹＭ３）を用いる限外濾過により濃縮す
る。次に、濃縮した物質（５ｍＬ）を、５０ｍＭ酢酸ア
ンモニウムｐＨ６で平衡化した１．５ｃｍ×８５ｃｍ
ＴＳＫ−ＨＷ５０Ｓゲル濾過カラムにかけた。９０ない
し１００ｍＬの容量でキシラナーゼが溶出した。これら
の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そのピーク
を純粋なキシラナーゼとしてプールした。このタンパク
質を２８０ｎｍでの消散係数を用いて定量した。細胞１
０ｇからの典型的な精製収量はキシラナーゼ２５ｍｇで
あった。全てのＮＩ−ＴＸ及びＮＩ−ＢＸキシラナーゼ
は、グリセロールを含まない酢酸アンモニウムバッファ
ーにおける良好な溶解性を有している。

【０１６７】（Ｃ）酵素活性を測定するための標準検定定量的な検定により、可溶性キシランから生じる還元糖
末端の数を決定した。この検定の基質は、カバキシラン
の５％懸濁液（シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical C
o.））からの水中に溶解されているカバキシランの画分
であった。不溶性画分を除去した後、その上清を凍結乾
燥して乾燥器内に保存した。比活性の測定を以下の通り
に行った。検定バッファ（５０ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ５．５もしくは被験キシラナーゼに最適のｐ
Ｈ）で予め希釈されている３０ｍｇ／ｍＬキシラン１０
０μＬ、検定バッファー１５０μＬ、検定バッファーで
希釈されている酵素５０μＬを含む反応混合物を４０℃
でインキュベートした。様々な時間間隔でその一部５０
μＬを取り、１ｍＬの５ｍＭＮａＯＨで希釈すること
により反応を停止させた。ヒドロキシ安息香酸ヒドラジ
ド試薬（ＨＢＡＨ）を用いて還元糖の量を決定した（Le
ver, 1972, Analytical Biochem 47: 273-279）。酵素
活性の１単位を、４０℃で１分間に１μモルの還元糖を
生じる量と定義した。

【０１６８】修飾キシラナーゼと天然キシラナーゼとを
比較するため（表４及び５）、キシラナーゼの比活性を
天然キシラナーゼの比活性に標準化した。

【０１６９】

【表４】

【０１７０】＊データは天然ＴｒＸの比活性７７０Ｕ／
ｍｇに標準化されている。

【０１７１】

【表５】

【０１７２】＊データはＢｃＸの比活性３３０Ｕ／ｍｇ
に標準化されている。ＮＩ−ＴＸ（表４）及びＮＩ−Ｂ
Ｘキシラナーゼ（表５）の両者において、修飾キシラナ
ーゼの４０℃での比酵素活性は天然キシラナーゼと大き
くは相違しない。

【０１７３】実施例４修飾トリコダーマキシラナーゼの温度／活性概要

【０１７４】これは、可溶性キシランの加水分解におけ
るキシラナーゼの酵素活性に対する温度の効果の尺度で
あった。その手順は、インキュベーション温度及び時間
の変化を伴う標準検定と同じであった。酵素（１５μｇ
／ｍＬ）とｐＨ５．５の５０ｍＭクエン酸ナトリウム中
の可溶性キシラナーゼとを混合し、循環水浴中におい
て、異なる温度でインキュベートした。３０分後、キシ
ランから放出された還元糖の量をＨＢＡＨによって決定
し、４０℃での値を１００％とする相対活性として算出
した。

【０１７５】キシランの加水分解に対する温度の効果を
図５に示す。大腸菌発現ＴｖＸ（３−１９０）は、５５
℃以上では、天然ＴｒＸよりもかなり小さい活性しか示
さなかった。Sungら、１９９５によって報告されるよう
に、同様に低い好熱性が大腸菌発現ＴｒＸにおいて示さ
れている。

【０１７６】天然ＴｒＸは６０℃までは非常に活性であ
った。大腸菌内で発現するものを上回るこの酵素の耐熱
性の利点は、おそらく、トリコダーマホストにおける翻
訳後修飾の結果である。

【０１７７】変異Ｑ１６２Ｈを有する変異体ＮＩ−ＴＸ
１は、ＴｖＸ（３−１９０）と同じ活性／温度概要を有
する。

【０１７８】ＮＩ−ＴＸ１の（１−２９）領域をＴｆｘ
（１−２９）の対応配列で置換し、（−４）から（−
１）位でテトラペプチドＡＳＨＡを用いてＮ−末端を伸
長させることによりＮＩ−ＴＸ２が生じた。有効温度を
４０℃でのものに対して１５０％の相対活性を可能にす
る温度であると定義すると、この変異体はＴｖＸ（３−
１９０）又はＮＩ−ＴＸ１を１０℃上回る利得を示し
た。

【０１７９】Ｔｆｘ（１−２９）によって置換されてい
るものの、ＮＩ−ＴＸ２における（−４）から（−１）
位での残基ＡＳＨＡのＮ−末端伸長がない変異体キシラ
ナーゼＮＩ−ＴＸ３は後者と同じ温度／活性概要を有す
る。

【０１８０】短いＴｆｘ（１０−２９）配列の置換を伴
う他の変異体ＮＩ−ＴＸ４は、ＮＩ−ＴＸ２及びＮＩ−
ＴＸ３よりも僅かに低い好熱性を有する。

【０１８１】（２６−２９）領域でのＴｆｘ由来のテト
ラペプチドの変更を伴うキメラキシラナーゼＮＩ−ＴＸ
５は、ＴｖＸ（３−１９０）又はＮＩ−ＴＸ１を５℃上
回る利得を示した。

【０１８２】二重変異Ｙ２７Ｍ及びＮ２９Ｌを伴う変異
体ＮＩ−ＴＸ６は６０℃まで有意の酵素活性を保持し
た。これはＮＩ−ＴＸ５と同じ温度／活性概要を示し
た。

【０１８３】他の変異体ＮＩ−ＴＸ７はＮＩ−ＴＸ２と
同じ好熱性を有する。ＮＩ−ＴＸ７はＮＩ−ＴＸ３と同
じアミノ酸配列を有するが、−４から−１位にテトラペ
プチドＡＳＡＲからなるＮ−末端伸長を有する。この変
異体及びＮＩ−ＴＸ２は、これらのテトラペプチドでの
伸長がキメラ・トリコダーマ・キシラナーゼの温度範囲
に対して大きな効果を及ぼさないことを示しているが、
他のＮ−末端伸長が調査されている。

【０１８４】ＮＩ−ＴＸ８を合成した。これはＴｖＸ
（３−１９０）又はＮＩ−ＴＸ１を１３℃上回り、天然
ＴｒＸを約１０℃上回る利得を示した。これはＮＩ−Ｔ
Ｘ７と同じ構造のものであり、さらに（−１０）から
（−２）位にＣ．アセトブチリカムｘｙｎＢ（２３−３
１）でのＮ−末端上流の伸長を有する。

【０１８５】ＮＩ−ＴＸ８の上流伸長中のＣ．アセトブ
チリカムｘｙｎＢ（２３−３１）配列をより短いトリペ
プチド配列ＧＲＲで置き換えることができるかどうかを
試験するため、変異体ＮＩ−ＴＸ９を構築した。このト
リペプチドは、後に説明されるＮＩ−ＢＸ７の研究にお
いて同定されている。このよりサイズの小さい新規変異
体ＮＩ−ＴＸ９はＮＩ−ＴＸ８と同じ温度／活性概要を
示した。これは、キシラナーゼのＮ−末端の上流伸長に
よる性能の強化の最初の報告である。

【０１８６】第１１族キシラナーゼの好熱性に寄与する
他の残基を同定するため、ＮＩ−ＴＸ１から２つの変異
Ｎ１０Ｈ及びＮ１１Ｄを伴って誘導される変異体ＮＩ−
ＴＸ１０を調製した。この新規変異体ＮＩ−ＴＸ１０
は、その有効温度において、その前駆体ＮＩ−ＴＸ１と
比較して６℃の利得を示した。

【０１８７】最後に、それぞれ三重変異（Ｎ１０Ｈ、Ｙ
２７Ｍ、Ｎ２９Ｌ）及び四重変異（Ｎ１０Ｈ、Ｎ１１
Ｄ、Ｙ２７Ｍ、Ｎ２９Ｌ）を伴うＮＩ−ＴＸ１の誘導体
である２種類の変異体キシラナーゼＮＩ−ＴＸ１１及び
ＮＩ−ＴＸ１２を構築した。これらを、（ｉ）変異Ｎ１
０Ｈ及びＮ１１Ｄの個々の寄与、及び（ｉｉ）上に同定
される２つの他の有益な変異Ｙ２７Ｍ及びＮ２９Ｌとの
それらの合併効果を決定するのに用いた。変異体ＮＩ−
ＴＸ１１及びＮＩ−ＴＸ１２の両者は、有効温度におけ
る１３℃の利得を伴う等しい温度−活性概要を示した。
この結果は、Ｎ１１Ｄ変異がＴｒＸの好熱性に対する効
果を持たないことを示した。ＮＩ−ＴＸ１１の（１−
４）位の残基を野性型ＴｒＸのものに変換することによ
りＮＩ−ＴＸ１３を得た。ＮＩ−ＴＸ１１及びＮＩ−Ｔ
Ｘ１３の両者の温度−活性概要は等しく保持された。

【０１８８】相対活性１５０％に対する有効温度におけ
るＮＩ−ＴＸ１１又はＮＩ−ＴＸ１３（＋１３℃）によ
るこの利得は、個別の変異Ｎ１０Ｈ（＋６℃、ＮＩ−Ｔ
Ｘ１１中）及びＹ２７Ｍ／Ｎ２９Ｌ（＋４℃、ＮＩ−Ｔ
Ｘ２中）による利得の理論的な合計よりも大きい。この
改善は、また、キメラ変異体ＮＩ−ＴＸ２（＋１０
℃）、ＮＩ−ＴＸ３（＋１０℃）及びＮＩ−ＴＸ４（＋
９℃）において示されるように、三重変異を有し得るあ
らゆる天然ＴｆＸ配列での直接置換によるいかなる利得
よりも大きい。さらに、ＮＩ−ＴＸ１１又はＮＩ−ＴＸ
１３における３個の残基の三重変異は、キメラ酵素にお
けるような３１−２０残基のＴｆＸ配列での置換と比較
してＴｒＸにおける非常に小さな修飾に相当し、これは
トリコダーマ・キシラナーゼの一般的な特性における他
の望ましくない変化を間接的に最小化し得る。

【０１８９】実施例５修飾バチルス・キシラナーゼの温度／活性概要

【０１９０】検定プロトコルは、一般的に、実施例４に
おけるＮＩ−ＴＸキシラナーゼに対するものと同じであ
る。ＮＩ−ＢＸキシラナーゼによるｐＨ５．５の５０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウムバッファー中の可溶性キシランの
加水分解に対する温度の効果を図１０に示す。

【０１９１】天然ＢｃＸは６０℃まで活性であった。そ
のＮ−末端のＢｃＸ（１−２２）配列を置換するＴｆｘ
（１−３１）配列を有する変異体ＮＩ−ＢＸ１は、８２
℃近辺までの高い活性を有する。ＮＩ−ＴＸの項におい
て論じられるように、４０℃におけるものに対して１５
０％の相対活性を可能にする温度として有効温度を定義
することができる。この場合、ＮＩ−ＢＸ１の好熱性に
おける利得は約２２℃である。ＮＩ−ＢＸ１における
（−４）から（−１）位の余分な残基ＡＳＨＡを持たな
いＮＩ−ＢＸ２は同じ温度／活性概要を示した。

【０１９２】ＮＩ−ＢＸ３及びＮＩ−ＢＸ５における
（−１）位でのＡｒｇ残基の挿入によるさらなる修飾
は、ＮＩ−ＢＸ１及びＮＩ−ＢＸ２よりも２．５℃だけ
好熱性を改善している。

【０１９３】同じ利得が、（−１）位に他の塩基性残基
Ｌｙｓを有するＮＩ−ＢＸ４においても観察されてい
る。酸性残基Ｇｌｕ又はＡｓｐで置換することにより、
最大温度の１０℃程度の損失が生じる（データは示さ
ず）。したがって、これらの結果は、中性（Ｈｉｓ）及
び酸性（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）残基の存在とは反対に、（−
１）位での塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）での伸長
の耐熱性に対する寄与を示している。

【０１９４】変異体ＮＩ−ＢＸ６はＮＩ−ＢＸ３を２．
５℃、又はＮＩ−ＢＸ１を５℃上回る利得を示す。した
がって、（−１０）から（−４）位でのＣ．アセトブチ
リカムｘｙｎＢ（２３−２９）配列、（−３）でのＧｌ
ｙ、及び（−２）及び（−１）位の両者でのＡｒｇの追
加によるＮ−末端の伸長により、好熱性をさらに改善す
ることが可能である。

【０１９５】ＮＩ−ＢＸ６の上流伸長中のＣ．アセトブ
チリカムｘｙｎＢ（２３−３１）配列をより短いトリペ
プチド配列ＧＲＲで置換することができるかどうかを試
験するため、変異体ＮＩ−ＢＸ７を構築した。ＮＩ−Ｂ
Ｘ６及びＮＩ−ＢＸ７の両者は等しい有効温度又は最高
温度限界を有するように思われるが、よりサイズの小さ
い後者の変異体は前者よりも広い酵素活性の温度範囲を
示した。前に変異体ＮＩ−ＴＸ９において説明されるよ
うに、同じトリペプチドは、ＣａＸ配列を用いることな
くトリコダーマ・キシラナーゼの有効温度を高めること
も可能であった。

【０１９６】まとめると、真菌トリコダーマ・キシラナ
ーゼの好熱性をうまく高めている修飾は、一般には、細
菌バチルス・サーキュランス・キシラナーゼに適用する
ことが可能である。

【０１９７】実施例６ＮＩ−ＢＸキシラナーゼとCAMPBELLらの従来技術との好
熱性の比較

【０１９８】Campbellらの従来技術の最も改善されたバ
チルス・サーキュランス（ＢｃＸ）変異体ＴＳ１９ａ
は、アミノ酸３、４、８、及び２２（ＢｃＸの番号付け
系による）が修飾されていた。この修飾キシラナーゼを
上に説明されるものと同じプロトコルを用いてＮＩ−Ｂ
Ｘキシラナーゼと比較したところ、図１０に示される結
果を得た。ＮＩ−ＢＸキシラナーゼに最適な温度はＴＳ
１９ａよりも８−１４度高い。加えて、最適温度で、本
発明のＮＩ−ＢＸ６及びＮＩ−ＢＸ７はCampbellらのも
のよりも３倍高い活性を有する。この一組の結果は、本
発明によって生成した修飾キシラナーゼのCampbellらの
ものよりも優れた性能を示す。

【０１９９】実施例７ＮＩ−ＢＸ６及びＮＩ−ＢＸ７と天然クロストリジウム
及びＴ．フュスカ・キシラナーゼとの好熱性の比較

【０２００】変異体キシラナーゼＮＩ−ＢＸ６のＮ−末
端ドメインはクロストリジウム・アセトブチリカムｘｙ
ｎＢ（ＣａＸ）に由来する短い配列による伸長を含んで
いた。変異体キシラナーゼＮＩ−ＢＸ７のＮ−末端ドメ
インはトリペプチドＧＲＲによる伸長を含んでいた。Ｎ
Ｉ−ＢＸ６及びＮＩ−ＢＸ７はアミノ酸配列を有し、サ
ーモモノスポラ・フュスカの熱安定性キシラナーゼＴｆ
ｘＡに由来する短い配列で置換されていた。ＮＩ−ＢＸ
６及びＮＩ−ＢＸ７の好熱性を、これらの天然サーモモ
ノスポラ及びクロストリジウム・キシラナーゼについて
の公表データと比較することにより評価した。

【０２０１】８５℃までの高い活性を有する変異体ＮＩ
−ＢＸ６及びＮＩ−ＢＸ７は、４３℃の非常に低い最適
温度を有するクロストリジウム・アセトブチリカムｘｙ
ｎＢ（ＣａＸ）よりも優れている（Zappe ら１９８７、
Zappe ら１９９０）。Ｔ．フュスカ・キシラナーゼＴｆ
ｘＡの温度概要について利用できるデータはなかった。
Ｔ．フュスカの発酵上清の好熱性についての公表データ
（Casimir-Schenkelら、１９９２）を利用することがで
きた。この上清は６種類のキシラナーゼを含み、ＴｆＸ
Ａはそのうちの１つである。ＮＩ−ＢＸ６及びＮＩ−Ｂ
Ｘ７の活性に対する温度の効果は、Ｔ．フュスカの発酵
上清について説明されるプロトコル（Casimir-Schenkel
ら、１９９２）に従って測定した。これには、変異体キ
シラナーゼを５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐ
Ｈ７）中のキシランに添加し、７０、８０及び９０℃で
正確に１０分間インキュベートすることが含まれてい
た。

【０２０２】そのデータは、キメラバチルス・キシラナ
ーゼがＴ．フュスカ・キシラナーゼ上清よりも高い好熱
性を示し、したがって、ＴｆＸＡよりもかなり高いであ
ろうことを示す（表６）。

【０２０３】この例は、キメラ修飾における短い配列の
挿入が、その短い配列の源である好熱性キシラナーゼを
大きく超えてキシラナーゼの耐熱性を増大させ得るとい
う驚くべき結果を示す。

【０２０４】

【表６】

【０２０５】＊７０℃での酵素活性を１００％として算
出した。＊＊Casimir-Schenkelら、１９９２（引用することによ
りここに組込まれる）による公表データ。

【０２０６】酵素活性についてのより高い温度に加え
て、新規変異体の中には野性型酵素と比較してより高い
活性を獲得したものもある。幾つかのＮＩ−ＢＸキシラ
ナーゼ（ＮＩ−ＢＸ６、ＮＩ−ＢＸ７）のそれらの各々
の最適温度（７５℃）での相対活性は、野性型ＢｃＸ
（５５℃）の４倍であった（図１０）。

【０２０７】まとめると、真菌トリコダーマ・キシラナ
ーゼの好熱性をうまく高めている修飾は、一般には、細
菌バチルス・サーキュランス・キシラナーゼに適用する
ことが可能である。

【０２０８】実施例８修飾トリコダーマ・キシラナーゼのｐＨ／活性概要

【０２０９】これは、可溶性キシランの加水分解におけ
るキシラナーゼの酵素活性に対する異なるｐＨの効果の
尺度である。その手順はインキュベーション温度及び時
間の変化を伴う標準検定と同じものであった。ｐＨ４−
８の５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー中のトリコ
ダーマ酵素（１５μｇ／ｍＬ）及び可溶性キシラナーゼ
を共に６５℃でインキュベートした。３０分後、キシラ
ンから放出された還元糖の量をＨＢＡＨで決定し、最適
ｐＨでの値を１００％とする相対活性で表した。

【０２１０】異なるＮＩ−ＴＸキシラナーゼの酵素活性
に対するｐＨの効果を図１１に示した。天然ＴｒＸ、Ｎ
Ｉ−ＴＸ１、ＮＩ−ＴＸ５、ＮＩ−ＴＸ６は、ｐＨ５．
５までの高い活性及びｐＨ６での活性の大きな損失を示
す同じｐＨ／活性概要を示した。

【０２１１】変異体ＮＩ−ＴＸ３、ＮＩ−ＴＸ３及びＮ
Ｉ−ＴＸ８におけるＴｆｘ（１−２９）での置換は、ｐ
Ｈ６．０までの完全な活性及びｐＨ７での有意の活性を
招く結果となる。これは、天然ＴｒＸを１ｐＨ単位上回
る利得に相当する。変異体ＮＩ−ＴＸ９はＮＩ−ＴＸ８
と同じｐＨ−活性概要を示し、したがって、上流ＣａＸ
配列をトリペプチドＧＲＲで置換することが可能である
ことが示される。

【０２１２】二重変異（Ｎ１０Ｈ、Ｎ１１Ｄ）を有する
類似体ＮＩ−ＴＸ１０は、その前駆体であるＮＩ−ＴＸ
１と比較して、その活性の上限における０．５ｐＨ単位
の利得を示す。ＮＩ−ＴＸ１１、ＮＩ−ＴＸ１２及びＮ
Ｉ−ＴＸ１３は０．６ｐＨ単位の利得を示した。

【０２１３】実施例９修飾バチルス・キシラナーゼのｐＨ概要

【０２１４】試験手順は実施例８における修飾トリコダ
ーマ・キシラナーゼに対するプロトコルと同じであっ
た。バチルス・サーキュランス・キシラナーゼを可溶性
キシランと共に６５℃でクエン酸ナトリウム（ｐＨ４−
８）及びホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５及び
１０）中においてインキュベートした。図１２に示され
るように、天然ＢｃＸはｐＨ６．０まで完全に活性であ
る。

【０２１５】変異体ＮＩ−ＢＸ１、ＮＩ−ＢＸ２、ＮＩ
−ＢＸ３、ＮＩ−ＢＸ５、ＮＩ−ＢＸ６、及びＮＩ−Ｂ
Ｘ７におけるＴｆｘ（１−３３）での長い配列の置換に
より、活性がほぼｐＨ７．０にまで広がった（図１
２）。これは、ＢｃＸを１．５−２ｐＨ単位上回る利得
に相当する。

【０２１６】実施例１０修飾バチルス・キシラナーゼとCAMPBELLらのものとのｐ
Ｈ／活性概要の比較

【０２１７】Campbellらの従来技術の最良キシラナーゼ
ＴＳ１９ａのｐＨ範囲を測定し、実施例８に説明される
プロトコルに従ってＮＩ−ＢＸキシラナーゼと比較し
た。その結果を図１２に示す。ＮＩ−ＢＸキシラナーゼ
の最適ｐＨは、ＴＳ１９ａそれ自体に天然ＢｃＸを僅か
ではあるが上回る改善（０．５ｐＨ単位）がなされてい
るにもかかわらず、ＴＳ１９ａより１−１．５単位高
い。この結果は、Campbellらのものを凌駕する本発明の
キシラナーゼの性能を示す。

【０２１８】実施例１１修飾バチルス・キシラナーゼとクロストリジウム・アセ
トブチリカム及びＴ．フュスカの天然キシラナーゼとの
ｐＨ／活性概要の比較

【０２１９】ＮＩ−ＢＸキシラナーゼのＮ−末端ドメイ
ンがクロストリジウム・アセトブチリカムｘｙｎＢ（Ｃ
ａＸ）及びサーモモノスポラ・フュスカのキシラナーゼ
ＴｆｘＡに由来する短い配列によって構成されているた
め、修飾バチルス・キシラナーゼのｐＨ範囲をこれらの
２種類の天然キシラナーゼの公表データと比較した。６
５℃でｐＨ７までの最大活性を有する（図１２）ＮＩ−
ＢＸ変異体キシラナーゼは、４３℃で６．０の最適ｐＨ
を有する（Zappe ら１９８７、Zappe ら１９９０）ク
ロストリジウム・アセトブチリカムｘｙｎＢ（ＣａＸ）
よりも高い最大ｐＨを有する。

【０２２０】Ｔ．フュスカ・キシラナーゼＴｆｘＡに関
しては、そのｐＨ範囲は既に開示されている（Wilson
ら、ＰＣＴ／１９９５）。したがって、比較研究のた
め、ＮＩ−ＢＸキシラナーゼの酵素活性に対するｐＨの
効果をＴｆｘＡについて説明されるプトロコル（Wilson
ら、ＰＣＴ／１９９５）に従って決定した。これには、
ｐＨ８−１０の０．０５Ｍナトリウムグリシンバッファ
ー中でキシランにキシラナーゼを添加し、５０℃で３０
分間インキュベートすることが含まれる。図１３に示さ
れるように、ＴｆｘＡの最適ｐＨが８であるのに対し
て、バチルス・キシラナーゼＮＩ−ＢＸ１、ＮＩ−ＢＸ
２、ＮＩ−ＢＸ３、ＮＩ−ＢＸ６、及びＮＩ−ＢＸ７は
全て最適ｐＨ９を示した。

【０２２１】この例は、本発明のキシラナーゼが短いア
ミノ酸配列を提供するのに用いられるキシラナーゼのい
ずれかよりも高いｐＨ範囲を有するという驚くべき結果
を示す。

【０２２２】実施例１２修飾トリコダーマ・キシラナーゼの熱安定性

【０２２３】これは、キシランの存在なしに設定温度で
貯蔵するキシラナーゼの耐性の尺度である。以下のパラ
メータが一般にＮＩ−ＴＸ及びＮＩ−ＢＸキシラナーゼ
の両者に用いられた。検定バッファー（５０ｍＭクエン
酸ナトリウム、ｐＨ５．５もしくは４．５）中のキシラ
ナーゼ（１５０μｇ／ｍＬ）を設定温度でインキュベー
トした。設定間隔でアリコートを取り出した。２０℃に
冷却した後、その加熱試料の残留酵素活性を実施例３の
ＨＢＡＨ検定により４０℃で決定した。その酵素活性
を、“０分”アリコートの活性のパーセンテージとして
標準化した。

【０２２４】図１４は、キメラキシラナーゼＮＩ−ＴＸ
５、ＮＩ−ＴＸ１０、及びＮＩ−ＴＸ１１が天然ＴｒＸ
を上回る５３℃での改善された貯蔵安定性を有すること
を示す。ＮＩ−ＴＸ５の場合におけるＴｆｘのＳＭＥＬ
テトラペプチド配列による（２６−２９）領域の置換
は、それが６０分間のインキュベーションの後にその酵
素活性の全てを保持することを可能にしている。

【０２２５】大腸菌内で発現したＮＩ−ＴＸ１、ＴｖＸ
（３−１９０）、及びＴｒＸは天然ＴｒＸを上回る熱安
定性の改善は示さない。

【０２２６】６８℃の高インキュベーション温度では、
天然ＴｒＸ、ＮＩ−ＴＸ１及びＮＩ−ＴＸ５は１０分未
満で全ての酵素活性を失った。同じ温度で、キメラキシ
ラナーゼＮＩ−ＴＸ２は１０分後に酵素活性の４０％を
保持している。

【０２２７】キメラキシラナーゼＮＩ−ＴＸ８は６０分
後にその活性の５５％を保持しており、したがって、天
然ＴｒＸによるものよりも約１５℃高い貯蔵温度の耐性
を示す。

【０２２８】まとめると、ＮＩ−ＴＸ２、ＮＩ−ＴＸ
８、及びＮＩ−ＴＸ９におけるキメラ修飾、すなわち、
トリコダーマ・キシラナーゼの（１−２９）領域のＴｆ
ｘ（１−２９）配列による置換、（−１０）から（−
２）位のＣ．アセトブチリカムｘｙｎＢ（２３−３１）
及び（−１）位のＡｒｇ、又はトリペプチドＧＲＲのい
ずれかでの上流伸長は熱安定性をさらに高める。

【０２２９】実施例１３修飾バチルス・キシラナーゼの熱安定性

【０２３０】ＮＩ−ＢＸ修飾バチルス・キシラナーゼ及
びＢｃＸを７０℃、ｐＨ５．５でインキュベートした
（図１６）。天然キシラナーゼＢｃＸは、期待通り、１
０分未満に全ての酵素活性を失った。対照的に、変異体
キシラナーゼＮＩ−ＢＸは、２０ないし３０分後でも活
性の大部分を保持していた。これは、ＢｃＸ（１−２
２）配列をＴｆｘ（１−３１）配列で置換することによ
り、バチルス・サーキュランス・キシラナーゼの熱安定
性を高めることが可能であることを示していた。ＮＩ−
ＢＸ３、ＮＩ−ＢＸ５、ＮＩ−ＢＸ６、及びＮＩ−ＢＸ
７における熱安定性のさらなる増加は、（−１０）から
（−４）位のＣ．アセトブチリカムｘｙｎＢ（２３−２
９）、（−３）位のＧｌｙ並びに（−２）及び（−１）
位の両者のＡｒｇ、又はトリペプチドＧＲＲのいずれか
の追加によるＮ−末端の伸長によって達成された。ＮＩ
−ＢＸ６及びＮＩ−ＴＸ７については、熱安定性におけ
る利得は天然酵素ＢｃＸに対して約１５℃である。した
がって、真菌トリコダーマ・キシラナーゼの熱安定性を
うまく高める修飾は、一般に、バチルス・サーキュラン
ス・キシラナーゼに適用することが可能である。

【０２３１】実施例１４パルプの処理における修飾トリコダーマ・キシラナーゼ
の性能の評価

【０２３２】上で実施例３ないし１３において説明され
る検定は可溶性キシランの加水分解を含み、この手順は
一連のＮＩ−ＴＸ及びＮＩ−ＢＸの中の好熱性修飾キシ
ラナーゼの同定において成功を収めている。しかしなが
ら、漂白プロセスのパルプの予備処理において、キシラ
ナーゼはパルプ中の不溶性キシランと相互作用すること
があり得る。したがって、可溶性キシラン基質を用いて
同定された性能の改善がパルプの処理において観察され
ることを確認することが重要である。したがって、修飾
キシラナーゼの性能を漂白前の褐色ストックパルプの処
理において評価した。

【０２３３】天然及び修飾酵素の試料を、パルプでの試
験のため、カナダ、オタワ州のアイオジェン社（Iogen
Corporation ）に送付した。アイオジェンはキシラナー
ゼ酵素を製造してパルプ業界に供給しており、パルプの
処理におけるキシラナーゼ酵素の性能を評価するための
試験を開発している。この試験は、酵素を指定された期
間パルプに添加した後、引き続くパルプの漂白性に対す
るその酵素の効果を測定することを包含する。この試験
はκ数２５．６の市販の軟材クラフトパルプを用いて行
った。

【０２３４】トリコダーマ・キシラナーゼのアイオジェ
ン・パルプ試験の結果を図１７に示す。パルプ処理にお
ける天然ＴｒＸの最適ｐＨであるｐＨ６．０で、５２℃
まで良好な性能が達成された。天然ＴｒＸは、ｐＨ６．
５ではパルプに対して活性ではなかった。

【０２３５】単一の点変異Ｑ１６２Ｈを有する大腸菌発
現ＮＩ−ＴＸ１は４０℃を上回る温度ではパルプに対し
て無効であった。対照的に、変異体ＮＩ−ＴＸ５、ＮＩ
−ＴＸ２及びＮＩ−ＴＸ８は、ｐＨ６．５で、それぞれ
６０、６１、及び６５℃まで機能し得た。

【０２３６】酵素が耐える絶対的な温度は、パルプに対
しては可溶性キシランの加水分解におけるものよりも低
いが、修飾キシラナーゼによるパルプ処理における温度
（＋８ないし１３℃）及びｐＨ（＋０．５単位）の改善
は実施例４及び８で説明されるキシラン加水分解でのそ
れらの好熱性及び好アルカリ性における利得と一致し
た。

【０２３７】これらの予備試験に基づくと、パルプ処理
において酵素が耐える温度及びｐＨは高められている。
異なるパルプ及び処理技術を用いる温度及びｐＨ範囲の
より広範な試験により、修飾キシラナーゼがパルプに対
して有効な条件の範囲が広がるであろう。

【０２３８】実施例１５パルプの処理における修飾バチルス・キシラナーゼの性
能の評価

【０２３９】Ｂ．サーキュランス・キシラナーゼを、同
様にアイオジェン社でパルプ処理において試験した（図
１８）。ｐＨ８．０で、天然ＢｃＸは４０℃を上回る温
度では性能が劣っていた。ｐＨが７に低下すると、Ｂｃ
Ｘは５０℃まででのみ有効であった。対照的に、変異体
ＮＩ−ＢＸ１はｐＨ８．０で７５℃まで活性であった。
ＮＩ−ＢＸ１酵素が耐える絶対的な温度は、パルプに対
しては可溶性キシランの加水分解におけるものよりも低
いが、修飾キシラナーゼによるパルプ処理における温度
（＋２８℃）及びｐＨ（＋１単位）の改善は実施例５及
び９で説明されるキシラン加水分解でのそれらの温度耐
性及びｐＨ範囲における利得と一致した。

【０２４０】これらの予備試験に基づくと、パルプ処理
において酵素が耐える温度及びｐＨは高められている。
異なるパルプ及び処理技術を用いる温度及びｐＨ範囲の
より広範な試験により、修飾キシラナーゼがパルプに対
して有効な条件の範囲が広がるであろう。

【０２４１】参考文献 Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube,
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開番号WO 95/12668. Winterhalter C. and Liebl, W. (1995) Appl. Enviro
n. Bicrobiol. 61:1810-1815. Zappe, H., Jones, W. A., and Woods, D. R. (1987) A
ppl. Microbiol. Biotechnol. 27:57-63. Zappe, H., Jones, W. A., and Woods, D. R. (1990) N
ucleic Acids Res. 18:2179. 我々の発明の好ましい態様を示して説明したが、本発明
は特許請求の範囲の範囲によって定義される。

【０２４２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：184 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：アスペルギルス・ニガー・アワモリ変種（Aspe
rgillus niger, var. awamori ）刊行物の情報ジャーナル：Xylan and Xylanase 頁：349-360 日付：1992

【０２４３】配列 Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val Gln Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp 1 5 10 15 Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp 20 25 30 Gly Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser 35 40 45 Ser Asn Ala Ile Thr Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ser 50 55 60 Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gly Ala Glu Tyr 65 70 75 80 Tyr Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr 85 90 95 Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys Thr 100 105 110 Asp Thr Arg Ile Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr 115 120 125 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr 130 135 140 Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala Gln His Gly Phe Gly Asn Ser 145 150 155 160 Asp Phe Asn Tyr Gln Val Met Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly 165 170 175 Ser Ala Ser Val Thr Ile Ser Ser 180

【０２４４】配列番号：2 配列の長さ：185 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：アスペルギルス・ツビゲンシス（Aspergillus
tubigensis）刊行物の情報ジャーナル：Xylan and Xylanase 頁：235-246 日付：1992

【０２４５】配列 Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val Gln Asn Tyr Asn Gln Asn Leu Gly Asp 1 5 10 15 Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp 20 25 30 Gly Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Gly Trp Thr Thr Gly 35 40 45 Ser Ser Asn Ala Ile Thr Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser 50 55 60 Ala Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gln Ala Glu 65 70 75 80 Tyr Tyr Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys 100 105 110 Thr Asp Thr Arg Ile Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe 115 120 125 Thr Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val 130 135 140 Thr Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala His His Gly Phe His Asn 145 150 155 160 Ser Asp Phe Asn Tyr Gln Val Val Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala 165 170 175 Gly Ser Ala Ala Val Thr Ile Ser Ser 180 185

【０２４６】配列番号：3 配列の長さ：185 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：バチルス・サーキュランス（Bacillus circula
ns）刊行物の情報ジャーナル：Nucleic Acid Research 巻：16 頁：7187 日付：1988

【０２４７】配列 Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile Val 1 5 10 15 Asn Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn 20 25 30 Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe 35 40 45 Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly 50 55 60 Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr 65 70 75 80 Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly 85 90 95 Thr Val Lys Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg 100 105 110 Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gln Tyr 115 120 125 Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile 130 135 140 Thr Phe Thr Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu 145 150 155 160 Gly Ser Asn Trp Ala Tyr Gln Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Val Trp 180 185

【０２４８】配列番号：4 配列の長さ：201 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）刊行物の情報ジャーナル：FEBS Letters 巻：171 頁：197-201 日付：1984

【０２４９】配列 Arg Thr Ile Thr Asn Asn Glu Met Gly Asn His Ser Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly Asn Thr Ser Met Thr Leu Asn Asn Gly 20 25 30 Gly Ala Phe Ser Ala Gly Trp Asn Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe Arg 35 40 45 Lys Gly Lys Lys Phe Asp Ser Thr Arg Thr His His Gln Leu Gly Asn 50 55 60 Ile Ser Ile Asn Tyr Asn Ala Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ser Tyr 65 70 75 80 Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Gln Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr Ile 85 90 95 Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Ala Tyr Lys Gly Ser 100 105 110 Phe Tyr Ala Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg Val 115 120 125 Asn Gln Pro Ser Ile Ile Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser 130 135 140 Val Arg Gln Thr Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Ser Val Ser Ala His 145 150 155 160 Phe Arg Lys Trp Glu Ser Leu Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu 165 170 175 Thr Ala Phe Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val 180 185 190 Met Thr Asn Gln Leu Phe Ile Gly Asn 195 200

【０２５０】配列番号：5 配列の長さ：185 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：バチルス・サブチリス（Bacillus subtilus ）刊行物の情報ジャーナル：：Arch. Microbiol. 巻：144 頁：201-206 日付：1986

【０２５１】配列 Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile Val 1 5 10 15 Asn Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn 20 25 30 Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe 35 40 45 Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly 50 55 60 Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr 65 70 75 80 Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly 85 90 95 Thr Val Lys Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg 100 105 110 Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gln Tyr 115 120 125 Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile 130 135 140 Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu 145 150 155 160 Gly Ser Asn Trp Ala Tyr Gln Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Val Trp 180 185

【０２５２】配列番号：6 配列の長さ：211 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：クロストリジウム・アセトブチリカムP262 （Clostridium acetobutylicum P262 ）株：Xyn B 刊行物の情報ジャーナル：Nucleic Acids Res. 巻：18 頁：2719 日付：1990

【０２５３】配列 Ser Ala Phe Asn Thr Gln Ala Ala Pro Lys Thr Ile Thr Ser Asn Glu 1 5 10 15 Ile Gly Val Asn Gly Gly Tyr Asp Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly 20 25 30 Asn Thr Ser Met Thr Leu Lys Asn Gly Gly Ala Phe Ser Cys Gln Trp 35 40 45 Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Asp 50 55 60 Thr Gln Thr Tyr Lys Gln Leu Gly Asn Ile Ser Val Asn Tyr Asn Cys 65 70 75 80 Asn Tyr Gln Pro Tyr Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr 85 90 95 Ser Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp Gly Ser Trp 100 105 110 Arg Pro Pro Gly Gly Thr Ser Lys Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly 115 120 125 Ile Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg Ile Asn Gln Pro Ser Ile Gln 130 135 140 Gly Asn Thr Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Thr Lys Arg 145 150 155 160 Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser Lys His Phe Ala Ala Trp Glu Ser 165 170 175 Lys Gly Met Pro Leu Gly Lys Met His Glu Thr Ala Phe Asn Ile Glu 180 185 190 Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Lys Ala Asp Val Asn Ser Met Ser Ile Asn 195 200 205 Ile Gly Lys 210

【０２５４】配列番号：7 配列の長さ：206 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）株：Xyn A 刊行物の情報ジャーナル：Biosci, Biotech, Biochem 巻：57 頁：273-277 日付：1993

【０２５５】配列 Gly Arg Ile Ile Tyr Asp Asn Glu Thr Gly Thr His Gly Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly Asn Thr Ile Met Glu Leu Asn Asp 20 25 30 Gly Gly Thr Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe 35 40 45 Arg Lys Gly Arg Lys Phe Asn Ser Asp Lys Thr Tyr Gln Glu Leu Gly 50 55 60 Asp Ile Val Val Glu Tyr Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser 65 70 75 80 Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Phe Leu Val Glu Tyr Tyr 85 90 95 Ile Val Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys 100 105 110 Gly Thr Ile Thr Gln Trp Met Ala Gly Thr Tyr Glu Ile Tyr Glu Thr 115 120 125 Thr Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Asp Gly Thr Ala Thr Phe Gln Gln 130 135 140 Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val 145 150 155 160 Thr Glu His Phe Lys Gln Trp Glu Arg Met Gly Met Arg Met Gly Lys 165 170 175 Met Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr 180 185 190 Ala Asn Val Tyr Lys Asn Glu Ile Arg Ile Gly Ala Asn Pro 195 200 205

【０２５６】配列番号：8 配列の長さ：211 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ruminococcus flavefaciens ）刊行物の情報ジャーナル：EMBL database accession number Z11127 日付：1992

【０２５７】配列 Ser Ala Ala Asp Gln Gln Thr Arg Gly Asn Val Gly Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Met Trp Asn Gln Asn Gly Gln Gly Gln Ala Ser Met Asn Pro Gly 20 25 30 Ala Gly Ser Phe Thr Cys Ser Trp Ser Asn Ile Glu Asn Phe Leu Ala 35 40 45 Arg Met Gly Lys Asn Tyr Asp Ser Gln Lys Lys Asn Tyr Lys Ala Phe 50 55 60 Gly Asn Ile Val Leu Thr Tyr Asp Val Glu Tyr Thr Pro Arg Gly Asn 65 70 75 80 Ser Tyr Met Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Met Glu Tyr 85 90 95 Tyr Ile Val Glu Gly Trp Gly Asp Trp Arg Pro Pro Gly Asn Asp Gly 100 105 110 Glu Val Lys Gly Thr Val Ser Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Asp Ile Arg 115 120 125 Lys Thr Met Arg Tyr Asn Gln Pro Ser Leu Asp Gly Thr Ala Thr Phe 130 135 140 Pro Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Thr Ser Gly Ser Ala Asn Asn Gln 145 150 155 160 Thr Asn Tyr Met Lys Gly Thr Ile Asp Val Ser Lys His Phe Asp Ala 165 170 175 Trp Ser Ala Ala Gly Leu Asp Met Ser Gly Thr Leu Tyr Glu Val Ser 180 185 190 Leu Asn Ile Glu Gly Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Ala Asn Val Lys Ser 195 200 205 Val Ser Val 210

【０２５８】配列番号：9 配列の長さ：197 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：シゾフィラム・コミュネ（Schizophyllum comm
une ）株：Xylanase A 刊行物の情報ジャーナル：Canadian Fed. Biol. Soc. annual meetin
g 頁：Abstract #676 日付：1988

【０２５９】配列 Ser Gly Thr Pro Ser Ser Thr Gly Thr Asp Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ser 1 5 10 15 Trp Trp Thr Asp Gly Ala Gly Asp Ala Thr Tyr Gln Asn Asn Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Tyr Thr Leu Thr Trp Ser Gly Asn Asn Gly Asn Leu Val Gly 35 40 45 Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ala Ala Ser Arg Ser Ile Ser Tyr Ser 50 55 60 Gly Thr Tyr Gln Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp 65 70 75 80 Thr Arg Ser Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr Gly Ser 85 90 95 Tyr Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ser His Lys Gly Ser Val Thr Cys Asn 100 105 110 Gly Ala Thr Tyr Asp Ile Leu Ser Thr Trp Arg Tyr Asn Ala Pro Ser 115 120 125 Ile Asp Gly Thr Gln Thr Phe Glu Gln Phe Trp Ser Val Arg Asn Pro 130 135 140 Lys Lys Ala Pro Gly Gly Ser Ile Ser Gly Thr Val Asp Val Gln Cys 145 150 155 160 His Phe Asp Ala Trp Lys Gly Leu Gly Met Asn Leu Gly Ser Glu His 165 170 175 Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Thr Ala 180 185 190 Thr Ile Thr Val Thr 195

【０２６０】配列番号：10 配列の長さ：191 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyc
es lividans ）株：Xln B 刊行物の情報ジャーナル：Gene 巻：107 頁：75-82 日付：1991

【０２６１】配列 Asp Thr Val Val Thr Thr Asn Gln Glu Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Ser Gln Gly Thr Val Ser Met Asn Met Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gln Tyr Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val 35 40 45 Ala Gly Lys Gly Trp Ala Asn Gly Gly Arg Arg Thr Val Gln Tyr Ser 50 55 60 Gly Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp 65 70 75 80 Thr Ser Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Thr 85 90 95 Tyr Arg Pro Thr Gly Glu Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly 100 105 110 Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Val Asn Lys Pro Ser Val Glu 115 120 125 Gly Thr Arg Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg 130 135 140 Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg 145 150 155 160 Ala Gly Met Pro Leu Gly Asn Phe Ser Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr 165 170 175 Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ile Asn Val Gly Gly 180 185 190

【０２６２】配列番号：11 配列の長さ：191 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyc
es lividans ）株：Xln C 刊行物の情報ジャーナル：Gene 巻：107 頁：75-82 日付：1991

【０２６３】配列 Ala Thr Thr Ile Thr Thr Asn Gln Thr Gly Thr Asp Gly Met Tyr Tyr 1 5 10 15 Ser Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Tyr Ser Thr Gln Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Val Ala 35 40 45 Gly Lys Gly Trp Ser Thr Gly Asp Gly Asn Val Arg Tyr Asn Gly Tyr 50 55 60 Phe Asn Pro Val Gly Asn Gly Tyr Gly Cys Leu Tyr Gly Trp Thr Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Ser Tyr Arg 85 90 95 Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ser Asp Gly Gly Thr Tyr 100 105 110 Asp Ile Tyr Gln Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu Gly Thr 115 120 125 Lys Thr Phe Gln Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Val Thr Ser 130 135 140 Gly Ser Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg 145 150 155 160 Ala Gly Met Asn Met Gly Gln Phe Arg Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr 165 170 175 Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ile Thr Val Ser Gly 180 185 190

【０２６４】配列番号：12 配列の長さ：189 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：ストレプトマイセス種36a （Streptomyces sp.
36a）刊行物の情報ジャーナル：Trends in Actinomycetologia 頁：91-96 日付：1989

【０２６５】配列 Ala Thr Thr Ile Thr Asn Glu Thr Gly Tyr Asp Gly Met Tyr Tyr Ser 1 5 10 15 Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Tyr Ser Thr Arg Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Val Ala Gly 35 40 45 Lys Gly Trp Ala Asn Gly Gly Arg Arg Thr Val Arg Tyr Thr Gly Trp 50 55 60 Phe Asn Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Gly Cys Leu Tyr Gly Trp Thr Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Ser Tyr Arg 85 90 95 Pro Thr Gly Glu Thr Arg Gly Thr Val His Ser Asp Gly Gly Thr Tyr 100 105 110 Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu Ala Pro 115 120 125 Ala Ala Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Val Thr Ser 130 135 140 Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg Ala Gly 145 150 155 160 Met Asn Met Gly Asn Phe Arg Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr Glu Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Thr Val Ser Gly 180 185

【０２６６】配列番号：13 配列の長さ：189 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：サーモモノスポラ・フュスカ（Thermomonospor
a fusca ）株：Tfx A 刊行物の情報ジャーナル：Appl. Environ. Microbiol. 巻：60 頁：763-770 日付：1994

【０２６７】配列 Ala Val Thr Ser Asn Glu Thr Gly Tyr His Asp Gly Tyr Phe Tyr Ser 1 5 10 15 Phe Trp Thr Asp Ala Pro Gly Thr Val Ser Met Glu Leu Gly Pro Gly 20 25 30 Gly Asn Tyr Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val Ala Gly 35 40 45 Lys Gly Trp Ala Thr Gly Gly Arg Arg Thr Val Thr Tyr Ser Ala Ser 50 55 60 Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg 65 70 75 80 Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg 85 90 95 Pro Thr Gly Thr Tyr Met Gly Thr Val Thr Thr Asp Gly Gly Thr Tyr 100 105 110 Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Thr 115 120 125 Arg Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Thr Ser 130 135 140 Gly Thr Ile Thr Ala Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg His Gly 145 150 155 160 Met His Leu Gly Thr His Asp Tyr Met Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Leu Gly Thr Ser 180 185

【０２６８】配列番号：14 配列の長さ：190 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：トリコダーマ・ハルジアナム（Thrichoderma h
arzianum）刊行物の情報ジャーナル：Xylan and Xylanase 頁：435-438 日付：1992

【０２６９】配列 Gln Thr Ile Gly Pro Gly Thr Gly Tyr Ser Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr Trp Asn Asp Gly His Ala Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Phe Thr Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly 35 40 45 Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Ile Tyr Gly Trp Ser 65 70 75 80 Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr 85 90 95 Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly 100 105 110 Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile 115 120 125 Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His 130 135 140 Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala 145 150 155 160 Ser His Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val 165 170 175 Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser 180 185 190

【０２７０】配列番号：15 配列の長さ：178 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：トリコダーマ・レエセイ（Trichoderma reese
i）株：Xyn I 刊行物の情報ジャーナル：BioTechnology 巻：10 頁：1461-1465 日付：1992

【０２７１】配列 Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gln Asn Tyr Gln Thr Gly Gly Gln Val Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser Val Asn Trp Asn Thr Gln Asp 20 25 30 Asp Phe Val Val Gly Val Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Ala Pro Ile 35 40 45 Asn Phe Gly Gly Ser Phe Ser Val Asn Ser Gly Thr Gly Leu Leu Ser 50 55 60 Val Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Met Glu 65 70 75 80 Asp Asn His Asn Tyr Pro Ala Gln Gly Thr Val Lys Gly Thr Val Thr 85 90 95 Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr Ile Trp Glu Asn Thr Arg Val Asn Glu 100 105 110 Pro Ser Ile Gln Gly Thr Ala Thr Phe Asn Gln Tyr Ile Ser Val Arg 115 120 125 Asn Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Gln Asn His Phe Asn 130 135 140 Trp Ala Ser Leu Gly Leu His Leu Gly Gln Met Met Asn Tyr Gln Val 145 150 155 160 Val Ala Val Glu Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Gln Ser Val 165 170 175 Ser Asn

【０２７２】配列番号：16 配列の長さ：190 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：トリコダーマ・レエセイ（Trichoderma reese
i）株：Xyn II 刊行物の情報ジャーナル：Biotechnology 巻：10 頁：1461-1465 日付：1992

【０２７３】配列 Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly 20 25 30 Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly 35 40 45 Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser 65 70 75 80 Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr 85 90 95 Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly 100 105 110 Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile 115 120 125 Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His 130 135 140 Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala 145 150 155 160 Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val 165 170 175 Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser 180 185 190

【０２７４】配列番号：17 配列の長さ：190 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：トリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）刊行物の情報ジャーナル：Xylan and Xylanase 頁：149-154 日付：1992

【０２７５】配列 Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Phe Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly 20 25 30 Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly 35 40 45 Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser 65 70 75 80 Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr 85 90 95 Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly 100 105 110 Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile 115 120 125 Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Thr His 130 135 140 Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala 145 150 155 160 Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val 165 170 175 Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser 180 185 190

【０２７６】配列番号：18 配列の長さ：573 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：環状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：pTvX(3-190)

【０２７７】配列 CTAGCATAGG ACCAGGAACC GGTTTCAACA ACGGTTACTT TTACAGCTAT TGGAACGATG 60 GCCATGGTGG TGTTACCTAT ACAAACGGGC CCGGAGGCCA ATTTAGCGTC AATTGGTCTA 120 ACTCCGGAAA CTTCGTAGGT GGAAAAGGTT GGCAACCCGG GACCAAAAAT AAGGTGATCA 180 ACTTCTCTGG ATCTTATAAT CCGAATGGGA ATTCATACTT AAGCGTCTAT GGCTGGTCTA 240 GAAACCCACT GATTGAATAT TACATTGTCG AAAATTTCGG TACCTACAAT CCGAGTACCG 300 GCGCCACAAA ATTAGGCGAA GTCACTAGTG ATGGATCCGT ATATGATATC TACCGTACCC 360 AACGCGTTAA TCAGCCATCG ATCATTGGAA CCGCCACCTT TTATCAGTAC TGGAGTGTTA 420 GACGTACGCA TCGGAGCTCC GGTTCGGTTA ATACTGCGAA TCACTTTAAT GCATGGGCAC 480 AGCAAGGGTT AACCCTAGGT ACAATGGATT ATCAAATCGT AGCGGTGGAA GGCTACTTCT 540 CGAGTGGTTC CGCTAGTATT ACAGTGAGCT AAA 573

【０２７８】配列番号：19 配列の長さ：579 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：環状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：pXYbc ゲノム内での位置単位：bp

【０２７９】配列 GCTAGCACAG ATTACTGGCA AAACTGGACA GACGGTGGCG GTATCGTTAA TGCCGTGAAC 60 GGCTCCGGAG GCAACTACAG CGTGAATTGG TCTAATACTG GGAACTTCGT AGTCGGAAAA 120 GGTTGGACGA CAGGATCCCC GTTCCGTACG ATCAACTACA ACGCTGGCGT TTGGGCCCCG 180 AATGGTAACG GTTACCTGAC ACTGTATGGC TGGACGCGTT CGCCACTGAT TGAATATTAC 240 GTTGTCGACT CTTGGGGAAC GTACCGTCCG ACTGGAACCT ACAAAGGCAC AGTCAAAAGC 300 GATGGTGGTA CCTATGACAT CTACACCACC ACAAGATACA ACGCACCTTC CATCGATGGC 360 GATCGGACCA CCTTTACTCA GTATTGGAGT GTTAGACAAT CTAAGCGGCC GACTGGTTCG 420 AACGCCACCA TTACGTTCAC CAATCACGTG AATGCATGGA AATCCCACGG TATGAACCTA 480 GGTTCTAATT GGGCTTATCA AGTAATGGCG ACCGAAGGCT ACCAGAGCTC TGGTTCTTCC 540 AACGTTACAG TGTGGTAAAG ATCTTGAAGC TTGGGACGT 579

【０２８０】配列番号：20 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-162H-1

【０２８１】配列 TGGGCACAGC ACGGGTTAAC C 21

【０２８２】配列番号：21 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-162H-2

【０２８３】配列 CTAGGGTTAA CCCGTGCTGT GCCCATGCA 29

【０２８４】配列番号：22 配列の長さ：65 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tfx-1

【０２８５】配列 CTAGCCACGC GGCCGTAACT TCAAATGAAA CCGGTTATCA TGACGGCTAT TTCTACAGCT 60 TCTGG 65

【０２８６】配列番号：23 配列の長さ：38 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tfx-2

【０２８７】配列 ACCGATGCAC CGGGAACTGT GTCCATGGAG CTCGGGCC 38

【０２８８】配列番号：24 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tfx-3

【０２８９】配列 TCATGATAAC CGGTTTCATT TGAAGTTACG GCCGCGTGG 39

【０２９０】配列番号：25 配列の長さ：56 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tfx-4

【０２９１】配列 CGAGCTCCAT GGACACAGTT CCCGGTGCAT CGGTCCAGAA GCTGTAGAAA TAGCCG 56

【０２９２】配列番号：26 配列の長さ：41 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tfx(1-6)-1

【０２９３】配列 CTAGCTAAGG AGGCTGCAGA TGGCAGTAAC ATCAAATGAA A 41

【０２９４】配列番号：27 配列の長さ：41 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tfx(1-6)-2

【０２９５】配列 CCGGTTTCAT TTGATGTTAC TGCCATCTGC AGCCTCCTTA G 41

【０２９６】配列番号：28 配列の長さ：41 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-1f

【０２９７】配列 CTAGCTAAGG AGGCTGCAGA TGCAAACAAT ACAACCAGGA A 41

【０２９８】配列番号：29 配列の長さ：41 base pairs 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-8f

【０２９９】配列 CCGGTTCCTG GTTGTATTGT TTGCATCTGC AGCCTCCTTA G 41

【０３００】配列番号：30 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-26SMEL-1

【０３０１】配列 CATGGTGGTG TGAGCATGGA GCTCGGGCC 29

【０３０２】配列番号：31 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-28E/29L-1

【０３０３】配列 CGAGCTCGTA GGTCACACCA C 21

【０３０４】配列番号：32 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-27M/29L-1

【０３０５】配列 CATGGAGGCG TCACAATGAC TCTGGGGCC 29

【０３０６】配列番号：33 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-27M/29L-2

【０３０７】配列 CCAGAGTCAT TGTGACGCCT C 21

【０３０８】配列番号：34 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-27M-1

【０３０９】配列 CATGGAGGCG TCACAATGAC TAATGGGCC 29

【０３１０】配列番号：35 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX-27M-2

【０３１１】配列 CATTAGTCAT TGTGACGCCT C 21

【０３１２】配列番号：36 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tf-(-1)R-1

【０３１３】配列 CTAGCGCAAG AGCAGTAACA AGTAACGAGA 30

【０３１４】配列番号：37 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源：クローン名：Tf-(-1)R-2

【０３１５】配列 CCGGTCTCGT TACTTGTTAC TGCTCTTGCG 30

【０３１６】配列番号：38 配列の長さ：47 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：CaTf-(-1)R-1

【０３１７】配列 CTAGCGCATT CAACACACAG GCCGCTCCTC GAGCTGTCAC CAGCAAC 47

【０３１８】配列番号：39 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：CaTf-(-1)R2

【０３１９】配列 CCGGTCTCGT TGCTGGTGAC AGCTCGAGGA GCGGCCTGTG TGTTGAATGC G 51

【０３２０】配列番号：40 配列の長さ：54 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：GRR-Tf(1-6)-1

【０３２１】配列 ACTCTGCAGA TGGGAAGAAG GGCCGTAACT TCAAATGAAA CCGGTTATCA TGAC 54

【０３２２】配列番号：41 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Uni-PCR-1r

【０３２３】配列 GAAAAGTGCC ACCTGACGTC CCAAGCTT 28

【０３２４】配列番号：42 配列の長さ：73 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX10HD-2

【０３２５】配列 CCGGTTTCCA CGACGGTTAC TTTTACAGCT ATTGGAACGA CGGCCATGGA GGAGTAACTT 60 ACACCAATGG GCC 73

【０３２６】配列番号：43 配列の長さ：65 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX10HD-1

【０３２７】配列 CATTGGTGTA AGTTACTCCT CCATGGCCGT CGTTCCAATA GCTGTAAAAG TAACCGTCGT 60 GGAAA 65

【０３２８】配列番号：44 配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TX10HD/N-1

【０３２９】配列 GAAACCGGTT ACCACRACGG TTACTTTTAC AGCTATTGGA ACGATGGCC 49

【０３３０】配列番号：45 配列の長さ：41 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TrX1f

【０３３１】配列 CTAGCTAAGG AGGCTGCAGA TGCAAACAAT ACAACCAGGA A 41

【０３３２】配列番号：46 配列の長さ：41 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：TrX8f

【０３３３】配列 CCGGTTCCTG GTTGTATTGT TTGCATCTGC AGCCTCCTTA G 41

【０３３４】配列番号：47 配列の長さ：37 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tfx-2b

【０３３５】配列 ACCGATGCCC CGGGAACTGT GAGTATGGAG CTCGGCC 37

【０３３６】配列番号：48 配列の長さ：63 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tfx-4b

【０３３７】配列 CCGGGGCCGA GCTCCATACT CACAGTTCCC GGGGCATCGG TCCAGAAGCT GTAGAAATAG 60 CCG 63

【０３３８】配列番号：49 配列の長さ：30 base pairs 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tf-(-1)K-1

【０３３９】配列 CTAGCGCAAA AGCAGTAACA AGTAACGAGA 30

【０３４０】配列番号：50 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tf-(-1)K-2

【０３４１】配列 CCGGTCTCGT TACTTGTTAC TGCTTTTGCG 30

【０３４２】配列番号：51 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tf-(-1)D-1

【０３４３】配列 CTAGCGCAGA TGCAGTAACA AGTAACGAGA 30

【０３４４】配列番号：52 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Tf-(-1)E-2

【０３４５】配列 CCGGTCTCGT TACTTGTTAC TGCTTCTGCG 30

【０３４６】配列番号：53 配列の長さ：61 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：CaTf-PCR-1

【０３４７】配列 CCCGCTAGCG CATTCAACAC ACAAGCARGT SSAAGGGCCG TAACTTCAAA TGAAACCGGT 60 T 61

【０３４８】配列番号：54 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 直接の起源クローン名：Xy-14a

【０３４９】配列 ATTCGGGGCC CAAACGCCAG CGTTGTAGTT GATCGTACG 39

【図面の簡単な説明】

【図１】数種類の第１１族キシラナーゼの間の多重アミ
ノ酸整列化を示す。各々の文字は、標準アミノ酸略語を
用いてアミノ酸を表す。区分けはその頁の活字組に合う
ように任意に選択されたものであり、そのタンパク質の
構造とは無関係である。トリコダーマ・レエセイｘｙｎ
ＩＩの１から３０のアミノ酸の番号付けを示す。列挙さ
れる第１１族キシラナーゼの少なくとも８０％に共通の
アミノ酸はボールド体で示す。全ての第１１族キシラナ
ーゼに共通の残基には下線が付されている。クロストリ
ジウム・ステルコラリウム、ストレプトマイセス・リビ
ダンス（ｘｙｎＢ）、及びサーモモノスポラ・フュスカ
のキシラナーゼについては、触媒性コア配列のみが示さ
れている。

【図２】図１の続きである。

【図３】図１の続きである。

【図４】真菌トリコダーマ・ハルジアナム・キシラナー
ゼ（ＴｈＸ）及び細菌バチルス・サーキュランス・キシ
ラナーゼ（ＢｃＸ）の主鎖構造を示す。

【図５】プラスミドｐＴｖＸ（３−１９０）においてト
リコダーマ・キシラナーゼをコードする遺伝子配列を構
築するための合成オリゴヌクレオチドを示す。

【図６】図５の続きである。

【図７】プラスミドｐＸＹｂｃにおいてバチルス・サー
キュランス・キシラナーゼＢｃＸをコードする遺伝子配
列を構築するための合成オリゴヌクレオチドを示す。

【図８】図７の続きである。

【図９】ＮＩ−ＴＸ変異体キシラナーゼの酵素活性に対
する温度の効果を示す。酵素活性は４０℃のものに標準
化した。

【図１０】ＮＩ−ＢＸ変異体キシラナーゼの酵素活性に
対する温度の効果を示す。酵素活性は４０℃のものに標
準化した。CampbellらのＢｃＸ変異体ＴＳ１９ａの概要
も示す。

【図１１】ＮＩ−ＴＸ修飾トリコダーマ・キシラナーゼ
の酵素活性に対する、６５℃でのｐＨの効果を示す。デ
ータは最大酵素活性に標準化されている。

【図１２】ＮＩ−ＢＸ修飾キシラナーゼの酵素活性に対
する、６５℃でのｐＨの効果を示す。ＢｃＸ変異体ＴＳ
１９ａの概要も示す。データは最大酵素活性に標準化さ
れている。

【図１３】修飾バチルス・キシラナーゼの酵素活性に対
する、５０℃でのｐＨの効果を示す。Wilsonら（ＰＣ
Ｔ、１９９５）によって公表されたＴｆｘＡについての
データも含まれる。ＴｆｘＡと比較するため、全ての修
飾バチルス・キシラナーゼの酵素活性はｐＨ８での結果
に標準化した。

【図１４】トリコダーマ・キシラナーゼＮＩ−ＴＸ１、
ＮＩ−ＴＸ５、ＮＩ−ＴＸ１０、ＮＩ−ＴＸ１１、Ｔｖ
Ｘ（３−１９０）及び天然ＴｒＸの５３℃での熱安定性
を示す。酵素活性はインキュベーション０分でのものに
標準化した。

【図１５】キメラキシラナーゼＮＩ−ＴＸ２、ＮＩ−Ｔ
Ｘ５、ＮＩ−ＴＸ８、ＮＩ−ＴＸ９及び天然ＴｒＸの６
８℃での熱安定性を示す。比較のため、天然ＴｒＸの５
３℃での概要も含めた。酵素活性はインキュベーション
０分でのものに標準化した。

【図１６】ＮＩ−ＢＸ及びＢｃＸの７０℃での熱安定性
を示す。酵素活性はインキュベーション０分のものに標
準化した。

【図１７】ＮＩ−ＴＸキシラナーゼ、組換え及び天然Ｔ
ｒＸのパルプの漂白を強化する性能に対する温度の効果
を示す（Iogen Corporation によって実施される試
験）。

【図１８】ＮＩ−ＢＸ１及び野生型ＢｃＸのパルプの漂
白を強化する性能に対する温度の効果を示す（Iogen Co
rporation によって実施される試験）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:885） (72)発明者マコトヤグチカナダ国ケイ２シー３エヌ５オンタリオオタワプリンスオブウェールズドライブ 2206−1380 (72)発明者カズヒコイシカワ茨城県つくば市並木４ 909−101

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トリコダーマ・レエセイ・キシラナーゼＩ
Ｉのアミノ酸の番号付けで決定される１４位又はアミノ
酸を整列化した場合の他のキシラナーゼにおける対応す
る位置にアミノ酸チロシン又はフェニルアラニンを有
し、かつ１０位の上流のＮ−末端に少なくとも８個のア
ミノ酸残基を有するトリコダーマ、アスペルギルス、ス
トレプトマイセス、及びバチルスの第１１族キシラナー
ゼからなる群より選択される第１１族キシラナーゼ酵素
であって、該キシラナーゼ酵素は１０位のアミノ酸を異
なるアミノ酸で置換することにより天然の酵素に関して
強化された好熱性、好アルカリ性、又は熱安定性を示す
ように修飾されている第１１族キシラナーゼ酵素。
【請求項２】第１１族キシラナーゼが、トリコダーマ・
レエセイ・キシラナーゼＩ、トリコダーマ・レエセイ・
キシラナーゼＩＩ、トリコダーマ・ハルジアナム・キシ
ラナーゼ、トリコダーマ・ビリデ・キシラナーゼ、スト
レプトマイセス・リビダンス・キシラナーゼＢ、及びス
トレプトマイセス・リビダンス・キシラナーゼＣからな
る群より選択される請求項１による修飾キシラナーゼ。
【請求項３】アミノ酸１０が他の酸で置換され、かつア
ミノ酸２７及び２９がバリン、メチオニン、イソロイシ
ン、及びロイシンからなる群より選択されるアミノ酸で
置換されている請求項１による修飾キシラナーゼ。
【請求項４】アミノ酸１０、２７、及び２９が、それぞ
れ、ヒスチジン、メチオニン、及びロイシンで置換され
ている請求項３による修飾キシラナーゼ。
【請求項５】トリコダーマ・レエセイ・キシラナーゼＩ
Ｉのアミノ酸の番号付けで決定される１４位又はアミノ
酸を整列化した場合の他のキシラナーゼにおける対応す
る位置にアミノ酸チロシン又はフェニルアラニンを有す
るトリコダーマ、アスペルギルス、ストレプトマイセ
ス、及びバチルスの第１１族キシラナーゼからなる群よ
り選択される第１１族キシラナーゼ酵素であって、該キ
シラナーゼ酵素は該キシラナーゼ酵素のＮ−末端領域の
アミノ酸配列をサーモモノスポラ・フュスカ・キシラナ
ーゼＡに由来する対応整列化アミノ酸配列で置換してキ
メラキシラナーゼを形成することと、０ないし１０個の
アミノ酸を追加することによる該キメラキシラナーゼの
Ｎ−末端の上流伸長とによって強化された好熱性、好ア
ルカリ性、又は熱安定性を示すように修飾されている第
１１族キシラナーゼ酵素。
【請求項６】第１１族キシラナーゼが、トリコダーマ・
レエセイ・キシラナーゼＩ、トリコダーマ・レエセイ・
キシラナーゼＩＩ、トリコダーマ・ハルジアナム・キシ
ラナーゼ、トリコダーマ・ビリデ・キシラナーゼ、バチ
ルス・サーキュランス・キシラナーゼＡ、バチルス・サ
ブチリス・キシラナーゼＡ、アスペルギルス・ニガー・
キシラナーゼＡ、アスペルギルス・カワチイ・キシラナ
ーゼＣ、アスペルギルス・ツビゲンシス・キシラナーゼ
Ａ、ストレプトマイセス・リビダンス・キシラナーゼ
Ｂ、及びストレプトマイセス・リビダンス・キシラナー
ゼＣからなる群より選択される請求項５による修飾キシ
ラナーゼ。
【請求項７】アミノ酸１０−２９を含むアミノ酸の配列
がサーモモノスポラ・フュスカ・キシラナーゼＡに由来
する対応整列化アミノ酸配列で置換されている請求項１
による修飾キシラナーゼ。
【請求項８】アミノ酸１−２９を含むアミノ酸の配列が
サーモモノスポラ・フュスカ・キシラナーゼＡに由来す
る対応整列化アミノ酸配列で置換されている請求項５に
よる修飾キシラナーゼ。
【請求項９】前記キシラナーゼが、ＮＩ−ＴＸ２、ＮＩ
−ＴＸ３、ＮＩ−ＴＸ４、ＮＩ−ＴＸ５、ＮＩ−ＴＸ
７、ＮＩ−ＴＸ８、ＮＩ−ＴＸ９、ＮＩ−ＢＸ１、ＮＩ
−ＢＸ２、ＮＩ−ＢＸ３、ＮＩ−ＢＸ４、ＮＩ−ＢＸ
５、ＮＩ−ＢＸ６及びＮＩ−ＢＸ７からなる群より選択
される請求項５による修飾キシラナーゼ。
【請求項１０】Ｎ−末端の上流伸長が−２及び−１位で
の１もしくは２個の塩基性アミノ酸並びに−１０から−
３位でのクロストリジウム・アセトブチリカム・キシラ
ナーゼｘｙｎＢの（２３−３１）領域の追加からなる請
求項８による修飾キシラナーゼ。
【請求項１１】Ｎ−末端の上流伸長が配列アラニン−セ
リン−アラニン−アルギニン又はアラニン−セリン−ア
ラニン−リシンで同定されるテトラペプチドのいずれか
１つの追加を包含する請求項５による修飾キシラナー
ゼ。
【請求項１２】Ｎ−末端の上流伸長が（−３）から（−
１）位での残基グリシン−アルギニン−アルギニンの追
加を包含する請求項８による修飾キシラナーゼ。
【請求項１３】木材パルプの漂白性を改善する方法であ
って、パルプを請求項１によるキシラナーゼで約５分な
いし３時間、約５５℃ないし７５℃の温度で処理するこ
とを包含する方法。
【請求項１４】キシラナーゼ処理をｐＨ７．５ないし
９．０で行う請求項１３の方法。
【請求項１５】Ｎ−末端の上流伸長が（−３）から（−
１）位での残基グリシン−アルギニン−アルギニンの追
加を包含する請求項５による修飾キシラナーゼ。
【請求項１６】トリコダーマ・キシラナーゼＩＩのアミ
ノ酸１−２９又は他の第１１族キシラナーゼの対応整列
化配列を含むアミノ酸の配列が他の第１１族キシラナー
ゼからのキシラナーゼに由来する対応整列化アミノ酸配
列で置換されている請求項１５による修飾キシラナー
ゼ。
【請求項１７】トリコダーマ・レエセイ・キシラナーゼ
ＩＩのアミノ酸１−２９又は他の第１１族キシラナーゼ
の対応整列化配列を含むアミノ酸の配列がサーモモノス
ポラ・フュスカ・キシラナーゼＡに由来する対応整列化
アミノ酸配列で置換されている請求項１６による修飾キ
シラナーゼ。
【請求項１８】好熱性、好アルカリ性、及び耐熱性のい
ずれか１つもしくは全てを改善するための第１１族キシ
ラナーゼ酵素の修飾方法であって、（１）トリコダーマ・レエセイ・キシラナーゼＩＩのア
ミノ酸１０、２７、もしくは２９又は他の第１１族キシ
ラナーゼの対応整列化アミノ酸の修飾；（２）Ｎ−末端領域の１以上のアミノ酸配列を他の第１
１族キシラナーゼに由来する対応整列化アミノ酸配列で
置換してキメラキシラナーゼを形成すること；及び（３）１０個までのアミノ酸の追加によるＮ−末端の上
流伸長、の３つのタイプの修飾の１以上からなる方法。
【請求項１９】木材パルプの漂白性を改善する方法であ
って、パルプを請求項５による修飾第１１族キシラナー
ゼで５分ないし３時間、５５℃ないし７５℃で処理する
ことを包含する方法。
【請求項２０】キシラナーゼ処理をｐＨ７．５ないし
９．０で行う請求項１９の方法。
【請求項２１】木材パルプの漂白性を改善する方法であ
って、パルプを請求項２による修飾第１１族キシラナー
ゼで約５分ないし３時間、約５５℃ないし７５℃の温度
で処理することを包含する方法。
【請求項２２】キシラナーゼ処理をｐＨ７．５ないし
９．０で行う請求項２１の方法。
【請求項２３】木材パルプの漂白性を改善する方法であ
って、パルプを請求項６による修飾第１１族キシラナー
ゼで約５分ないし３時間、約５５℃ないし７５℃の温度
で処理することを包含する方法。
【請求項２４】キシラナーゼ処理をｐＨ７．５ないし
９．０で行う請求項２３の方法。
【請求項２５】前記キシラナーゼが、ＮＩ−ＴＸ６、Ｎ
Ｉ−ＴＸ１０、ＮＩ−ＴＸ１１、ＮＩ−ＴＸ１２又はＮ
Ｉ−ＴＸ１３からなる群より選択される請求項１による
修飾キシラナーゼ。