FI122936B - Ksylanaaseja, joilla on lisääntynyt termofiilisyys ja alkalifiilisyys - Google Patents

Description

Ksylanaaseja, joilla on lisääntynyt termofiilisyys ja alkalifiilisyys - Ksylanaser med förbättrad termofilitet och alkalifilitet

Esillä oleva keksintö koskee ksylanaaseja. Erityisemmin keksintö koskee ksylanaaseja ja modifioituja ksylanaaseja, joilla on parantunut suorituskyky korkean lämpö-5 tilan ja pH:n olosuhteissa.

Keksinnön tausta

Ksylanaasit ovat ryhmä entsyymejä, joilla on laaja-alainen kaupallinen hyödyllisyys. Ksylanaasien pääasiallinen käyttökohde on massan biovalkaisussa paperintuotannossa. Lisäksi ksylanaaseja on käytetty kirkasteaineina mehuissa ja viineissä, 10 entsymaattisina aineina tarkkuuslaitteiden ja puolijohteiden pesussa (esim. US-pa-tentti no 5 078 802) ja niitä on myös käytetty parantamaan siipikarja- ja sikarehun sulavuutta.

Valmistettaessa massaa paperintuotantoon, kuitumateriaalit altistetaan korkeille lämpötiloille ja paineille kemikaalien läsnäollessa. Tämä käsittely muuttaa kuidut 15 massaksi ja tunnetaan kuidutuksena. Kuidutuksen jälkeen massa valkaistaan. Ksy-lanaasientsyymejä käytetään parantamaan massan valkaistumista. Ksylanaasi-käsittely auttaa myöhempiä valkaisukemikaaleja, kuten klooria, klooridioksidia, vetyperoksidia tai näiden kemikaalien yhdistelmiä valkaisemaan massan tehokkaammin. Massan esikäsittely ksylanaasilla lisää lopullisen paperituotteen valkoi-20 suutta ja laatua sekä vähentää massan valkaisuun tarvittavien klooripohjaisten kemikaalien määrää. Tämä puolestaan vähentää tällaisissa prosesseissa syntynyttä klooripitoista j ätevettä.

Tärkein kemiallinen kuidutusprosessi on kraftmassa (valkaisematon sulfaattimassa).

CVJ

^ Krafmassaa varten massa on kuidutuksen jälkeen ja ennen massan ksylanaasikäsit- ^ 25 telyä lämpötilassa noin 55 - 70 °C ja hyvin emäksisessä pH:ssa (esim. Nissen et ai.,

LO

9 1992). Useiden kaupallisesti saatavilla olevien villityypin ksylanaasien haittapuoli o on, että näillä entsyymeillä ilmentyy hapan pH-optimi ja noin 55 °C:n lämpötila- ir optimi. Ksylanaasien tehokkaaksi hyödyntämiseksi valkaisusovelluksissa massa täytyy siksi hapottaa pH:hon, joka suunnilleen vastaa nimenomaisen käytetyn ksyla- o 30 naasin optimaalista pH:ta. Lisäksi kuuma massa täytyy jäähdyttää lähelle lämpöti- § laa, joka on optimaalinen lämpötila valitun ksylanaasin entsymaattiselle aktiivisuu- o delle. Massalämpötilojen laskeminen ksylanaasikäsittelyä varten laskee myöhemmän kemiallisen valkaisun tehoa. Massan hapotus vaatii happojen suurien määrien käyttöä. Edelleen happojen lisäys johtaa korroosioon, mikä vähentää prosessilaittei- 2 den kestoaikaa. Täten suunnilleen massan olosuhteita vastaavissa lämpötiloissa ja pH-olosuhteissa optimaalisesti aktiiviset ksylanaasit olisivat käyttökelpoisia ja suotuisia massanvalmistuksessa.

Ksylanaaseja, joilla on suurempi aktiivisuus korkeammissa lämpötiloissa voitaisiin 5 käyttää käsittelemään massa välittömästi kuidutusprosessin jälkeen ilman massan jäähdytyksen tarvetta. Vastaavanlaisesti ksylanaasit, joilla on suurempi aktiivisuus korkeammissa pH-olosuhteissa, tarvitsisivat vähemmän tai ei lainkaan happoa neutralisoimaan massan. Tällaisilla ominaisuuksilla varustettujen ksylanaasien eristys tai geneettinen manipulointi tarjoaisi useita etuja ja huomattavaa taloudellista hyö-10 tyä useissa erilaisissa teollisuusprosesseissa.

Useisiin tunnetun tekniikan ratkaisumalleihin, jotka on suunnattu kohti massan valkaisuun käytettävän ksylanaasin parantamista, sisältyvät termostabiilien ksylanaasien eristys äärimmäisistä, 80 - 100 °C:ssa kasvavista termofnleistä, kuten Cal-docellum saccharolyticumista, Thermatoga maritimasta ja Thermatoga sp. kannasta 15 FJSS.B.l (Luthi et ai., 1990; Winterhalter et ai., 1995; Simpson et ai., 1991). Nämä termostabiilit entsyymit ovat kuitenkin suuria, molekyylimassojen vaihdellen välillä 35 - 120 kDa (320 - 1100 tähdettä) ja niillä on vähentynyt kyky läpäistä kuitumassa verrattaessa muihin pienempiin ksylanaaseihin, joilla ilmentyy parempi reagoimis-kyky massakuiduille. Lisäksi joillakin erittäin termostabiileista ksylanaaseista, ku-20 ten Caldocellum saccharolyticum ksylanaasi A:lla on sekä ksylanaasi- että sellu-laasiaktiivisuutta (Luthi et ai., 1990). Tämä ylimääräinen massaa hajottava aktiivisuus on ei-toivottavaa massan valkaisulle sen massalle, paperissa olevalle massama-teriaalille haitallisen vaikutuksen johdosta. Lisäksi hypertermostabiileilla ksylanaa-sientsyymeillä, jotka toimivat normaalisti erittäin korkeissa lämpötiloissa, on mata-25 lat spesifiset aktiivisuudet optimaaliselle massanvalkaisulle tarvittavilla lämpötila-

CM

£ alueilla (Simpson et ai, 1991).

cv g Useita ksylanaaseja on modifioitu proteiinimanipuloinnilla niiden ominaisuuksien g parantamiseksi teollisiin sovelluksiin. Esimerkiksi US-patentti no 5 759 840 (Sung x et ai.) ja US-patentti no 5 866 408 (Sung et ai) tuovat esiin mutaatiot Trichoderma 30 reesei -ksylanaasi II:n (Trx) N-terminaalisella alueella (tähteet 1 - 29). Kolmen mu-g taation Trx:n tähteissä 10, 27 ja 29 havaittiin kohottavan ksylanaasientsyymin ent- n symaattista aktiivisuutta korotetuissa lämpötiloissa ja emäksisissä pH-olosuhteissa.

O

o

CM

US-patentti no 5 405 769 (Campbell et ai.) tuo esiin Bacillus circulans ksylanaasin (BcX) modifikaation käyttäen kohdennettua mutageneesiä entsyymin termostabii-35 liuden parantamiseksi. Paikkaspesifiset mutaatiot sisältävät kahden aminohapon 3 vaihdon Cys-tähteiksi molekyylin sisäisten disulfidisidosten muodostamiseksi. Lisäksi spesifiset tähteet entsyymin N-terminuksessa mutatoitiin, joiden myös havaittiin parantavan lisää entsyymin termostabiiliutta. In vitro määrityksissä disulfidimu-tantit osoittivat termostabiiliutta 62 °C:ssa, 7 °C:n parannuksen verrattuna natiiviin 5 BcX-ksylanaasientsyymiin. Nämä termostabiilit disulfidimutantit eivät kuitenkaan osoittaneet mitään termofiilisyyden lisääntymistä laboratoriomäärityksissä myöhemmissä tutkimuksissa (Wakarchuck et ai., 1994). Mutaatiot T3G (siis treoniini paikassa 3 vaihdettuna Gly:ksi; BcX-ksylanaasin aminohapponumerointi), D4Y (F) ja N8Y (F) lähellä BcX-ksylanaasientsyymin N-terminusta välittivät termostabiiliu-10 den 57 °C:een, 2 °C:n nousu verrattuna natiiviin BcX:ään (US-patentti no 5 405 769). Näiden entsyymien käyttö teollisissa sovelluksissa vaatii kuitenkin vielä massan jäähdytyksen ja hapotuksen esikäsittelyn jälkeen ennen entsyymin lisäystä. Näin ollen lisäkohotuksia termostabiiliuteen, termofiilisyyteen ja pH-optimiin tarvitaan vielä.

15 Turunen et ai. (2001) tuo esiin TrX II:n mutaatiot (N1 ID, N38E, Q162H) paikoissa 11, 38 ja 162, komplementit vastaavat disulfidisidokset (S110C/N154C) ksylanaa-sin termostabiiliuden parantamiseksi. Näillä mutaatioilla, mukaan lukien N11D, on kuitenkin myös epäsuotuisa vaikutus sekä ksylanaasin termofiilisyyteen että alkali-fiilisyyteen, johtaen entsymaattisen aktiivisuuden laskuun korkeammissa lämpöti-20 loissa ja neutraali-emäksisessä pH:ssa verrattaessa natiiviin TrX II:een.

Tunnetulle tekniikalle on tarvetta saada uusia, teolliseen käyttöön soveltuvia ksy-lanaaseja, joilla ilmentyy kohonnut entsymaattinen aktiivisuus korotetuissa lämpötiloissa ja pH-olosuhteissa. Keksinnön tarkoituksena on voittaa tunnetun tekniikan haittapuolet.

^ 25 Edellinen tarkoitus saavutetaan itsenäisen patenttivaatimuksen ominaisuusyhdistel- c3 mällä, epäitsenäiset patenttivaatimukset tuovat esiin lisää keksinnön edullisia suori- i g tusmuotoja.

i 00

Keksinnön yhteenveto ί

CL

Esillä oleva keksintö koskee ksylanaaseja. Erityisemmin keksintö koskee modifioi- o 30 tuja ksylanaaseja, joilla on parantunut suorituskyky korkean lämpötilan ja pH:n olo- o suhteissa.

o cv Tämä keksintö koskee modifioitua perheen 11 ksylanaasia käsittäen substituoidun aminohappotähteen paikassa, joka paikka on määritetty modifioidun ksylanaasient-syymin sekvenssivertailusta Trichoderma reesein ksylanaasi II:n SEQ ID NO: 16 4 määritetyn aminohapposekvenssin kanssa ja 0 - 11 substituoitua lisäaminohappoa. Tällaisella modifioidulla perheen 11 ksylanaasilla ilmentyy parantunut termofiili-syys verrattuna vastaavaan natiiviin perheen 11 ksylanaasiin, josta modifioitu perheen 11 ksylanaasi on johdettu. Joissain suoritusmuodoissa modifioitu perheen 11 5 ksylanaasi ilmentää parantunutta alkalofiilisyyttä verrattuna vastaavaan natiiviin perheen 11 ksylanaasiin, josta modifioitu perheen 11 ksylanaasi on johdettu,

Esillä oleva keksintö tuo myös esiin edellä määritetyn mukaisen modifioidun perheen 11 ksylanaasin, johon on substituoitu asparagiinihappo paikkaan 11, glysiini paikkaan 116 ja/tai kysteiini paikkaan 118. Joissain suoritusmuodoissa modifioitu 10 perheen 11 ksylanaasi on modifioitu Trichoderma reesei ksylanaasi Modifioitu perheen 11 ksylanaasi voi olla esimerkiksi Trichoderma reesei ksylanaasi II.

Esillä oleva keksintö käsittää myös edellä määritetyn mukaisen modifioidun perheen 11 ksylanaasin ja edelleen substituoidun His:n paikoissa 10 ja 105, substituoi-dun Met:n paikassa 27, substituoidun Leu:n paikassa 29, substituoidun Alain pai-15 koissa 75 ja 125, substituoidun Glu:n paikassa 129 ja substituoidun Arg:n paikassa 161.

Joissain suoritusmuodoissa edellä määritellyn mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi tunnetaan siitä, että sillä on maksimaalinen tehokas lämpötila (maximum effective temperature, MET) välillä noin 69 °C - 84 °C .

20 Toisissa suoritusmuodoissa edellä määritellyn mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi tunnetaan siitä, että sillä on maksimaalinen tehokas pH (maximum effective pH, MEP) välillä noin pH 5,8 - pH 8,4 . Esillä oleva keksintö koskee myös modifioituja perheen 11 ksylanaaseja valittuna ryhmästä, joka koostuu: g TrX-HML-75 A105H-125 A129E-144R: stä, ™ 25 T rX-HML-7 5 A105H-125 A129E-144R161R: stä, 9 T rX-HML-7 5 A10 5H-116G-125A129E-144R:stä, o T rX-HML-7 5 A105H-118C-125 A129E-144R: stä, | TrX-H-11D-ML-75 A105H-125 A129E-144R161R: stä, * TrX-H-11 D-ML-75 A105H-116G-125A129E-144R161R:stä, o 30 TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R:stä ja § TrX-H-11 D-ML-75 A105H-116G118C-125A129E-144R161R:stä.

o cv

Esillä oleva keksintö kohdistuu teolliseen prosessiin, jossa edellä määritellyn mukaisella modifioidulla perheen 11 ksylanaasilla hydrolysoidaan ksylaanisubstraattia.

5

Sisällytettynä on myös teollinen prosessi, jossa ksylaanisubstraatti on kuitumassas-sa.

Tämä keksinnön yhteenveto ei välttämättä kuvaile kaikkia tarvittavia keksinnön ominaisuuksia, vaan että keksintö voi olla myös kuvailtujen ominaisuuksien osayh-5 distelmänä.

Lyhyt piirrosten kuvaus Nämä ja muut keksinnön ominaisuudet tulevat ilmeisemmiksi seuraavasta kuvauksesta, jossa viitataan mukaan liitettyihin piirroksiin, joissa:

Kuva 1 esittää aminohapposekvenssivertailua perheen 11 ksylanaasien kesken. 10 Aminohapponumerointi rinnastetaan Trichoderma reesei -ksylanaasi II:een (Tr2), kuten osoitetaan sekvenssien yläpuolella. Tähteet paikoissa 75 ja 105 (suhteessa Tr2:een) on kursivoitu ja osoitettu tähtimerkillä. Aminohapot, jotka ovat yhteisiä ainakin 75 % listattuja perheen 11 ksylanaaseja, osoitetaan lihavoituna. Kaikille perheen 11 ksylanaaseille yhteiset tähteet on alleviivattu. Ksylanaaseille, joilla on 15 massaa sitova domeeni, esitetään vain katalyyttiset ydinsekvenssit.

Kuva 2 esittää TrX-ksylanaasin nukleotidisekvenssiä (SEQ ID NO: 39) ja synteettisiä oligonukleotideja, joita käytettiin Trichoderma reesei ksylanaasi II -entsyymiä (TrX) koodaavan sekvenssin kokoamiseksi plamidiin pTrX.

Kuva 3 esittää lämpötilan vaikutusta modifioidun ksylanaasin TrX-HML-20 75A105H-125A129E-144R entsymaattiseen aktiivisuuteen verrattuna TrX-HML- 75A105H-125A129E:hen, pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tiedot on normalisoitu 40 °C:ssa havaittuun aktiivisuuteen.

C\J

o Kuva 4 esittää lämpötilan vaikutusta modifioitujen ksylanaasien TrX-116G ja TrX- ιό 118C entsymaattiseen aktiivisuuteen verrattuna natiiviin TrX:ään, pH:ssa 5,0 30

O

^ 25 minuutin inkubaatioiden aikana. Tiedot on normalisoitu 40 °C:ssa havaittuun aktii visuuteen.

X

X

CL

^ Kuva 5 esittää lämpötilan vaikutusta modifioitujen ksylanaasien TrX-HML- o 75A105H-116G-125A129E-144R ja TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E- o 144R161R entsymaattiseen aktiivisuuteen verrattuna natiiviin TrX:ään, TrX- ° 30 HML:ään, TrX-HML-75A105H-125A129E:hen ja TrX-HML-75A105H- 125A129E-144R:ään, pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tiedot on normalisoitu 40 °C:ssa havaittuun aktiivisuuteen.

6

Kuva 6 esittää lämpötilan vaikutusta modifioitujen ksylanaasien TrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R, TrX-HML-75A105H-l 16G- 125A129E-144R, TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R, TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R ja TrX-H-11D-ML-75 AI 05H-118C- 5 125A129E-144R161R entsymaattiseen aktiivisuuteen verrattuna TrX-HML- 75A105H-125A129E-144R:ään, pH:ssa 6,0 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tiedot on normalisoitu 40 °C:ssa havaittuun aktiivisuuteen.

Kuva 7 esittää lämpötilan vaikutusta modifioitujen ksylanaasien TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R ja TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-10 144R161R, TrX-HML-75A105H-l 18C-125A129E-144R ja TrX-H-11D-ML- 75A105H-118C-125A129E-144R161R entsymaattiseen aktiivisuuteen verrattuna TrX-HML-75A105H-125A129E-144R:ään, pH:ssa 6,0 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tiedot on normalisoitu kunkin entsyymin maksimiaktiivisuuteen nähden.

Kuva 8 esittää lämpötilan vaikutusta modifioidun ksylanaasin TrX-H-11D-ML-15 75A105H-125A129E-144R161R entsymaattiseen aktiivisuuteen verrattuna TrX- HML-75A105H-125A129E-144R161R:ään, pH:ssa 6,0 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tiedot on normalisoitu 40 °C:ssa havaittuun aktiivisuuteen.

Kuva 9 esittää pH/aktiivisuusprofiilia modifioiduille ksylanaasientsyymeille TrX-H-l 1 D-ML-75 A105H-116G118C-125A129E-144R161R, TrX-H-11D-ML- 20 75A105H-116G-125 A129E-144R161R, TrX-HML-75 A105H-116G-125 A129E- 144R ja T rX-HML-7 5 A105H-118C-125 A129E-144R verrattuna TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R:ään ja TrX-HML-75A105H-125A129E:hen, pH-välillä 5,0 - 8,0 65 °C:ssa 30 minuutin inkubaation aikana. Tiedot on normalisoitu pH:hon, jossa kullakin entsyymillä on optimaalinen aktiivisuus.

C\J

o 25 Kuva 10 esittää pH/aktiivisuusprofiileja modifioiduille ksylanaaseille TrX-116G ja ιό TrX-118C verrattuna natiiviin TrX:ään, pH-välillä 4,5 - 7,0 50 °C:ssa 30 minuutin o oJj inkubaation aikana. Tiedot on normalisoitu pH:hon, jossa ilmentyy kullekin ent syymille optimaalinen aktiivisuus.

CC

CL

^ Kuva 11 esittää esillä olevan keksinnön useiden modifioitujen entsyymien maksi- o 30 maalisen tehokkaan lämpötilan (MET) ja maksimaalisen tehokkaan pH:n (MEP) arcs vot. MET ja MEP ovat vastaavasti korkein lämpötila ja pH, joissa ksylaanasilla il-

O

^ mentyy vähintään 80 % optimaalisesta aktiivisuudestaan (käyttäen liukoista koivu puun ksylaania substraattina, katso menetelmä määritysten täydellisille yksityiskohdille). Nämä tietopisteet saatiin tiedoista, jotka esitetään kuvissa 3 ja 10.

7

Edullisen suoritusmuodon kuvaus

Esillä oleva keksintö koskee ksylanaaseja. Erityisemmin keksintö koskee ksyla-naasia ja modifioituja ksylanaaseja, joilla on parantunut suorituskyky korkean lämpötilan ja pH:n olosuhteissa.

5 Seuraava kuvaus edullisesta suoritusmuodosta esimerkin avulla on vain ja rajoittumatta ominaisuuksien yhdistelmään, tarpeellinen keksinnön toteuttamisen osoittamiseksi.

Mekanismia, jolla ksylanaasit edistävät massan valkaistumista ei täysin tiedetä. On oletettu, että värillinen ligniini on liittyneenä kiteiseen massaan ksylaanin välityk-10 sellä ja ksylanaasientsyymit edistävät massan valkaistumista hydrolysoimalla ksy-laania vapauttaen värillisen ligniinin massasta. Tässä esitetyn kaltaisia ksylanaaseja ja modifioituja ksylanaaseja voidaan käyttää massan valkaisutarkoituksissa tai muissa sovelluksissa, jotka vaativat aktiivisuutta lämpötiloissa ja pH:ssa, jotka ovat suuremmat kuin villityypin entsyymillä. Massan biovalkaisuun edullinen ksylanaasi 15 johdetaan ksylanaasista, joka luokitellaan perheeseen 11 (katso taulukko 1), tässä esiin tuotujen modifikaatioiden ei kuitenkaan tarvitse rajoittua vain perheen 11 ksy-lanaaseihin ja mukaan voidaan lukea myös muita ksylanaasientsyymejä. Perheen 11 ksylanaasientsyymit ovat ryhmä pieniä entsyymejä, joilla on suhteellisen pieni mo-lekyylimassa (noin 20 kDa ja noin 200 aminohappotähdettä). Perheen 11 ksy-20 lanaaseihin liittyvä pieni koko sallii helpon penetroitumisen kuitumassaan. Lisäksi perheen 11 ksylanaaseilla ei ole sellulaasiaktiivisuutta.

Yksi esillä olevan keksinnön kohde on modifioidun perheen 11 ksylanaasi, joka saadaan Trichoderma sp:stä käsittäen ainakin yhden substituoidun aminohappotäh- ^ teen ja joka tunnetaan siitä, että sillä on maksimaalinen tehokas lämpötila (MET, o 25 katso määritelmä jäljempänä) välillä noin 69 °C - 84 °C. Edullisesti modifioitu ksy- iö lanaasi tunnetaan siitä, että sillä on MET välillä noin 70 °C - 80 °C. Tämä keksintö o ^ sisältää myös modifioidun ksylanaasin käsittäen ainakin yhden substituoidun ami-

° nohappotähteen ja joka tunnetaan siitä, että sillä on maksimaalinen tehokas pH

£ (MEP, katso määritelmä jäljempänä) välillä noin 5,8 - 8,4. Edullisesti MEP on vä- ^ 30 Iillä noin 6,0 - 8,0.

σ> o o Tämä keksintö koskee myös modifioitua ksylanaasia, joka saadaan Tr ichoder musta o ^ käsittäen ainakin yhden substituoidun aminohappotähteen ja joka tunnetaan siitä, et tä sillä on maksimaalinen tehokas lämpötila (MET) välillä noin 69 °C - 84 °C ja 8 maksimaalinen tehokas pH (MEP) välillä noin 5,8 - 8,4. Edullisesti MET välillä noin 70 °C - 80 °C ja MEP on välillä noin 6,0 - 8,0.

Tämä keksintö koskee myös natiivia perheen 11 ksylanaasia, joka tunnetaan siitä, että sillä on maksimaalinen tehokas lämpötila (MET) välillä noin 69 °C - 84 °C ja 5 maksimaalinen tehokas pH (MEP) välillä noin 5,8 - 8,4. Edullisesti MET välillä noin 70 °C - 80 °C ja MEP on välillä noin 6,0 - 8,0.

’’Maksimaalisella tehokkaalla lämpötilalla” tai ’’METillä” tarkoitetaan korkeinta lämpötilaa, jossa ksylanaasilla esiintyy ainakin 80 % optimaalisesta aktiivisuudestaan. Tämä testi suoritetaan tyypillisesti käyttäen liukoista koivupuu-ksylaania sub-10 straattina pH:ssa 5,5 tai 6,0 ja 30 minuutin jakson ajan. Modifioitujen ksylanaasien karakterisointiin käytetyt määritysten tulokset esitetään kuvissa 3 - 8 ja niihin sisältyi 30 minuutin inkubaatio pH:ssa 5,5 tai 6,0. Esillä olevan keksinnön, kuvista 3-8 määritetty, useiden entsyymien MET-yhteenveto esitetään kuvassa 11. Kokeet osoittavat, että ksylanaasin MET vaihtelee eri substraateille. Näin ollen tulee ym-15 märtää, että eri substraateilla saadaan eri MET-arvot (tietoja ei esitetty). Esillä olevan keksinnön ksylanaasien arvioimistarkoituksiin käytetään liukoista koivupuu-ksylaanisubstraattia (katso esimerkki 3).

’’Maksimaalisella tehokkaalla pH:lla” tai ’’MEPillä” tarkoitetaan korkeinta pH:ta, jossa ksylanaasilla esiintyy ainakin 80 % optimaalisesta aktiivisuudestaan. Tämä 20 testi suoritetaan tyypillisesti käyttäen liukoista koivupuuksylaania substraattina 65 °C:ssa ja 30 minuutin jakson ajan. Modifioitujen ksylanaasien karakterisointiin käytetyt määritysten tulokset esitetään kuvissa 9 ja 10 ja niihin sisältyi 30 minuutin inkubaatio 65 °C:ssa. Esillä olevan keksinnön useiden entsyymien MEP-yhteenveto esitetään kuvassa 11. Kokeet osoittavat, että ksylanaasin MEP vaihtelee eri sub-^ 25 straateille. Esimerkiksi pehmeästä puusta tai kovapuusta valmistetulle kraftmassalle ° on havaittu MEP 9,2 (tietoja ei esitetty). Näin ollen tulee ymmärtää, että eri sub- o straateilla saadaan eri MEP-arvot. Esillä olevan keksinnön ksylanaasien arvioimis- g tarkoituksiin käytetään liukoista koivupuuksylaanisubstraattia (katso esimerkki 4).

X

tr

CL

05

O

n o o

C\J

9

Taulukko 1 Perheen 11 ksylanaasientsyymit

Mikrobi Ksylanaasi SEQ ID NO

Aspergillus niger Xyn A SEQ TD NO: 1

Aspergillus awamori var.kawachi Xyn B SEQ ID NO: 19

Aspergillus kawachii Xyn C SEQ ID NO: 54

Aspergillus tubigensis Xyn A SEQ ID NO: 2

Bacillus circulans Xyn A SEQ ID NO: 3

Bacillus pumilus Xyn A SEQ ID NO: 4

Bacillus subtilis Xyn A SEQ ID NO: 5

Cellulomonas fimi Xyn D " -

Chainia spp. Xyn " -

Clostridium acetobutylicum Xyn B SEQ ID NO: 6

Clostridium stercorarium Xyn A SEQ ID NO: 7

Fibrobacter succinognees Xyn II SEQ ID NO: 18

Neocallimasterix patriciarum Xyn A

Nocardiopsis dassonvillei Xyn II -

Ruminococcus flavefaciens Xyn A SEQ ID NO: 8

Shizophyllum cimmune Xyn SEQ ID NO: 9

Streptomyces lividans Xyn B SEQ ID NO: 10

Streptomyces lividans Xyn C SEQ ID NO: 11

Streptomyces sp. No. 36a Xyn SEQ ID NO: 12

Streptomyces thermoviolaceus Xyn II -

Thermomonospora fusca Xyn A SEQ ID NO: O

Thermomyces lanuginosus Xyn SEQ ID NO: 2Ö

Trichoderma harzianum Xyn SEQ ID NO: 14 ^ Trichoderma reesei XynI SEQ ID NO: Γ5 ^ Trichoderma reesei Xyn II SEQ ID NO: 16 o Trichoderma viride Xyn SEQ ID NO: 17 00 o | Perheen 11 ksylanaaseilla on kattava aminohapposekvenssin samankaltaisuus (kuva 5 1). Usean perheen 11 ksylanaasin rakenteelliset tutkimukset osoittavat, että baktee- O) o ri- ja sienialkuperää olevilla perheen 11 ksylanaaseilla on sama yleinen molekyylien rakenne (US-patentti no 5 405 769; Arase et ai, 1993). Lisäksi useilla tähän men- ^ nessä identifioiduilla perheen 11 ksylanaaseilla ilmentyy kolmenlaista sekundääri- rakennetta mukaan lukien beetalevyjä, -käännöksiä ja yksittäinen alfaheliksi.

10

Trichoderma reesei ksylanaasi II -entsyymin heliksi kattaa alueen aminohaposta 151 aminohappoon 162 (Törrönen et ai., 1995).

Ksylanaasi luokitellaan perheen 11 ksylanaasiksi, jos se käsittää aminohappoja, jotka ovat yhteisiä muille perheen 11 ksylanaaseille, mukaan lukien kaksi glutamaatti-5 tähdettä (E), jotka voivat toimia katalyyttisinä tähteinä. Glutamaatti tähteet löydetään pakoista 86 ja 177 [katso kuva 1, perustuu Tr2:n (Trichoderma reesei ksylanaasi II -entsyymi) aminohapponumerointiin].

Useimmat tähän mennessä identifioiduista perheen 11 ksylanaaseista ovat mesofnli-siä ja niillä on pienet molekyylimassat (20 kDa). Tämä perhe sisältää kuitenkin 10 myös ainakin kaksi korkeamman molekyylimassan termostabiilia ksylanaasia, Thermomonospora fusca ksylanaasi A:n (TfX-A), jossa on 296 aminohappoa ja mo-lekyylimassa noin 32 kDa (Irwin et ai., 1994; Wilson et ai., 1994; WO 95/12668) ja Clostridium stercorarium ksylanaasi A:n, jossa on 511 aminohappoa ja molekyyli-massa noin 56 kDa. Clostridium stercorarium ksylanaasi A entsyymillä ilmentyy 15 maksimiaktiivisuus lämpötilassa 70 °C (Sakka et ah, 1993).

Suuret termostabiilit perheen 11 ksylanaasit poikkeavat pienistä mesofiilisistä entsyymeistä entsyymin pidentyneessä C-terminuksessa olevan, hydrofobisen, massaa sitovan domeenin (CBD) suhteen. TfX-A entsyymi koostuu katalyyttisestä, kaikille perheen 11 ksylanaaseille yhteisestä 189 tähteen ydinsekvenssistä, ja 107 tähteen 20 massaa sitovasta domeenista. Suuremmalla C. stercorarium ksylanaasi A:lla on 2 kopiota massaa sitovia domeeneja.

Kohdennettua mutageneesiä on käytetty esillä olevassa keksinnössä synnyttämään mutaatiot ksylanaaseissa, mitkä mutaatiot tekevät entsyymistä termofiilisemmän ja ^ alkalifiilisemmän verrattuna natiiviin entsyymiin. Edullisesti mutanttiksylanaasi on δ 25 sellainen, joka johdetaan perheen 11 ksylanaasista. Edullisemmin esillä olevan kek-

l0 sinnön mutanttiksylanaasi käsittää mutantin Trichoderma reesei ksylanaasi II

o ^ -entsyymin, o ϊε Näin ollen esillä olevan keksinnön piirissä ajatellaan, että ksylanaaseja, mukaan lu-

CL

kien perheen 11 ksylanaasit, esimerkiksi mutta rajoittumatta Trichoderma reesei o 30 -ksylanaasi II, Trichoderma reesei -ksylanaasi I, Trichoderma viride -ksylanaasi, o Streptomyces lividans -ksylanaasi B ja Streptomyces lividans -ksylanaasi C, voidaan o cvi modifioida seuraamalla tässä hahmoteltua yleistä ratkaisumallia ja metodiikkaa.

Termillä ’’termofiilisyys” tarkoitetaan, että ensyymi on aktiivinen tai aktiivisempi korkeammassa lämpötilassa verrattaessa toisen entsyymin aktiivisuuten, kun kaikki 11 muut olosuhteet säilyvät muuttumattomana. Esimerkiksi ksylanaasi 1 :llä on kohonnutta termofiilisyyttä verrattuna ksylanaasi 2:een, jos ksylanaasi 1 kykenee tai on aktiivisempi hydrolysoimaan ksylaania korkeammassa lämpötilassa kuin ksylanaasi 2 identtisissä olosuhteissa käytettäessä samaa substraattia. Koska useimmat ksyla-5 naasit ovat tehokkaita korkeammissa lämpötiloissa hydrolysoidessaan puhdasta ksylaania ennemmin kuin kuitumassaa, pitäisi tehdä vertaava analyysi samaa substraattia käyttäen. Kvantitatiiviset termofiliisyysmitat, joihin tässä viitataan, käyttävät puhdasta ksylaania substraatteina ellei ole toisin osoitettu.

’’Termostabiiliudella” tarkoitetaan entsyymin kykyä olla varastoitavissa tai inkuboi-10 tavissa korkeissa lämpötilaolosuhteissa tyypillisesti substraatin poissa ollessa ja ilmentää sitten aktiivisuutta, kun palautetaan standardimääritysolosuhteisiin. Esimerkiksi ksylanaasi 1 :n sanotaan omaavan kohonnutta termostabiiliutta verrattuna ksylanaasi 2:een, jos ksylanaasi 1 säilyttää suuremman aktiivisuusmäärän kuin ksylanaasi 2 tietyssä lämpötilassa pitämisen jälkeen (tyypillisesti korkeampi lämpötila), 15 esimerkiksi mutta rajoittumatta 70 °C:ssa 24 tunnin ajan, mitä seuraa määritys matalammassa lämpötilassa. Vastakohtana termofiilisyydelle, termostabiilius koskee entsyymiaktiivisuuden jäljelle jäämistä ilman substraattia tapahtuneen inkuboinnin jälkeen.

Näiden kahden termin (termofiilisyys ja termostabiilius) käyttö on ollut tunnetun 20 tekniikan piirissä sekavaa, sillä niitä on vaihdettu keskenään. Tässä määritetyn mukainen termien käyttö on kuitenkin yhdenmukaista termien käytölle alalla (Mathrani jaAhring, 1992).

’’Alkaliftilisyydellä” tarkoitetaan, että entsyymi on aktiivinen tai aktiivisempi korkeammassa pH:ssa verrattaessa toisen entsyymin aktiivisuuten, kun kaikki muut 25 olosuhteet säilyvät muuttumattomana. Esimerkiksi ksylanaasi l:llä on kohonnutta ° alkalifiilisyyttä verrattuna ksylanaasi 2:een, jos ksylanaasi 1 kykenee hydrolysoi- o maan ksylaania korkeammassa pH:ssa kuin ksylanaasi 2. Tyypillisesti alkalifiilisyys i g koskee entsyymin aktiivisuutta ksylaanisubstraatin läsnä ollessa.

X

£ ’’Laajemmalla tehokkaalla pH-alueella” tarkoitetaan, että entsyymi on aktiivinen tai 30 aktiivisempi korkeammassa pH:ssa, matalammassa pH:ssa tai sekä korkeammassa ° että matalammassa pH:ssa verrattaessa toisen ensyymin aktiivisuuteen, kun kaikki

CO

§ muut olosuhteet säilyvät muuttumattomana. Esimerkiksi, jota ei tule pitää rajoitta-

C\J

vana, ksylanaasi l:llä ilmentyy laajempi tehokas pH-alue verrattuna ksylanaasi 2:een, jos ksylanaasi 1 kykenee hydrolysoimaan ksylaania poikki pH:n 5,5 - 8,0 lä 12 hellä optimaalista (80 %) aktiivisuutta, kun taas ksylanaasi 2 voi säilyttää 80 % optimaalisesta aktiivisuudesta vain kapeammalla pH-alueella 5,5 - 7,5.

”TrX-numeroinnilla” tarkoitetaan numerointia, joka liittyy TrX:n aminohapposekvenssiin perustuvaan aminohappojen paikkaan (Xyn II - taulukko 1, Tr2 - kuva 1, 5 sekvenssi no 16). Kuten jäljempänä tuodaan esiin ja mikä on ilmeistä kuvan 1 katsauksesta, perheen 11 ksylanaaseilla esiintyy huomattava määrä sekvenssin samankaltaisuutta. Näin ollen, panemalla aminohapot allekkain ksylanaasientsyymien välisen sekvenssin samankaltaisuuden optimoimiseksi ja käyttämällä TrX:n amino-happonumerointia numeroinnin pohjana, voidaan muiden ksylanaasientsyymien 10 aminohappojen paikat määrittää suhteessa TrX:ään.

’’Ilmentymisteholla” tarkoitetaan soveltuvuutta tai helppoutta, jolla tuottoisäntä tuottaa aktiivista entsyymiä tai entsymaattista aktiivisuutta, ja se tyypillisesti lasketaan aktiivisen entsyymin tai entsymaattisen aktiivisuuden määränä, joka tuotetaan fermentaatioviljelmän yksikkötilavuutta kohti, kun kaikki fermentaatio-olosuhteet 15 säilyvät muuttumattomana. Esimerkiksi, jota ei tule pitää rajoittavana, ksylanaasi 1 :llä on parantunut ilmentymisteho verrattuna ksylanaasi 2:een, jos ksylanaasia tuotetaan 3 kertaa enemmän kuin ksylanaasi 2:ta viljelmän yksikkötilavuudessa saman isännän avulla. Ei-rajoittava esimerkki tällaisesta isännästä on E. coli.

Modifioidulla ksylanaasilla tarkoitetaan ksylanaasimolekyylin muuttamista käyttäen 20 tekniikoita, jotka ovat tunnettuja alan asiantuntijalle. Näitä tekniikoita ovat, mutta rajoittumatta, kohdennettu mutageneesi, kasettimutageneesi, satunnainen muta-geneesi, synteettinen oligonukleotidirakennelma, kloonaus ja muut geneettiset valmistustekniikat.

^ Kuten tässä yksityiskohtaisemmin kuvataan, on valmistettu useita mutanttiksylanaa- o 25 seja, joilla ilmentyy kohonnutta termofiilisyyttä, alkalifiilisyyttä ja termostabiiliutta lo verrattaessa natiiviin ksylanaasiin. Useiden mutanttien lista, jota ei tule pitää rajoit- o ^ tavana millään tavalla, esitetään taulukossa 2.

o | Lisäksi esillä oleva kohdistetaan modifioituun perheen 11 ksylanaasiin, esimerkiksi ^ mutta rajoittumatta ksylanaasiin, joka saadaan Trichoderma .syxstä käsittäen ainakin o 30 yhden substituoidun aminohappotähteen ja joka tunnetaan siitä, että sillä on maksi- o maalinen tehokas lämpötila (MET) välillä noin 69 °C - 84 °C. Edullisesti modifioi- o ^ tu ksylanaasi tunnetaan siitä, että sillä on MET välillä noin 70 °C - 80 °C. Tämä keksintö koskee myös modifioitua ksylanaasia, esimerkiksi mutta rajoittumatta ksylanaasia, joka saadaan Trichodermasta käsittäen ainakin yhden substituoidun ami- 13 nohappotähteen ja joka tunnetaan siitä, että sillä on maksimaalinen tehokas pH (MEP) välillä noin 5,8 - 8,4. Edullisesti MEP on välillä noin 6,0 - 8,0. Tämä keksintö koskee myös modifioitua ksylanaasia, esimerkiksi mutta rajoittumatta ksy-lanaasia, joka saadaan Trichodermasta käsittäen ainakin yhden substituoidun ami-5 nohappotähteen ja joka tunnetaan siitä, että sillä on maksimaalinen tehokas lämpötila (MET) välillä noin 69 °C - 84 °C ja maksimaalinen tehokas pH (MEP) välillä noin 5,8 - 8,4. Edullisesti MET on välillä noin 70 °C - 84 °C ja MEP on välillä noin 6,0 - 8,0.

Ksylanaasin METin ja MEPin määritys voidaan suorittaa seuraavasti: 10 i) mittaa ksylanaasin lämpötilaprofiili, kuten hahmotellaan esimerkissä 3.

Lämpötilat, joille vähintään 80 % optimaalisesta (maksimi) aktiivisuudesta määritetään ja korkein lämpötila on MET; ii) mittaa ksylanaasin pH-profiili, kuten hahmotellaan esimerkissä 4. pH, jolle vähintään 80 % optimaalisesta (maksimi) aktiivisuudesta määritetään ja kor-15 kein pH on MEP.

Arvot voidaan sitten piirtää kuvaajaan, kuten esitetään kuvassa 11.

C\J

δ

CM

ιό o 00 o

X

cc

CL

05

O

δ o o

CM

14

Taulukko 2 Modifioidut ksylanaasit Ksylanaasi Kuvaus

TrX-HML TrX, jossa onNIOH, Y27M jaN29L (katso US-patentti no 5 759 840)

TrX-HML-105R TrX N10H, Y27M, N29L ja L105R

TrX-HML-75A-105R TrX N10H, Y27M, N29L, S75AjaL105R

TrX-HML-75G-105R TrX N10H, Y27M, N29L, S75GjaL105R

TrX-HML-GRAE TrX N10H, Y27M, N29L, S75G, L105R, Q125A ja I129E

TrX-HML-AHAE TrX N1 OH, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A j a 1129E

TrX-HML-AHAE-R TrX N1 OH, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, 1129E j a 144R

TrX-HML-AHAE-RR TrX N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, I129E, 144R ja Q161R

TrX-116G TrX D116G

TrX-118C TrX Y118C

TrX-HML-AHGAE-R TrXNlOH, Y27M,N29L, S75A, L105H, D116G, Q125A, I129E ja H144R

TrX-HML-AHCAE-R TrXNlOH, Y27M,N29L, S75A, L105H, Y118C, Q125A, I129EjaH144R

TrX-H-11D-ML-AHAE-RR TrX N10H, N1 ID, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A ja I129E, H144R

ja Q161R

TrX-H-11D-ML-AHGAE-RR TrX N10H, N11D, Y27M, N29L, S75A, L105H, D116G, Q125A, I129E,

H144Rja Q161R

TrX-H-11D-ML-AHCAE-RR TrX N10H, N11D, Y27M, N29L, S75A, L105H, Y118C, Q125A, I129E,

H144Rja Q161R

cv-- O TrX-H-11D-ML-AHCAE-RR TrX N10H, N11D, Y27M, N29L, S75A, L105H, D116G, Y118C, Q125A, C\1

^ I129E, H144Rja Q161R

O -- 00 o x Substituutio paikassa 11, 116, 118, 144 tai 161 ei merkittävästi muuta ksylanaasi- entsyymin spesifistä aktiivisuutta verrattuna natiivin ksylanaasin aktiivisuuteen S 5 (katso taulukko 4, esimerkki 2-3).

o

CO

o Ksylanaasin llmentymistehon parantaminen C\l

Mutanttiksylanaaseja TrX-H-llD-ML-75A105H-125A129E-144R161R (TrX H 11D-ML-AHAE-RR), TrX-H-11D-ML-75 A105H-116G-125A129E-144R161R

15 (TrX H 11D-ML-AHGAE-RR) ja TrX-H-llD-ML-75A105H-l 18C-125A129E-144R161R (TrX H 11D-ML-AHCAE-RR), joissa kaikissa on mutaatio N11D on johdonmukaisesti ekspressoitu ja ne tuottavat noin 2,5 - noin 4,3 kertaa enemmän proteiinia kuin niiden prekursorit ilman tätä mutaatiota (katso taulukko 5, esimerkki 5 2-4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että tämä mutaatio parantaa ksylanaasien tuot- tosaantoa, tärkeä tekijä missä tahansa tuotossa teollisessa mittakaavassa. Tämä parannus ksylanaasin ilmentymistehossa saavutetaan ilman minkäänlaista laskua ksy-lanaasin termofiilisyydessä ja alkalifiilisyydessä.

Ksylanaasin termofiilisyyden kohottaminen 10 Mutaatio paikassa 144 Argiksi on parantanut mutanttiksylanaasin TrX-HML-75A105H-125A129E-144R (TrX-HML-AHAE-R) entsymaattista aktiivisuutta ksy-laanin hydrolyysissä korkeammissa lämpötiloissa (kuva 3) verrattaessa prekursori-ksylanaasiin TrX-HML-75A105H-125A129E, josta tämä mutaatio puuttuu. Näin ollen esillä oleva keksintö antaa käyttöön natiivin tai modifioidun ksylanaasin käsittä-15 en emäksisen aminohapon, esimerkiksi mutta rajoittumatta Arg:n paikassa 144. Edullisesti natiivilla tai modifioidulla ksylanaasilla, jolla on emäksinen aminohappo paikassa 144, ilmentyy MET välillä noin 69 °C - 84 °C.

Kaksi mutaatiota paikoissa 116 ja 118 vastaavasti Glyksi ja Cysiksi osoittavat myös parantunutta ksylanaasiaktiivisuutta korkeammissa lämpötiloissa. Verrattuna natii-20 viin TrX:ään, yksittäisillä pistemutanteilla TrX-116G ja TrX-118C esiintyy suurempi aktiivisuus korkeammissa lämpötiloissa (kuva 4) lämpötilaoptimilla 55 °C:ssa, verrattuna natiivilla TrX:llä ilmentyvään 50 °C:een.

Sama lisääntyminen termofiilisyydessä näiden kahden mutaation vaikutuksesta (116 ^ ja 118 vastaavasti Glyksi ja Cysiksi) havaitaan myös TrX-HML-75A105H-116G- o 25 125A129E-144R:llä (T rX-HML-AHG AE-R) ja TrX-HML-75A105H-118C- lo 125A129E-144R:llä (TrX-HML-AHCAE-R) verrattaessa prekursoriksylanaasiin 2 T rX-HML-7 5 A105H-125 A129E-144R (T rX-HML-AH AE-R) pH:ssa 5,5 (katso ° kuva 5,116G-mutantti) ja pH:ssa 6,0 (kuvat 6 ja 7).

ir

CL

^ Parannus termofiilisyydessä mutaatioiden vaikutuksesta paikassa 116 pieneksi βίο 30 polaariseksi tähteeksi on odottamatonta, sillä valtaosalla luonnollisista ksylanaaseis- o ta, mukaan lukien termofiiliset ksylanaasit (esimerkiksi Tf, Tl, Cs, kuva 1) on nega- o ....

^ tnvisesti varautuneita aminohappoja, aspartaattia (D, 66 %, kuva 1) ja glutamaattia (E, 10 %, kuva 1) tai polaarinen, varaukseton aminohappo glutamiini (Q, 15 %, kuva 1) tässä paikassa. Yhdelläkään tunnetulla ksylanaasilla ei ole Glytä paikassa 116.

16 Näin ollen esillä oleva keksintö koskee myös natiivia tai modifioitua ksylanaasia käsittäen ei-polaarisen aminohapon, esimerkiksi mutta rajoittumatta Glyn paikassa 116. Edullisesti natiivilla tai modifioidulla ei-polaarisen aminohapon paikassa 116 sisältävällä ksylanaasilla ilmentyy MET välillä noin 69 °C - 84 °C.

5 Mutaatioon paikassa 118 kysteiiniksi perustuva termofiilisyyden parannus on myös odottamatonta, sillä useimmilla ksylanaaseilla, mukaan lukien termofiiliset ksy-lanaasit (Tf, Tl, Cs, kuva 1) on tyrosiini (Y, 60 %, kuva 1) ja tryptofaani (W, 10 %, kuva 1). Ainoat ksylanaasit, joilla on kysteiini paikassa 118 ovat mesofiilisen Aspergillus nigerin, Aspergillus kawakiin ja Aspergillus tubigensiksen joukossa 10 (kuva 1), joiden lämpötilaoptimi on noin 45 - 55 °C (Sunna ja Antranikian, 1997). Näin ollen esillä oleva keksintö koskee myös modifioitua ksylanaasia käsittäen ei-aromaattisen, hydrofobisen aminohapon, esimerkiksi mutta rajoittumatta Cysin paikassa 118, ja natiivia ksylanaasia käsittäen ei-aromaattisen, hydrofobisen aminohapon paikassa 118 edellyttäen, että natiivilla ksylanaasilla on MET välillä noin 69 °C 15 - 84 °C.

Toinen mutaatio paikassa 11 Aspiksi on myös hyväksi ksylaanasin termofiilisyydel-le. Mutantilla TrX-H-llD-ML-75A105H-125A129E-144R161R (TrX-Hl 1D-ML-AHAE-RR) esiintyy suurempi aktiivisuus korkeammissa lämpötiloissa verrattuna prekursoriin TrX-HML-75A105H-125A129E-144 (TrX-HML-AHAE, kuva 8). 20 Tämä tulos on myös odottamaton, sillä Turenen et ai. (2001) raportoi, että sama N1 ID mutaatio alensi lämpötilaoptimeja ja -aluetta TrX-mutantilla, jossa oli mole-kyylinsisäinen disulfidisidos. Lisäksi US-patentti no 5 759 840 tuo esiin, että 11D-mutaatiolla ei ole mitään vaikutusta TrX-H-1 lD-ML:n (mutantti nimeltä NI-TX12) termofnlisyyteen. Näin ollen esillä oleva keksintö koskee myös natiivia tai modifi-25 oitua ksylanaasia käsittäen happaman aminohapon, esimerkiksi mutta rajoittumatta

CM

ς Aspin paikassa 11 edellyttäen, että natiivilla tai modifioidulla ksylanaasilla ilmen- tyy MET välillä noin 69 °C - 84 °C.

LO

o i g Lisäksi edellä identifioidut mutaatiot voidaan yhdistää muodostamaan mutanttiksy- x lanaaseja, joilla on suurempi termofnlisyys jopa korkeammalla pH-alueella. Kol- “ 30 moismutaatioihin N11D/D116G/144R tai N11D/Y118C/144R perustuvilla yhdisti telmämutanttiksylanaaseilla nimittäin TrX-H-llD-ML-75A105H-116G-125A129E- S 144R161R:llä (TrX-Hl 1D-ML-AHGAE-RR) ja TrX-H-llD-ML-75A105H-118C- § 125A129E-144R161R:llä (TrX-Hl 1D-ML-AHCAE-RR) esiintyi maksimaalinen enstymaattinen aktiivisuus korkeammissa 70 - 75 °C:n lämpötiloissa ja edelleen 35 osoittivat merkittävää entsymaattista aktiivisuutta 80 °C:ssa pH:ssa 5,5 (kuva 5, vain 116G-mutantti) ja pH:ssa 6,0 (kuvat 6 ja 7). Nämä tulokset viittaavat siihen, et- 17 tä mutaatioiden Dl 16G tai Y118C vaikutukset N1 lD:n ja H144R:n kanssa mutant-tiksylanaasin termofiilisyyteen ovat täydentäviä. Näin ollen esillä oleva keksintö koskee natiivia tai modifioitua ksylanaasia käsittäen happaman aminohapon paikassa 11, ei-polaarisen aminohapon paikassa 116 ja emäksisen aminohapon paikassa 5 144, esimerkiksi mutta rajoittumatta N11D/D116G/144R:n, tai happaman aminoha pon paikassa 11, ei-aromaattisen hydrofobisen aminohapon paikassa 118 ja emäksisen aminohapon paikassa 114, esimerkiksi mutta rajoittumatta N11D/Y118C/144R:n. Edullisesti natiivilla tai modifioidulla ksylanaasilla, joka käsittää happaman aminohapon paikassa 11, ei-polaarisen aminohapon paikassa 116 ja 10 emäksisen aminohapon paikassa 144, tai ksylanaasilla, joka käsittää happaman aminohapon paikassa 11, ei-aromaattisen hydrofobisen aminohapon paikassa 118 ja emäksisen aminohapon paikassa 114, on MET välillä noin 69 °C - 84 °C.

Lisäksi optimaalisen aktiivisuuden saavuttamiseksi korkeammissa lämpötiloissa, esillä olevaan keksintöön perustuvat mutanttiksylanaasit, esimerkiksi: 15 T rX-H-11D-ML-7 5 A105H-116G-125 A129E-144R161R (TrX-Hl 1D-ML- AHGAE-RR) ja TrX-H-llD-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R (TrX-H11D-ML-AHCAE-RR), (kuvat 5 ja 6) osoittavat myös korkeampaa entsymaattista aktiivisuutta (havainnoitu huomattavampana ksyloosin vapautumisena) lämpötilaoptimeissaan. Sekä TrX-20 Hl lD-ML-AHGAE-RR:llä että TrX-Hl lD-ML-AHCAE-RR:llä esiintyy noin 600 % aktiivisuus lämpötilaoptimeissaan kuin 40 °C:ssa havaittu aktiivisuus. Tämä veti vertoja prekursoriin, modifioituun ksylanaasiin TrX-HML-75A105H-125A129E, jolla esiintyy noin 400 % aktiivisuus lämpötilaoptimissaan verrattuna sen aktiivisuuteen 40 °C:ssa ja luonnolliseen TrX:ään (150 % aktiivisuudestaan op-25 timaalisessa lämpötilassaan verrattuna arvoon 40 °C:ssa).

g Tämä keksintö näin ollen sisältää modifioidun ksylanaasin käsittäen His:n paikoissa ^ 10 ja 105, Met:n paikassa 27, Leu:n paikassa 29, Ala:n paikoissa 75 ja 125, Glu:n 9 paikassa 129 ja ainakin yhden:

OO

o x happaman aminohapon paikoissa 11, 30 pienen, ei-polaarisen aminohapon paikassa 116, g keskikokoisen, ei-aromaattisen, hydrofobisen aminohapon paikassa 118 ja n emäksisen aminohapon paikassa 144.

o

Edullisesti aminohappo paikassa 11 on Asp (D), aminohappo paikassa 116 on Gly (G), aminohappo paikassa 118 on Cys (C) ja aminohappo paikassa 144 valitaan ryh-35 mästä, joka koostuu Lys:stä (L) ja Arg:stä (R).

18

Ksylanaasin alkalifiilisyyden kohottaminen pH-olosuhteiden vaikutus entsymaattiseen aktiivisuuteen mutaation Q161R vaikutuksesta mutanttiksylanaasissa TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R (TrX-HML-AHAE-RR) esitetään kuvassa 9. Verrattiin sen prekursoreihin TrX-HML-5 75A105H-125A129E ja TrX-HML-75A105H-125A129E-144R (ei esitetty). Mu- tanttiksylanaasilla TrX-HML-75A 105H-125A129E-144R161R (TrX-HML-AHAE-RR) on identtinen pH/aktiivisuusprofiili, mutta sillä on kuitenkin suurempi aktiivisuus korkeammilla pH-alueilla noin 6,5 - 8,0. TrX-HML-AHAE-RR:llä on myös matalampi aktiivisuus matalammilla pH-alueilla noin 5,0 - 6,0 verrattaessa prekur-10 soreihin ilman tätä mutaatiota. Näin ollen esillä oleva keksintö koskee natiivia tai modifioitua ksylanaasia käsittäen emäksisen aminohapon, esimerkiksi mutta rajoittumatta Arg:n paikassa 161. Edullisesti natiivilla tai modifioidulla ksylanaasilla, jolla on emäksinen aminohappo paikassa 161, ilmentyy MEP välillä noin 5,8 - 8,4.

Mutaatiot paikoissa 116 ja 118 vastaavasti Glyksi ja Cysiksi parantavat myös ent-15 symaattista aktiivisuutta korkeammilla pH-alueilla. Verrattuna natiiviin TrX:ään, yksittäisillä mutanteilla TrX-116G ja TrX-118C on suurempi aktiivisuus korkeammassa pH:ssa, kuten esitetään kuvassa 10.

Parannus mutaation vaikutuksesta paikoissa 116 pieneksi ei-polaariseksi tähteeksi alkalifiilisyyden parantamiseksi on odottamatonta, sillä yhdelläkään luonnollisella 20 ei ole Glytä paikassa 116. Näin ollen esillä oleva keksintö antaa käyttöön natiivin tai modifioidun ksylanaasin käsittäen ei-polaarisen aminohapon, esimerkiksi mutta rajoittumatta Glyn paikassa 116. Edullisesti natiivilla tai modifioidulla ei-polaarisen aminohapon paikassa 116 sisältävällä ksylanaasilla ilmentyy MEP välillä noin 5,8 - 8,4.

C\J

o 25 Mutaatioon paikassa 118 kysteiiniksi perustuva termofiilisyyden parannus on myös LO odottamatonta, sillä useimmilla ksylanaaseilla, mukaan lukien alkalifiilinen ksy-

O

^ lanaasi (esimerkiksi Tf, Bp, katso kuva 1) on tyrosiini (Y, 60 %, kuva 1) ja trypto- ° faani (W, 10 %, kuva 1). Ainoat ksylanaasit, joilla on kysteiini paikassa 118 ovat £ asidofiilisen Aspergillus nigerm, Aspergillus kawakiin ja Aspergillus tubigensiksen ^ 30 joukossa (kuva 1), joiden pH-optimi on noin 2-4 (Sunna ja Antranikian, 1997; Ki- ? noshita et ai., 1995). Näin ollen esillä oleva keksintö kattaa natiivin tai modifioidun

CO

§ ksylanaasin käsittäen ei-aromaattisen hydrofobisen aminohapon, esimerkiksi mutta C\| rajoittumatta Cysin paikassa 118. Edullisesti natiivilla tai modifioidulla ei-aromaattisen hydrofobisen aminohapon paikassa 118 sisältävällä ksylanaasilla ilmentyy 35 MEP välillä noin 5,8 - 8,4.

19

Mutaatioiden D116G ja Y118C kohottava vaikutus ksylanaasin alkalifiilisyyteen havaitaan myös mutanteilla TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R (TrX-HML-AHGAE-R) ja TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R (TrX-HML-AHCAE-R), (kuva 9) verrattaessa prekursoriksylanaaseihin TrX-HML-75A105H-5 125A129E-144R ja TrX-HML-75A105H-125A129E. Vaikka molemmat mutantit osoittivat korkeampaa aktiivisuutta pH:ssa noin 6,5 - 8,0, vain mutantti TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R (TrX-HML-AHGAE-R) säilyttää olennaisesti optimaalisen aktiivisuuden matalammassa pH:ssa noin 5,0 - 6,0. Tämä korkean aktiivisuuden säilyminen pH:ssa noin 5,0 - 8,0 edustaa optimaalisen pH-alueen laaje-10 nemista tämän paikassa 116 olevan mutaation vaikutuksesta.

Edellä identifioidut mutaatiot on yhdistetty muodostamaan mutanttiksylanaaseja, joilla on suurempi alkalifiilisyys ja termofiilisyys. Nelosmutaatioihin N11D/D116G/H144R/Q161R tai N11D/Y118C/144R/Q161R perustuvilla yhdiste lmämutanttiksylanaaseilla, nimittäin TrX-H-llD-ML-75Al 05H-116G- 15 125A129E-144R161R:llä (TrX-Hl 1D-ML-AHGAE-RR, kuva 9) ja TrX-H-llD- ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R:llä (TrX-Hl 1D-ML-AHCAE-RR, ei esitetty), on lähes maksimaalinen enstymaattinen aktiivisuus pH:ssa noin 5,0 - 7,0 verrattuna niiden prekursoreihin. Lisäksi mutaation D116G läsnäolo auttaa olennaisesti maksimaalisen aktiivisuuden säilyttämistä matalalla pH-alueella noin 5,0 - 6,0 20 välttäen täten prekursorilla TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R (kuva 9) havaitun merkittävän aktiivisuuden menetyksen matalassa pH:ssa. Tämä tulos vahvisti edelleen optimaalisen pH-alueen laajentumista tämän paikassa 116 olevan mutaation vaikutuksesta. Näin ollen esillä oleva keksintö koskee natiivia tai modifioitua ksylanaasia käsittäen happaman aminohapon paikassa 11, ei-polaarisen amino-25 hapon paikassa 116 ja emäksisen aminohapon paikassa 114, esimerkiksi mutta ra-^ johtumatta NllD/D116G/144R:n, tai happaman aminohapon paikassa 11, βίο aromaattisen, hydrofobisen aminohapon paikassa 118 ja emäksisen aminohapon ιό paikassa 114, esimerkiksi mutta rajoittumatta N11D/Y118C/144R:n. Edullisesti na-

O

^ tiivilla tai modifioidulla ksylanaasilla, joka käsittää happaman aminohapon paikassa 30 11, ei-polaarisen aminohapon paikassa 116 ja emäksisen aminohapon paikassa 114 £ tai ksylanaasilla, joka käsittää happaman aminohapon paikassa 11, ei-aromaattisen, ^ hydrofobisen aminohapon paikassa 118 ja emäksisen aminohapon paikassa 144 on ? MEP välillä noin 5,8 - 8,4.

CO

o o ^ Tämä keksintö antaa käyttöön myös modifioidun ksylanaasin käsittäen His:n pai- 35 koissa 10 ja 105, Met:n paikassa 27, Leu:n paikassa 29, Ala:n paikoissa 75 ja 125, Glu:n paikassa 129 ja ainakin yhden: 20 happaman aminohapon paikassa 11, pienen, ei-polaarisen aminohapon paikassa 116, keskikokoisen, ei-aromaattisen, hydrofobisen aminohapon paikassa 118, emäksisen aminohapon paikassa 161.

5 Edullisesti aminohappo paikassa 11 on Asp, aminohappo paikassa 116 on Gly, aminohappo paikassa 118 on Cys, aminohappo paikassa 161 valitaan ryhmästä, joka koostuu Lys:stä ja Arg:stä.

Yhteenvetona parantuneet alkalifiiliset mutantti-TrX-ksylanaasit voidaan rakentaa: i) mutatoimalla Asp 116 pieneksi, ei-polaariseksi tähteeksi, esimerkiksi mutta 10 raj oittumatta Glyksi, ii) mutatoimalla Tyr 118 keskikokoiseksi, ei-aromaattiseksi, hydrofobiseksi tähteeksi, kuten mutta rajoittumatta Cysiksi, iii) mutatoimalla Gin 161 emäksiseksi aminohapoksi Arg tai Lys, iv) yhdistämällä i):ssä kuvatut mutaatiot ii):ssä - iii):ssä kuvattuihin termofiili- 15 syyden j a alkalifiilisyyden parantamiseksi, tai v) yhdistämällä edellä i):ssä - iv):ssä kuvatut mutaatiot HML-sarjan mutaatioihin, kuten kuvataan edellä (katso US-patentti no 5 759 840, johon tässä viitataan HML-mutaatioiden osalta).

Edellä olevaa kuvausta ei ole tarkoitettu rajoittamaan vaatimusten kohteena olevaa 20 keksintöä millään tavalla, lisäksi käsitelty ominaisuusyhdistelmä ei ehkä ole täysin välttämätön kekseliäälle ratkaisumallille.

C\J

c3 Esimerkit i tn o ^ Esillä olevaa keksintöä havainnollistetaan lisää seuraavissa esimerkeissä. Tulee kui- ° tenkin ymmärtää, että nämä esimerkit ovat vain havainnollistaviin tarkoituksiin eikä £ 25 niitä tulisi käyttää rajoittamaan esillä olevan keksinnön ulottuvuutta millään tavalla.

o Esimerkki 1: Trichoderma reesei mutanttiksylanaasien rakentaminen cö o ° Perusrekombinantti-DNA-menetelmiä, kuten plasmidivalmistelu, restriktioentsyy- mipilkkominen, polymeraasiketjureaktio, oligonukleotidifosforylaatio, ligaatio, transformaatio ja DNA-hydridisaatio suoritettiin alan asiantuntijoille tuttujen, hyvin 30 vakiintuneiden menettelytapojen (esim. Sung et ah, 1986) tai entsyymien tai kitin 21 valmistajan suositusten mukaisesti. Puskurit useille entsyymeille on toimitettu osana kittiä tai valmistettu valmistajan ohjeiden mukaisesti. Restriktioentsyymit, T4-polynukleotidikinaasi ja T4-DNA-ligaasi hankittiin New England Biolabs Ltd:Itä (Mississauga, Ont). GeneAmp PCR-reagenssikitti hankittiin Perkin-Elmeriltä. Pre-5 kursoriplasmidi pXYbc, joka on pUC-tyypin plasmidi, jossa on insertoituna Bacillus circulans ksylanaasigeeni, on valmistettu aiemmin ja julkaistu (Sung et ai., 1993; Campbell et ai., US-patentti no 5 405 769). Tavallisesti käytettyä E. coli kantaa HB 101 (Clonetech Lab, Palo Alto, CA) käytettiin transformaatio- ja ekspressio-isäntänä kaikille geenikonstrukteille. Koivupuuksylanaasi ja Remazol Brilliant Blue 10 R-D-Xylan hankittiin Sigmalta (St. Louis, Mo). Hydroksibentsoehappohydratsidi (HBAH) hankittiin Aldrichilta. Oligonukleotidit valmistettiin APPLIED BIO-SYSTEM DNA-syntetisaattorilla (malli 380B). Kaikki ksylanaasin entsymaattiset määritykset suoritettiin kannellisessa kiertovesihauteessa (Haake tyyppi F 4391) ja ylläpidettiin lämpötila-alueella ± 0,1 °C.

15 1-1: Prekursoriplasmidin pTrX rakentaminen, jossa plasmidissa on synteetti nen TrX (sekvenssi no 39)

Prekursoriplasmidi pTrX jäljempänä esiin tuotaville mutaatioille on julkaistu aiemmin (Sung et ai., 1995). Tämä plasmidi johdetaan pUCl 19-plasmidista, jossa on synteettinen Trichoderma reesei -ksylanaasia koodaava nukleotidisekvenssi (TrX 20 kuva 2). Tämän ksylanaasin ja muiden myöhemmin kuvattujen mutanttiksylanaa-sien ilmentyminen on pUC-plasmidin IacZ-promoottorin kontrolloimaa. Trichoderma ksylanaasigeenin kokonaiskokoonpano vaati kaksi vaihetta, aluksi aluetta (92 - 190, Tr2 numerointi) varten, jota seurasi alue (1 - 92, Tr2 numerointi). Menettelytapa tämän geenin rakentamiselle on rutiininomainen ja identtinen useiden 25 muiden geenien standardille julkaistulle menettelytavalle. Menettelytapa vaatii ksy-

CM

^ lanaasia koodavien, päällekkäin menevien synteettisten oligonukleotidien entsy- ^ maahisen fosforyloinnin. Tätä seuraa niiden ligatointi sopivasti katkaistuun plasmi- 9 diin.

00 o x TrX(92 - 190):n rakentamiseksi suunniteltiin kymmenen päällekkäin menevää oli- 30 gonukleotidia (katso kuva 2), o XyTv-101, sekvenssi no 29, o XyTv-102, sekvenssi no 30, o ^ Trx-103, sekvenssi no 31,

XyTv-104, sekvenssi no 32, 35 XyTv-105, sekvenssi no 33, 22

XyTv-106, sekvenssi no 38,

XyTv-107, sekvenssi no 37,

Trx-108, sekvenssi no 36,

XyTv-109, sekvenssi no 35 ja 5 XyTv-110, sekvenssi no 34 joissa on kodoninkäyttötaajuus, joka jäljittelee E. colin vastaavaa. Kahden terminaalisen oligonukleotidin Sali- ja Bglll-koheesiopäät mahdollistivat kymmenen fragmentin entsymaattisen ligaation linearisoituun plasmidiin pXYbc. Trichoderma ksy-lanaasin TrX(92 - 190) aluetta koodaavat kymmenen oligonukleotidia (50 pmol, 1 10 μΐ kutakin) fosforyloitiin seoksessa, joka sisälsi 10X standardikinaasipuskuria (0,4 μΐ), 1 mM ATP:tä (4 μΐ), T4-DNA-kinaasia (5 yksikköä) ja vettä (3 μΐ). Fosforylaa-tioreaktiot suoritettiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sitten liuokset yhdistettiin ja kuumennettiin 70 °C:een 10 minuutin kuluessa. Sen jälkeen, kun oli jäähdytetty hitaasti huoneenlämpöön, yhdistetyt liuokset lisättiin 4 mM ATP:n (3,5 μΐ), EcoRI-Hindlll-15 linearisoidun plasmidin pUC119 (0,1 pmol) ja T4-DNA-ligaasin (3,5 μΐ) seokseen ja inkuboitiin 12 °C:ssa 20 tunnin ajan. Ligaatioseoksen alikvootteja käytettiin E. coli HB101:n transformoimiseksi YT-maljoilla (8 g hiivauutetta, 5 g bacto-trypto-nia, 5 g NaCka, 15 g agaria 1 l:ssa vettä), jotka sisälsivät ampisilliinia (100 mg/1).

Hybridisaatiokoettimien valmistamiseen yksi oligonukleotideista, esimerkiksi 20 XyTv-110 (10 pmol, 1 μΐ) fosforyloitiin 32P-ATP:llä (10 pmol, 3 μΐ) käyttäen T4-DNA-kinaasia (1 μΐ), 10X kinaasipuskuria (1 μΐ) ja vettä (4 μΐ) 37 °C:ssa tunnin ajan.

Transformantit valikoitiin satunnaisesti hybridisaatioanalyysiin. Pesäkkeitä kasvatettiin ampisilliinia sisältävillä YT-maljoilla yön yli ja siirrettiin nailonkalvoille. Sit-^ 25 ten ne denaturoitiin 0,5 N NaOH - 1,5 M NaCklla (10 min) ja neutralisoitiin 0,5 N

c3 Tris-HCl (pH 7,0) - 1,5 M NaCklla (10 min). Ultraviolettisäteilytyksen jälkeen 254 i o nm:ssä 8 minuutin ajan, kalvoja pestiin 6X SSC - 0,05 % Triton X-100:lla 30 mi- i g nuutin ajan. Solujätteet rapattiin pois täydellisesti. Toisen 30 minuutin jälkeen tuo- x reessä liuoksessa, duplikaattikalvot siirrettiin yksittäin erillisiin seoksiin 6X SSC - 30 1 % dekstraanisulfaatti - 0,05 % Triton X-100 - IX Denhardtin hybridisaationestet- o) tä. P-leimattu koetin lisättiin kalvolle. 16 tunnin jälkeen 45 °C:ssa, kalvoa pestiin & kahdesti 6X SSC - 0,05 % Triton X-100:lla huoneenlämmössä 5 minuutin ajan ja

O

° sitten 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. Positiivisesti hybridisoituneet kloonit, joissa oli välissä oleva plasmidi pBcX-TrX, identifioitiin autoradiografia-analyysillä.

23

Edellä olevaa menettelytapaa, joka käsittää synteettisten päällekkäin menevien oli-gonukleotidien entsymaattisen fosforyloinnin ja ligaation linearisoituun plasmidiin, käytettiin TrX(l -92) alueen kokoonpanossa ja kasettimutageneesissä tässä keksinnössä kuvattujen muiden mutanttiksylanaasien myöhemmälle muodostukselle.

5 TrX(l - 92, Tr2 numerointi) alueen kokoonpanoa varten kokopitkän Trichoderma reesei -ksylanaasi II geenin (TrX) täydentämiseksi, välissä oleva plasmidi pBcX-TrX linearisoitiin Nhel- ja Kpnl-endonukleaaseilla DNA-insertin vapauttamiseksi BcX(l - 83):lle. Nhel:n ja Kpnl:n koheesiopäillä ligatoitiin kahdeksan Trx(l - 91)-sekvenssiä koodaavaa, päällekkäin menevää oligonukleotidia 10 TrX-1, sekvenssi no 21,

XyTv-2, sekvenssi no 22,

TrX-3, sekvenssi no 23,

XyTv-4, sekvenssi no 24,

XyTv-5, sekvenssi no 28, 15 TrX-6, sekvenssi no 27,

XyTv-7, sekvenssi no 26 ja TrX-8, sekvenssi no 25 linearisoituun plasmidiin pBcX-TrX (kuva 2) edellä kuvatun menettelytavan kautta. Uudessa plasmidissa pTrX oli siten synteettinen TrX-geeni (sekvenssi no 39).

20 Kaikki edellä kuvatut mutanttiksylanaasigeenit on rakennettu kasettimutageneesi-menetelmän kautta. Menettelytapa kasettimutageneesille oli identtinen edellä kuvattuun geenikokoonpanokuvaukseen nähden. Yleisesti kasettimutageneesi käsitti (i) päällekkäin menevien synteettisten oligonukleotidien entsymaattisen fosforyloinnin, ^ (ii) synteettisten oligonukleotidien ligatoinnin linearisoidun plasmidin kanssa, (iii) o 25 plasmidin transformaation E. coli HB 101 kompetentteihin soluihin, (iv) mutantti- iö transformattien identifioinnin hydridisaation välityksellä leimatulla oligonukleoti- o ^ dillaja (v) mutaation varmentamisen dideoksinukleotidisekvensoinnilla.

o | 1-2: Prekursoriplasmidin pTrX-HML rakentaminen o Tämän prekursoriplasmidin pTrX-HML rakentaminen on kuvattu yksityisiä 30 kohtaisesti US-patentissa no 5 759 840 (katso esimerkki IN, johon tässä viitataan, o ^ plasmidi nimeltä pNI-TX13). TrX-HML käsittää natiivin TrX-ksylanaasin yhdessä kolmen mutaation N10H (Asn paikassa 10 vaihdetaan Hisiksi), Y27M ja N29L kanssa. Sekvenssin ensimmäiset kolmekymmentä aminohappoa käsittäen N10H:n, Y27M:n ja N29L:n esitetään jäljempänä.

24

TrX 12345678 aminohappo qtiqfgto 5'~CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA AGA ÄTÄ CAA CCA GGA ACC GGT 3 * -G ATT CCT CC GAC GTC TÄC GTT TGT TAT GTT GGT CCT TGG CCA «hei PinAl 9 10 11 12 13 24 IS 16 1? 28 19 20 21 22 23 24

Y H N G Y F Y S Y »4 K D G H G G

TAC CAC AÄC GGT TÄC TTT TAC AGC TAT TGG ÄÄC GAT GGC CAT GGA GGC

ATG GTG TTG CCA ATG AAA ATG TCG ATA ACC TTG CCA CCG GTA CCT CCG

25 26 27 28 29 30

V T H T h G

GTC ACA ATG ACT CTG GGG

CAG TGT TAC TGÄ GAC CCC

1-3: Deleetioplasmidin pTrX-HML-(l - 113) rakentaminen

Plasmidi pTrX-HML-(l - 113) käsittää TrX:n (sekvenssi no 39) aminohapposek-5 venssin 1-113 eikä pysty ekspressoimaan aktiivista ksylanaasia. Tällaiset trans-formantit varmennetaan kirkastusvyöhykkeen tai kehän puuttumisena transformant-tipesäkkeiden ympäriltä sinisillä ksylaanimaljoilla.

Uusi plasmidi rakennettiin (i) poistamalla TrX(l 14 - 190):ää koodaavapTrX-HML- sekvenssi leikkaamalla restriktioentsyymeillä BamHI ja Bglll, (ii) ligatoimalla 10 identtiset koheesiopäät linearisoituun plasmidiin, (iii) transformoimalla E. coli HB 101 kompetentteihin soluihin, jota seurasi maljaus YT-maljoille (sisältäen 5 g cvi hiivauutetta, 3 g bacto-tryptonia, 5 g NaCl:a, 15 g agaria 1 l:ssa vettä, 1 g Remazol ^ Brilliant Blue R-D-ksylaania ja ampisilliinia 100 mg/1), (iv) identifioimalla mutant- g titransformantit ksylanaasiaktiivisuuden menetyksen välityksellä (kirkastusvyöhyk- oö 15 keen tai kehän puuttuminen pesäkkeiden ympäriltä sinisillä ksylaanimaljoilla yön o x yli 40 °C:ssa) ja (v) varmentamalla mutaatio dideoksinukleotidisekvensoiimilla.

CC

Menettelytapa kullekin näistä vaiheista oli samanlainen kuin edellä kuvatulle geeni- ^ kokoonpanolle, o o 1-4: Plasmidin pTrX-HML-105R rakentaminen

CVJ

20 Mutanttiksylanaasi pTrX-HML-105R on samanlainen kuin TrX-HML paitsi, että

Leu paikassa 105 korvataan Argilla (L105R).

25 PCR:ää käytettiin L105R mutaation sisältävän, (100 - 190) aluetta koodaavan DNA-fragmentin muodostamiseksi. Mutaation sisältävät PCR-alukkeet (lihavoituna) pTrX-HML-105R rakentamisessa esitetään jäljempänä: TX-105R-1 CSEQ ID BO:44) 100 101 102 1Q3 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

T S A T K R G E V T S D G S

5' -AGC GGC GCC AGA AAÄ AGA GGC SAA GTC ACT AGT GAT GGÄ TCC

Kasi Västakkais-PCR-aluke TX-C1 käsitti: TX-C1 {SEQ ID NO:42}

183 184 185 186 187 188 189 190 ter GSASITVS

CCA AGG CGÄ TCA TAA TGT GAG TCG ATT TCT AGA ÄGT TCG AAC CC-5'

Sgll HindiII

5 Sopiva PCR-templaatti ja -alukkeet sekä restriktioentsyymit PCR-tuotteiden pään leikkaamiseksi listataan jäljempänä (taulukko 3-1).

Taulukko 3-1 PCR-tuote PCR-ylävirta- PCR- PCR- Restriktioentsyymit aluke vastakkaisaluke templaatti PCR-tuotteelle (a) TX-105R-1 TX-C1 pTrX Kasl/Hindlll

Leikattu PCR-tuote (a) (taulukko 3-1) ligatoitiin KasI/Hindlll-linearisoituun plasty 10 midiinpTrX-HML-(l - 113) plamidin pTrX-HML-105R muodostamiseksi, δ cv 1-5: Plasmidien pTrX-HML-75A105R ja pTrX-HML-75G105R rakentaminen o o Ksylanaasimutantit TrX-HML-75A-105R ja TrX-HML-75G-105R ovat samanlaisia g kuin TrX-HML-105R poikkeuksella, että niissä on vastaavasti yksittäinen lisämu- _ taatio S75A tai S75G.

'T

CD

O

n 15 Mutaation S75A (TX-75A-1, sekvenssi no 40) ja S75G (TX75-G-1, sekvenssi no o o 46) sisältävät PCR-alukkeet esitetään jäljempänä.

26 TX-75A-1 {SEQ ID NO:40} 69 70 ?1 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81

NGN S Y L A V Y G W S R

B'-T GGG AAT TCÄ TAC TTA GCC GTC TAT GGC TGG TCT AG

ScoRX

TX-75G-1 (SEQ ID NO:46} 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81

NGN SYLGVYGWS R 5' -T GGG ART TCA TAG TTA GGC GTC TAT GGC TGG TCT AG ECORI

Sopiva PCR-templaatti ja -alukkeet sekä restriktioentsyymit PCR-tuotteiden pään leikkaamiseksi listataan jäljempänä (taulukko 3-2).

Taulukko 3-2 PCR-tuote PCR-ylävirta- PCR- PCR- Restriktioentsyymit aluke vastakkaisaluke templaatti PCR-tuotteelle (b) TX-75A-1 TX-C1 pTrX-HML- EcoRI/Hindlll

105R

(c) TX-75G-1 TX-C1 pTrX-HML- EcoRI/Hindlll

105R

5

EcoRI/Hindlll-leikatut PCR-tuotteet (b) ja (c) (katso taulukko 3-2) valmistettiin ja ligatoitiin EcoRI/Hindlll-linearisoituun pTrX-HML(l - 113) plasmidiin vastaavasti £! plasmidien pTrX-HML-75A-105R ja pTrX-HML-75G-105R muodostamiseksi, o

(M

iö 1-6: Plasmidin pTrX-HML-75G105R-125A129E rakentaminen i o 10 Mutantti TrX-HML-75G-105R-125A129E oli identtinen TrX-HML-75G-105R:lle | poikkeuksella, että siinä on lisämutaatiot Q125A ja I129E.

'sf g Kokonainen mutanttiksylanaasigeeni kasattiin kahden, 1 - 121 ja 122 - 190 alueita g koodaavien DNA-sekvenssien ligatoinnin kautta. 1-121 aluetta koodaava DNA- cm sekvenssi eristettiin deletoimalla plasmidi pTrX-HML-75G-105R restriktionukleaa- 15 seilla, jotka listataan jäljempänä (taulukko 3-3).

27

Taulukko 3-3

Deleetiosekvenssi Prekursoriplasmidi Restriktioentsyymit

(A) pTrX-HML-75G-105R Nhel/MluI

122 - 190 aluetta koodaava DNA-sekvenssi oli PCR-tuote (d) alukkeilla, jotka koo-daavat mutaatiota, kuten jäljempänä esitetään.

TX-125AX29E-1 {SEQ ID NO:49)

120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 QRVNAPSIEGTAT 5' -C CM CGC <3Τ*Γ AAT GCG CCA TCG ATC GAG GGA ACC GCC ACC

MluI

5

Sopiva PCR-templaatti ja -alukkeet sekä restriktioentsyymit PCR-tuotteen pään leikkaamiseksi listataan jäljempänä (taulukko 3-4).

Taulukko 3-4 PCR-tuote PCR-ylävirta- PCR- PCR- Restriktioentsyymit aluke vastakkaisaluke templaatti PCR-tuotteelle (d) TX-125A129E-1 TX-C1 pTrX Mlul/Hindlll 10 Leikattu PCR-tuote (d) ja deleetiosekvenssi (A) ligatoitiin Nhel/Hindlll-lineari-soituun plasmidiin pTrX-(l - 113) plasmidin pTrX-HML-75G-105R-125A129E muodostamiseksi.

δ

<M

uS 1-7: Plasmidin pTrX-HML-75A105H-125A129E rakentaminen o o Kokonainen mutanttigeeni kasattiin kahden, 1 - 101 ja 102 - 190 alueita koodaavan | 15 DNA-sekvenssin ligatoinnin kautta.

S 1-101 aluetta koodaavan DNA-sekvenssin valmistusta varten restriktionukleaasit o n sopivan plasmidin deletoimiseksi listataan jäljempänä (taulukko 3-5).

o o 0X1 Taulukko 3-5

Deleetiosekvenssi Prekursoriplasmidi Restriktioentsyymit 28

(B) pTrX-HML-75 A-105R Nhel/KasI

102 - 190 aluetta koodaavan DNA-sekvenssin valmistamista varten käytettiin polymeraasiketjureaktiota alukkeella TX-105H-1.

TX-105H-1 {SEQ ID NO;41) 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 TGÄTKHGEVT sdgs 5'-ACC GGC GCC ACA AAA CAC GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCC Kasi 5 Sopivat PCR-alukkeet mutaatioilla paikassa 105 sekä restriktioentsyymit PCR-tuotteen pään leikkaamiseksi listataan jäljempänä (taulukko 3-6).

Taulukko 3-6: Plasmidi pTrX-HML-75G-105R-125A129E PCR-templaattina PCR-tuote PCR-ylävirta- PCR- Restriktioentsyymit aluke vastakkaisaluke PCR-tuotteelle (e) TX-105H-1 TX-C1 Kasl/Hindlll

Leikattu PCR-tuote (e) ja deleetiosekvenssi (B) ligatoitiin Nhel/Hindlll-10 linearisoituun plasmidiin pTrX-(l - 113) plasmidin pTrX-HML-75A-105H-125A129E muodostamiseksi.

1-8: Deleetioplasmidin pTrX-del(43 - 53) rakentaminen cm Deletoidun (43 - 53) alueen sisältävää inaktiivista ksylaanasia koodaava plasmidi £3 pTrX-del(43 - 53) rakennettiin plasmidin pTrX restriktioleikkauksella BspEI-koh- g 15 dasta tähteestä 43 ja Xmal-kohdasta tähteestä 53 ja antamalla identtisten päiden li- rö gatoitua itsekseen. Transformaation jälkeen oikeat kloonit identifioitiin ksylanaasin o ekspressoitumattomuutena tai kehän tai kirkastusvyöhykkeen puutteena sinisillä ^ ksylaania sisältävillä YT-maljoilla.

o 1-9: Deleetioplasmidien pTrX-del(123 - 144) ja pTrX-HML-75A105H-del(123 o 20 -144) rakentaminen C\l

Osittain deletoidun ksylanaasigeenin sisältävät kaksi plasmidia rakennettiin PCR-reaktiolla uusilla alukkeilla, jotka koodaavat (123 - 144) alueen deleetiota.

PCR-oligonukleotidialukkeet: 29 TX-del<123-144)-lr (SEQ ID NO:43} 148 147 146 145 122 121 120 119 118 117 116 115

G S S R R Q T R Y I D Y

5' -C GGA GCT CCG AC GCG TTG GGT ACG GTA GAT ATC ATA

Sad Mlul ΪΧ-Ν1 {SEQ ID NO:45) 1 2 3 4 5 6 7

Q ? I Q P G T

S’-CTAGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA A

Nhel PstI

Taulukko 3-7: PCR-templaatti TX-del(123 - 144)-lr:n ja TX-Nl:n ollessa aluk-keena PCR-tuote PCR-templaatti Restriktioentsyymit PCR- _tuotteelle_ _(f)_pTrX_Pstl/SacI_ (g)_PTrX-HML-75 A105H-125 A129E Pstl/SacI_ 5

Leikattujen PCR-fragmenttien (f) ja (g) ligaatio Pstl/SacI-linearisoituun plasmidiin pTrX ja transformaatio oikeiden kloonien tuottamiseksi, joissa on vastaavasti plas-midit pTrX-del(123 - 144) ja pTrX-HML-75A105H-del(123 - 144), jotka identifioi oitiin ksylanaasin ekspressoitumattomuutena tai kehän tai kirkastusvyöhykkeen ^ 10 puutteena sinisillä ksylaania sisältävillä YT-malj oilla.

tn o g 1-10: Plasmidin pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R rakentaminen £ Uusi mutantti pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R poikkeaa prekursorista ^ pTrX-HML-75A105H-125A129E lisämutaatiolla H144R. Uutta PCR-käänteisalu- σ> ° kettä käytettiin tämän mutaation luomiseksi.

CO

o o

(M

30 TX~144R~lr |SEQ SO:47} 159 158 157 156 155 154 153 152 151 150 149 14? 147 146 145 144 143 142

W A W F H « A T U V S G $ S R & $ R

5' -CCA TGC ATT AAA GIG ATI CGC AGT ATT AAC CGÄ ACC GGA GCT CCS ÄGG ATT ACG

Hsil

141 140 139 138 R V S W TCT AAC ACT CCA

Sopiva PCR-templaatti ja -alukkeet sekä restriktioentsyymit PCR-tuotteen pään leikkaamiseksi, joka PCR-tuote on 1 - 146 sekvenssi, listataan jäljempänä (taulukko 3-8).

5 Taulukko 3-8 PCR-tuote Ylävirta- Alavirta-aluke Templaatti Restriktio- _aluke_leikkaus_ (h) TX-N1 TX-144R-lr pTrX-HML-75A105H- Pstl/Nsil _125A129E_

Pstl/Nsil-leikattu PCR-fragmentti (h) ligatoitiin Pstl/Nsil-linearisoituun plasmidiin pTrX-del(43 - 53) toimivan ksylanaasigeenin palauttamiseksi ennalleen uudessa plasmidissa pTrX-HML-75 A-105H-125 A-129E-144R.

10 1-11: Plasmidin pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R rakentaminen 2 Uusi mutantti pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R poikkeaa prekursorista <3 pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R lisämutaatiolla Q161R. Uutta PCR-kään- o teisaluketta käytettiin tämän mutaation luomiseksi, oo ° TX-XSlR-Xr (SSQ 10 RO: 48) | 168 167 166 165 164 163 162 161 160 159 158 157 156 155 154

^ TGLT LGQR A&ASFHN

05

2 5' -GT ÄCC TAG GGT TÄÄ CCG TTG CCG TGC CGÄ TGC ATT AAA GTG ATT

cö

o ÄvrII

cv 15 TrX(l - 165) aluetta koodaava PCR-tuote valmistettiin, kuten kuvataan taulukossa 3-9.

31

Taulukko 3-9: Plasmidi pTrX-HML-75A-105H-125A129E-144R PCR-temp-laattina.

PCR-tuote PCR-ylävirta- PCR- Restriktioentsyymit aluke vastakkaisaluke PCR-tuotteelle

(i) TX-N1 TX-161R-lr Pstl/AvrII

Pstl/AvrII-leikattu PCR-tuote (i) ligatoitiin Pstl/AvrII-linearisoituun plasmidiin 5 pTrX-del(43 53) toimivan ksylanaasigeenin palauttamiseksi ennalleen uudessa plasmidissa pT rX-HML-7 5 A-105H-125 A-129E-144R161R.

1-12: Plasmidien pTrX-116G ja pTrX-118C rakentaminen

Kaksi uutta mutanttia ovat identtisiä TrX:lle pääasiallisella poikkeuksella lisämutaa-tion muodossa, siis Asp-116 Glyksi (Dl 16G) tai Tyr-118 Cysiksi (Y118C).

10 Valmistettiin kaksi PCR-aluketta mutaatiolla (lihavoituna).

TX-116G-1 (SEQ ID NO:50}

111 112 113 114 115 116 117 118 119 DGSVYGIYR 5' ~GAC GGÄ TCC GTA TAT GGT ATC TAC CG BamHI

TX-118C-1 (SEQ ID NO:51}

111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 BGSVYDICR. TQR ™ 5'-GAC GGÄ TCC GTA TAT GAT ATC TGC CGT ACC CAA CSC

cm BaiöHI

LO

cp 02 Seuraavaa plasmiditemplaattia ja alukkeita tarvitaan kahteen PCR:ään: o | Taulukko 3-10: PCR plasmidin pTrX ollessa templaattina g PCR-tuote PCR-ylävirta- PCR- Restriktio-leikkaukset g _aluke_vastakkaisaluke_ ° ^j)_TX-116G-1 TX-C1_BamHI/Hindlll_ ^k)_TX-118C-1 TX-C1_BamHI/Hindlll_ 32

Leikattujen PCR-tuotteiden (j) ja (k) ligatointi BamHI/Hindlll-linearisoituun plas-midiin pTrX-del(123 - 144) palautti toimivan ksylanaasigeenin ennalleen transfor-manteissa, joissa oli vastaavat plasmidit pTrX-116G ja pTrX-118C.

1-13: Plasmidien pTrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R ja pTrX-HML-5 75A105H-118C-125A129E-144R rakentaminen

Kaksi uutta mutanttia olivat identtisiä prekursorille TrX-HML-75A105H-125A129E-144R pääasiallisella poikkeuksella lisämutaation muodossa, siis Asp-116 Glyksi (Dl 16G) tai Tyr-118 Cysiksi (Y118C).

Seuraavaa plasmiditemplaattia ja alukkeita tarvitaan kahteen PCR:ään: 10 Taulukko 3-11: PCR plasmidin pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R ollessa templaattina PCR-tuote PCR-ylävirta- PCR- Restriktio-leikkaukset _aluke_vastakkaisaluke_ Q_TX-116G-1 TX-C1_BamHI/Hindlll_ (m)_TX-118C-1 TX-C1_BamHI/Hindlll_

Leikattujen PCR-tuotteiden (1) ja (m) ligatointi BamHI/Hindlll-linearisoituun plas-midiin pTrX-HML-75A105H-del(123 - 144) palautti toimivan ksylanaasigeenin 15 ennalleen transformanteissa, joissa oli vastaavat plasmidit pTrX-HML-75 A105H-116G-125A129E-144R ja pTrX-HML-75A105H-l 18C-125A129E-144R.

1-14: Plasmidien pTrX-H-llD-ML-75A105H-125A129E-144R161R, pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R ja pTrX-H-llD-ML-75A105H- ^ 118C-125A129E-144R161R rakentaminen o

(M

g 20 Uudet mutantit TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R, TrX-H-llD- ώ ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R ja TrX-H-11D-ML-75AI05H-118C- χ 125A129E-144R161R ovat identtisiä niiden vastaaville prekursoreille TrX-HML- £ 75A105H-125A129E-144R, TrX-HML-75A105H-l 16G-125A129E-144R ja TrX- HML-75A105H-118C-125A129E-144R pääasiallisella poikkeuksella lisämutaa-^ 25 tioiden muodossa, siis Asn-11 Aspiksi (N11D) ja Gln-161 Argiksi (Q161R). Val- o mistettiin uudet PCR-alukkeet mutaatiolla N11D (lihavoituna).

33 TX-lOHllD-1 {SEQ NO:52) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

GTGYHDGYFYSYW 5' -GGA ACC GGT TAC CAC GAC GGT TAG TTT TAC AGC TAT TGG Age I

Taulukko 3-13 PCR- Ylävirta-aluke Alavirta-aluke Templaatti Restriktio- tuote_leikkaus_

(n) TX-10H11D-1 TX-161R-lr pTrX-HML-75A105H- Agel/AvrII

_125A129E-144R_ (o) TX-10H1 ID-1 TX-161R-lr pTrX-HML-75A105H- AgeLAvrll _116G-125 A129E-144R_

(p) TX-10H1 ID-1 TX-161R-lr pTrX-HML-75A105H- Agel/AvrII

_118C-125 A129E-144R_

Leikattujen PCR-tuotteiden (n), (o) ja (p) ligatointi Agel/AvrII-leikattuun plasmi-5 diin pTrX-del(43 - 53) palautti toimivan ksylanaasigeenin ennalleen transforman-tissa, jossa oli vastaavasti uudet plasmidit pTrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R, pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R ja pTrX-H-11D-ML-75 A105H-118C-125 A129E-144R161R.

1-15: Deleetioplasmidin pTrX-H-1 lD-ML-75A105H-116G-del(123 - 144) ra-10 kentaminen

Osittain deletoidun ksylanaasigeenin sisältävä plasmidi valmistettiin PCR-reaktiolla uudella alukkeella, joka koodaa (123 - 144) alueen deleetiota menettelytavalla, joka ^ on identtinen esimerkeille 1-9.

i tn o οό Taulukko 3-14: PCR-templaatti TX-del(123 - 144)-lr:llä ja TX-N1 alukkeena | PCR-tuote PCR-templaatti Restriktioentsyymit ^ _PCR-tuotteelle_ | (q) pTrX-H-11 D-ML-75 A105H-116G- Pstl/Sacl § _125A129E-144R161R_ w 15

Leikatun PCR-tuotteen ligatointi Pstl/SacI-linearisoituun plasmidiin pTrX ja transformaatio oikeiden kloonien tuottamiseksi, joissa on vastaavasti deleetioplasmidi 34 pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-del(123 - 144), jotka kloonit identifioitiin ksyla-naasin ekspressoitumattomuutena tai kehän tai kirkastusvyöhykkeen puutteena sinisillä ksylaania sisältävillä YT-maljoilla.

1-16: Plasmidin pTrX-H-llD-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R 5 rakentaminen

Uusi mutantti TrX-H-llD-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R oli identtinen prekursoreilleen TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R j a pTrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R yhdistelmämutaation erolla Tyr-118 Cysiksi (Y118C) ja Asp-116 Glyksi (D116G). Valmistettiin uudet 10 PCR-alukkeet yhdistelmämutaatio 11a Dll 6G/Y118C (lihavoituna).

TX-1X6G118C-1 (SEQ ID NO:53) m 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122

D G S V ¥ G I CRT Q R

5' -GAC GGA TCC GTA TÄT GGT ÄTC TGC CGT ACC CAA CGC

BamHI

Taulukko 3-15: PCR yhdistelmämutaation sisältävän (112 - 167) fragmentin luomiseksi PCR- Ylävirta-aluke Alavirta-aluke Templaatti Restriktio- tuote_leikkaus_ (r) TX-116G118C-1 TX-161R-lr pTrX-HML-75A105H- BamHLAvrll _125A129E-144R_ 15 Leikattujen PCR-tuotteiden (r) ligatointi BamHI/AvrII-leikattuun plasmidiin pTrX-o H-llD-ML-75A105H-116G-del(123 - 144) palautti toimivan ksylanaasigeenin en-

CVJ

^ nalleen transformantissa, jossa oli uusi plasmidi pTrX-H-11D-ML-75A105H- ° 116G118C-125A129E-144R161R.

00 o g Esimerkki 2: Mutanttiksylanaasien karakterisointi

CL

σ> 20 2-1: Ksylanaasien tuotto

O

CO

o Viljelyolosuhteet käsittivät ampisilliinia sisältävässä (100 mg/1) 2YT-mediumissa 0X1 (16 g bacto-tryptonia, 10 g hiivauutetta, 5 g NaCka, 1 l:ssa vettä) olevan 5 ml:n yli- yön ymppikasvuston lisäyksen 2YT-mediumiin (1 1), jossa oli ampisilliinia. Viljelmiä kasvatettiin ravistuksella (200 rpm) 37 °C:ssa. 16 tunnin jälkeen solut kerättiin.

35 2-2: Mutanttiksylanaasien puhdistus

Proteiininäytteet valmistettiin soluista tekemällä aluksi soluista uute jauhamalla 10 g solupastaa 25 g:aan alumiinioksidijauhetta. Jauhamisen jälkeen tasaiseksi seokseksi, lisättiin pieniä määriä (5 ml) jääkylmää puskuria A (10 mM natriumase-5 taatti, pH 5,5 BcX-mutanteille) tai puskuria B (10 mM natriumasetaatti, pH 4,6 TX-mutanteille) ja seosta jauhettiin voimakkaasti lisäysten välillä. Alumiinioksidi ja so-lujätteet poistettiin sentrifugoimalla seosta 8 000 x g:llä 30 minuutin ajan.

Ennen pylväskromatografiaa supernantit täsmättiin pH:hon 4,6 etikkahapolla ja sentrifugoitiin kaiken sakan poistamiseksi. Seuraava pylväskromatografiamene-10 telmä oli identtinen kaikille mutanttiksylanaaseille.

Hapotuksen ja sentrifugoinnin jälkeen ksylanaasinäyte pumpattiin 50 ml:n perusti-lavuuteen, CM-sefaroosi nopeavirtaus, kationinvaihtopylväs (Pharmacia Biotech, Uppsala) tasapainotettu 10 mM natriumasetaatilla (pH 4,6). Ksylanaasi eluoitiin 250 ml:n lineaarisella gradientilla (0 - 0,6 M NaCl 10 mM natriumasetaatissa, pH 4,6) 15 virtausnopeudella 1 ml/min. Ksylanaasit eloituvat 150 - 200 ml:ssä gradienttia. Ali-kvootit kerätyistä fraktioista tutkitaan SDS-PAGElla ja ne fraktiot, joissa oli eniten ksylanaasia poolattiin. Puhdistettu ksylanaasi kvantifioitiin spektrofotometrialla 280 nm:ssä käyttäen ekstinktiokerrointa välillä 54 600 - 53 400 M'1 useimmille mutant-ti-TrX-ksylanaaseille. Tyypillinen puhdistus 10 g:sta soluja tuotti 25 mg ksylanaa-20 siä.

2-3: Standardimääritys entsymaattisen aktiivisuuden mittaamiseksi

Kvantitatiivinen määritys määritti liukoisen ksylaanin tuottamien pelkistävien soke-ripäiden lukumäärän. Substraatti tälle määritykselle oli koivupuuksylaanifraktio, jo-^ ka liukeni veteen koivupuuksylaanin (Sigma Chemical Co.) 5 % suspensiosta. Liu- ^ 25 kenemattoman fraktion poiston jälkeen, supernatantti kuivajäädytettiin ja säilytettiin

LO

9 eksikkaattorissa. Spesifisen aktiivisuuden mittaus suoritettiin seuraavasti: Reaktio- o seoksia, joissa oli 100 μΐ ksylaania pitoisuudessa 30 mg/ml laimennettuna ennestään

Er määrityspuskuriin (50 mM natriumsitraatti, pH 5,5 tai testatun ksylanaasin optimi-

CL

pH), 150 μΐ määrityspuskuria ja 50 μΐ entsyymiä liuotettuna määrityspuskuriin, in-o 30 kuboitiin 40 °C:ssa. Eri aikaväleillä siirrettiin syrjään 50 μ1:η annoksia ja reaktio lo- g petettiin laimentamalla 1 ml:aan 5 mM NaOHia. Pelkistävien sokerien määrä määriin tettiin hydroksibentsoehappohydratsiinireagenssilla (HBAH; Lever, 1972, Analyti cal Biochem. 47: 273 - 279). Entsyymiaktiivisuuden yksikkö määritettiin määränä, joka tuottaa 1 μηιοί pelkistävää sokeria minuutissa 40 °C:ssa.

36

Spesifisten aktiivisuuksien vertaamiseksi mutantti- ja natiiviksylanaasien välillä, mutanttiksylanaasin spesifiset aktiivisuudet muutettiin suhteelliseksi aktiivisuudeksi. Suhteellinen aktiivisuus lasketaan prosenttiosuutena jakamalla mutantti-entsyymin spesifinen aktiivisuus natiiviksylanaasin spesifisellä aktiivisuudella.

5 Taulukko 4: Mutantti- ja natiiviksylanaasien suhteellinen aktiivisuus 40 °C:ssa ja pH:ssa 5,5

Ksylanaasi Suhteellinen __aktiivisuus_ natiivi TrX 100*

TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R__84_

TrX-Η-11D-ML-75 A105H-116G-125A129E-144R161R__80_

TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R__Π3_

TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R 121 *Natiivin TrX-ksylanaasin spesifisen aktiivisuuden määritettiin olevan 770 U/mg.

Taulukossa 4 esitetyt tulokset osoittavat, että mutanttiksylanaasien spesifiset entsy-maattiset aktiivisuudet 40 °C:ssa eivät ole merkittävästi muuttuneet verrattuna na-10 tiiviksylanaasiin. Ennemminkin 118C-mutanttiksylanaaseilla (TrX-HML-AHCAE-R ja TrX-Hl 1D-ML-AHCAE-R) havaitaan enemmän aktiivisuutta, kun verrataan natiiviksylanaasiin (13-21 % nousu spesifisessä aktiivisuudessa).

2-4: Mutanttiksylanaasien ilmentymistehon määritys E. colissa 2-3:ssa kuvatulla standardimäärityksellä on määritetty suhteellinen ilmentymisteho 15 kullekin mutanttiksylanaasille arvioimalla ksyloosivapautuminen, jonka saa aikaan c\i bakteerikasvuston yksikkötilavuudessa tuotettu ksylanaasi. Kolmea, mutaatiota ^ N11D koodaavaa mutanttiksylanaasia, nimittäin TrX-H-11 D-ML-75 AI OSITUS 125A129E-144R161R:ää (TrX-H-11D-ML-AHAE-RR), TrX-H-llD-ML- » 75A105H-116G-125A129E-144R161R:ää (TrX-H-11D-ML-AHGAE-RR) ja TrX- ° 20 H-l 1D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161 R:ää (TrX-H-11D-ML-AHCAE- cc RR), ekspressoidaan 2,4 - 4,3 kertaa tehokkaammin E. colissa verrattaessa niiden S vastaaviin prekursoreihin TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R, TrX-HML- 2 75A105H-116G-125A129E-144R161R ja TrX-HML-75A105H-l 18C-125A129E- o 144R161R ilman tätä mutaatiota.

(M

37

Taulukko 5: Mutanttiksylanaasien ilmentymisteho

Ksylanaasi Suhteellinen __ilmentymisteho *

TrX-H-11D-ML-75 A105H-125 A129E-144R161R_2,4-kertainen

TrX-H-llD-ML-75A105H-l 16G-125A129E-144R161R 3,1-kertainen

TrX-H-11D-ML-75 A105H-118C-125A129E-144R161R 4,3-kertainen * Suhteessa vastaaviin prekursoreihin, kuten todetaan tekstissä edellä.

Tämä osoittaa, että yksi mutaation N1 ID eduista on ilmentymisen parannus mikrobeissa, tärkeä ominaisuus entsyymin teolliselle tuotolle.

5 Esimerkki 3: Mutanttiksylanaasien termofiilisyys

Termofiilisyyttä tutkittiin eri lämpötilojen vaikutuksen testaamiseksi liukoisen ksy-laanin enstymaattiselle hydrolyysille eri mutanttiksylanaasien vaikutuksesta.

Määritysmenettelytapa oli vastaava standardimääritykselle muutoksilla inkubaatio-lämpötilassa ja -ajassa. Ksylanaaseja (15 μg/ml) ja liukoista koivupuuksylaanisub-10 straattia pH:n 5,5 50 mM natriumsitraattipuskurissa sekoitettiin kiertovesihauteessa eri lämpötiloissa. 30 minuutin inkubaation jälkeen määritettiin ksylaanista vapautuneiden pelkistävien sokerien määrä HBAH-analyysillä ja laskettiin suhteellisena aktiivisuutena, jolloin 40 °C:n arvo edustaa 100 %.

Lämpötilan vaikutus ksylaanin hydrolyysille TrX-HML-75A105H-125A129E-15 144R:n (TrX-HML-AHAE-R) vaikutuksesta esitetään kuvassa 3. Verrattuna pre- kursoriin ilman H144R-mutaatiota (TrX-HML-AHAE), tämä mutanttiksylanaasi osoitti hiukan parantunutta entsymaattista aktiivisuutta korkeammassa lämpötilassa.

C\J

ς Nämä tulokset viittaavat siihen, että H144R-mutaatio parantaa ksylanaasien termo- , fiilisyyttä.

o § 20 Toinen mutantti TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R (TrX-HML-AHAE- x RR) ei merkittävästi kohottanut entsymaattista aktiivisuutta korkeammassa lämpöti- lassa (ei esitetty) verrattaessa TrX-HML-75A105H-125A129E-144R:ään (TrX- g HML-AHAE-R). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Q161R-mutaatio ei anna hyö- cö tyä ksylanaasien termofiilisyydelle.

o cv 25 Kahta mutanttisarjaa, jotka perustuvat mutaatioille D116G ja Y118C, on testattu. Verrattuna natiivi-TrX:ään yksittäisillä mutanteilla TrX-116G ja TrX-118C on suurempi aktiivisuus korkeammissa lämpötiloissa (kuva 4).

38

Sama parantava vaikutus termofiilisyydessä havaittiin myös seuraavalla mutanttipa-rilla TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R (TrX-HML-AHGAE-R) ja TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R (TrX-HML-AHCAE-R) verrattaessa pre-kursoriin TrX-HML-75A105H-125A129E-144R (TrX-HML-AHAE-R) pH:ssa 5,5 5 (kuva 5, vain 116G-mutantti esitetty) ja pH:ssa 6,0 (kuvat 6 ja 7, nämä kuvat käsittävät samat tiedot, mutta niissä on erilainen suhteellisen aktiivisuuden esitystapa).

Toinen mutanttiksylanaasien sarja, joka perustuu N1 lD-mutaatioon, antaa myös hyödyn termofiilisyydelle. Mutantilla TrX-H-llD-ML-75A105H-125A129E-144R161R (TrX-Hl 1D-ML-AHAE-RR) oli suurempi aktiivisuus korkeammissa 10 lämpötiloissa verrattaessa prekursoriin TrX-HML-75A105H-125A129E-144R (TrX-HML-AHAE-R, kuva 8). Tämä tulos on odottamaton, sillä aiemman tekniikan raportit osoittivat saman N1 lD-mutaation joko alentavan lämpötilaoptimia ja lämpötila-aluetta TrX-mutanteilla, joilla on molekyylin sisäinen disulfidisidos (Turenen et ai., 2001) tai sillä ei havaittu vaikutusta TrX-H-1 lD-ML:n termofiilisyyteen (US-15 patentti no 5 759 840, mutantti nimeltä NI-TX12). Nämä esillä olevan keksinnön tiedot osoittavat, että llD-mutaatio antaa hyödyn sopivasti modifioiduille ksyla-naaseille.

Edellä identifioidut mutaatiot voidaan yhdistää sellaisten mutanttiksylanaasien muodostamiseksi, joilla on suurempi termofiilisyys jopa korkeammalla pH-alueella. 20 Yhdistelmämutanttiksylanaaseilla, jotka käsittävät kolmoismutaatiot N11D/D116G/144R tai N11D/Y118C/144R nimittäin TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125 A129E-144R161R: llä (TrX-Hl 1D-ML-AHGAE-RR) ja TrX-H-llD-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R:llä (TrX-Hl 1D-ML-AHCAE-RR) on maksimaalinen entsymaattinen aktiivisuus korkeammissa lämpötiloissa noin 70 °C -25 75 °C ja esiintyy merkittävä entsymaattinen aktiivisuus 80 °C:ssa pH:ssa 5,5 (kuva

CVJ

ς 5, vain 116G-mutantti esitetty) ja pH:ssa 6,0 (kuvat 6 ja 7). Nämä tulokset viittaavat ^ siihen, että mutaatioiden D116G ja Y118C vaikutukset täydentävät mutaatioita 9 N1 ID ja H144R mitä tulee ksylanaasin termofiilisyyteen.

CO

o x Esimerkki 4: Mutanttiksylanaasien alkalifiilisyys

CL

^ 30 Geneettisesti modifioitujen ksylanaasien alkalifiilisyyttä tutkittiin testaamaan sitä 2 vaikutusta mikä eri pH-olosuhteilla oli liukoisen koivupuuksylaanin entsymaat- § tiselle hydrolyysille mutanttiksylanaasien vaikutuksesta. Määritysmenettelytapa oli

C\J

vastaava standardimääritykselle muutoksilla inkubaatiolämpötilassa ja -ajassa. Geneettisesti modifioitujen ksylanaasien alikvootteja (15 pg/ml) ja liukoista ksy-35 laanisubstraattia 50 mM natriumsitraattipuskureissa, jotka vaihtelivat välillä pH 4 - 39 7, inkuboitiin yhdessä 65 °C:ssa. 30 minuutin inkubaatioiden jälkeen määritettiin ksylaanisubstraatista vapautuneiden pelkistävien sokerien määrä HBAH-analyysillä ja laskettiin entsymaattinen aktiivisuus pH:n funktiona eri mutanttiksylanaaseille, jolloin maksimaalista aktiivisuutta pidettiin 100 %:na.

5 Mutaatio H144R ei vaikuta aktiivisuuteen korkeammassa pH:ssa. Mutantilla TrX-HML-7 5 A105H-125 A129E-144R ja sen prekursorilla TrX-HML-75A105H-125A129E on sama pH/aktiivisuusprofiili (ei esitetty). Kuten esimerkissä 3 todettiin, tämä mutaatio (H144R) on kuitenkin edullinen ksylanaasin termofiilisyydelle.

pH:n vaikutus entsymaattiseen aktiivisuuteen mutaation Q161R vaikutuksesta mu-10 tanttiksylanaasissa TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R (TrX-HML-AHAE-RR) esitetään kuvassa 9. Verrattuna sen prekursoreihin TrX-HML-75A105H-125A129E ja TrX-HML-75A105H-125A129E-144R (ei esitetty), joilla kummallakin on identtiset pH/aktiivisuusprofiilit, mutanttiksylanaasilla TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R (TrX-HML-AHAE-RR) esiintyy suurempi aktii-15 visuus korkeammalla pH-alueella 6,5; 7,0; 7,5 ja 8,0. TrX-HML-AHAE-RR:llä on myös matalampi aktiivisuus matalammassa pH:ssa 5,0; 5,5 ja 6,0 verrattaessa prekursoreihin ilman tätä mutaatiota.

Mutaatioiden D116GjaY118C suoraa vaikutusta ksylanaasiaktiivisuuteen on testattu. Verrattuna natiivi-TrX:ään yksittäiset mu tantit TrX-116G ja TrX-118C ovat 20 osoittaneet suurempaa aktiivisuutta korkeammassa pH:ssa (kuva 10).

Sama parantava vaikutus alkalifiilisyyteen mutaatioiden D116Gja Y118C vaikutuksesta havaitaan myös mutanteilla TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R (TrX-HML-AHGAE-R) ja TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R (TrX-^ HML-AHCAE-R, kuva 9) verrattaessa prekursoreihin TrX-HML-75A105H- o 25 125A129E-144R ja TrX-HML-75A105H-125A129E. Vaikka molemmat nämä mu- ιό tantit osoittavat suurempaa aktiivisuutta pH:ssa 6,5; 7,0; 7,5 ja 8,0, mutantti TrX- ^ HML-75A105H-116G-125A129E-144R säilyttää optimaalisen aktiivisuutensa ma- ° talammassa pH:ssa 5,0; 5,5 ja 6,0. Tämä korkean aktiivisuuden ylläpito pH:ssa 5,0 - £ 8,0 molempien näiden mutanttien vaikutuksesta edustaa optimaalisen pH-alueen 30 laajenemista, o § N1 lD-mutaatio ei näytä edistävän TrX:n alkalifiilisyyttä. Mutantilla TrX-H-llD- ° ML-75A105H-125A129E-144R161R (TrX-Hl 1DML-AHAE-RR) on identtinen pH/aktiivisuusproflili kuin prekur s orillaan TrX-HML-75A105H-125A129E- 144R161R (ei esitetty). Tulos, ettei 1 lD:llä ole vaikutusta pH/aktiivisuusprofiilissa, 40 on ristiriidassa julkaisun Turenen et ai. (2001) kanssa, mikä toteaa, että N11D-mutaatio alensi pH-optimia ja pH-aluetta TrX-mutantissa, joka sisälsi molekyylin sisäisen disulfidisidoksen. Edellä kuvatut tulokset ovat kuitenkin yhtäpitäviä US-patentin no 5 759 840 kanssa, missä ei havaittu mitään negatiivista vaikutusta TrX-5 H-l lD-ML:n (mutantti nimeltä NI-TX12) alkalifiilisyyteen.

Edellä identifioidut mutaatiot on yhdistetty sellaisten mutanttiksylanaasien tuottamiseksi, joilla on suurempi alkalifiilisyys ja termofiilisyys. Yhdistelmämutanttiksy-lanaaseilla, jotka perustuvat nelosmutaatioille N11D/D116G/H144R/Q161R tai N11D/Y118C/H144R/Q161R, nimittäin TrX-H-llD-ML-75A105H-116G-10 125A129E-144R161R:llä (TrX-Hl 1D-ML-AHGAE-RR, kuva 9) ja TrX-H-llD- ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R:llä (TrX-Hl 1D-ML-AHCAE-RR, ei esitetty), esiintyy maksimaalinen entsymaattinen aktiivisuus noin pH:ssä 5,5 - 7 verrattaessa prekursoriksylanaaseihin. Lisäksi mutaation Dl 16G läsnäolo auttaa säilyttämään olennaisesti maksimaalisen aktiivisuuden matalamalla pH-alueella 5,0; 15 5,5 ja 6,0 välttäen täten merkittävän aktiivisuuden menetyksen matalassa pH:ssa mikä havaitaan prekursorilla TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R (kuva 9). Tämä tulos edelleen vahvistaa optimaalisen pH-alueen laajentumista.

Yhteenvetona, alkalifiilinen ksylanaasi voidaan rakentaa mutaatioiden D116G tai Y118C yhdistämisellä Q161R:n kanssa. Toisten uusien mutaatioiden N11D ja 20 H144R lisäys voi edelleen parantaa mutantti-TrX:n termofiilisyyttä. N1 lD-mutaatio voi olla hyödyksi mutanttien ilmentymiselle.

Vaikka esillä oleva keksintö kuvailee mutanttiksylanaaseja, jotka omaavat parantunutta termofiilisyyttä ja alkalifiilisyyttä sekä etuja liittyen näihin entsyymeihin paperimassan tuotossa, näillä mutanttiksylanaaseilla voi olla myös käyttöä muissa te-^ 25 ollisissa prosesseissa, erimerkiksi mutta rajoittumatta tarkkuuslaitteiden ja puolijoh- ^ teiden pesussa. Lisäksi kohonneen termofiilisyytensä ja termostabiiliutensa ansiosta i o mutanttiksylanaaseja voidaan käyttää kemiallisissa prosesseissa, joissa käytetään g pieniä määriä denaturantteja tai detergenttejä tai liuottimien läsnäollessa, esimerkik- x si mutta rajoittumatta pienien määrien polaarittomia liuottimia, kuten mutta rajoit- 30 tumatta heksaania, dioksaaneja, hiilitetrakloridia, bentseeniä, eettereitä, klorofor-g mia, etikkahappoa ja metyleenikloridia ja polaarisia liuottimia, kuten mutta rajoit- cö tumatta asetonia, alkoholeja, dimetyyliformamidia, asetonitriiliä, sulfolaania, dime- ^ tyylisulfoksidia ja vettä.

41

Esillä olevaa keksintöä on kuvattu edullisten suoritusmuotojen suhteen. Alan asiantuntijoille on kuitenkin ilmeistä, että voidaan tehdä useita variaatioita ja modifikaatioita poikkeamatta tässä kuvatun keksinnön piiristä.

Kaikkiin kirjallisuusviitteisiin ja sitaatteihin viitataan tässä.

5 Kirjallisuusviitteet

Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y. ja Okada H. (1993) FEBS Lett. 316: 123- 127.

Casimir-Schenkel, J., Davis, S., Fiechter, A., Gysin, B., Murray, E., Perrolaz, J.-J. ja Zimmermann, W. Eurooppapatenttihakemus no 91810652.7, julkaistu 4.3.1992 jul-10 kaisu no 0 473 545 A2.

Campbell, R. L., Rose, D. R., Sung, W. L., Yaguchi, M. ja Wakarchuk, W. US-pa-tentti no 5 405 769 julkaistu huhtikuun 11., 1995.

Campbell, R. L., Rose, D. R., Sung, W. L., Yaguchi, M. ja Wakarchuk, W. PCT-jul-kaisu no WO 94/24270, julkaistu 27.10.1994.

15 Chandra Raj, K. ja Chandra, T. S. (1995) Biotechnol. Lett. 17: 309 - 314.

Fisk, R. S. ja Simpson, C. (1993) teoksessa Stability and Stabilization of Enzymes, toim. W. J. J. van den Tweel, A. Harder ja R. M. Buitelaar, Elsevier Science Publishers B. V., s. 323 - 328.

Gruber, K., Klintschar, G., Hayn, M., Schlacher, A., Steiner, W. ja Kratky, C. 20 (1998) Biochemistry 37: 13475 - 13485.

Irwin, D., Jung, E. D. ja Wilson, D. B. (1994) Appi. Environ. Microbiol. 60: 763 -770.

^ Kinoshita, K., Takano, M., Koseki, T., Ito, K. ja Iwano, K. (1995) J. Fermentation ^ and Bioengineering 79: 422 - 428.

LO

° 25 Krengel, U. ja Dijkstra (1996) J. Mol. Biol. 263: 70 - 78.

00 ° Lee, S. L., Forsberg, C. W. ja Rattray, J. B. (1987) Appi. Environ. Microbiol. 53: £ 644 - 650.

g Luthi, E., Jasmat, N. B. ja Bergquist, P. L. (1990) Appi. Environ. Microbiol. 56: m 2677 - 2683.

o ™ 30 Mathrani, I. M. ja Ahring, B. K. (1992) Appi. Microbiol. Biotechol. 38: 23 - 27.

42

Misset, O. (1993) teoksessa Stability and Stabilization of Enzymes, toim. W. J. J. van den Tweel, A. Harder ja R. M. Buitelaar, Elsevier Science Publishers B. V., s. Ill - 131.

Nissen, A. M., Anker, L., Munk, N. ja Lange, N. K. Teoksessa Xylans and Xylana-5 ses, toim. J. Visser, G. Beldman, M. A. Kusters-van Someren ja A. G. J. Voragen, Elsevier, Amsterdam, (1992) s. 325 - 337.

Sakka, K., Kojima, Y., Kondo, T., Karita, S., Ohmiya, K. ja Shimada, K. (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57: 273 - 277.

Simpson, H. D., Haufler, U. R. ja Daniel, R. M. (1991) Biochem. J. (1991) 277: 10 413-417.

Sung, W. L., Yao, F.-L., Zahab, D. M. ja Narang, S. A. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 561 -565.

Sung, W. L., Luk, C. K., Zahab, D. M. ja Wakarchuk, W. (1993) Protein Expression Purif. 4: 200 - 206.

15 Sung, W. L., Luk, C. K., Chan, B., Wakarchuk, W., Yaguchi, M., Campbell, R., Willick, G., Ishikawa, K. ja Zahab, D. M. (1995) Biochem. Cell Biol. 73: 253 -259.

Sung, W. L., Yaguchi, M. ja Ishikawa, K. US-patentti no 5 759 840 julkaistu kesäkuun 2., 1998.

20 Sung, W. L., Yaguchi, M. ja Ishikawa, K. US-patentti no 5 866 408 julkaistu helmikuun 2., 1999.

Suuna, A. ja Antranikian, G. (1997) Crit. Rev. Biotech. 17: 39 - 67.

Tolan, J. S. ja Vega Canovas, R. (1992) Pulp & Paper Canada 93: 116 - 119.

^ Turenen, O., Etuaho, K., Fenel, F., Vehmaanpera, J., Wu, X., Rouvinen, J. ja Leiso- 25 la,M. (2001) J. Biotech. 88:37-46.

LO

9 Wakarchuck, W. W., Sung, W. L., Campbell, R. L., Cunningham, A., Watson, D. C.

o ja Yaguchi, M. (1994) Protein Engineering 7: 1379 - 1386.

£ Wilson, D. B., Jung, E. D., Changas, G. S., Irvin, D. C. Kansainvälinen PCT- julkaisu 11. toukokuuta, 1195. Julkaisu no WO 95/12668.

30 Winterhalter, C. ja Liebl, W. (1995) Appi. Environ. Microbiol. 61: 1810 - 1815. o ° Zappe, H., Jones, W. A. ja Woods, D. R. (1987) Appi. Microbiol. Biotechnol. 27: 57-63.

Zappe, H., Jones, W. A. ja Woods, D. R. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 2179.

Claims (13)

1. Modifioitu perheen 11 ksylanaasi, johon on substituoitu arginiini paikkaan 144, ja nollasta yhteentoista muuta substituoitua aminohappoa, jolloin mainittu paikka määritetään rinnastamalla mainitun modifioidun perheen 11 5 ksylanaasin ja sekvenssin numero 16 samanlaiset kohdat, jolloin mainitulla modifioidulla perheen 11 ksylanaasilla on parantunut termofiilisyys verrattuna siihen vastaavaan perheen 11 natiiviksylanaasiin, josta mainittu modifioitu perheen 11 -ksylanaasi on johdettu.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi, jolloin 10 modifioidulla ksylanaasilla on parantunut alkalofiilisyys verrattuna vastaavaan perheen 11 natiiviksylanaasiin, josta mainittu modifioitu perheen 11 ksylanaasi on johdettu.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi, johon on substituoitu asparagiinihappo (Asp) paikkaan 11.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi, johon on substituoitu glysiini (Gly) paikkaan 116.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi, johon on substituoitu kysteiini (Cys) paikkaan 118.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi, 20 jolloin mainittu perheen 11 ksylanaasi on modifioitu Trichoderma reesei -ksylanaasi. C\J

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi, ιό jolloin mainittu modifioitu Trichoderma reesei -ksylanaasi on modifioitu Tricho- o ^ derma reesei -ksylanaasi II. o ir 25

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi jossa on lisäksi substituoidut histidiinit (His) paikoissa 10 ja 105, substituoitu me- o tioniini (Met) paikassa 27, substituoitu leusiini (Leu) paikassa 29, substituoidut ala- o niinit (Ala) paikoissa 75 ja 125, substituoitu glutamiinihappo (Glu) paikassa 129 ja o w substituoitu arginiini paikassa 161.

9. Modifioitu perheen 11 ksylanaasi valittuna ryhmästä, joka koostuu: TrX-HML-75 A105H-125 A129E-144R: stä TrX-HML-75 A105H-125 A129E-144R161R: stä TrX-HML-75 A105H-116G-125 A129E-144R: stä 5 T rX-HML-75 A105H-118C-125 A129E-144R: stä TrX-H-11D-ML-75 A105H-125 A129E-144R161 R:stä TrX-H-11 D-ML-75 A105H-116G-125A129E-144R161R:stä TrX-H-11 D-ML-75 A105H-118C-125A129E-144R161R: stä TrX-H-11 D-ML-75 A105H-116G118C-125A129E-144R161R:stä.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi, jolloin mainittu modifioitu perheen 11 ksylanaasi on tunnettu siitä, että sillä on maksimaalinen tehokas lämpötila (MET) välillä noin 69 °C - noin 84 °C.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen modifioitu perheen 11 ksylanaasi, jolloin mainittu modifioitu perheen 11 ksylanaasi on tunnettu siitä, että sillä on 15 maksimaalinen tehokas pH (MEP) välillä noin pH 5,8 - noin pH 8,4.

12. Teollinen prosessi, jossa ksylaanisubstraattia hydrolysoidaan jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukaisella modifioidulla perheen 11 ksylanaasilla.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen teollinen prosessi, jolloin mainittu hydrolysoitava ksylaanisubstraatti on kuitumassassa. 20 OJ δ (M uS cp CO o X cc CL cn o δ o o (M