NO323549B1

NO323549B1 - Termostabile xylanaser, isolert og renset DNA-sekvens, vektor, mikrobevertscelle, isolert mikroorganisme, fremgangsmate for fremstilling av en xylanase, for nedbryting av xylan og for delignifiering av tremasse, samt blanding og anvendelse av xylanase.

Info

Publication number: NO323549B1
Application number: NO19960567A
Authority: NO
Inventors: Wilhelmus Johannes Quax; Diane P Williams; Sara Iverson; Vidar Gronberg; Simon Forster; Dean Moody; Roberta Lee Farrell; Peter Leonard Bergquist; Roy Mciver Daniel; Hugh William Morgan
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1996-02-13
Publication date: 2007-06-11
Also published as: MX9600450A; AU693909B2; DE69527924T2; WO1995034662A1; ATE222956T1; CA2168344A1; FI960631A0; CN1143387A; CA2168344C; PL183432B1; DE69527924D1; FI119436B; EP0716702B1; FI960631A; JP4285767B2; NZ289089A; EP0716702A1; BR9506262A; AU2882495A; NO960567D0

Description

Teknisk område

Den foreliggende oppfinnelse vedrører termostabile xylanaser, isolert og renset DNA-sekvens, vektor, mikrobevertscelle, isolert mikroorganisme, fremgangsmåte for fremstilling av en xylanase, for nedbrytning av xylan og for delignifiering av tremasse, samt blanding og anvendelse av xylanase.. Nærmere bestemt er enzymene termostabile xylanaser. Disse xylanaser kan fremstilles fra anaerobe termofile bakterier. Xylanasene kan anvendes under betingelser som anvendes i papir- og masseindustrien, dvs. en pH på over 9 og en temperatur på over 70°C, spesielt er enzymene aktive ved T = 80°C.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Xylan er en komponent av plantehemicellulose. Xylan består av en hovedkjede av 1,4-glykosidisk bundet 6-D-xylose.

Vanligvis vil xylanene ha sidekjeder eller grupper omfattende xylose og andre pentoser, heksoser, uronsyrer og acetyl-grupper.

I papirfremstillingsprosessen er bleking av masse et viktig trinn. Skjematisk blir den fremgangsmåte som anvendes for massebehandling i papir- og masseindustrien gjennomført som følger: Massen behandles ved pH 10-12 ved 80°C for å fjerne mesteparten av ligninet i det såkalte oksygendelignifierings-trinn. Den gjenværende masse inneholder 2-5% lignin. Dette lignin gir massen sin brune farge. Deretter blir massen bleket i en blekeprosess i flere trinn. I denne blekeprosess anvendes kjemikalier såsom klor, klordioksyd, hydrogenperoksyd og/eller ozon for å oppnå en lys masse for høykvalitetspapir.

Klor og klorholdige kjemikalier anvendes ofte i blekeprosessen. Siden anvendelse av disse kjemikalier fører til dannelse av dioksin og andre klorerte organiske forbindelser, vil de imidlertid utgjøre en trussel for miljøet. Det er derfor en voksende tendens til å unngå anvendelse av kjemikalier som gir opphav til denne type avfallsprodukter.

Dette har utløst en tendens til utvikling av klorfrie prosesser; totalt klorfrie (TCP) og elementært klorfrie (ECF).

I disse prosesser anvendes hydrogenperoksyd eller ozon til blekingen. Anvendelsen av disse oksyderende kjemikalier kan imidlertid ha en negativ effekt på papirkvaliteten, spesielt på styrken av papiret.

Det er blitt funnet at visse enzymer gjør massen mere tilgjengelig for blekemidler, slik at de reduserer bleke-mengden. Spesielt xylanaser er blitt funnet å være svært anvedelige i papir- og massebearbeidingen. Xylanaser er blitt rapportert å øke ekstraherbarheten av ligniner fra massen. I aktuelle prosesser, anvendes xylanasene for det meste etter oksygendelignifieringstrinnet, fordi de ikke er aktive og ikke overlever under de betingelser som anvendes under oksygen-delignif ier ingen.

Xylanasene spalter hemiclullosekjedene som er anvsvarlige for den tette binding av lignin til cellulusenettverket. Etter xylanasebehandlingen, er det lettere å fjerne ligninet i de påfølgende trinn.

Anvendelsen av xylanaser fører derfor til en reduksjon av forbruket av aktivt klor i forblekingen med 25-30%. Denne reduksjon av klorforbruket vil ikke påvirke kvalitetspara-meterne av det resulterende papir (Viikari et al., 1986, Proe. of the third Int. Conf. Biotechnology in Pulp and Paper Ind, Stockholm; p. 67-69 og Bajpai og Bajpai-, 1992, Process Bio-chemistry 27:319-325).

Xylanasebehandlingen vil også redusere behovet fra andre

kjemikalier, såsom hydrogenperoksyd, i blekeprosessen.

Anvendelsen av xylanaser fra soppkilder til bleking av kraftmasse er blitt rapportert. Disse er sure xylanaser, og pH- og temperaturoptima for enzymene er: pH ■ 3,5 og T ■ 30-50°C. Disse verdier er ikke ideelle for anvendelsen i blekeprosessen, hvor de overveiende betingelser er pH > 9 og temperaturen > 70°C.

Xylanaser av bakterieopprinnelse, med høyere pH og/eller temperaturoptima, er blitt rapportert for anvendelse i blekeprosessen. Noen av disse skriver seg fra følgende arter (pH-og temperaturoptima for den rapporterte xylanaseaktivitet i parentes): Bacillus pumilus {pH = 7-9, T = 40°C, Nissen et al., 1992, Progress in Biotechnology 7 : 325-337), Bacillus stearo-thermophilus (pH = 7, T = 65°C, internasjonal patentsøknad WO 91/10724), Dictvoglomus thermophilum (pH = 6-8, T = 70°C, europeisk patentsøknad EP 0 511 933), Rhodothermus (pH = 5,5-6,5, T - 80-100°C, europeisk patentsøknad EP O 538 177), Thermotoga (pH = 5-6, T = 90°C, internasjonal patentsøknad WO 93/19171) og Thermoanaerobacter ethanolicus (T = 68°C, Deblois og Wiegel, 1992, Progress in Biotechnology, 7 : 487-490).

EP-A-0 511 933 beskriver xylanolytiske enzympreparater som kan oppnås fra mikroorganismer fra Dictyoglomus. Dette dokumentet vedrører følgelig enzympreparater og ikke spesifikke isolerte enzymer som tilveiebrakt i foreliggende oppfinnelse.

EP-A-0 538 177 beskriver også xylanolytiske enzympreparater. Slike preparater kan bli oppnådd fra stammer av alkafile organismer. Det beskrives følgelig her enzympreparater og ikke spesifikt isolerte enzymer som i foreliggende oppfinnelse.

WO-A-93/19171 beskriver xylanaser fra organismer isolert fra Thermatoga. Heller ikke dette dokumentet beskriver xylanaser med hensyn på en aminosyre eller polynukleotidsekvens. Det beskrives ikke en xylanase som viser betydelige delignifiseringsaktivitet ved høy pH p.g.a. at pH-optimumet til enzymene beskrevet i dokumentet er 5,5 til 6,5.

Clark et al., 1992, Enzyme Engineering 672, 137-141 beskriver en bakteriell Thermatogastamme FjSS3-B.l som produserer en xylanase som har et pH optimum på 5,3 og en molekylvekt på omtrent 31kDa. Ingen sekvensinformasjon er tilstede i dette dokumentet.

Sakka et al., 1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57, 273-277 beskriver sekvensen til et xynA-gen kodende for en xylanase A og sammenligner sekvensen av den katalytiske domenen til nevnte xynA-gen med andre xylanasegener. Den katalytiske domen til xynA har tilfelles 69% og 64% homologi med xynB og en annen xynA. Dette er signifikant p.g.a. xynA er en F-type xylanase, mens i kontrast til dette er xylanasene ifølge foreliggende oppfinnelse en G-type xylanase. Det er velkjent for fagfolk innenfor dette området at G-type- og F-type-sekvenser har forskjellige egenskaper.

Sakka et al., 1990, Agric. Biol. Chem. 54, 337-342 beskriver et antall DNA-fragmenter som tilsynelatende omfatter gener som koder for enzymer som viser xylanaseaktivitet. Ingen sekvensinformasjon er derimot beskrevet. Dette dokumentet beskriver ikke noen fysiske eller enzymatiske egenskaper til enzymene.

Irwin et al., .1994, Applied and Environ Microbiål. 60, 763-770 beskriver sekvensen av en xylanase fra Thermomonospora fusca. Den identifiserte sekvensen er den til et xynA-gen. Som angitt ovenfor faller xynA-genene inn i klassen av F-type-xylanaser. Xylanasene ifølge foreliggende oppfinnelse er derimot G-type-xylanaser. Disse to typene av xylanaser har forskjellige egenskaper og sekvenser:.

Selv om anvendelsen av noen av disse xylanaser for bleking er blitt krevet, er det inntil idag ikke blitt rapportert noen xylanaser som har de ønskede egenskaper med signifikant delignifieringsaktivitet ved temperaturer > 80°C.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse beskriver xylanaser som kan fremstilles fra anaerobe termofile mikroorganismer som er blitt isolert i ren kultur fra varme kilder i New Zealand. Mikroorganismene er blitt deponert ved Centraal Bureau voor Schimtnelcultures (CBS), Baarn, Nederland, den 14. april 1994.

Den foreliggende oppfinnelse beskriver også enzymer som har betydelig xylanaseaktivitet ved en temperatur på minst 80°C. Videre beskriver den foreliggende oppfinnelse xylanase kjennetegnet ved at den har en signifikant delignifieringsaktivitet ved en temperatur på minst 80°C ved en pH 9,0 og omfatter en aminosyresekvens som har minst 70% identitet med hele aminosyresekvensen av SEKV ID NR: 13.

Det er videre beskrevet isolert og renset DNA-sekvens, kjennetegnet ved at den koder for en xylanase ifølge hvilket som helst av kravene 1-7.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også vektor kjennetegnet ved at den inneholder DNA-sekvensen ifølge krav 8 eller 9.

Det er videre beskrevet mikrobevertscelle, kjennetegnet ved at den har blitt transformert med vektoren ifølge krav 10, eller inneholder som heterolog DNA, en sekvens ifølge krav 8 eller 9.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre isolert mikroorganisme kjennetegnet som en anaerob og termofil bakterie og som har deponeringsnummer CBS 211.94, 212.94, 213.94, 214.94, 255.94 og 216.94.

Oppfinnelsen vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av en xylanase, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter dyrking av en mikroorganisme ifølge krav 12, eller vertscelle ifølge krav 11, i et egnet medium, etterfulgt av gjenvinning av enzymet.

Det er videre beskrevet fremgangsmåte for nedbrytningen av xylan, hvor fremgangsmåten omfatter å kontakte en xylanase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, med en blanding inneholdende xylanet.

Oppfinnelsen vedrører også fremgangsmåte for: delignifiering av tremasse, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter å kontakte tremassen med en xylanase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, ved en temperatur på minst 80°C under betingelser som tillater xylanaseaktivitet.

Den foreliggende oppfinnelse beskriver videre en fremgangsmåte for fremstilling av en xylanase. Fremgangsmåten omfatter dyrking av mikroorganismer eller vertsceller ifølge den foreliggende oppfinnelse i et egnet medium, etterfulgt av gjenvinning av enzymene.

Den foreliggende oppfinnelse beskriver dessuten anvendelse av xylanasene under betingelser som tilsvarer industri-elle anvendelsesbetingelser, ved anvendelse av høy temperatur og høy pH.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre blanding egnet for degraderingen av xylan eller for behandling av tremasse omfattende en xylanase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7 og anvendelse av xylanase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, eller en mikrobiell vertscelle ifølge krav 11, for degradering av xylan eller for delignifiering av tremasse.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1: Fylogenetisk analyse av de interne konsensussekvenser av de seks ekstremofile stammer. Sekvensene be-nevnes som følger; organisme/forover primer/rekombinant antall. Det viste grenantall er verdiene som oppnås fra en boot-strap-analyse av sekvensene. Fig. 2: Sekvensinnretning av interne konsensussekvenser i familien G. Fig. 3: Xylanasedomenet av xynD fra TG456 innsatt som et Sphl-BamHl-fragment i pJLA602. Fig. 4: Papiregenskaper for papir fremstilt fra hardvedmasse TCF bleket som beskrevet i eksempel 15. Ref = intet enzym, 715 = TG456 xynD, 716 = Tg53 xynD. Det er gitt strekk-fasthet (A), porøsitet (B), rivestyrke (C) og bruddstyrke (D) i relasjon til Schoppen-Riegler-verdier. Fig. 5: Papiregenskaper for papir fremstilt fra hardvedmasse ECF bleket som beskrevet i eksempel 15. Referanse = intet enzym, 715 - TG456 xynD, 716 = Tg53 xynD. Det er gitt strekkfasthet (A), porøsitet (B), rivestyrke (C) og bruddstyrke (D) i relasjon til Schoppen-Riegler-verdier. Fig. 6: Papiregenskaper av papir fremstilt fra løsved-masse TCF bleket som beskrevet i eksempel 15. Referanse * intet enzym, 715 - TG456 xynD, 716 TgS3 xynD. Det er gitt strekk-fasthet (A), porøsitet (B), rivestyrke <C) og bruddstyrke (D) i relasjon til Schoppen-Riegler-verdier. Fig. 7: Papiregenskaper av papir fremstilt fra lesved- - masse ECF bleket som beskrevet i eksempel 15. Referanse - intet enzym, 715 = TG456 xynD, 716 - Tg53 xynD. Det er gitt strekkfasthet (A), porøsitet (B), rivestyrke (C) og bruddstyrke (D) i relasjon til Schoppen-Riegler-verdier. Fig. 8: Raffineringskurver som bestemt i eksempel 15 for TCF (A) og ECF (B) bleket hardvedmasse og for TCF (C) og ECF (D) bleket løsvedmasse. Ref ■ intet enzym, 715 TG456 xynD, 716 Tg53.xynD. Fig. 9: En sammenligning av pH-optima (A) og temperaturoptima (B) av TG456 xynD-xylanasen og Pulpzyme HB ^Novo Nordisk). Fig. 10: En sammenligning av termostabiliteten av TG456 xynD-xylanasen og Pulpzyme HB (Novo Nordisk) ved 80°C, pH 7,0

(A) og ved 65°C, pH 9,0 (B) .

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse beskriver mikroorganismer som er blitt isolert fra varme kilder i New Zealand. Disse mikroorganismer er blitt karakterisert som anaerobe termofile bakterier, og er blitt klassifisert ifølge Rainey (1992, PhD-avhandling, University of Waikato, Hamilton, New Zealand).

Mikroorganismene er deretter blitt screenet ved anvendelse av en xylanagar-diffusjonsassay. Stammer som viste en klaringssone i denne test, ble utvalgt som potensielle xylanaseproduserende stammer. Stammene ble dyrket under anaerobe betingelser ved pH 7,0 og T « 75 eller 80°C avhengig av organismen. Etter konsentrering ved ultrafiltrering, ble kulturmediet analysert for xylanaseaktivitet i en analyse ved pH ■ 6,5 og 9 og T « 80°C (eksempel 1) .

Seks forskjellige stammer ble funnet å gi xylanaseaktivitet under de angitte betingelser. Disse mikroorganismer er blitt deponert ved CBS den 14. april 1994 under deponer-ingsnummerne: CBS 211.94, CBS 212.94, CBS 213.94, CBS 214.94, CBS 215.94 og CBS 216.94.

Enzymer som har xylanaseaktivitet, og spesifikt enzymer som har i alle fall en betydelig xylanaseaktivitet ved en temperatur på minst 80°C og en pH på 6 eller høyere kan fremstilles fra de deponerte stammer. Nevnte enzymer kan også fremstilles fra mutanter og varianter av de deponerte stammer.

Med uttrykket "betydelig aktivitet" menes at xylanasene ifølge den foreliggende oppfinnelsen ved 80°C har minst 40% av den aktivitet de har ved 70°C, fortrinnsvis er denne minst 60%, mere fortrinnsvis ca. minst 80%, enda mere fortrinnsvis ca. 200%.

Xylanasene kan bli fremstilt ved en fremgangsmåte omfattende dyrking av de deponerte mikroorganismer ifølge den foreliggende oppfinnelse i et egnet medium, etterfulgt av gjenvinning av de enzymer som har den angitte aktivitet. Isolering og rensing av xylanasen kan gjennomføres ved anvendelse av standard fremgangsmåter kjent i teknologien.

En delvis rensing av enzymene er gitt som eksempel i eksempel 2. I dette eksempel blir cellene først fjernet ved hulfiberfiltrering. Deretter renses proteinet ytterligere ved ammoniumsulfat-tilsetning til en sluttkonsentrasjon på 1 M. Løsningen påsettes deretter på en fenylsefarosekolonne, og proteinet elueres med 1 M.NaCl. Endelig konsentreres proteinet ved ultrafiltrering, og salt fjernes ved diafiltrering.

For å bestemme det xylannedbrytende potensial for xylanasene ved alkalisk pH, er det utført en sammenligning av

aktivitetene av xylanasene isolert fra de angitte stammer ved en pH på 7 og 9 ved anvendelse av forskjellige substrater og en temperatur på 70°C {eksempel 3} . Xylanasene er blitt vist å ha betydelig aktivitet ved alkalisk pH. Avhengig av sub-stratet og analysen, hadde xylanasene ved pH 9 ca. 20% eller mer av den aktivitet de har ved pH 7. Én xylanase ble vist å beholde 80% av sin pH 7-aktivitet ved pH 9.

Termostabiliteten av xylanasene isolert fra de' angitte stammer, vil variere betydelig. Noen av xylanasene er svært termostabile: de har en halveringstid på.mer enn 2 timer ved pH » 9 og ved 80°C (se eksempel 4) . Halveringstiden ved pH = 9,0 og 80°C for xylanasene ifølge oppfinnelsen, er minst 10 minutter, fortrinnsvis vil halveringstiden under disse betingelser være mer enn 20 minutter, mere fortrinnsvis er den mer enn 30 minutter, enda mere fortrinnsvis er den mer enn €0 minutter og mest fortrinnsvis vil halveringstiden være mer enn 120 minutter.

Oppfinnelsen beskriver vektorer, som inkluderer ekspresjonsvektorer, karakterisert ved at de inneholder den DNA-sekvens som koder for xylanasene ifølge den foreliggende oppfinnelse. Det er også beskrevet en mikrobevertscelle karakterisert ved at den transformeres med én av disse vektorer.

Sekvensanalyse av DNA-sekvensene som koder for xylanasene, åpenbarte at de fremstilte sekvenser faller i to grupper av enzymfamilier, dvs. xylanasene av F-typen og G-typen som tidligere definert av Gilkes et,al.,(1991, Microbiol. Rev. 55: 303-315). xynA, xynB og xynC-sekvensene tilhører xylanasene av F-typen; xynD-sekvensene ifølge oppfinnelsen som fremstilles tilhører xylanasene av G-typen (se eksemplene 6, 7, 8 og 9) . Xylanaser av G-typen fra termofile mikroorganismer er ikke blitt beskrevet tidligere så vidt vi kjenner til. De termofile mikroorganismer som er kilden for xylanasene ifølge denne oppfinnelse, er definert heri som mikroorganismer med en optimal veksttemperatur som er høyere enn 65°C. Fortrinnsvis vil den optimale veksttemperatur være høyere enn 68°C, mer fortrinnsvis vil den optimale veksttemperatur være høyere enn 70°C, og mest fortrinnsvis vil den optimale veksttemperatur være høyere enn 75°C.

Ekspresjon av G-type xylanase-DMA-sekvenser ifølge denne oppfinnelse i E. coli, er vist å gi aktive proteiner (se eksempel 10 og 11). Nevnte proteiner er aktive ved en temperatur på 80°C.

Kloningen og ekspresjonen demonstrert i eksemplene i den foreliggende beskrivelse, muliggjør ekspresjon av genene i homologe organismer. Ekspresjonen kan også gjennomføres i andre organismer ved ahvendlese av egnede ekspresjons og sekresjonsregulerende sekvenser. Organismer som velges er i gjær, sopp og bakterier. Spesifikke mikroorganismer inkluderer stammer valgt fra Aspergillus niger, Kluyveromyces lactis og Bacillus licheniformis.

Xylanasene ifølge den foreliggende oppfinnelse er blitt vist å ha en betydelig aktivitet på havrespelt-xylan og på bjerkeved'-xylan.

Xylanasene ifølge den foreliggende oppfinnelse er videre blitt testet for sin blekeevne. Denne blekeevne bestemmes ved delignifieringsaktiviteten av xylanasene ifølge den foreliggende oppfinnelse. Oppfinnelsen beskriver xylanaser (enzymer) som har en signifikant delignifieringsaktivitet, som målt på flere tremasser. Enzymp repar at ene, xylanasene, har evne til å delignifiere tremasse ved en temperatur på minst 80°C. Uttrykket "tremasse" skal tydes i bred forstand, og er ment å omfatte alle typer av lignocellulosematerialer.

Enzymene er blitt testet for sin blekeevne på både hardved og løsvedmasse. Ligninfjerningen er blitt målt ifølge to forskjellige fremgangsmåter (eksempel 5). Lignin i mediet ble bestemt ved A300-testen. I denne test viste alle preparater signifikant delignifieringsaktivietet ved 80°C på både hard- og løsved. Ved pH 9 og 80°C, var aktiviteten på løsved minst 43% av aktiviteten ved pH 6, mens 3 stammer på hardved ved pH 9, viste aktiviteter på mer enn 50% sammenlignet med pH 6, og 3 andre 118-30%. Bleking av løsvedmasse ble også målt ved å bestemme nedsettelsen av lignininnholdet i massen ved anvendelse av kappa-testen. Kappåtallet ble nedsatt med 0,5 til 1,4 enheter etter inkubering av massen ved pH 9 og 80°C med xylanasepreparatene.

Dessuten kan blekekapasiteten av enzymene ifølge den foreliggende oppfinnelse, måles ved f.eks. økningen av ISO-hvitheten av papir fremstilt med konvensjonelt behandlet masse, ytterligere inkubert med nevnte enzymer, sammenlignet med inkubring uten enzymer. Nevnte konvensjonelle behandling omfatter eksponering for blekemidler såsom Ha02, ozon, Cl2 eller ClOa, ifølge teknologien.

De klonede xylanaser av G-typen ifølge oppfinnelsen som uttrykt i E. coli, er også blitt testet for sin yteevne i ECP-blekeeksperimenter på både løsved og hardvedmasse (se eksempel 12). Overraskende har vi observert at xylanasen av G-typen (innkodet av xynD-genene) har en mye bedre yteevne i blekesekvenser på både løsved og hardvedmasse, sammenlignet med xylanasene av F-typen, opp til 6,8% ISO delta hvithet sammenlignet med ikke-enzymkontrollen, som kan sammenlignes med høyst 1,2% ISO hvithetøkning for den beste xylanase for F-typen. Ytterligere testing av de termostabile xylanaser av G-typen viste at de også gir utmerkede resultater i TCF-blekeeksperimenter på både løsved og hardvedmasse (se eksemplene 14 og 15). Verifisering av egenskapene til papiret fremstilt fra den således blekede masse, viste ingen signifi-kante forskjeller fra kontrollpapiret uten enzymer.

De klonede xylanaser av G-typen er høyst termostabile, endog ved høy pH. Det ble målt en halveringstid ved 80°C og pH 7,0 på mer enn 30 minutter. Ved 65°C og pH 9,0, blir halveringstiden for enzymet ikke signifikant redusert, endog etter 120 minutters inkubering (se eksempel 16). Halveringstiden ved pH 9,0 og 65°C for G-type xylanasene ifølge oppfinnelsen, er minst 10 minutter, fortrinnsvis er halveringstiden under disse betingelser mer enn 20 minutter, mere fortrinnsvis er den mer enn 30 minutter, enda mere fortrinnsvis er den mer enn 60 minutter og mest fortrinnsvis vil halveringstiden være mer. enn 120 minutter.

Denne oppfinnelse beskriver DNA-sekvenser som koder for termostabile xylanaser av G-typen, hvorav det interne konsensusfragment (ICF) viser mer enn 80% identitet med det interne konsensusfragment ICF av SEKV. ID NR. 12. ICF av G-typen defineres heri som det fragment som ligger mellom sekvensene tilsvarende SEKV. ID NR. 4 og SEKV. ID NR. 5 i SEKV. ID NR. 12 (nukleotidposisjonene 295 til 623). Fortrinnsvis vil identiteten med ICF av G-typen være mer enn 87%, mere fortrinnsvis vil identiteten være mer enn 95%, mest fortrinnsvis vil identiteten være mer enn 99%.

I en ytterligere utførelse, beskriver denne oppfinnelse xylanasesekvenser av G-typen som har minst 70% identitet felles med aminosyresekvensen av SEKV. ID NR. 13. Fortrinns- . vis er denne aminosyreidentitet høyere enn 80%; mere fortrinnsvis er aminosyreidentiteten høyere enn 90%; enda mere fortrinnsvis er aminosyreidentiteten høyere enn 95%; mest fortrinnsvis er aminosyreidentiteten høyere enn 99%.

Enzymene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes umiddelbart etter oksygendelignifieringstrinnene i massefrem-et ill ingsprosessen beskrevet ovenfor. Som en konsekvens av temperatur- og pH-karakteristikkene for enzymene, kan det unngås utstrakt avkjøling og pH-tilpasning. Enzymene kan også bli anvendt før eller under oksygendelignifieringstrinnet. Før dette trinn, er ligning-konsentrasjonen mye høyere, og derfor vil effekten av anvendelsen av xylanasen være mye større.

Videre.er det beskrevet anvendelser av enzympreparatene ifølge den foreliggende oppfinnelse, og spesielt en fremgangsmåte hvori tremasse blir behandlet med nevnte enzympreparater ifølge denne oppfinnelse.

På lignende måte kan en fluff-masse behandles med enzympreparatene ifølge denne oppfinnelse.

Videre kan papir, kartong og fluff-masse bli laget fra en tremasse behandlet med enzympreparatene ifølge denne oppfinnelse.

Eksempel 1

Isolering av stammer som gir termostabil xylanaseaktivitet

Xylanase-produserende mikroorganismer ble fremstilt fra varme kilder i forskjellige termiske områder i New Zealand. Stammene ble isolért ved in situ-anriking ved anvendelse av havre-spelt-xylan som substrat fra varme kilder med en temperatur på over 70°C, og. en pH mellom 6,0 og 8,5. Kulturer av stammer ble fremstilt ved ytterligere anaerob dyrking i laboratoriet på 2/1-medium pluss xylan ved en temperatur (70°C, 75°C eller 85°C) tilsvarende temperaturen på stedet hvorifra prøven var tatt.

Sammensetningen av 2/1-medium pluss xylan er som følger:

Anaerobt 2/1-medium

PH 7, 9

Dispens, under N2-gass

Wolin' s vitaminblanding SL10 sporelementer, modifisert

Rene stammekulturer ble fremstilt fra enkeltkolonier i agarrullerør. Kulturkonsentrater fremstilt ved ultrafiltrering ble testet for xylanaseaktivitet ved 70°C og 80°C og ved pH 6,5 og 9,0 ved anvendelse av en farget xylanmetode (se nedenfor) og pAHBAH-metoden (se eksempel 3).

Seka stammer som var deponert ved CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultures) er gjengitt i tabell 1.

Farget xylan, sammensatt av lerkevedxylan koblet til Remazol brilliantblått R (Sigma), ble fremstilt ifølge en fremgangsmåte beskrevet av Biely et al. (1985), Anal. Biochem. 144, 142-146. Lerkeved-xylan (6,7 g) ble plassert i 250 ml vann og omrørt i flere timer ved romtemperatur for oppløsning..

Remazol brilliantblått R (10,0 g) ble tilsatt til denne blanding.. Etter oppløsning, ble tilsatt dråpevis 20 ml av en natriumacetatløsning (2,7 g natriumacetat i 20 ml destillert vann). Deretter ble tilsatt en løsning av 6 g NaOH i 70 ml yann, og omrøringen fortsatt i 18 timer. Det fargede xylan som hadde dannet seg, ble felt ut ved tilsetning av 700 ml 96% etanol. Etter henstand i 6 timer, ble bunnfallet fraskilt ved filtrering (Whatman GF/A). Filterkaken ble vasket med 3 liter av en 2:1 blanding av 96% etanol/0,05 M Na-acetat, etterfulgt av 1 liter 96% etanol og 3 liter aceton, inntil filtratet var fargeløst. Utbyttet var 10,5 g farget xylan..

For enzymanalysen, ble 5,1 g farget xylan løst i 150 ml 0,1 M MOPS-buffer, pH 6,8. Blandingen ble omrørt ved 70°C i 4 timer for oppløsning. Etter avkjøling til romtemperatur, ble uløselig materiale fjernet ved sentrifugering ved 10.000 x g.

For aktivitetsanalyse, ble stokkløsningen inneholdende 3,34% w/v farget xylan, fortynnet med 0>1 M MOPS-buffer, pH 6,8 for

.å gi en arbeidsløsning med 0,5% farget xylan. Enzymanalysen ved anvendelse av farget xylan, ble gjennomført ved tilsetning av 0,9 nil farget xylanløshing

(0,5%) til 0,6 ml enzympreparat i en hensiktsmessig-buffer under blanding. En porsjon (0,4 ml) av denne blanding ble overført i 0,8 ml 96% etanol som kontroll (blindprøve). Den gjenværende løsning ble inkubert ved 70°C i 90 minutter. Reaksjonen ble stanset ved overføring av 0,4 ml av testbland-ingen i 0,8 ml 96% etanol. Denne løsning ble etterlatt ved romtemperatur i 30 minutter for å tillate utfelling av uspaltet farget xylan. Testprøvene ble sentrifugert i 5 minutter med full hastighet i en Beckmann mikrofuge E, og absorbansen av superantanten ble målt ved 595 nm i et spektro-fotometer.

Stamme TG 456 produserer G-type xylanase ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 2

Isolering av enzympreparater

Anaerob fermentering ble utført i 2 liter Schott-flasker inneholdende 1800 ml av 2/1 pluss xylanmedium i stasjonær inkubering ved en temperatur på enten 75 eller 80°C (avhengig av den organisme som ble dyrket) i 24 timer. Fra 10 liter av vel dyrket kultur, ble cellene fjernet ved hulfiberfiltrering

i nærvær av 0,01% triton x 100 (Amicon DC 10 LA og Amicon 0,1 um H5MP01-43 filter). Ammoniumsulfat ble tilsatt til det cellefrie kulturmedium til en sluttkonsentrasjon på 1 M. Den resulterende løsning ble pumpet inn på en 9 x 15 cm kolonne inneholdende 1 liter fenylsefarose (Pharmacia-Fast Flow-low subst i tut ion) ekvilibrert med 1 M ammoniumsulfat. Strømnings-1 hastigheten var 150-200 ml/minutt. Kolonnen ble vasket med 5 liter av 1 M ammoniumsulfat.. Xylanasen ble eluert med 5 liter 1 M NaCl. Fraksjonene ble oppsamlet i 500-1000 ml volumer. Xylanaseaktiviteten ble bestemt (med PAHBAH-metoden som beskrevet i eksempel 3) i.fraksjonene, og de aktive fraksjoner; ble slått sammen, ultrafiltrert til et lite volum og diafiltrert for å redusere saltkonsentrasjonen ved anvendelse av en Amicon Stirred Cell (modell 2000A eller 8400) med en YM2 -membran.

Eksempel 3

Karakterisering av xylanaseaktiviteter av

de delvis rensede enzympreparater

Analytiske metoder

Analyser for xylanaseaktivitet ble gjennomført ved anvendelse av modifiserte fremgangsmåter av Sumner-analysen (Sumner et al., 1921, J. Biol. Chem. 47:5-9). Alternativt ble xylanaseaktiviteten bestemt ved anvendelse av en modifisert PAHBAH-assay, basert på en fremgangsmåte fra Lever (1973,

Biol. Med. 1:274-281).

Fremgangsmåte 1

Sumner- assay av xylanaseaktivitet på havrespelt- xylan

En substratløsning av havrespelt-xylan fremstilles som følger: 4 g havrespelt-xylan slemmes opp i 100 ml avmineral-isert vann. Suspensjonen ultralydbehandles i 6 minutter (sonikator: Sonics & Materials, Vibracell type VC 250 B), inkuberes ved 100°C i. 10 minutter, og sentrifugeres i 10 minutter ved 10.000 opm i en Sorvall RC-SB sentrifuge. Supernatanten anvendes som substraløsning og inneholder ca. 2% havrespelt-xylan.

Analysen utføres som følger: Et prøverør fylles med 200

ul havrespelt-xylanløsning, 600 pl alikvoter av enzympreparat (eksempel 2) fortynnet i hensiktsmessig buffer.: Prøverøret inkuberes under målebetingelser i et vannbad i 15 minutter. Etter inkuberingen tilsettes 7,2 ml DNS-reagens (dinitro-salicylsyre). Blandingen oppvarmes i vannbad ved 100°C i 10 minutter, hvoretter prøverøret avkjøles på is. Absorbansen måles ved 575 nm; For å.eliminere bakgrunnsabsorbansen av enzymprøvene, utføres et kontrolleksperiment som følger: et rør inneholdende substrat uten enzympreparat blir inkubert under de samme betingelser som testprøvene. Etter 15 minutters inkubering, tilsettes 7,2 ml DNS og enzymprøven i denne (rekkefølge)<

Én enhet av xylanaseaktivitet (xU) defineres som den mengde enzym som gir 1 umol av xyloseekvivalent, målt som reduserende sukker.

Aktuelle målebetingelser var pH 7,0, 9,0 og 70°C. Ved pH 7 ble det anvendt en 50 mM fosfatbuffer, og ved pH 9 en 50 mH borat/KOH-buffer.

Fremgangsmåte 2

Sumner- assay av xylanaseaktivitet på bjerkeved- xylan

Det anvendes i alt vesentlig den samme fremgangsmåte som beskrevet i fremgangsmåte 1. Istedenfor en havrespelt-xylan-løsning anvendes en bjerkeved-xylansuspensjon. En substrat-løsning av bjerneved-xylan fremstilles som følger: 4 g bjerkeved-xylan slemmes opp i 50 ml 0,2 N NaOH og omrøres inntil synlig oppløsning. Løsningens pH justeres til 7,0 med iseddiksyre, vann tilsettes til .100 ml, og løsningen sentrifugeres ved 10.000 opm i en Sorvall RC-SB-sentrifuge. Supernatanten anvendes som substratløsning og inneholder ca. 3% bjerkeved-xylan. TestbetingeIsene var pH 7 og 9 og 70°C. Resultatene er vist i tabell 3.

Fremgangsmåte 3

PAHBAH- assay av xylanazeaktivitet på havrespelt- xylan

Modifiseringen av PAHBAH-metoden (Lever, 1973) er av PAHBAH-reagenset, som følger: 0,05 M trinatriumsitrat, 0,1 M NaaS03( 0,02 M CaCl2, 0,5 M NaOH og .0,1 M p-hydroksybenzosyre-hydrazid (PAHBAH).

For analysen av enzympreparatene blir 0,05 ml eller 0,1

ml av enzympreparatet blandet med 0,3 ml substratbuffer (50 mM bis-Tris-propan, pH etter behov -f 0,2 % havrespelt-xylan i suspensjon). En passende mengde vann tilsettes til et slutt-volum på 0,5 ml. Inkuberingen gjøres vanligvis ved 70°C i 30 minutter. For å stanse reaksjonen tilsettes 1,0 ml PAHBAH-reagens etter inkuberingen, og prøvene oppvarmes ved 100°C i 6 minutter. Blindprøvene består av substratbuffer inkubert identisk med prøven, hvortil enzymet blir tilsatt etter PAHBAH-reagenset. Før bestemmelse av absorpsjonen ved 420 nm, blir alle prøver sentrifugert i 1 minutt med full hastighet i en Beckman mikrofuge E for å fjerne suspendert xylan fra supernatanten. Resultatene er vist i tabell 4. Ut ifra denne tabell, kan det konkluderes at ved pH 9,0, 80°C vil alle stammer fremdeles ha en betydelig aktivitet Sammenlignet med pH 6,0, 70°C.

Eksempel 4

Termostabilitet av xylanaseaktiviteter

Halveringstiden for xylanaseaktiviteten av enzympreparat-éne ble bestemt som følger. Enzympreparatet ble fortynnet 1/10 i 100 mM TAPS-buffer (pH 9,0 ved 80°C) og inkubert ved 80°C En prøve ble tatt ut ved 0, 10, 20, 40, 60 og 120 minutter og tilsatt til 100 mM MOPS-buffer (pH 6,0 ved 70°C) på is, til en sluttfortynning på 1/20 til 1/100 som hensiktsmessig for den endelige analyse. Prøvene ble holdt på is inntil de ble analysert ved 70°C og pH 6,0 ved anvendelse av PAHBAH-assaymetoden som beskrevet i eksempel 3, fremgangsmåte 3. Resultatene er vist i tabell 5.

Eksempel 5

Delignifie ringsakt iviteter

Delignifieringskapasiteten til xylanasene ble bestemt med to forskjellige fremgangsmåter. Ved anvendelse av A300-metoden blir det anslått mengden av lignin frigjort fra massen . etter enzymbehandlingen. Ved anvendelse av kappa-analysen måles det gjenværende lignininnhold av massen etter be-handlingen.

Metode 1: A300- test

For måling av delignifieringen med A300-analysen, ble enzympreparatene inkubert med løsved- eller hardvedmasse ved en konsentrasjon på 2 PAHBAH-enheter pr. g fuktig masse (ca. 6 PAHBAH-enheter/g tørr masse). Inkuberingene ble gjennomført i

2 timer ved 80°C både ved pH 6,0 i MOPS-buffer, og ved pH 9,0 i TAPS-buffer. Massekonsentrasjonen ved inkuberingen var 0,1 g fuktig vekt pr. ml. Det ble anvendt to forskjellige typer masse: Kraft-løsvedmasse etter oksygendelignifiering, og Kraft-hardvedmasse etter oksygendelignifiering. Egenskapene

til disse masser er gitt i tabell 6.

Den mengde lignin som ble fjernet fra massen, ble bestemt ved å måle absorbansen av supernantanten ved 300 nm, etter fraskilling av supernantanten fra massen ved sugefiltrering. gjennom et Whatman GF/C-filter båret på et sintret glass-filter. Resultatene av A300-testen er vist i tabell 7.1 denne analyse, er delta A300-verdier på > 0,2 signifikant høyere enn bakgrunnsnivået. Dette eksempel viser derfor at enzymene har en signifikant delignifieringsaktivitet ved 80°C.

Metode 2; Kappa- testen

Kappa-testene ble gjennomført ifølge TAPPI-protokoll T236 (tilgjengelig fra TAPPI, Technology Park, Atlanta, USA), med noen modifikasjoner. Enzympreparatet ble tilsatt i en dose på 10 x U/g masse (tørrvekt), og inkubert i 2 timer ved pH 9, 80°C. Som kontroll ble masse inkubert for det samme tidsrom under de samme betingelser uten enzymtilsetning. Det ble anvendt, oksygendelignifiert løsved, for egenskaper se tabell 6.

Forskjellen mellom kappatallet med enzymtilsetning og kappåtallet uten enzymtilsetning kalles kappareduksjonen, og er en verdi for delignifieringen. Kappareduksjonene er vist i tabell 8. I denne analyse er verdier på > 0,5 signifikant høyere enn bakgrunnsnivået. Som i det foregående eksempel, viser dette eksempel følgelig at enzymene har en signifikant delignifieringsaktivitet ved 80°C.

Eksempel 6

Kloning og sekvensbestemmelse av interne konsensusfragmenter av gener som koder for termostabile xylanaser av F- typen 6. 1 PCR- amplifikasjon av interne fragmenter av xylånasegener

Tre PCR-primere ble anvendt til amplifikasjon av interne konsensusfragmenter av xylanasegéner; to forskjellige forover-primere (xynFA, (S( CAC ACK CTK GTK TGG CA 3', SEKV. ID NR. 1) og xynFB (5' CAT ACK TTK GTT TGG CA 3', SEKV. ID NR. 2) Og én reversprimer (xynR (TMG TTK ACM ACR TCC CA, SEKV. ID NR. 3) . xynFA og xynFB-primerne bandt seg i den samme lokalisering,

men var noe forskjellige i sekvens på grunn av små forskjeller i sekvensen av xylanasegenene i fremoverkonsensusregionen. PCR-betingelsene var som følger: (94°C 1 minutt, . 50°C 1 minutt, 72°C 1 minutt) x 30. Alle familie-F-interne konsensusfragmenter var ca. 350 bp.

6. 2 Sekvensbestemmelse av PCR- produkténe

Alle interne xylanase-PCR-produkter (ca. 350 bp) ble endereparert (tilbakefylt) som beskrevet nedenfor før kloning inn i Smal-setet (fosfatasert) av Ml3mp 10 sekvenserings-vektoren.

Trinn 1 - Ammoniumacetatfelling:

(a) Det lages 50 ul PCR-blanding til 100 ul med TE-buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0).

(b) Tilsett 100 ul 4 M CH3COO-NH4<*> og 250 pl 100% CH3CHa0H.

(c) Det inkuberes på is i 15 minutter (eller over natten ved -20°C) . (d) Det sentrifugeres ved 16000 opm i 15 minutter og supernatanten kastes. (e) Pelle ten vaskes i 500 pl kald 70% CH3CHaOH. Det sentrifugeres om igjen (16000 opm, 5 minutter) og supernatanten kastes. (f) Pelleten tørkes under vakuum i 5 minutter og slemmes opp igjen i 20 pl TE-buffer.

Trinn 2 - Ende-reparasjon av PCR-fragmenter:

(a) Til 20 pl utfelt DNA tilsettes: 3 pl 10x ligasebuffer (Boehringer Mannheim), 1 pl. 12,5 mM dNTP'er (Pharmacia DNA-polymeriseringsblanding), 0,5 pl (5 U) E. coli DNA-polymerase stort (Klenow) fragment (BRL technologies Ltd), 0,25 pl {2,5

U) T4 DNA-polymerase (Boehringer Mannheim), 0,25 pl (2,5 VJ) T4-polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim) og HaO opptil 30 Pl. (b) Det inkuberes ved 37°C i 30 minutter, og enzymene varme-drepes ved inkubering ved 70°C i 10 minutter.

Trinn 3 Gelrensing av det endereparerte xylanasefragment: (a) DNA kjøres gjennom 2% LMP-agarose i lx Tris-acetatbuffér (pH 7,8).

(b) Det 350 bp xylanasebånd skjæres ut fra agarosen.

(c) DNA renses fra agaroseskiven ved anvendelse av GenéClean<c->fremgangsmåten (Bio 101 Inc.).

Trinn 4 - Ligering inn i Ml3mp 10 (Smal-fosfatasert):

(a) Det blandes sammen 1 pl Ml3mp 10 vektor-DNA (hensiktsmessig fortynnet til ca. 10 ng/pl), 20-50 ng innskudd-DNA (xylanasekonsensus-primerfragment), 1 pl 10x ligase-buffer

(Boehringer Mannheim), 1 ul T4 DNA-ligase (Boehringer Mannheim) og Ha0 opp til 10 ul.

(b) Det inkubres over natten ved romtemperatur.

Trinn 5 - Transformasjon av ligeringsblanding inn i Escherichia coli-stamme JM101: (a) JMlOl transformeres med den hele 10 ul ligeringsblanding ved anvendelse av den DMSO-medierte transformasjonsteknikk til Chung et al. (1989, Proe. Nati. Acad. Sei. 86: 2172-2175). (b) M13/JM101 plates ut, og rekombinante M13-plasmider isoleres ved anvendelse av standard fremgangsmåter (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press).

Rekombinant Ml3-fag inneholdende interne xylanase-konsensusfragmenter ble sekvensert fra ssDNA (Sambrook et al., 1989) på en Applied Biosystems 373A automated DNA sequencer ved anvendelse av fargestoff-primerkjemi (den anvendte sekvenseringsprimer var den universelle ,M13^ forover (fargestoff merkede) primer, ABI Ltd.). Alle DNA-sekvensdata ble analysert og manipulert ved anvendelse av G CG sekvensanalyse software (installert på Irix) kjørt på en Silicon Graphics Personal Iris Workstation.

Familie F- xylanase interne fragmentsekvensresultater:

Basert på PCR-fragmentene som ble oppformert fra de seks stammer gjengitt i tabell 1 ved anvendelse av xylanase-konsensusprimerne, ble det forutsett av hver organisme inneholdt mellom 1 og 3 familie F xylanasegener. Resultatene er blitt analysert via den velkjente boot-strap-analyse (Wisconsin Molecular Biology Package, Devereiix, 1984, Nucleic. Acids Res. 12, 387-394). I fig. 1 er vist et dendogram av de forskjellige xylanaser og stammer. Ut ifra nukleotidsekvens-ene av familie F-konsensusfragmentene, synes det nå som om hver organisme vil inneholde tre forskjellige familie F-gener.

Hver av familie F-xylanasegenene i hver organisme tilhører en forskjellig xylanase-cluster (basert på nukleotid og primære aminosyresekvenshomologier), nå betegnet som cluster A, cluster B og cluster C. Xylanasen i full lengde oppformert fra TG 456, tilhører cluster A, og er deretter blitt betegnet TG 456 xynA. I tillegg er det blitt identifisert interne konsensusfragmenter fra en TG 456 cluster B-xylanase (TG 456 xynB) og en cluster C-xylanase (TG 456 xynC).

Eksempel 7

Kloning og sekvensbestemmelse' av interne konsensusfragmenter

av gener som koder for termostabile G- type xylanaser

7. 1 PCR- ampiifikasjon av interne fragmenter av G- type xylanasegener

Familie G interne konsensusfragmenter (ICF<*>er) ble isolert med polymerasekjedereaksjonen (PCR) ved anvendelse av den forover og reverse familie G-konsensusprimer (GF og GR). PCR-profilen var som følger:

n.b. dC refererer til grader celsius.

x refererer til antallet cykler (dvs. x 1 tilsvarerer én cyklus).

(94°C, 4 minutter) x 1

(94<*>C, 1 minutt; 45°C, 1 minutt; 72°C, 1 minutt) x 35 (94°C, 1 minutt; 45°C, 1 minutt; 72°C, 6 minutter) x 1

PCR<1>ene ble gjennomført i 50 pl reaksjoner ved anvendelse av følgende bestanddeler: 100 ng GF-primer; 100 ng GR-primer; 0,25 mM dNTP'er; 1 Unit Taq polymerase; 0,25 mM MgCl2; 10 mM Tris-HCl, pH 8,8; 50 mM KCl; 0,001% gelatin; 1-10 ng templat-DNA.

To PCR-primere ble anvendt til å oppformére konsensusfragmenter av xylanasegener: GF: TATNTGRSTNTMTATGGQTGG (forover intern konsensusprimer) SEKVi ID NR. 4.

GR: CCGCTNCTTTGGTANCCTTC (revers intern konsensusprimer)

SEKV. ID NR. 5.

Med alle seks stammer ble det funnet et PCR-fragment etter ampiifikasjon med konsensusprimerne.

To typer av PCR-produkter {DNA-fragmenter) ble oppformert: et 300 bp fragment av den forventede størrelse, pluss et uventet 600 bp PCR-produkt - dette 600 bp fragment var en hode-til-hale dimer av 300 bp PCR-produktet; antagelig var denne 600 bp type et resultat av selv-priming under PCR-reaksjonene, som en konsekvens av homologi mellom GF og GR-primerne.

7. 2 Sekvensbestemmelse av PCR- produktene

De 300 bp fragmenter oppformert fra hver organisme, ble endereparert (se eksempel 6).

De endereparerte fragmenter ble deretter renset fra en 1% agarosegel med lav smeltetemperatur (kjørt i Tris-acetat kjørebuffér) ved anvendelse av Geneclean-fremgangsmåten (Bio 101, La Jolla, California).

Ca. 10 ng av de endereparerte og gelrensede 300 ICF'er ble ligert inn i Smal-setet av Ml3mpl0 ved anvendelse av BM T4 DNA-ligase, i 10 ul reaksjoner

7. 3 Sekvensbestemmelse av PCR- produktene

Seks uavhengige fager som skrev seg fra stammene TG4S7 og TG53, ble sekvensert. Ut ifra innretningene (fig. 2) synes det som om bare et enkelt G-type xylanasegen er tilstede i hver av disse stammene. I tillegg ble det sekvensert M13mpl0-rekombinanter inneholdende familie G ICF'er fra TG453, TG456, TG479 og TG631. Disse organismer inneholdt alle et familie G-xylanasegen som koder for en i alt vesentlig identisk xylanase, selv om variasjoner i DNA-sekvensen er opp til 13%.

Eksempel 8

Sekvens av F- type xylanaser i full lengde

På- basis av de interne PCR-fragmenter er det identifisert tre forskjellige typer av F-xylanasegener: xynA, xynB og xynC. Ved anvendelse av genom Walking-PCR (GWPRCR) er det blitt isolert xylanasegener i full lengde fra de fleste av stammene.

Sekvenser i full lengde av TG456 xynA-genet ér blitt bestemt. Den komplette sekvens av xynA-genet er gitt i SEKV. ID NR. 6. Den innkodede aminosyresekvens av TG456 xylanase A er gjengitt i SEKV. ID NR. 7.

For xynB og xynC ble det oppdaget at genene koder for multidomeneenzymer med ett xylanasedomene. Disse xylanase-domener er blitt subklonet ved anvendelse av PCR-primere designet på sekvenser i utkanten av xylanasedomenet.

Den partielle sekvensinformasjon for xynB og xynC-genene som skriver seg fra TG456, er gitt i henholdsvis SEKV. ID NR. 8 og SEKV. ID NR. 10. De innkodede aminosyresekvenser av TG456 xylanasene B og C er gitt i henholdsvis SEKV. ID NR. 9 og SEKV. ID NR. 11.

Eksempel 9

Komplett sekvens av G- type xylanasegener

Ved anvendelse av genom Walking PCR (GWPRCR) er xynD-genene i full lengde blitt isolert fra de fleste av stammene.

Den komplette sekvens for xynD-genet av TG4S6 er gitt i SEKV. ID NR. 12 bg den innkodede.TG4S6 xylanase-D-aminosyresekvens er gitt i SEKV. ID NR. 13.

Eksempel 10

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer og verter

for xylanaseproduksjon fra klonede gener

I konsensus PCR-primerne er det blitt utformet hensikts-messige restriksjonsseter som tillater subklonig av xylanasegener i egnede ekspresjonsvektorer.

xynA og xynC-genene blir innsatt ved NcoI-BamHI i pJLA602-ekspresjonsvektoren (Schauder, B., Blucker, H., Frank,

R. og McCarthy, J.E.G. (1987). Inducible Expression Vectors Incorporating the Escherichia coli atpE Transcriptional Initiation Region. Gene 52: 279-283)) for i rammefusjon med lambda L og R-promotorene (Gibbs, M.G., Saul, D.J., Luthi, E.

og Bergquist, P.L. (1992). Beta-mannanasen fra "-Caldocellum saccharolyticum" er del av et multidomeneenzym. Appl. Environ. Microbiol. 58 (12): 3664-3867).

XynB og xynD-gener ble innsatt i de unike Sphl-BamHI-setene av pJLA602.

Konstruksjonene ble overført til vertene E. coli JM101 og E. coli DK5a ved anvendelse av standard transformasjons-teknikker.

Fig. 3 viser sekvensen av xylånasedomenet av xynD fra TG456 innsatt i pJLA602 som et SphI-BamHI-fragment.

Eksempel 11

Fremstilling og gjenvinning av klonede xylanaser

For å oppnå proteinprøver fra de klonede xylanaser av F-typen, ble E. coli-klonene fermentert i en LH-fermentor med 10,0 liter kapasitet (serie 210). Kulturen ble holdt ved 30°C inntil induksjon (42°C) med kontinuerlig gjennomlufting (4,8 liter/minutt), omrøring (500 opm) og pH-kontroll (pH 7,1). De anvendte media og andre tilsetninger er gitt nedenfor:

Lura-substrat (for inokulumkulturer):

BGM2 bulk- vekstmedium for fermentorforsøk ( mengder er for sluttmedium, dvs. 2 satser å 8, 5 liter):

Etter at fermentorbeholderen, med ca. 6 liter vann i den, var sterilisert ved autoklavering ved 121°C i 30 minutter, ble den avkjølt til 30°C. Mediakonsentratet (8,5 gangers konsentrat) ble pumpet gjennom et sterilt 0,2 um patronfilter (Sartorius) . ,', Før. inokulering ble følgende tilsetninger gjort:

Væskevolumet ble deretter justert til 8,5 liter* pH av media ble justert til 7,1. Filtersterilisert luft ble spylt gjennom fermentoren ved en strømningshastighet på 4,8 liter pr. minutt. Fermentortemperåturen ble holdt på 30°C ved sirkulasjon av varmt og kaldt vann gjennom fingerprobene. pH-kontrollen var ved tilsetning av autoklavert NaOH (5 M) eller H4SO4 (2 M). Fermentorrørerhastigheten var 500 opm.

Inokuleringen ble initiert med en alikvot (ca. 10,0 ml) av en frisk kultur av E. coli-klonen dyrket i Luria-substrat med 100 ug/ml ampicillin ved en OD«50 på 0,2 til 0,4. Cellene ble dyrket til en OD650 på mellom 11 og 13 ved 30°C, deretter ble de satsmatet. med et mediumkonsentrat, fikk gjenvinne seg . og ble dyrket til en OD€50 på mellom 14 og 16. De ble deretter indusert ved å heve temperaturen til 42°C.

Cellene ble høstet 4 timer etter at maksimum OD6S0 var nådd... Cellene ble gjenvunnet ved hul fiber f iltrering (0,1 pm, Amicon) og slemmet opp igjen i 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7,5 mM EDTA, 7,5 mM fi-merkaptqetanol, 0,02% PMSF, 1,0 pM pepstatin A, 0,02% DNase og 0,02% lysozym og inkubert ved 4°C i 1 time (totalvolum på ca. 1 liter). Cellene ble ultralydbehandlet på is i 160 ml satser i 4-6 minutter i trykkbølger på 1 minutt inntil de var lyset (overvåket ved mikroskopi). En alikvot av 56 mM PMSF (i isopropanol) ble tilsatt (hver tilsetning tilsvarende 16.0 pM) hvert andre minutt av ultralydbehandlingen til en sluttkonsentrasjon på ikke mer enn 1 mM PMSF. Etter at lysen var fullstendig, ble celleavfallet fjernet ved sentri-fuger ing. Supernatanten ble varmebehandlet ved 70°C inntil det foregikk åpenbar utfelling av protein (vanligvis ca. 20-30 minutter), og det denaturerte protein ble fjernet ved sentri-fuger ing. Før fenyl-sefarosekromatografi, ble ammoniumsulfat tilsatt 'til den varmebehandlede supernantant til en- sluttkonsentrasjon på 1,0 M (dette.kalles det første varmebehandlingsekstrakt). Cellepelleten avledet fra de ultralyd-behandlede celler, ble reekstrahert ved oppslemming i 1,0 liter av 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 7 mM fi-merkaptoetanol, etterfulgt av en andre varmebehandling ved 70°C i 15 minutter, og det utfelte protein ble igjen fjernet ved sentri-fuger ing. Denne ble funnet å ekstrahere ytterligere 20-40% av xylanasen, og ble benevnt det andre varmebehandlingsekstrakt.

Ammoniumsulfat ble tilsatt til dette varmebehandlingsekstrakt nr. 2 til 1,0 M, og varmebehandlingsekstraktene nr. 1 og nr. 2 ble slått sammen før fenylsefarose-separasjonen. Xylanaseaktiviteten ble eluert i trinn fra fenylsefarose-kolonnen med 1100 ml sjiktvolum (etter inngående vasking med 1,0 M ammoniumsulfat og retur til basislinje) ved anvendelse av 1,0 M NaCl, og det eluerte protein ble konsentrert og avsaltet ved ultrafiltrering med en YM3 membran (Amicon). Slutt-konsentrasjonen av preparatene er 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 7 mM £-merkaptoetanol, ca. 250 mM NaCl, 20% glycerol og 0,05% natriumazid.

Por fremstilling av xylanasene av G-type, var fremgangsmåten hesten identisk med den beskrevet ovenfor, bortsett fra. at HEPES-buffer ble anvendt istedenfor Tris-HCl for både ekstraksjonstrinnet (pH 8,0) og avsaltingstrinnet (pH 7,3). Sluttpreparatet hadde en buffersammensetning av 50 mM HEPES, pH 7,3, 1 mM EDTA, 7 mM fi-merkaptoetanol, 0,05% natriumazid, 20,0% gl<y>cerol. og + 250 mM NaCl.

Tilsammen seks preparater av F-typen (5 xynA og 1 xynB) og to preparater av G-typen av tilstrekkelig renhet ble fremstilt. For både F-type og G-typepreparatene, ble protein-konsentrasjonen bestemt ved standard BCA-metoden (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Renheten av prøvene ble-grovt anslått ved å kjøre en SDS-PAGE-gel {Phast-system, Pharmacia,' 20% gel) og sammenligne tykkelsen av båndet ved ca. 40 kDa for F-typen, og ca. 25 kDa for G-typen, med tykkelsen av båndene av urenhetene. Renheten av prøvene varierte mellom 20 og 70%

(tabell 9).

Eksempel 12

BCF- blekeresultater med klonede xylanaser av F- og G- typen

ECF-bleking ble gjennomført ved anvendelse av oksygen-delignif iert Kraft-masse fra en svensk massefabrikk. Løsved-massen (SW) hadde et kappatall på 16,0, og hardvedmassen (HW) et kappatall på 10,6. En XDED-sekvens ble anvendt under betingelser som presentert i tabell 10.

Resultatene av disse eksperimenter er gjengitt i tabell 11. Det kan sees at xylanasene av G-typen har signifikant bedre ytelse sammenlignet med xylanasene av F-typen, når de sammenlignes på basis av enzymprotein.

<1>"<s>) refererer til seks forskjellige eksperimenter. Referanseverdiene for ISO-hvithet av disse eksperimenter var som følger: eksperiment 1: 73,5; eksperiment 2: 78,3; eksperiment .3; 52,0; eksperiment 4: 52,3; eksperiment 5: 79,0; eksperiment 6: 80,5.

Eksempel 13

ECF doseresponskurver med klonede G- type xylanaser

Ved anvendelse av den samme XDED-blekesekvens som beskrevet i eksempel 12, ble doseringen av de to xylanaser av G-typen variert. Resultatene er vist i tabell 12. Doseringer av 1 til 3 ug/g masse gir allerede en økning i ISO-hvithet på minst to poeng.

Eksempel 14

TCF- blekeresultater med klonede G- type xylanaser

De to xylanasene av G-typen ble testet i en TCF-blekesekvens ved anvendelse av XOPP-sekvensen som beskrevet i eksempel 15 (nedenfor). Oksygendelignifiert hardvedkraftmasse ble anvendt (30 g o.d. pr. prøve). Doseringen av G-type xylanasene ble variert som angitt i tabell 13. ISO-hvithets-verdier oppnådd for hver prøve etter X, Pl og P2-trinnene, er gitt i tabell 13. Verdiene representerer gjennomsnittet av duplikate prøver.

Eksperimentet ble gjentatt ved anvendelse av doseringer på 3 og 6 ug protein pr. g masse. Bare hvithetsverdiene oppnådd etter P2-trinnet ble bestemt. Resultatene er presentert i tabell 14.

Eksempel 15

ECF og TCF- resultater, innbefattet papiregenskaper

Xylanaseprøver ble testet for blekeeffekt i ECF og TCF-bleking av en Kraft H/W og en Kraft S/W-masse levert fra en svensk massefabrikk. De klonede TG456 xynD og TG53 xynD (i. dette eksempel referert til som henholdsvis 715 og 716) blir sammenlignet med referanseprøver med "intet enzym". Raffiner-ingstestene i en Lampen kulemølle viste at 715 ga den totalt beste yteevne med betydelige forbedringer i rivestyrke og intet signifikant tap i strekkfastbet og bruddstyrke.

Sc reen i ngprotokol1 Egenskaper av ubleket masse

Blekeparametere som skal testes

TCF

ECF

BlekébetingeIser

A) TCF H/W og S/W (Samme blekebetingelser for begge masser)

x

fu

O

ra

W

b.

O

W

o

9 u

ns

in

s

H

rH

«I A

•rt •U *i •ri i (3 O» -n Dl

O

<H

C

0) 8 0)

(3 0)

E

•H

u

<u

Cu

a

M

4>

•H

3 1 04 o «d

v

I) a U ri 0 —' 4J rH VO 3 rH a

2 <g1>

Verifisering av papiregenskaper

Etter at alle sekvensene var fullstendig bleket, ble 30 g prøver tatt og raffinert i en Lampen-kulemølle med 10, 20 og 30 tusen omdreininger. Schopper-Rieglers ble målt, hvoretter ca. 2 g ark ble laget for bestemmelse av strekkfasthet, porøsitet, rivestyrke og bruddstyrke. Arkene ble etterlatt til kondisjonering i 24 timer ved 23°C og 50% releativ fuktig-het. De oppnådde resultater er gjengitt i fig. 4-6.

Eksempel 16

pH- optimum, temperaturoptimum og termostabilitet av TG456 xynD

Aktivitetene ble målt som beskrevet i eksempel 2, fremgangsmåte 1, med havrespelt-xylan som substrat.. Alle analyser ble gjennomført i 50 mM fosfatbuffer, ved den pH og temperatur som er angitt. Resultatene er gjengitt i fig. 9 og 10.

TG456 xylanase D er mye mer termostabil enn referanse-enzymet Pulpzyme HB (Novo Nordisk), og det har et noe høyere pH-optimum.

Claims

1. Xylanase, karakterisert ved at den har en signifikant delignifieringsaktivitet ved en temperatur på minst 80°C ved en pH 9,0 og omfatter en aminosyresekvens som har minst 70% identitet med hele aminosyresekvensen av SEKV ID NR: 13.

2. Xylanase ifølge krav 1, som har en halveringstid ved 80°C og pH 9,0 på mer enn 10 minutter.

3. Xylanase ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at: a) xylanasen er en G-type xylanase, og b) xylanasen er avledet fra en termofil organisme med en optimal veksttemperatur høyere enn 65°C.

4. Xylanase ifølge krav 3, karakterisert v e d at den termofile organisme er anaerob.

5. Xylanase ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at xylanasen har en halveringstid ved 80°C og ved pH .7,0 på mer enn 10 minutter.

6. Xylanase ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at xylanasen har en halveringstid ved 65°C og ved pH 9,0 på mer enn 10 minutter.

7. Xylanase ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at xylanasen er avledet fra en stamme deponert under følgende deponeringsnumre: CBS 211.94, 212.94, 213.94, 214.94, 215.94 og 216.94.

8. Isolert og renset DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for en xylanase ifølge hvilket som helst av de foregående krav.

9. DNA-sekvens ifølge krav 8, karakterisert v ed at den omfatter en sekvens som har minst 80% identitet med hele den kodende sekvensen av SEKV ID MR: 12.

10. Vektor, karakterisert ved at den inneholder DMA-sekvensen ifølge krav 8 eller 9.

11. Mikrobevertscelle, karakterisert ved at den har blitt transformert med vektoren ifølge krav 10, eller inneholder som heterolog DMA, en sekvens ifølge krav 8 eller 9.

12. Isolert mikroorganisme karakterisert som en anaerob og termofil bakterie og som har deponeringsnummer CBS 211.94, 212.94, 213.94, 214.94, 255.94 og 216.94.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en xylanase, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter dyrking av en mikroorganisme ifølge krav 12, eller vertscelle ifølge krav 11, i et egnet medium, etterfulgt av gjenvinning av enzymet.

14. Fremgangsmåte for nedbrytningen av xylan, hvor fremgangsmåten omfatter å kontakte en xylanase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, med en blanding inneholdende xylanet.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvori xylanasen anvendes ved en temperatur på 80°C eller høyere.

16. Fremgangsmåte for delignifiering av tremasse, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter å kontakte tremassen med en xylanase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, ved en temperatur på minst 80°C under betingelser som tillater xylanaseaktivitet.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at xylanasen anvendes før, under eller etter oksygendelignifieringstrinnet.

18. Blanding egnet for degraderingen av xylan eller for behandling av tremasse omfattende en xylanase ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7.

19. Anvendelse av xylanase ifølge et hvilket somhelst av kravene 1-7, eller en mikrobiell vertscelle ifølge krav 11, for degradering av xylan eller for delignifiering av tremasse.