FI119436B - Termostabiilit ksylanaasit - Google Patents

Description

119436

Termostabiilit ksylanaasit Tekniikan ala Tämä keksintö koskee uusia mikro-organismeja ja uusia entsyy-5 mejä. Tarkemmin entsyymit ovat lämmönkestäviä ksylanaaseja. Näitä ksylanaaseja saadaan anaerobisista termofiilisistä bakteereista. Ksylanaaseja voidaan käyttää paperi- ja selluteollisuudessa käytettävissä olosuhteissa, esim. pH:ssa yli 9 ja lämpötilassa yli 70 °C, erityisesti entsyymit ovat aktiivi-10 siä, kun t = 80 °C.

Keksinnön taustaa

Ksylaani on kasvihemiselluloosan osa. Ksylaani koostuu β-D-ksyloosirungosta, joka on sitoutunut 1,4-glykosidisidoksin.

15 Yleensä ksylaaneilla on sivuketjuja tai ryhmiä, jotka käsittävät ksyloosia ja muita pentooseja, heksooseja, uronihappoja ja asetyyliryhmiä.

Sellun valkaisu on tärkeä vaihe paperintuotantoprosessissa.

20 Sellun käsittelyyn paperi- ja selluteollisuudessa käytettävä prosessi suoritetaan kaavamaisesti kuvattuna seuraavasti: ·:··· Sellua käsitellään pH:ssa 10 - 12 lämpötilassa 80 °C, jotta saadaan poistetuksi suurin osa ligniinistä niin sanotussa • ♦ . 25 ligniinin happipoistovaiheessa. Jäljelle jäävä sellu sisältää Φ · · * * * .··., 2 - 5 % ligniiniä. Tästä ligniinistä johtuu sellun ruskea vä- • · "I ri. Tämän jälkeen sellu valkaistaan monivaiheisessa valkaisu- • · · • · · *" prosessissa. Tässä valkaisuprosessissa käytetään kemikaaleja, • · · *·* * kuten klooria, klooridioksidia, vetyperoksidia ja/tai otso- 30 nia, jotta saadaan kirkasta sellua korkealaatuista paperia varten.

··· • « ♦ · ···

Valkaisuprosessissa käytetään usein klooria ja klooria si- • ·* .···, sältäviä kemikaaleja. Kuitenkin, koska näiden kemikaalien • · ·* 35 käyttö aiheuttaa dioksiinin ja muiden kloorattujen orgaanis- • · · ’•V ten yhdisteiden muodostumista, ne muodostavat ympäristöris- *·**· kin. Siksi suuntauksena on entistä enemmän välttää tällaisia jäteaineita synnyttävien kemikaalien käyttöä.

2 119436 Tämä on kannustanut suuntausta kehittää kloorittomia prosesseja - kokonaan kloorittomia (total chlorine-free, TCF) ja alkuainekloorittomia (elementary chlorine-free, ECF). Näissä 5 prosesseissa käytetään valkaisuun vetyperoksidia tai otsonia. Näiden hapetuskemikaalien käytöllä voi kuitenkin olla haitallinen vaikutus paperin laatuun, erityisesti paperin lujuuteen .

10 On havaittu, että tietyt entsyymit tekevät sellun paremmin valkaisuaineiden tavoitettavaksi ja vähentävät siten valkaisuaineen tarvetta. Erityisesti ksylanaasien on havaittu olevan hyvin käyttökelpoisia paperin ja sellun prosessoinnissa. Ksylanaasien on raportoitu parantavan ligniinien uutetta-15 vuutta sellusta. Nykyisissä prosesseissa ksylanaaseja käytetään useimmiten ligniinin happipoisto -vaiheen jälkeen, koska ne eivät ole aktiivisia eivätkä säily olosuhteissa, joita ligniinin happipoiston aikana käytetään.

20 Ksylanaasit katkaisevat hemiselluloosaketjuja, jotka aiheuttavat ligniinin kiinnittymisen läheisesti selluloosaverkkoon. Ksylanaasikäsittely tekee ligniinin helpommin poistettavaksi ····· myöhemmissä vaiheissa.

·« * ♦ » · • ♦ • · . .·. 25 Siksi ksylanaasien käyttö johtaa aktiivisen kloorin kulutuk- • · · ♦ ·· .···. sen vähentymiseen esivalkaisussa 25 - 30 %:lla. Tämä kloorin • · vähennys ei vaikuta tuotettavan paperin laatuparametreihin "I (Viikari et ai. 1986. Proc. of the third Int. Conf, Biotech- • · · *·* ' nology in Pulp and Paper Ind., Tukholma, s. 67 - 69, ja Baj- 30 pai & Bajpai. 1992. Process Biochemistry. 27: 319 - 325).

• · · • · · • · ···

Ksylanaasikäsittely vähentää myös muiden kemikaalien, kuten vetyperoksidin, tarvetta valkaisuprosessissa.

· · • · ··♦ • · • * **' 35 On raportoitu sieniperäisten ksylanaasien käytöstä sulfaat- • · ·.*.· tisellun valkaisussa. Nämä entsyymit ovat happamia ksylanaa- « *·**! se ja, ja niiden pH- ja lämpötilaoptimit ovat: pH = 3 - 5 ja t =30-50 °C. Nämä arvot eivät ole ihanteellisia käytettävik- 3 119436 si valkaisuprosessissa, jossa yleisimmät olosuhteet ovat pH > 9 ja lämpötila > 70 °C.

Bakteeriperäisiä ksylanaaseja, joilla on suuremmat pH- ja/tai 5 lämpötilaoptimit, on kuvattu valkaisuprosessikäyttöön. Jotkin näistä ovat peräisin seuraavista lajeista (kuvatun ksylanaa-sin pH- ja lämpötilaoptimi sulkeissa):

Bacillus pumilus (pH =7-9, t = 40 °C, Nissen et ai. 1992. Progress in Biotechnology 7: 325 - 337), Bacillus stearother-10 mophilus (pH =7, t = 65 °C, kansainvälinen patenttihakemus WO 91/10724), Dictyoglomus thermophilum (pH =6-8, t = 70 °C, Eurooppalainen patenttihakemus EP O 511 933), Rhodother-mus (pH = 5,5 - 6,5, t = 80 - 100 °C, Eurooppalainen patenttihakemus EP O 538 177), Thermotoga (pH =5-6, t = 90 °C, 15 kansainvälinen patenttihakemus WO 93/19171) ja Thermoanaero-bacter ethanolicus (t = 68 °C, Deblois & Wiegel. 1992. Progress in Biotechnology 7: 487 - 490).

Vaikka joidenkin näiden ksylanaasien valkaisukäytöstä on esi-20 tetty patenttivaatimuksia, tähän mennessä ei ole raportoitu minkään ksylanaasin olevan tunnettu toivotusta ominaisuudestaan, että sillä olisi merkittävää ligniininpoistoaktiivi- ·;··· suutta lämpötilassa > 80 °C.

·· • · · • · • · . 25 Keksinnön yhteenveto • · * Tämä keksintö kuvaa ksylanaase ja, joita saadaan anaerobisis- • · *" ta, termofiileistä mikro-organismeista, jotka on eristetty • · · puhdasviljelmiksi Uuden Seelannin kuumista lähteistä. Mikro- • * · *·* * organismit on talletettu laitokseen Centraal Bureau voor 30 Schimmelcultures (CBS), Baarn, Alankomaat, 14.4.1994.

• · • · · • * * • · • · · Tämä keksintö kuvaa myös entsyymejä, joilla on huomattava ksylanaasiaktiivisuus lämpötilassa vähintään 80 °C. Tämä kek- • · · .···. sintö kuvaa ksylanaase ja, joilla on merkittävä ligniininpois- • * “* 35 toaktiivisuus lämpötilassa ainakin 80 °C ja pHrssa 9 ja jotka « · ·,*,· käsittävät aminohapposekvenssin, joka on ainakin 70-prosent- "**! tisesti identtinen SEQ ID NO:13:ssa esitetyn aminohapposek venssin kanssa. Tämä keksintö kuvaa myös eristettyjä mikro- 4 119436 organismeja, jotka ovat anaerobisia ja termofiilisiä bakteereita ja joilla on talletusnumerot CBS 211.94, 212.94, 213.94, 214.94, 215.94 tai 216.94.

5 Tämä keksintö kuvaa myös prosessin ksylanaasin valmistamiseksi. Prosessi käsittää, että tämän keksinnön mukaisia talletettuja mikro-organismeja viljellään sopivassa kasvatusalustassa ja kerätään sitten talteen entsyyrrfit.

10 Tämä keksintö kuvaa myös kyseisiä ksylanaaseja koodaavien geenien kloonauksen. Kuvataan myös näiden geenien ilmentäminen isäntäsolussa. Tällä tavalla tuotettuina entsyymit ovat olennaisesti puhtaita. Näin ollen tämä keksintö kuvaa toisenkin menetelmän ksylanaasien tuottamiseksi, s.o. yhdistel-15 mä-DNA:n ilmentämisen.

Tämä keksintö kuvaa myös näiden ksylanaasien käytön teollisia olosuhteita vastaavissa käyttöolosuhteissa, korkeassa lämpötilassa ja korkeassa pH:ssa. Keksintö kuvaa ksylaanin hajot-20 tamiseen tai puusellun käsittelyyn soveltuvan koostumuksen, joka sisältää keksinnön mukaista ksylanaasia, ja keksintö kuvaa lisäksi keksinnön mukaisen ksylanaasin tai mikrobi-isän-····; täsolun käytön ksylaanin hajottamiseksi tai ligniinin poista- miseksi puusellusta. Esitetään myös menetelmä ligniinin pois- • · ,,·. 25 tamiseksi puusellusta, jossa menetelmässä puusellu saatetaan • I 1 * 1 1 kosketukseen keksinnön mukaisen ksylanaasin kanssa lämpöti- • · "I lassa vähintään 80 °C ja ksylanaasiaktiivisuuden mahdollista- • · · • » · *·1 vissa olosuhteissa.

• · · • « · 30 Lyhyt selitys kuvioista • · •,V Kuvio 1: Fylogeneettinen analyysi kuuden ekstremofiilisen • · ·. · kannan sisäisistä konsensussekvensseistä (internal consensus • · · ,V, sequences). Sekvenssit on nimetty seuraavasti: organismi/ • · · #··! eteenpäin-aluke (forward primer) /rekombinoitumisluku . Haaroi- • » *!1 35 hin merkityt luvut ovat sekvenssien bootstrap-analyysista • Φ *.·.· saatuja arvoja.

· 5 119436

Kuvio 2: Ryhmän G sisäisten konsensussekvenssien rinnakkain-asettelu.

Kuvio 3: TG456:n xynD:n ksylanaasidomeeni insertoituna Sphl-5 BamHI-fragmenttina pJLA602:een.

Kuvio 4: Esimerkissä 15 kuvatulla tavalla TCF-valkaistusta lehtipuusellusta valmistetun paperin paperiominaisuudet. Ref = ei entsyymiä (nolla), 715 = TG456 xynD, 716 = TG53 xynD.

10 Vetoindeksi (A), huokoisuus (B), repäisylujuus (C) ja puh-kaisulujuus (D) suhteessa Schoppen-Riegler-arvoihin esitetään .

Kuvio 5: Esimerkissä 15 kuvatulla tavalla ECF-valkaistusta 15 lehtipuusellusta valmistetun paperin paperiominaisuudet. Ref = ei entsyymiä, 715 = TG456 xynD, 716 = TG53 xynD. Vetoindeksi (A), huokoisuus (B), repäisylujuus (C) ja puhkaisulu-juus (D) suhteessa Schoppen-Riegler-arvoihin esitetään.

20 Kuvio 6: Esimerkissä 15 kuvatulla tavalla TCF-valkaistusta havupuusellusta valmistetun paperin paperiominaisuudet. Ref = ei entsyymiä, 715 = TG456 xynD, 716 = TG53 xynD. Vetoindeksi ·:··: (A) , huokoisuus (B) , repäisylu juus (C) ja puhkaisulu juus (D) ·1 2 3·1. suhteessa Schoppen-Riegler-arvoihin esitetään.

9 f ·1 2 5 2 • · · 3 ,···„ Kuvio 7: Esimerkissä 15 kuvatulla tavalla ECF-valkaistusta • · ”1 havupuusellusta valmistetun paperin paperiominaisuudet. Ref = * 1 9

Hl ei entsyymiä, 715 = TG456 xynD, 716 = TG53 xynD. Vetoindeksi 9 9« * (A), huokoisuus (B), repäisylujuus (C) ja puhkaisulujuus (D) 30 suhteessa Schoppen-Riegler-arvoihin esitetään.

9 9#9 9 9 9 9 « *99 ·...· Kuvio 8: Esimerkissä 15 määritetyt hiertämiskäyrät TCF- (A) ja ECF— (B) -valkaistulle lehtipuusellulle ja TCF- (C) ja ,···, ECF- (D) -valkaistulle havupuusellulle. Ref = ei entsyymiä, 9 9 *i1 35 715 = TG456 xynD, 716 = TG53 xynD.

9 919 9 9 9 9 · 9 9 9 6 119436

Kuvio 9: pH-optimien (A) ja lämpötilaoptimien (B) vertailu TG456 xynD -ksylanaasin ja Pulpzyme HB:n (Novo Nordisk) välillä.

5 Kuvio 10: Lämmönkestävyyksien vertailu TG456 xynD -ksylanaasin ja Pulpzyme HB:n (Novo Nordisk) välillä 80 °C:ssa, pH:ssa 7,0 (A) sekä 65 °C:ssa, pH 9,0 (B).

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 10 Tämä keksintö kuvaa mikro-organismeja, joita on eristetty Uuden Seelannin kuumista lähteistä. Nämä mikro-organismit on karakterisoitu anaerobisiksi, termofiileiksi bakteereiksi, ja ne on luokiteltu Raineyn (1992, väitöskirja, University of Waikato, Hamilton, Uusi Seelanti) mukaan.

15

Mikro-organismit on myöhemmin tutkittu ksylaaniagaridiffuu-siomenetelmällä. Kannat, jotka tässä testissä muodostivat kirkkaan vyöhykkeen, valittiin mahdollisiksi ksylanaasia tuottaviksi kannoiksi. Kantoja kasvatettiin anaerobisissa 20 oloissa pH:ssa 7,0 ja lämpötilassa 75 tai 80 °C organismista riippuen. Kun viljelyliemi oli tiivistetty ultrasuodatuksel-la, sen ksylanaasiaktiivisuus analysoitiin määrityksellä ·;··· pHtssa 6,5 ja pH:ssa 9, lämpötilassa 80 °C (esimerkki 1).

·· · • · « • « • · . .·. 25 Kuuden eri kannan havaittiin tuottavan ksylanaasia maini- « * · tuissa olosuhteissa. Nämä mikro-organismit on talletettu *·*:’ CBS: ään 14.4.1994 talletusnumeroilla CBS 211.94, CBS 212.94, * * · *·:·* CBS 213.94, CBS 214.94, CBS 215.94 ja CBS 216.94.

• « * • 4 · 30 Tämä keksintö kuvaa myös entsyymejä, joilla on ksylanaasiak- • · V.: tiivisuutta, erityisesti entsyymejä, joilla on vähintään huo-

mättävää ksylanaasiaktiivisuutta lämpötilassa vähintään 80 °C

.V. ja pH :ssa 6 tai yli. Mainittuja entsyymejä saadaan tallete- • · · 1,1 tuista kannoista. Mainittuja entsyymejä saadaan myös talle- • · • · “* 35 tettujen kantojen mutanteista ja muunnoksista.

• ♦ • · · * · • · *:·*: Ilmauksella "huomattavaa aktiivisuutta" tarkoitetaan, että tämän keksinnön mukaisilla entsyymeillä on vähintään 80 7 119436 °C:ssa vähintään 40 % aktiivisuudesta, joka niillä on 70 °C:ssa, edullisesti vähintään 60 %, edullisemmin vähintään noin 80 % ja vielä edullisemmin noin 200 %.

5 Tämä keksintö kuvaa edelleen ksylanaasien, jotka ovat aktiivisia lämpötilassa noin 80 °C, tai joilla on huomattavaa aktiivisuutta näissä olosuhteissa, valmistusprosessia. Prosessi käsittää tämän keksinnön mukaisten talletettujen mikro-organismien viljelemisen sopivassa kasvatusalustassa ja sen jäl-10 keen entsyymien, joilla on mainittu aktiivisuus, eristämisen ja puhdistamisen. Ksylanaasin eristäminen ja puhdistaminen voidaan suorittaa alalla tunnettuja standardimenetelmiä käyttäen .

15 Esimerkki entsyymien osittaisesta puhdistamisesta on esimerkissä 2. Tässä esimerkissä solut poistetaan ensin onttokuitu-suodatuksella. Sen jälkeen proteiinia puhdistetaan edelleen lisäämällä ammoniumsulfaattia lopulliseksi pitoisuudeksi 1 M. Sitten liuos viedään fenyylisefaroosipylvääseen ja proteiini 20 eluoidaan 1 M NaCl:lla. Lopuksi proteiini tiivistetään ultrasuodatuksella ja suola poistetaan dialyysillä.

·:··{ Ksylanaasien ksylaaninhajotuspotentiaalin määrittämiseksi JV. emäksisessä pH:ssa, mainituista kannoista eristettyjen ksyla- , 25 naasien aktiivisuuksien välillä pH:ssa 7 ja pH:ssa 9 tehtiin f · · vertailu käyttäen eri substraatteja ja lämpötilaa 70 °C (esi- • · *“ merkki 3). Ksylanaaseilla osoitettiin olevan huomattavaa ak- • · · "1 tiivisuutta emäksisessä pH:ssa. Substraatista ja määritys- • · · *·1 1 menetelmästä riippuen ksylanaaseilla on pH:ssa 9 noin 20 % 30 tai enemmän aktiivisuudesta, joka niillä on pH:ssa 7. Yhden • · V.· ksylanaasin osoitettiin pH:ssa 9 säilyttävän 80 % aktiivisuu- ·· desta, joka sillä oli pH:ssa 7.

• · • 1 · * · ·

Mainituista kannoista eristettyjen ksylanaasien lämmönkestä- 11 35 vyys vaihtelee huomattavasti. Jotkin näistä ksylanaaseista 119436 8 liintumisikä on vähintään 10 minuuttia, edullisesti puoliin-tumisikä näissä olosuhteissa on yli 20 minuuttia, edullisemmin se on yli 30 minuuttia, vielä edullisemmin yli 60 minuuttia ja edullisimmin puoliintumisikä on yli 120 minuuttia.

5 Tämä keksintö kuvaa myös, kuinka kloonataan ja ilmennetään DNA-sekvenssiä, joka on tunnettu siitä, että se koodaa ksy-lanaasia, jota saadaan anaerobisesta, termofiilisestä kannasta. Keksintö kuvaa vektoreita, joihin kuuluu ilmentämis-10 vektoreita, jotka ovat tunnettuja siitä, että ne sisältävät DNA-sekvenssin, joka koodaa tämän keksinnön mukaisia ksyla-naaseja. Kuvataan myös isäntäsolumikrobi, joka on tunnettu siitä, että se on transformoitu jollakin näistä vektoreista.

15 Sekvenssianalyysi keksinnön mukaisia ksylanaaseja koodaavasta DNArsta paljasti, että tuotetut sekvenssit jakautuvat kahteen entsyymiryhmään, s.o. F-tyypin ja G-tyypin ksylanaaseihin, jotka Gilkes et ai. ovat aiemmin määrittäneet (1991, Microbiol. Rev. 55: 303 - 315). Keksinnön mukaisista mikro-orga-20 nismeista saadut sekvenssit xynA, xynB ja xynC kuuluvat F-tyypin ksylanaaseihin. Näistä mikro-organismeista saadut xynD-sekvenssit kuuluvat G-tyypin ksylanaaseihin (katso esi-*:··· merkkejä 6, 7, 8 ja 9) . Tietääksemme aikaisemmin ei ole ku- j*.*. vattu G-tyypin ksylanaaseja termofiileistä mikro-organismeis- • · . .·, 25 ta. Termofiiliset mikro-organismit, joista keksinnön mukaiset « « ..»•t ksylanaasit ovat peräisin, määritellään tässä mikro-organis- • · *" meiksi, joiden optimikasvulämpötila on 65 °C. Edullisesti op- "* timikasvulämpötila on yli 68 °C, edullisemmin optimikasvu- • · · *·* * lämpötila on yli 70 °C ja edullisimmin optimikasvulämpötila 30 on yli 75 °C.

• · • · * · · • · • · · ί#>>; Keksinnön mukaisten F- ja G-tyypin ksylanaasien DNA-sekvens- sien ilmentymisen E.colissa on osoitettu tuottavan aktiivista • * · proteiinia (katso esimerkkejä 10 ja 11). Mainitut proteiinit *" 35 ovat aktiivisia lämpötilassa 80 °C.

» · • « · • · · • *:**; Tämän selityksen esimerkeissä esitetty kloonaus ja ilmentä minen mahdollistaa geenien ilmentämisen homologisissa orga- 9 119436 nismeissa. Ilmentäminen voidaan suorittaa myös muissa mikro-organismeissa sopivien ilmentämistä ja eritystä säätelevien sekvenssien avulla. Mahdollisia organismeja ovat hiiva, sienet ja bakteerit. Spesifisiin mikro-organismeihin kuuluu kan-5 toja, jotka on valittu ryhmästä Aspergillus niger, Klu-yveromyces lactis ja Bacillus licheniformis.

Tämän keksinnön mukaisilla entsyymeillä on osoitettu olevan huomattava spelttikauraksylaaniin ja koivupuun ksylaaniin 10 kohdistuva aktiivisuus.

Tämän keksinnön mukaisia entsyymejä on myös testattu valkai-sukykynsä suhteen. Tämän valkaisukyvyn määrää keksinnön mukaisten entsyymien ligniininpoistoaktiivisuus. Keksintö kuvaa 15 entsyymejä, joilla on merkittävä ligniininpoistoaktiivisuus mitattuna useilla puuselluilla. Entsyymivalmisteet, ksylanaa-sit, kykenevät poistamaan puusellusta ligniiniä lämpötilassa vähintään 80 °C. Ilmaus "puusellu" on tulkittava laajasti, ja sen tarkoitetaan käsittävän kaikenlaiset lignoselluloosa-20 materiaalit.

Entsyymien valkaisukyvyt on testattu sekä lehtipuu- että ha-·:··; vupuusellussa. Ligniininpoisto on mitattu kahdella eri mene- $V. telmällä (esimerkki 5). Väliaineen ligniinipitoisuus määri- Φ · . 25 tettiin A300-testillä. Tässä testissä kaikilla valmisteilla • « « ··· oli merkittävää ligniininpoistoaktnvisuutta 80 C:ssa seka • * **! lehti- että havupuussa. pH:ssa 9, lämpötilassa 80 °C, aktii- • * · • 4 * ··* visuus havupuussa oli vähintään 43 % aktiivisuudesta pH:ssa • · · *·* 6, kun taas lehtipuussa 3:11a kannalla oli pH:ssa 9 yli 50 30 %:n aktiivisuus verrattuna aktiivisuuteensa pH:ssa 6, ja • ♦ :.V 3:11a muulla 18 - 30 %. Havupuusellun valkaisu mitattiin myös • · · määrittämällä sellun ligniinipitoisuuden vähentyminen käyttä-en kappa-testiä. Kappaluku pieneni 0,5 - 1,4 yksikköä, kun • · · l·'· sellua inkuboitiin pH:ssa 9, lämpötilassa 80 °C, ksylanaasi- • · "* 35 valmisteiden kanssa.

• * • · · • · · • · *!**! Lisäksi tämän keksinnön mukaisten entsyymien valkaisukapasi- teetti voidaan mitata esim. sen mukaan, minkä verran paperin 10 1 1 9436 ISO-kirkkaus kasvaa, kun tavanomaisesti käsiteltyä sellua myös inkuboidaan myös mainittujen entsyymien kanssa, verrattuna inkubointiin ilman entsyymejä. Mainittu tavanomainen käsittely käsittää altistamisen valkaisuaineille, kuten H2O2, 5 otsoni, CI2 tai ClOj, alan menetelmien mukaan.

Keksinnön mukaisia kloonattuja, F-tyypin ja G-tyypin ksyla-naaseja, E. colissa ilmennettyinä, on testattu myös suorituskykynsä suhteen ECF-valkaisukokeissa sekä havupuu- että 10 lehtipuusellussa (katso esimerkki 12). Olemme yllättäen havainneet, että G-tyypin ksylanaaseilla (xynD-geenien koodaamilla) on valkaisumenettelyissä sekä havupuu- että lehtipuu-sellussa paljon parempi suorituskyky kuin F-tyypin ksylanaaseilla, jopa 6,8 % ISO-delta-kirkkautta enemmän kuin entsyy-15 mittömässä verrokissa, mitä verrataan enintään 1,2 % nousuun ISO-kirkkaudessa parhailla F-tyypin ksylanaaseilla. Lämpökes-tävien G-tyypin ksylanaasien testaaminen edelleen osoitti, että ne tuottavat myös erinomaiset tulokset TCF-valkaisu-kokeissa sekä havupuu- että lehtipuusellussa (katso esimerk-20 kejä 14 ja 15). Näin valkaistusta massasta valmistetun paperin ominaisuuksien tutkiminen ei osoittanut merkitseviä eroja suhteessa entsyymittömään verrokkipaperiin.

• · iV. Kloonatut G-tyypin ksylanaasit ovat erittäin lämmönkestäviä, • · . .·, 25 jopa suuressa pH:ssa. 80 °C:ssa, pH:ssa 7,0 mitattiin yli 30 *·· * t···' minuutin puoliintumisikä. 65 °C:ssa, pH:ssa 9,0, entsyymin • · **! puoliintumisikä ei lyhene merkitsevästi, ei edes 120 minuutin • * ♦ • 4 · ·** inkuboinnin jälkeen (katso esimerkkiä 16). Keksinnön mukais- • · « *** * ten G-tyypin ksylanaasien puoliintumisikä pH:ssa 9,0, lämpö- 30 tilassa 65 °C, on vähintään 10 minuuttia, edullisesti puo- • · *,V liintumisikä näissä olosuhteissa on yli 20 minuuttia, edulli- · · semmin se on yli 30 minuuttia, vielä edullisemmin se on yli 60 minuuttia ja edullisimmin puoliintumisikä on yli 120 mi- • · * ..I nuuttia.

V 35 V.: Keksintö kuvaa lämmönkestäviä G-tyypin ksylanaaseja koodaavia *!*‘i DNA-sekvenssejä, joiden sisäinen konsensusfragmentti (ICF) on yli 80-prosenttisesti identtinen SEQ ID NO 12:n ICF:n kanssa.

11 1 1 9436 G-tyypin ICF määritellään tässä fragmentiksi, joka sijaitsee SEQ ID NO 4:ää ja SEQ ID NO 5:ttä vastaavien sekvenssien välissä SEQ ID NO 12:ssa (nukleotidiasemat 295 - 623). Edullisesti, identtisyys G-tyypin ICF:n kanssa on yli 87 %, edul-5 lisemmin identtisyys on yli 95 % ja edullisimmin yli 99 %.

Edelleen toisessa suoritusmuodossa keksintö kuvaa G-tyypin ksylanaasisekvenssejä, jotka ovat vähintään 70-prosenttisesti identtisiä SEQ ID NO 13:n aminohapposekvenssin kanssa. Edul-10 lisesti tämä aminohappoidenttisyys on yli 80 %, edullisemmin aminohappoidenttisyys on yli 90 %, vielä edullisemmin aminohappoidenttisyys on yli 95 % ja edullisimmin aminohappoidenttisyys on yli 99 %.

15 Tämän keksinnön mukaisia entsyymejä voidaan käyttää välittömästi edellä kuvatun sellunvalmistusprosessin ligniinin hap-pipoistovaiheen jälkeen. Entsyymien lämpötila- ja pH-ominai-suuksien ansiosta voidaan välttää suurta jäähdyttämistä ja pH:n mukauttamista. Toisessa keksinnön suoritusmuodossa ent-20 syymejä käytetään ligniinin happipoistovaiheen jälkeen tai sen aikana. Ennen tätä vaihetta ligniinipitoisuus on paljon suurempi, ja siksi ksylanaasin käytöllä on paljon suurempi ·:··; vaikutus.

• · « • · • ♦ . 25 Edelleen kuvataan tämän keksinnön mukaisten entsyymivalmis- .···. teiden sovellutuksia, varsinkin prosessia, jossa puusellua • · ,·# käsitellään mainituilla keksinnön mukaisilla entsyymivalmis- III teillä.

• · · * · · 1 • ·

Samankaltaisesti keksinnön mukaisilla entsyymivalmisteilla • m · *·*.* voidaan käsitellä revinnäismassaa.

·· · • · • · 9

Keksintö koskee myös paperia, pahvia ja revinnäismassaa, jot- • · .···. ka on tehty keksinnön mukaisilla entsyymivalmisteilla käsi- • · ··· ·*) r· • -io tellysta puusellusta.

• · · • ♦ « • · 12 1 1 9436

Esimerkki 1 Lämmönkestävää ksylanaasiaktiivisuutta tuottavien kantojen eristäminen

Ksylanaasia tuottavia mikro-organismeja saatiin useiden Uuden 5 Seelannin termisten alueiden kuumista lähteistä. Kannat eristettiin in situ -rikastuksella, spelttikauraksylaania substraattina käyttäen, kuumista lähteistä, joiden lämpötila oli yli 70 °C ja pH 6,0 - 8,5. Kantojen viljelmiä saatiin viljelemällä edelleen anaerobisesti laboratoriossa 2/1-kasvatus-10 alustalla plus ksylaanissa, lämpötilassa (70°, 75° tai 85°), joka vastaa lämpötilaa siellä, mistä näyte oli otettu.

• ««ta • · ·* · • · · • · • · * • * m φ · ··· *·· 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 999 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 999 m 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 $ • · 9 9 9 13 119436 2/1-kasvatusalustan + ksylaanin koostumus on:

Anaerobinen 2/1-kasvatusalusta

Resatsuriinia (0,1 %) 1,0 ml/1 SLlO-hivenaineita 1,0 ml/1

FeCls-liuosta (0,28 mg/ml) 1,0 ml/1

Wolinin vitamiineja 0, 1 ml/1

NaCl 0,9 g/1

MgCl2.6H20 0,2 g/1 KH2P04 0, 75 g/1 K2HP04 1,5 g/1 NH4CI 0,9 g/1

Kysteiiniä 0, 75 g/1

Hiivauutetta 0,5 g/1

Bacto-tryptonia 1,0 g/1

Spelttikauraksylaania 2 g/1

• I -- i— - I

···1 1 " 1111 ......1 .! PH 7,0 * * 1 • ·* Valmistetaan N2-kaasussa * • · · • · · c

*«· O

··1

Wolinin vitamiiniseos mg/100 ml ::: Biotiinia 2,0 *·*

Foolihappoa 10,0

Pyridoksiini-HCl: a 10,0

Ribof laviinia 5,0 • " · :***: Tiamiinia 5, 0 »··

Nikotiinihappoa 5,0 ··· *.! Pantoteenihappoa 5, 0 * · "1 Bl2-vitamiinia 0,1 • · t 1 t p-aminobentsoiinihappoa 5, 0 1 Tioktiinihappoa 5, 0 119436 14 SLlO-hivenaineet, muunnettu 5 M HC1 15 ml mg/1

ZnCl2 70

MnCl2.4H20 100 H3BO3 6

CoC12.6H20 130

CuC12.2H20 2

NiCl2.2H20 24

NaMo04-2H20 36

Kantojen puhdasviljelmät saatiin yksittäisistä pesäkkeistä 5 agarrullaputkista. Ultrasuodatuksella saatuja viljelmätiivis-teitä testattiin ksylanaasiaktiivisuuden suhteen 70 °C:ssa ja 80 °C:ssa, pH:ssa 6,5 ja 9,0, käyttäen värjätyn ksylaanin menetelmää (katso jäljempää) sekä PAHBAH-menetelmää (katso esimerkkiä 3) .

10

Kuusi kantaa, jotka talletettiin CBS:ään (Centraal Bureau voor Schimmelcultures) on esitetty taulukossa 1.

• · ... Taulukko 1: tässä patenttihakemuksessa käytettyjen kantojen • 1 1 ' ;1 15 talletusnumerot • « · ' ··· .···. Kanta CBS-talletusnumero ··· : :1: tg 53 cbs 211.94 ··· ___ _ ·«· J1: : TG 453 CBS 212.94 ,v> TG 456 CBS 213.94 • 1 · ^^- - - f ' f TG 457 CBS 214.94 ··· _ tg 479 cbs 215.94 • · · !···: TG 631 CBS 216.94 1 ♦ • · · • · ***** Värjätty ksylaani, joka koostuu lehtikuusiksylaanista lii tettynä Remazol Brilliant Blue R:ään (Sigma) valmistettiin 119436 15 menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Biely et ai., (1985) Anal. Biochem. 144, 142 - 146. Lehtikuusen ksylaania (6,7 g) pantiin 250 ml:aan vettä ja sekoitettiin useita tunteja huoneenlämmössä sen liuottamiseksi. Tähän seokseen lisättiin Remazol 5 Brilliant Blue R:ää (10,0 g). Liuotuksen jälkeen lisättiin tipoittain 20 ml Na-asetaattiliuosta (2,7 g Na-asetaattia 20 ml:ssa tislattua vettä). Sitten lisättiin liuos, jossa oli 6 g NaOH:a 70 ml:ssa vettä, ja jatkettiin sekoittamista 18 tuntia. Muodostunut värjätty ksylaani sakkautettiin lisäämällä 10 700 ml 96-prosenttista etanolia. Kun seos oli saanut seistä 6 tuntia, sakka erotettiin suodattamalla (Whatman GF/A). Suoda-tuskakku pestiin 3 1:11a 2:l-seosta 96 % etanolia/0,05 M Na-asetaattia, sen jälkeen 1 1:11a 96-prosenttista etanolia ja 3 1:11a asetonia, kunnes suodos oli väritöntä. Saanto oli 10,5 15 g värjättyä ksylaania.

Entsyyminmääritystä varten liuotettiin 5,1 g värjättyä ksylaania 150 ml:aan 0,1 M MOPS-puskuria, pH 6,8. Seosta sekoitettiin 70 °C:ssa 4 tuntia liuottamiseksi. Kun seos oli jääh-20 dytetty huoneenlämpöön, liukenematon aines poistettiin sent-rifugoimalla 10 000 x g:ssä. Aktiivisuuden määrityksiä varten laimennettiin kantaliuos, joka sisälsi 3,34 % w/v värjättyä ····· ksylaania, 0,1 M: 11a MOPS-puskurilla, pH 6,8, siten, että JV. saatiin 0,5-prosenttinen värjätyn ksylaanin käyttöliuos.

* · • 25 • · * ^ ^ • · · lllt Ensyymimääritys, jossa käytettiin värjättyä ksylaania, suo- • · *** ritettiin lisäämällä 0,9 ml värjätyn ksylaanin liuosta (0,5 • · · • « ·

Hl %) 0,6 ml:aan ensyymivalmistetta sopivassa puskurissa, se- • « » *·* koittaen. Annos (0,4 ml) tätä seosta siirrettiin 0,8 ml:aan 30 96-prosenttista etanolia nollanäytteeksi (kontrolli). Jäi- • · *.V jelle jäänyttä liuosta inkuboitiin 70 °C:ssa 90 minuuttia.

···

Reaktio lopetettiin siirtämällä 0,4 ml koeseosta 0,8 ml:aan .V, 96-prosenttista etanolia. Tämä liuos jätettiin huoneenlämpö- • · ·

Imi tilaan 30 minuutiksi, jotta hajoamaton värjätty ksylaani sai • * *1* 35 sakkautua. Koenäytteitä sentrifugoitiin 5 minuuttia täydellä • m *,V nopeudella Beckman Microfuge E:ssä ja supernatantin absor- *?·*! banssi mitattiin 595 nm:ssä spektrof otometrissä.

16 119 4 3 6

Esimerkki 2

Entsyymivalmisteiden eristäminen

Anaerobiset fermentoinnit suoritettiin 2 l:n Schott-pullois-sa, jotka sisälsivät 1 800 ml 2/1 plus ksylaani -kasvatus-5 alustaa, inkuboiden stationaarisesti, joko 75:n tai 80 °C:n lämpötilassa (viljeltävästä organismista riippuen) 24 tuntia. 10 lista hyvin kasvanutta viljelmää poistettiin solut ontto-kuitusuodatuksella 0,01 %:n Triton XlOOin läsnäollessa (Ami-con DC 10 LA ja Amicon 0,1 μιη H5MP01-43 -suodatin). Solutto-10 maan viljelmään lisättiin ammoniumsulfaattia lopulliseksi pitoisuudeksi 1 M. Saatu liuos pumpattiin 9 x 15 emin pylvääseen, joka sisälsi 1 lm fenyylisefaroosia (Pharmacia Fast Flow, vähän substituoitu) tasapainotettuna 1 M ammoniumsulfaatilla. Virtausnopeus oli 150 - 200 ml/minuutti. Pylvästä 15 pestiin 5 lilla 1 M ammoniumsulfaattia. Ksylanaasi eluoitiin 5 lilla 1 M NaClia. Fraktioita kerättiin 500in - lOOOin mlin tilavuuksina. Fraktioiden ksylanaasiaktiivisuus määritettiin (PAHBAH-menetelmällä, kuten kuvataan esimerkissä 3), ja aktiiviset fraktiot yhdistettiin, ultrasuodatettiin pieneen ti-20 lavuuteen ja dialysoitiin suolapitoisuuden pienentämiseksi käyttäen Amiconin Stirred Celliä (malli 2000A tai 8400) ja YM2-kalvoa.

• · !*.*. Esimerkki 3 • • v . 25 Osittain puhdistettujen entsyymivalmisteiden ksylanaasiaktii- *·· .*·*, visuuksien karakterisointi • · • · · • · · *** Analyysimenetelmät i · · * * Ksylanaasiaktiivisuusmääritykset tehtiin Sumnerin määritys- 30 menetelmästä (Sumner et ai. 1921. J. Biol. Chem. 47i 5-9) • · *.V muunnetuilla menettelyillä. Vaihtoehtoisesti ksylanaasiaktii- #·· visuus määritettiin käyttäen muunnettua PAHBAH-määritystä, joka perustui Leverin menetelmään (1973. Biol. Med. 1: 274 - • · · M 281) .

• I »I· • · • < · • · • · ««•M • «

Menettely 1 17 1 1 9436

Ksylanaasiaktiivisuuden määritys spelttikauraksylaanissa, Sumnerin menetelmä

Substraattiliuos spelttikauraksylaanista valmistetaan seuraa-5 vasti: 4 g spelttikauraksylaania suspendoidaan 100 ml:aan de-ionioitua vettä. Suspensiota sonikoidaan 6 minuuttia (soni-kaattori: Sonics & Materials, Vibracell tyyppiä VC 250 B), inkuboidaan 100 °C:ssa 10 minuuttia ja sentrifugoidaan 10 minuuttia 10 000 rpmtssä Sorvailin sentrifugilla RC-5B. Super-10 natanttia käytetään substraattiliuoksena, ja se sisältää noin 2 % spelttikauraksylaania.

Määritys tehdään seuraavasti: Pannaan koeputkeen 200 μΐ spelttikauraksylaaniliuosta ja 600 μ1:η alaeriä entsyymival-15 mistetta (esimerkki 2) liuotettuna sopivaan puskuriin. Koeputkea inkuboidaan mittausolosuhteissa vesihauteessa 15 minuutin ajan. Inkuboinnin jälkeen lisätään 7,2 ml DNS (dinit-rosalisyylihappo) -reagenssia. Seosta lämmitetään vesihauteessa 100 °C:ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen koeputkea jääh-20 dytetään jäillä. Mitataan absorbanssi 575 nm:ssä. Ensyymi-näytteiden tausta-absorbanssin eliminoimiseksi tehdään ver-rokkikoe seuraavasti: Koeputkea, joka sisältää substraattia *:“i ilman entsyymivalmistetta, inkuboidaan samoissa olosuhteissa ;1·1· kuin testinäytteitä. 15 minuutin inkuboinnin jälkeen lisätään • · . 25 7,2 ml DNS:ää ja entsyyminäyte (tässä järjestyksessä).

Mt ··· • · • · ,"It Yksi yksikkö (xU) ksylanaasiaktiivisuutta määritellään ent- • · · III syymimääräksi, joka tuottaa 1 umol ksyloosiekvivalenttia, • 1 · • · · • pelkistävänä sokerina mitattuna.

30 • · • · v

Todelliset mittausolosuhteet olivat pH 7,0 ja 9,0, lämpötila ··· 70 °C. pH:ssa 7 käytettiin 50 mM fosfaattipuskuria ja pH:ssa 9 käytettiin 50 mN boraatti/KOH-puskuria.

• · M» • · • 1

• M

• · * · · • « « • · · 18 1 1 94 36

Taulukko 2: suhteelliset ksylanaasiaktiivisuudet speltti-kauraksylaanissa, mitattuna 70 °C:ssa.

Kanta Aktiivisuus (%) pH 7, 0 pH 9, 0 TG 453 100 57 TG 456 100 39 TG 457 100 31 TG 479 100 19 TG 631 100 31 5 Menettely 2

Ksylanaasiaktiivisuus koivupuuksylaanissa, Sumnerin määritys Käytetään olennaisesti samaa menetelmää, joka on kuvattu menettelyssä 1. Spelttikauraksylaaniliuoksen sijasta käytetään koivupuuksylaaniliuosta. Substraattiliuos koivupuuksylaanista 10 valmistetaan seuraavasti: 4 g koivupuuksylaania suspendoidaan 50 ml:aan 0,2 N NaOH:a ja sekoitetaan, kunnes se näyttää liuenneen. Liuoksen pH säädetään 7,0:ksi jääetikalla, lisätään vettä 100 ml:aan ja liuos sentrifugoidaan 10 000 rpm:ssä Sorvailin RC-5B-sentrifugilla. Supernatanttia käytetään sub-·;··· 15 straattiliuoksena, ja se sisältää noin 3 % koivupuuksylaania.

JV. Koeolosuhteet olivat pH 7 ja 9, lämpötila 70 °C. Tulokset • · . esitetään taulukossa 3.

• « « ···

• M

Taulukko 3: suhteelliset ksylanaasiaktiivisuudet koivupuu- : 20 ksylaanissa, mitattu 70 °C:ssa »·· «·· • « · —m..............im·· _ —--

Kanta Aktiivisuus (%) . . pH 7, 0 pH 9, 0 • · ♦ _ * _ TG 453 100 40 *T* TG 456 100 20 :·:·: TG 457 100 21 ··· ^ - .......... _ ^ :···: TG 479 100 12 iV: ItG 631 100 21 • ·

Menettely 3 19 1 1 9436

Ksylanaasiaktiivisuus spelttikauraksylaanissa, PAHBAH-määri-tys PAHBAH-menetelmään tehty muunnos (Lever, 1973) koskee PAHBAH-5 reagenssia, seuraavasti: 0,05 M trinatriumsitraattia, 0,1 M Na2S0.3, 0,02 M CaCl2, 0,5 M NaOH ja 0,1 M p-hydroksibentsoe-happohydratsidia (PAHBAH).

Ensyymivalmisteiden tutkimiseksi sekoitetaan 0,05 ml tai 0,1 10 ml entsyymivalmistetta 0,3 ml:aan substraattipuskuria (50 mM Bis-Tris-propaania, pH tarpeen mukainen + 0,2 % spelttikaura-ksylaania suspensiossa). Lisätään sopiva määrä vettä lopulliseksi tilavuudeksi 0,5 ml. Inkubointi tehdään yleensä 70 °C:ssa 30 minuutin ajan. Reaktion lopettamiseksi inkuboinnin 15 jälkeen lisätään 1,0 ml PAHBAH-reagenssia ja näytteitä kuumennetaan 100 °C:ssa 6 minuuttia. Nollaliuokset ovat substraattipuskuria, jota on inkuboitu samalla tavoin kuin näytettä, johon lisätään entsyymiä PAHBAH-reagenssin jälkeen. Ennen absorption määritystä 420 nm:ssä kaikkia näytteitä 20 sentrifugoidaan 1 min täydellä nopeudella Beckman Microfuge E:ssä suspendoidun ksylaanin poistamiseksi supernatantista. Tulokset on esitetty taulukossa 4. Tästä taulukosta voidaan ·;··· päätellä, että pH:ssa 9,0, lämpötilassa 80 °C, kaikilla kan- noilla on vielä huomattavaa aktiivisuutta verrattuna tilan- • · . 25 teeseen pH 6,0, lämpötila 70 °C.

• · ·

Ml »·· • f » *** Taulukko 4: spelttikauraksylanaasin suhteelliset aktiivisuu- • · · **· det mitattuina PAHBAH-määrityksellä • · · • li

Kanta Aktiivisuus (%)

\V pH 6,0, 70 °C pH 9,0, 80 °C

TG 53 100 57 « ..... —1 1 i n » tg 453 100 20 • · . ............ - ------ I TG 456_ 100 65 /.·, I TG 457 100 82 « · · - ---- TG 479 100 30 • · - — - _ — ---- TG 631 100 65 119436 20

Esimerkki 4

Ksylanaasiaktiivisuuksien lämmönkestävyys

Ensyymivalmisteiden ksylanaasiaktiivisuuksien puoliintumisikä 5 määritettiin seuraavasti: Entsyymivalmistetta laimennettiin 1/10 100 mM TAPS-puskurilla (pH 9,0 lämpötilassa 80 °C) ja inkuboitiin 80 °C:ssa. Hetkillä 0, 10, 20, 40, 60 ja 120 minuuttia otettiin näyte, joka lisättiin 100 mM MOPS-puskuriin (pH 6,0 lämpötilassa 70 °C) jäillä, siten, että lopulliseksi 10 laimennokseksi tuli 1/20 - 1/100 sen mukaan, mikä lopulliseen määritykseen sopii. Näytteitä pidettiin jäissä, kunnes ne määritettiin 70 °C:ssa, pH:ssa 6,0, käyttäen PAHBAH-määritys-menetelmää, kuten on kuvattu esimerkissä 3, menettely 3. Tulokset esitetään taulukossa 5.

15

Taulukko 5: ksylanaasiaktiivisuuden lämmönkestävyys pH:ssa 9,0 ja 80 °C, mitattuna PAHBAH-määrityksellä spelttikaurak-sylaanilla

Kanta Puoliintumisikä, pH 9,0, 80 °C

TG 53 30 minuuttia . TG 453 60 minuuttia *···· - ..... . . _ .. . TG 456 > 120 minuuttia • · _________ * TG 457 > 120 minuuttia TG 479 < 10 minuuttia • · _________ *" TG 631 < 20 minuuttia • · · *·· 20 ·#♦ • · 1 • · ·

Esimerkki 5 . . Ligniininpoistoaktiivisuudet • · · 1 1 *.! Ksylanaasien ligniininpoistokyky määritettiin kahdella eri • · *”1 menetelmällä. A300-menetelmällä määritetään ligniinimäärä, • · ϊ#ϊ4ϊ 25 joka on entsyymikäsittelyn jälkeen vapautunut sellusta. Kap- pa-määrityksellä mitataan selluun käsittelyn jälkeen jäänyt ligniinimäärä.

• · · • · · • · 30 ·

Menetelmä 1: A300-koe 119436 21

Ligniininpoiston mittaamiseksi A300-määrityksellä inkuboitiin entsyymivalmisteita havupuu- ja lehtipuusellun kanssa pitoisuudessa 2 PAHBAH-yksikköä per g märkäsellua (noin 6 PAHBAH-5 yksikköä/g kuivasellua). Inkuboitiin 2 tuntia 80 °C:ssa, sekä pHrssa 6,0 MOPS-puskurissa että pH:ssa 9,0 TAPS-puskurissa. Sellupitoisuus inkuboinnissa oli 0,1 g märkäpainoa ml:aa kohden. Käytettiin kahta erityyppistä sellua: havupuu-sulfaattisellua ligniinin happipoiston jälkeen ja lehtipuu-sulfaatti-10 sellua ligniinin happipoiston jälkeen. Näiden sellujen ominaisuudet esitetään taulukossa 6.

Taulukko 6: ligniininpoistokokeissa käytettyjen sellutyyppien ominaisuudet 15 =^^=============^=======^===^===============i I Lehtipuu Havupuu koivu 80 % kuusta, 20 % mäntyä

Kirkkaus, ISO-% 50,8 35,8

Kappaluku 11,0 16,7 ·;··· Viskositeetti, dm3/kg 979 1003 ·· · S .* Kalsium, ppm 1900 2600 • I — I ·Ι·^I I <— i I 11 II· f • · · • · · IX Kupari, ppm 0,3 0,6 • · - - __ • · -- — - ' Φ · » ; j*; Rauta, ppm 5,1 11

«· I ^P·»»— I— III I —^ I

··· VΣ Magnesium, ppm 210 270 . . Mangaani, ppm 25 70 • · «·· ♦ · • · *1’ Sellusta irronneen ligniinin määrä määritettiin mittaamalla • · V.: supernatantin absorbanssi 300 nm:ssa, kun supernatantti oli • · · iftt· erotettu sellusta suodattamalla imulla sintterilasisuodatti- .V. 20 men tukeman Whatman GF/C-suodattimen läpi. A300-kokeen tu- • · · ψ'"\ lokset esitetään taulukossa 7. Tässä määrityksessä Delta A300 • · -arvot >0,2 ovat merkitsevästi korkeammat kuin taustataso.

22 1 1 9436

Siksi tämä esimerkki osoittaa, että entsyymeillä on merkittävä ligniininpoistoaktiivisuus 80 °C:ssa.

Taulukko 7: Mitattu A300-ligniininpoisto 80 °C:ssa, pH 6,0 ja 5 9,0, havupuusta ja lehtipuusta

Delta A300

Kanta _

Lehtipuu Havupuu _ pH 6,0 pH 9,0 %* pH 6,0 pH 9,0 %* TG 53 0, 7 0,5 71 0,6 0,35 58 TG 453 1, 0 0,3 30 0, 7 0,3 43 TG 456 1,0 0,3 30 0, 6 0, 6 100 TG 457 1, 0 0, 7 70 1, 0 0, 5 50 TG 479 0,9 0,16 18 0,8 0,6 75 TG 631 1,2 0, 7 58 0, 8 0, 7 88 *Σ**ϊ * Aktiivisuus pH 9:ssä prosentteina verrattuna aktiivisuuteen ί *: pH 6:ssa • · • ·*· 10 • · · ·*· .***. Menetelmä 2: kappatesti ··· , Kappatestit tehtiin TAPPI-protokollan T236 mukaan (saatavissa • · · TAPPI:stä, Technology Park, Atlanta, USA), eräin muunnoksin.

• · ·

Entsyymivalmistetta lisättiin 10 xU/g sellua (kuivapaino) ja 15 inkuboitiin 2 tuntia pHrssa 9, 80 °C. Nollanäytteenä inkuboi- • '**·* tiin sellua sama aika, samoissa olosuhteissa, mutta lisäämät- tä entsyymiä. Käytettiin havupuusellua, jolle oli tehty lig- ;*·*. niinin happipoisto, ominaisuudet esitetty taulukossa 6.

• · *·· • · • · 1

Eroa kappalukujen välillä, kun entsyymiä on lisätty ja ilman « · « *·*·' entsyymilisäystä, sanotaan kappaerotukseksi, ja se on lig- * niininpoistoa kuvaava arvo. Kappaerotukset esitetään taulu kossa 8. Tässä määrityksessä arvot >0,5 ovat merkitsevästi 23 1 1 9436 suurempia kuin taustataso. Siten tämä esimerkki, kuten edellinenkin, osoittaa, että entsyymeillä on merkitsevä lignii-ninpoistoaktiivisuus 80 °C:ssa.

5 Taulukko 8: ligniininpoisto kappaerotuksella mitattuna, määritettynä havupuusellusta, pH 9 ja 80 °C

---—-j—-- -

Kanta Kappaerotus TG 453 1,0 | TG 456_ 1,3 TG 457 1,4 | TG 479 1,0 TG 631 0,5

Esimerkki € 10 Lämmönkestäviä F-tyypin ksylanaaseja koodaavien geenien sisäisten konsensusfragmenttien kloonaaminen ja sekvenssien määritys ·:··· 6.1 Ksylanaasigeenien sisäisten fragmenttien PCR-monistaminen ·*·’· 15 Ksylanaasigeenien sisäisten konsensussekvenssien monistami- Φ · .seen käytettiin kolmea PCR-aluketta: kahta eri eteenpäin-alu- ,*Ö, kettä [xynFA (5' CAC ACK CTK GTK TGG CA 3', SEQ ID NO 1) ja • *” xynFB [5' CAT ACK TTK GTT TGG CA 3', SEQ ID NO 2] ja yhtä

‘“f käänteisaluketta [xynR (TGM TTK ACM ACR TCC CA, SEQ ID NO

• · · *·* 20 3)]. Alukkeet xynFA ja xynFB sitoutuivat samaan kohtaan, mut ta erosivat sekvenssinsä osalta hieman, koska ksylanaasi- « · V.· geenien eteenpäin-konsensusalueella on pieniä eroja. PCR:n *,#>ί olosuhteet olivat (94 °C 1 minuutti, 50 °C 1 minuutti, 72 °C 1 minuutti) x 30. Kaikki F-ryhmän sisäiset konsensusfragmentit • · · .··· 25 olivat noin 350 bp.

• · ·»» • · V,· 6.2 PCR-tuotteiden sekvenssien määritys '·*** Kaikkien ksylanaasien sisäisten PCR-tuotteiden (noin 350 bp) päät korjattiin (täytettiin) jäljempänä kuvatulla tavalla en- 119436 24 nen kloonaamista M13mpl0-sekvensointivektorin Smal (fosfatoi-tu) -kohtaan.

Vaihe 1 - Ammoniumasetaattisakkautus:

5 (a) Tehdään 50 μΐ PCR-seosta 100 piiksi TE-puskurilla (10 mM

Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0). (b) Lisätään 100 μΐ 4 M CH3COO-NH4+ ja 250 μΐ 100 % CH3CH2OH. (c) Inkuboidaan jäillä 15 minuuttia (tai yön yli -20 °C:ssa). (d) Sentrifugoidaan 16 000 rpm:ssä 15 minuuttia ja heitetään supernatantti pois. (e) 10 Pestään pelletti 500 piissä kylmää 70 % CH3CH20H:a. Sentrifugoidaan uudelleen (16 000 rpm 5') ja heitetään supernatantti pois. (f) Pellettiä kuivataan tyhjiössä 5 minuuttia ja sus-pendoidaan uudelleen 20 pilaan TE-puskuria.

15 Vaihe 2 - PCR-fragmenttien päiden korjaus: (a) 20 pliaan sakkautettua DNAita lisätään: 3 μΐ ΙΟχ Ligase -puskuria (Boehringer Mannheim), 1 μΐ 12,5 mM dNTPieitä (Pharmacian DNA-polymerointiseos), 0,5 μΐ (5 U) E. coliin DNA-polymeraasin suurta (Klenow) fragmenttia (BRL Technolo-20 gies Ltd), 0,25 μΐ (2,5 U) T4-DNA-polymeraasia (Boehringer Mannheim), 0,25 μΐ (2,5 U) T4-polynukleotidikinaasia (Boehringer Mannheim) ja H?0:ta 30 pl:aan asti. (b) Inkuboidaan 37 ***·: Cissa 30 minuuttia ja inaktivoidaan entsyymit kuumennuksella :*·*: inkuboimalla 70 °C:ssa 10 minuuttia.

• · . 25 • · · ··· ,···, Vaihe 3 - Päistään korjatun ksylanaasifragmentin geelipuh- ♦ · . · distus: • · f • · · (a) Ajetaan DNA 2-prosenttisen LMP-agaroosin läpi 1 x Tris- t S 1 • asetaattipuskurissa (pH 7,8). (b) Leikataan 350 bp:n ksyla- 30 naasijuova irti agaroosista. (c) Puhdistetaan DNA agaroosi- • · · *·*.* suikaleesta GeneClean©-menettelyllä (BiolOl Inc.).

• M

• · • I ««·

Vaihe 4 - Ligaatio M13mpl0:een (Smal-fosfatoitu) • * .···. (a) Sekoitetaan 1 μΐ M13mplO-vektori-DNA:ta (sopivasti lai- • · *·* 35 mennettuna noin pitoisuuteen 10 ng/μΐ), 20 - 50 ng insertti- ♦ · · *.*.* DNAita (ksylanaasin konsensusalukefragmentti, 1 μΐ 10 x li- gaasipuskuria (Boehringer Mannheim) , 1 μΐ T4-DNA-ligaasia (Boehringer Mannheim) ja H20:ta 10 pl:aan.

25 1 1 9436 (b) Inkuboidaan yön yli huoneenlämmössä.

Vaihe 5 - Ligaatioseoksen transformointi Escherichia coli -kantaan JM101: 5 (a) Transformoidaan JM101 koko 10 μ1:η ligaatioseoksella,

Chungin et ai. (1989. Proc. Natl. Acad. Sei. 86: 2172 -2175.) transformointimenetelmällä, jossa käytetään DMSO:ta.

(b) Maljataan M13/JM101 ja eristetään yhdistelmä-M13-plasmi-dit standardimenetelmiä käyttäen (Sambrook et ai. 1989. Cold 10 Spring Harbour Laboratory Press).

Yhdistelmä-M13-faagit, joissa oli ksylanaasin sisäisiä kon-sensusfragmentteja, sekvensoitiin ssDNA:sta (Sambrook et ai. 1989) Applied Biosystemsin automaattisella DNA-sekvensoijalla 15 373A, käyttäen väriainealukekemiaa [sekvensointialukkeena käytettiin universaalista M13 eteenpäin-aluketta (väriaineella leimattua), ABI Ltd.]. Kaikki DNA-sekvenssitiedot analysoitiin ja käsiteltiin G C G -sekvenssianalyysiohjelmiston avulla (asennettu Irixiin) Silicon Graphics Personal Iris 20 Workstation -työasemalla.

F-ryhmän ksylanaasien sisäisten fragmenttien sekvenssitulok- *:·*: set: :*·*: Kuudesta taulukossa 1 kuvatusta kannasta ksylanaasikonsensus- . 25 alukkeiden avulla monistettujen PCR-fragmenttien perusteella ·♦« .···. ennustettiin, että kukin organismi sisälsi 1-3 F-perheen ksylanaasigeeniä. Tulokset on analysoitu hyvin tunnetulla • · · IV. bootstrap-analyysillä (Wisconsin Molecular Biology Package, * ’ Devereux, 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387 - 394). Kuviossa 1 30 esitetään puudiagrammi (dendogrammi) eri ksylanaaseista ja • · ♦ ·*.' kannoista. Ryhmä F:n konsensusfragmenttien nukleotidisekvens- #*** seistä ilmenee nyt, että kukin organismi sisältää kolme eri-laista F-ryhmän geeniä. Kunkin organismin kukin ryhmän F ksy- • * .·*·. lanaasigeeni kuuluu eri ksylanaasiklusteriin (nukleotidi- ja * i 35 primaariaminohapposekvenssihomologioiden perusteella), jotka • · · V·* nyt nimetään klusteriksi A, klusteriksi B ja klusteriksi C.

Täyspitkä, TG 456:sta monistettu ksylanaasi kuuluu klusteriin A, ja sille on annettu nimi TG 456 xynA. Lisäksi on tunnis 119436 26 tettu sisäinen konsensusfragmentti klusterin B ksylanaasista (TG 456 xynB) ja klusterin C ksylanaasista (TG 456 xynC).

Esimerkki 7 5 Lämmönkestäviä G-tyypin ksylanaaseja koodaavien geenien sisäisten konsensusfragmenttien kloonaaminen ja sekvenssien määritys 7.1. G-tyypin ksylanaasigeenien sisäisten fragmenttien PCR-10 monistaminen

Ryhmä G:n sisäiset konsensusfragmentit (ICF:t) eristettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen ryhmä G:n eteenpäin- ja käänteiskonsensusaluketta (GF ja GR). PCR-profiili oli seuraava: 15 °C tarkoittaa celsiusasteita.

x tarkoittaa kierrosten lukumäärää (esim. xl on YKSI kierros ) .

(94 °C, 4 minuuttia) x 1 20 (94 °C, 1 minuutti; 45 °C, 1 minuutti; 72 °C, 1 minuutti) x 35 (94 °C, 1 minuutti; 45 °C, 1 minuutti; 72 °C, 6 minuuttia) x 1 *:·*: PCR:t tehtiin 50 μ1:η reaktioissa käyttäen seuraavia ainek-

:*·*; siä: 100 ng GF-aluketta, 100 ng GR-aluketta, 0,25 mM

• · • .*. 25 dNTP:eitä, 1 yksikkö Taq-polymeraasia, 0,25 mM MgCl2:ta, 10 .*··. mM Tris-HCl:a, pH 8,8, 50 mM KCl:a, 0,001 % gelatiinia, 1 - ···* , ,· 10 ng malline-DNA:ta.

f · · • · · ··· • t · • · · * Ksylanaasigeenien konsensusfragmenttien monistamiseen käytet-30 tiin kahta PCR-aluketta: *·*.* GF: TATNTGRSTNTMTATGGWTGG (sisäinen eteenpäin-konsensusaluke) *·· :...J SEQ ID NO 4.

m GR: CCGCTNCTTTGGTANCCTTC (sisäinen käänteis-konsensusaluke) .**·. SEQ ID NO 5.

• · ··· ♦ 35 • · *·*·: Kaikista kuudesta kannasta löydettiin PCR-fragmentti monis- * · tamalla konsensusalukkeilla.

119436 27

Monistettiin kahdenlaisia PCR-tuotteita (DNA-fragmentteja): odotetun kokoinen 300 bp:n fragmentti sekä odottamaton 600 bp:n PCR-tuote - tämä 600 bp:n fragmentti oli 300 bp:n PCR-tuotteen head-to-tail-dimeeri. Oletettavasti tämä 600 ep:n 5 tuote oli tulosta itsealukkeena toimimisesta PCR-reaktioiden aikana GF- ja GR-alukkeiden välisen homologian johdosta.

7.2 PCR-tuotteiden sekvenssien määritys

Kustakin organismista monistettujen 300 ep:n fragmenttien 10 päät korjattiin (katso esimerkkiä 6).

Päistä korjatut fragmentit puhdistettiin sitten 1-prosentti-sessa matalan sulamislampötilan agaroosigeelissä (ajo Tris-asetaatti-ajopuskurissa) Geneclean-menetelmällä (Bio 101, La 15 Jolla, Kalifornia).

Noin 10 ng päistä korjattua geelipuhdistettua 300 ICF:ää li-gatoitiin M13mpl0:n Smal-kohtaan käyttäen BM T4 -DNA-ligaasia 10 μ1:η reaktioissa.

20 7.3 PCR-tuotteiden sekvenssien määritys

Sekvensoitiin kuusi toisistaan riippumatonta, kannoista TG457 ·:**: ja TG53 peräisin olevaa faagia. Rinnakkain asetteluista (ku- ·1·1; vio 2) ilmenee, että kussakin näistä kannoista on läsnä vain • · .25 yksi G-tyypin ksylanaasigeeni. Lisäksi sekvensoitiin M13mpl0-,···, rekombinantteja, jotka sisälsivät ryhmä G:n ICF:iä (sisäisiä * f konsensusfragmentteja) TG453:sta, TG456:sta, TG479:stä ja • · 1 I" TG631:stä. Kaikki nämä organismit sisälsivät olennaisesti sa- • · · * manlaista ksylanaasia koodaavan G-perheen ksylanaasigeenin, 30 vaikkakin DNA-sekvenssien variaatiot ovat jopa 13 %.

• · · • · ·

«M

Esimerkki 8 j1.1. Täyspitkien F-tyypin ksylanaasien sekvenssi • · ,·1·. Sisäisten PCR-fragmenttien perusteella on identifioitu 3 eri 35 F-ksylanaasigeenityyppiä: xynA, xynB ja xynC.

• · « • · · • ♦ *"1 Genome Walking PCR:ää (GWPRCR, genomikävely-PCR) käyttäen on eristetty täyspitkät ksylanaasigeenit useimmista kannoista.

28 119436 TG456 xynA -geenin täyspitkiä sekvenssejä on määritetty. Xy-nA-geenin täydellinen sekvenssi esitetään SEQ ID NO 6:ssa.

Sen koodaama TG456-ksylanaasi A:n sekvenssi esitetään SEQ ID 5 NO 7:ssä.

XynB:n ja XynC:n osalta havaittiin, että geenit koodaavat mo-nidomeenisia entsyymejä, joissa on yksi ksylanaasidomeeni. Nämä ksylanaasidomeenit on alakloonattu käyttäen PCR-aluk-10 keitä, jotka on laadittu ksylanaasidomeenin rajalla olevien sekvenssien perusteella.

Osasekvenssitiedot TG456-peräisistä xynB- ja xynC-geeneistä annetaan SEQ ID NO 8:ssa ja vastaavasti SEQ ID NO 10:ssä.

15 vastaavasti. Geenien koodaamat TG456-ksylanaasien B ja C aminohapposekvenssit esitetään SEQ ID NO 9:ssä ja vastaavasti SEQ ID NO 11:ssä.

Esimerkki 9 20 G-tyypin ksylanaasigeenien täydellinen sekvenssi

Genomikävely-PCR:ää (GWPRCR) käyttäen on eristetty useimmista kannoista täyspitkät xynD:n geenit.

• ·

·*·’. TG456:n xynD-geenin täydellinen sekvenssi esitetään SEQ ID NO

• · . 25 12:ssa ja sen koodaama TG456-ksylanaasi D:n aminohapposek- ··♦ .···, venssi esitetään SEQ ID NO I3:ssa.

• · ·· · • ♦ · **·* Esimerkki 10 • · · *·* * Ilmentämisvektorien ja isäntien rakentaminen ksylanaasin 1 t tuottamiseksi kloonatuista geeneistä • · • · · • · # • · • · ·

Konsensus-PCR-alukkeisiin on laadittu sopivia restriktiokoh-tia, joiden avulla on mahdollista alakloonata ksylanaasigee-nejä sopiviin ilmentämisvektoreihin.

**:’ 35 • « ·.·.· XynA- ja xynC -geenit on insertoitu NcoI-BamHI pJLA602-il- *ί**ί mentämisvektoriin [Schauder, B., Blucker, H., Frank, R. ja

McCarthy, J. E. G. (1987) . Inducible Expression Vectors In- 119436 29 corporating the Escherichia coli atpE Transcriptional Initiation Region. Gene 52: 279 - 283.] niiden fuusioimiseksi lukukehyksessä lambda L- ja R -promoottoreihin [Gibbs, M. G., Saul D. J., Luthi, E ja Bergquist, P. L. (1992). The beta-5 mannanase from "Caldocellum saccharolyticum" is Part of a

Multidomain Enzyme. Appi. Environ. Microbiol. 58 (12) : 3864 -3867.]

XynB- ja xynD -geenit insertoitiin pJLA602:n uniikkeihin 10 Sphl-BamHI-kohtiin.

Rakenteet transformoitiin isäntiin E. coli JM101 ja E. coli DH5a käyttäen standarditransformointitekniikoita.

15 Kuvio 3 esittää xynD:n ksylanaasidomeenisekvenssin TG456:sta insertoituna pJLA602:een Sphl-BamHI-fragmenttina.

Esimerkki 11

Kloonattujen ksylanaasien tuottaminen ja talteenotto 20 Jotta saataisiin proteiininäytteitä kloonatuista F-tyypin ksylanaaseista, E. coli -klooneja fermentoitiin 10,0 l:n ti- lavuisessa LH-fermenttorissa (sarja 210). Viljelmää pidettiin *:*·: 30 °C:ssa, kunnes se indusoitiin (42 °C) ilmastaen jatkuvasti

·*·*· (4,8 litraa/min) , sekoittaen (500 rpm) ja säädellen pH:ta (pH

• · . 25 7, 1). Käytetty kasvatusalusta ja muut lisät esitetään seuraa- .···, vassa: • · • • · · • · · *" Luria-liemi (ymppiviljelmille): • * * *·* * Tryptoni 10 g 30 Hiivauute 5 g • · :.V NaCl 10 g ·,..ϊ Vettä 1000 ml:aan • · • · · • · · • · .···. BGM2-bulkkikasvatusalusta fermenttoriviljelyihin (määrät ovat • *“ 35 valmiille kasvatusalustalle eli kahteen 8,5 l:n erään): • · \V NH4C1 3,22 g *:**ί KH2P04 1, 05 g

MgSCq . 7H20 0, 135 g 119436 30 K2SO4 0, 043 g

FeSCb.7H20 0, 003 g SL-10-hivenaineita 1 ml

Tryptonia 10 g 5 Hiivauutetta 4,7 g

Glyserolia 34 ml

Vettä 1000 ml:aan

Kun fermentointiastia, jossa oli noin 6 litraa vettä, oli 10 steriloitu autoklavoimalla 121 °C:ssa 30 minuuttia, se jäähdytettiin 30 °C:seen. Kasvatusalustatiiviste (8,5-kertainen tiiviste) pumpattiin steriilin 0,2 pm:n kasettisuodattimen (cartridge filter) (Sartorius) läpi. Ennen ymppäystä tehtiin seuraavat lisäykset: 15

Vaahdonestoaine (Bevaloid 5901) 10 ml (autoklavoitu)

CaCl? (17 mg/ml kantaliuosta) 1 ml (autoklavoitu)

Ampisilliini 850 mg (suodatussteriloitu)

Tiamiini (vain JM101-viljelmät) 8,7 mg (suodatusster.) 20

Nesteen tilavuus säädettiin sitten 8,5 litraksi. Kasvatusalustan pH säädettiin 7,l:ksi. Suodatussteriloitua ilmaa *:·*: kuplitettiin fermenttorin läpi virtausnopeudella 4,8 litraa ·*·*· minuutissa. Fermenttorin lämpötila pidettiin 30 °C:ssa kier- • · . 25 rattämällä kylmää ja kuumaa vettä sormiulokkeiden kautta ··· .···, (through finger probes). pH:ta säädeltiin lisäämällä auto- ♦ · . W klavoitua NaOH:a (5 M) tai H^SC^ia (2 M) . Fermenttorin se- # · « koittimen nopeus oli 500 rpm.

• · · • · · m 30 Ymppäys aloitettiin erällä (noin 10,0 ml) tuoretta Luria- • · · *·*.* liemessä kasvatetun E. coli -kloonin viljelmää, jossa oli 100 ··· yg/ml ampisilliinia, kun optinen tiheys OD650 oli 0,2 - 0,4. Soluja kasvatettiin optiseen tiheyteen ODS50 11 - 13 lämpö- * · ,···. tilassa 30 °C. Sitten niille annettiin erinä kasvatusalusta- • · ·] 35 tiivistettä, annettiin palautua ja kasvatettiin OD65o:een 14 - *.*.* 16. Sitten ne indusoitiin nostamalla lämpötila 42 °C:een.

• · 3i 11?436

Solut kerättiin 4 tuntia maksimi-ODeso :n saavuttamisen jälkeen. Solut otettiin talteen onttokuitusuodatuksella (0,1 pm, Amicon) ja jälleensuspendoitiin 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7,5 mM EDTA, 7,5 mM β-merkaptoetanoli, 0,02 % lysotsyymiin ja in-5 kuboitiin 4 °C:ssa 1 tunti (kokonaistilavuus noin 1 litra). Solut sonikoitiin jäällä 160 ml:n erissä 4-6 minuuttia yhden minuutin jaksoissa, kunnes ne hajosivat (seurattiin mikroskoopilla) . Lisättiin erä 56 mM PMSFrää (isopropanolissa) (jokainen lisäys vastasi 160 pM:a) aina kahta sonikointi-10 minuuttia kohden, lopulliseksi pitoisuudeksi korkeintaan 1 mM PMSF:ää. Kun solut olivat hajonneet kokonaan, solunjäänteet poistettiin sentrifugoimalla. Supernatanttia kuumakäsiteltiin 70 °C:ssa, kunnes proteiinia sakkautui näkyvästi (yleensä noin 20 - 30 minuuttia), ja denaturoitunut proteiini poistet-15 tiin sentrifugoimalla. Ennen fenyyli-sefaroosi-kromatografiaa lisättiin ammoniumsulfaattia lämpökäsiteltyyn supernatanttiin lopulliseksi konsentraatioksi 1,0 M (tätä nimitetään lämpökä-sittelyuutteeksi 1°). Sonikoiduista soluista saatu solupel-letti jälleenuutettiin suspendoimalla 1,0 litraan 50 mM Tris-20 HC1 (pH 8,0), 5 mM EDTA, 7 mM β-merkaptoetanoliin, minkä jälkeen seurasi toinen lämpökäsittely 70 °C:ssa 15 minuuttia, ja sakkautunut proteiini poistettiin jälleen sentrifugoimalla. *:**: Tämän havaittiin uuttaneen vielä 20 - 40 % lisää ksylanaasis- •Vj ta, ja nimitettiin lämpökäsitelyuutteeksi 2°. Tähän lämpökä- * · . .*. 25 sittelyuutteeseen 2° lisättiin ammoniumsulfaattia pitoisuu- • · · .···. deksi 1,0 M ja lämpökäsittelyuutteet 1° ja 2° yhdistettiin • · **! ennen fenyyli-sefaroosi-erotusta. Ksylanaasiaktiivisuus elu- • · · *** oitiin vaiheittain 1100 ml:n pylvästilavuuden fenyylisefaroo- • * ♦ *·’ sipylväästä (kun sitä oli pesty perusteellisesti 1,0 M ammo- 30 niumsulfaatilla ja annettu palautua perusviivaan) käyttäen • · :.V 1,0 M NaCl, ja eluoitu proteiini tiivistettiin ja siitä pois- ··· ·...* tettiin suola ultrasuodattamalla YM3-kalvolla (Amicon). Vai-

misteiden lopulliset konsentraatiot ovat 25 mM Tris-HCl (pH

• · · 8,0), 5 mM EDTA, 7 mM β-merkaptoetanolia, noin 250 mM NaCl, • · *1* 35 20 % glyserolia ja 0,05 % natriumatsidia.

• · • · · • · t • ·

Menetelmä G-tyypin ksylanaasien valmistamiseksi oli lähes sama kuin edellä kuvattu, paitsi että käytettiin HEPES-puskuria 119436 32

TrisHClin sijasta sekä uutto- (pH 8,0) että suolanpoisto-vaiheessa (pH 7,3). Lopullisella valmisteella oli puskuri-koostumus 50 mM HEPES, pH 7,3, 1 mM EDTA, 7 mM β-merkapto-etanolia, 0,05 % natriumatsidia, 20,0 % glyserolia ja ± 250 5 mM NaCl.

Saatiin kaikkiaan 6 F-tyypin (5 xynA ja 1 xynB) ja 2 G-tyypin riittävän puhdasta valmistetta. Sekä F-tyypin että G-tyypin valmisteiden osalta määritettiin proteiinipitoisuus standar-10 di-BCA-menetelmällä (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Näytteiden puhtaus arvioitiin karkeasti ajamalla SDS-PAGE-geeli (Phast-system, Pharmacia, 20 % geeli) ja vertaamalla F-tyypin osalta noin kohdalla 40 kD ja G-tyypin osalta noin kohdalla 25 kD olevan juovan leveyttä epäpuhtausjuovien leveyteen.

15 Näytteiden puhtaus oli välillä 20 - 70 % (taulukko 9).

Taulukko 9: F-tyypin ja G-tyypin ksylanaasivalmisteiden puhtaus__

Entsyymi Puhtaus (%) TG53xynA 30 TG53xynD (G-tyyppi) 20 ·♦··· ‘ .............. ' ' »—..n I.· • · TG456xynA 70 • · - - _ • · : TG456xynD (G-tyyppi) 30 ··· ____ ___ ··· ' **··’ TG457xynA 70 • ............

• · · ............ .IMI ......... — • » t ,*1*^ TG479xynA 70 « · * ......................... ' -- _ * —..... ' TG63lxynA 70 • 9 TG631xynB 20 . 11 — 1 • · ··· : : : 20 Esimerkki 12 9 9 ϊ"|: ECF-valkaisutulokset kloonatuilla F- ja G-tyypin ksylanaa- .’· seilla • 99 • · «

Suoritettiin ECF-valkaisu käyttäen ruotsalaisen sellutehtaan sulfaattisellua, jolle oli tehty ligniinin happipoisto. Ha-25 vupuusellun (softwood, SW) kappaluku oli 16,0 ja lehtipuu- 33 119436 sellun (hardwood, HW) kappaluku 10,6. Käytettiin XDED-sarjaa taulukossa 10 esitetyissä olosuhteissa.

Taulukko 10. Valkaisuolosuhteet_

Vaihe X Dq e pitoisuus 10 % 10 % 10 % 10 % aika 120 min 60 min 60 min 120 min

lämpöt. 65 °C 60 °C 60 °C 70 °C

pH 9 n.2,5 n.10 n.3,5 kemikaali- 15 pg ksyl.- kloori- NaOH: 7,2 aCl^: annostus proteiinia kerroin: kg/t SW, 5,9 10 kg/t / g massaa 0,15 kg/t HW (S/HW) 5 X = entsyymi, D0, Di = klooridioksidi, E = NaOH-uutto.

Näiden kokeiden tulokset esitetään taulukossa 11. On nähtävissä, että G-tyypin ksylanaasit suoriutuvat merkitsevästi paremmin kuin F-tyypin ksylanaasit, kun vertaillaan entsyy-10 miproteiinin perusteella.

Taulukko 11. ECF-valkaisu kloonatuilla F- ja G-tyypin ksy-·> . lanaaseilla.

• · · --1_ _ ___

• · I

• · . Entsyymi Δ kirkkaus (% ISO) ··» havupuu lehtipuu • · * TG53xynA 1,02> 1,25 • · · I ............ ' " ................. .1 I .... I ..111 • ♦ # TG53xynD (G-tyyppi) 5, 93)/6, 84) 3, 06) :Vi TG456xynA 1,2^/0,7^ 1,05) • · **;·* TG456xynD (G-tyyppi) 4,33>/5,94) 4,05)/2,l6) • ......... .... · ' - --- • · · TG457xynA 01’ 06) • t TG479xynA 0,32) 0,3!i) • · * _ --- - * e^· 1 ' ....: TG63 lxynA 01( 0C) • · ___ TG63 lxynB 02) 34 1 1 9436 1-61 viittaavat kuuteen eri kokeeseen. ISO-kirkkauden refe-renssiarvot olivat näissä kokeissa seuraavat. Koe 1: 73,5, koe 2: 78,3, koe 3: 52,0, koe 4: 52,3, koe 5: 79,0, koe 6: 5 80, 5.

Esimerkki 13

Kloonattujen G-tyypin ksylanaasien ECF-annosvastekäyrät Käyttäen esimerkissä 12 kuvattuja XDED-valkaisusarjoja vaih-10 deltiin kahden G-tyypin ksylanaasin annostusta. Tulokset esitetään taulukossa 12. Jo annostukset 1-3 pg/g massaa tuottavat vähintään kahden pisteen kasvun ISO-kirkkaudessa.

Taulukko 12. Kahden G-tyypin ksylanaasin annosvastekäyrät

Ent- annos- kirkkaus, HW kirkkaus, SW (XDED) syymi tus (XDED) (pg xyl / g massaa) ________________________ %ISQ Δ %ISO %ISO Δ %ISO Δ

%ISO %ISO

TG456 0 78,5 - 55,85 - 62,92

xynD

»· · —^- i | Il —— I ' — • I · : 1 80, 73 2, 23 56, 80 0, 95 65, 73 2,81 e · · . . . . _______ ____ . ^—--- - jM*; 3 81,03 2,53 58,06 2,21 68,12 5,20 #·· »1« ................ 1' ' Il .m l.O 6 80,99 2, 49 59,20 3,35 68,32 5, 40 ·*· - 1 .............. 1 - • · · 15 70, 45 7,53 .V. TG53 0 78,5 - 55, 85 - 66, 75 • · · ' 9 9 • ·

,···. xynD

* · — M» “ " ' .V. 1 79, 73 1,23 57, 28 1, 43 69,04 2,29 • * · _ __.. . ........._ • # - 3 80, 13 1,63 57, 87 2, 02 69,35 2, 60 01’ 6 81,32 2,82 58,23 2,38 69,92 3, 17 • ----- "" ^"" ““ ^““ 15 72,39 5, 64 35 1 1 94 36

Esimerkki 14 TCF-valkaisutulokset kloonatuilla G-tyypin ksylanaaseilla Kahta F-tyypin ksylanaasia testattiin TCF-valkaisusarjalla 5 käyttäen XQPP-sarjaa kuten kuvataan esimerkissä 15 (jäljempänä) . Käytettiin sulfaattisellua (30 g o.d. per näyte), josta oli poistettu ligniini hapella. G-tyypin ksylanaasien annostus vaihteli taulukossa 13 esitetyllä tavalla. Kustakin näytteestä saadut ISO-kirkkausarvot X-, Pl- ja P2 -vaiheiden 10 jälkeen esitetään taulukossa 13. Arvot edustavat kahden näytteen keskiarvoa.

Taulukko 13. TCF-valkaisu - annosvastekoe G-tyypin ksyla- naaseilla._ Näyte annostus (pg X-kirk- Pl-kirk- P2-kirk- prot. / g kaus kaus kaus massaa) verrokki 0 50,3 79,5 81,0 TG456 xynD 15 53,8 81,8 84,3 6 52,9 81,0 83,8 TG53 xynD 15 55,2 82,2 85,1 „1 .* 6 53,6 82, 7 85,1

t · · ^. I ............. I .......... II... I I . I I. 1 II

• · * : is • · 1 • * »

Koe toistettiin annostuksilla 3 ja 6 pg proteiinia massa- • · **··1 grammaa kohden. Määritettiin ainoastaan P2-vaiheen saadut • · · *·ϊ·* kirkkausarvot. Tulokset esitetään taulukossa 14.

··· • · · • · · 20 Taulukko 14. TCF-valkaisun annosvastekoe G-tyypin ksyla-:Vi naaseilla

• · .I

·***: Näyte annostus (pg pro- P2-kirkkaus *;1 teiinia /g massaa) • · ^..........

V.: Verrokki 0 84,5 TG456 xynD 6 85,5 • .. . . ...................

·1:1: 3 86,5 • 1 ________________ 3 86, 8 ί**ϊ TG53 xynD 6 86,1 36 1 1 9436

Esimerkki 15 ECF- ja TCF -tulokset, paperin ominaisuudet mukaan luettuna Testattiin ksylanaasinäytteiden valkaisuvaikutusta ECF- ja 5 TCF -valkaisussa ruotsalaisesta sellutehtaasta saadussa leh-tipuusulfaattisellussa ja havupuusulfaattisellussa. Kloonattuja TG456 xynDitä ja TG53 xynD:tä (joihin tässä esimerkissä viitataan 715:nä ja 7l6:na, tässä järjestyksessä) verrataan entsyymittömiin verrokkinäytteisiin. Hiertämiskokeet Lampen-10 kuulamyllyssä osoittivat, että 715:n kokonaissuorituskyky oli paras: repäisyindeksi parani paljon, vetoindeksi ja puhkaisu-indeksi eivät huonontuneet merkitsevästi.

Seulontakokeet lehtipuu havupuu

1. TCF verr. QPP 1. TCF verr. QPP

2. Ents. 715 XQPP 2. Ents. 715 XQPP

3. Ents. 716 XQPP 3. Ents. 716 XQPP

4. ECF verr. ei ents. DE- 4. ECF verr. ei ents. DE-

DED DED

*·*"** 5. Ents. 715 XDEDED 5. Ents. 715 XDEDED

·* * • » ·

* Ϊ 6. Ents. 716 XDEDED 6. Ents. 716 XDEDED

• · · • · · ·*·

.**·, 7. Kem. verr. DEDED 7. Kem. verr. DEDED

• t ··· . 15 # » ·

• M

Valkaisemattoman sellun ominaisuudet • · · I — I .......... .................—|

Massa kappaluku % ISO-kirkkaus viskositeetti dm'Vkg • · .......... .....

sulf aattisel- 10, 8 53 1104 lu, lehtipuu • · ·_______ • · *"[: sulf aattisel- 16,1 36,4 1003 lu, havupuu t · « Il I _ • · • · 37 1 1 9 4 3 6

Testattavat valkaisuparametrit TCF_____ % ISO- kemikaalin kappaluku vis- paperin kirkkaus kulutus kositeetti lujuus

X:n jäi- XQP XQPP XQPP XQPP

keen

XQP XQPP

XQPP

ECF_____ % ISO- kemikaalin kappaluku viskositeetti paperin kirkkaus kulutus lujuus

X:n jäi- XDE XDE XDEDED XDEDED

keen

XDE XDED

XDED XDEDED

XDEDED

* » » ·· « * · · • · • · • · · ♦ * ♦ ··· *·* t · • · ·· · « « · f * · ··· M· • · · « · · * i • « · • · · * f *·· • · ··· * · « · · • t I * * *·« • * • · • f# • · * « * • « · • ' * « « 38 1 1 9436

Vaikaisuolosuhteet A) TCF, lehtipuusellu & havupuusellu (samat valkaisuolosuh-teet molemmilla selluilla)_

Vaihe X Q P P

kiinteys 10 9 10 10 (%)_____ aika (mi- 120 5*4 s se- 180 180 nuutteja) koittimes- sa lämpötila 65 65 85 85 (°C) pH 9 4-5 10,5-11 10,5-11 entsyy- 3 miannos EDTA-annos - 3 - - (kg/t)

NaOH-annos - - 20 10 (kg/t) ♦ · _______________________ I **i H202-annos - - 20 10 ί :’ϊ (kg/t) ··· I 1 _ 1 φφφ • · Γ- • · b ··· ^ * • φ · • · » ··· ··· φ φ Φ • φ Φ • • « φφφ • · * • · ΦΦΦ # Φ • * Φφφ

V

• Φ φφφ • · # • · ΦΦΦ • Φ Φ ΦΦΦ • φ Φ • φ Φ φ φ Φ φ Φ m Φ Φ 39 1 1 9436 B) ECF, lehtipuusellu_

Vaihe X D E D E D

kiinteys 10 10 10 10 10 10 (%)_______ aika (mi- 120 60 60 120 60 180 nuutteja) t (°C) 65 60 60 70 60 70 pH 92-3 n. 11,5 2,5-3 n.- 4-5 11,5 ents.an- 3 - - - - - nos (ug/g)_______ aCl-annos - 0,181kappa - 18-8 (kg/t) =19,4

kaikille X verr. & kaikille X

21,6 kem.

·2· verrokeille ·· · ...................................... -......... ^— ...... ' • · : ;1 NaOH-an- - - 11,6 - 10 • · ’2·1 nos kaikil- • « ·

*···1 (kg/t) le X

verr. & v": kaikil

le X

* · • · · • · · • · .2·. 13 kem.

• · • · · verro- • · · *·1·’ keille • · · • · ...................I— _____—— • · * · · • · · • 1 1 • · · 2 • · 40 1 1 94 36 C) ECF, havupuusellu

Vaihe X D E D E D

kiinteys 10 10 10 10 10 10 (%)_______ aika (mi- 120 60 60 120 60 180 nuutteja) t (°C) 65 60 60 70 60 70 pH 92-3 n. 11,5 2,5-3 n.- 4-5 11,5 ents.an- 3 - - - nos (yg/g)_______ aCl-annos - 0,18*kappa - 18-8 (kg/t) =28,8

kaikille X verr. & kaikille X

* *·’*· 32 kem.

• · · • "I verrokeille • * • · · *···* NaOH-an- - - 17,3 - 10 t ·· • · *···* nos kaikil-

:.i.: (kg/t) le X

• · · ·.· : verr . & kaikil-

·*·*· le X

• m ··· • · · • Φ · .·!·. 19,2 *·*·: kem.

• · · * · *···* verro- keille • · 4i 119 4 3 6

Edellä kuvattujen kokeiden tulokset on esitetään taulukoissa 15 (lehtipuu) ja 16 (havupuu).

Taulukko 15: Yhteenveto lehtipuun valkaisutuloksista lehtipuu P2 % ISO P2 kappa P2 vis- kokonais-

koosius P

TCP 78,4 6,7 866 25,2 verr.

TCP 715 81 6,2 850 26,1 + + - TCF 716 81, 7 6,2 740 27, 7 + + - D2 % ISO XDE kap- D2-vis- kokonais- pa koosius aCl EOF 88,6 4,6 1050 46,1 verr.

EOF 715 89,1 4,5 1035 44,8 ++-+ ECF 716 88,6 4,6 1040 45 00-+ • 1 ....... ..... ...................................... . ..

kem.- 88,6 4, 9 1020 47 • · • · . verr.

* · ·.............

··· ............. .......................... 1 ' ................ 1 • 1 · r- • · ^ • · · • · • · · * · · • · · • · · * · · • m λ m m • » · • 9 • 1 • · • · ··· • · • · · • · · * 1 • · · · • 1 • f Φ · · * • 1 • · · • · · • · 42 1 1 94 36

Taulukko 16: Yhteenveto havupuun valkaisutuloksista_ [havupuu P2 % ISO P2 kappa P2 vis- kokonais-

koosius P

TCF 69, 1 7, 3 814 18,5 verr.

TCF 715 72,1 6,7 805 16 ++-+ TCF 716 71 6,7 833 16,7 +++ D2 % ISO XDE kap- D2-vis- kokonais- pa koosius aCl ECF 85,5 4, 6 941 54,5 verr.

ECF 715 86,5 4,4 935 54,4 + + -0 ECF 716 86,7 4,3 935 54,5 ++-0 kem.- 87,5 3, 7 962 57,3 verr.

• ........... 1 ......... r • · ·« · ; *.· Paperin ominaisuuksien verifioiminen Φ i,!#i Kun kaikki valkaisusarjät olivat valmiit, otettiin 30 g näyt- Φ · · : : 5 teitä 3a hierrettiin niitä Lampen-kuulamyllyssa 10, 20 ja 30 • ;*· tuhannen kierroksen ajan. Mitattiin Schopper-Rieglerit, minkä »·· jälkeen tehtiin noin 2 g:n arkkeja vetoindeksiä, huokoisuut- ta, repäisyindeksiä ja puhkaisuindeksiä varten. Arkit jätet- .. tiin ilmastoitumaan 24 tunniksi 23 °C:ssa ja 50 % suhteelli- • · ♦ • · · *.* 10 sessa kosteudessa. Saadut tulokset esitetään kuvioissa 4-8.

• · • · ·«· :Y: Esimerkki 16 • · ·**’: TG456 xynD:n pH-optimi, lämpötilaoptimi ja termostabiilius ···

Aktiivisuudet mitattiin, kuten on kuvattu esimerkissä 2, me- 9 · · **t 15 nettely 1, substraattina spelttikauraksylaani. Kaikki määritykset tehtiin 50 mM fosfaattipuskurissa, mainitussa pH:ssa ja lämpötilassa. Tulokset esitetään kuvioissa 9 ja 10.

43 1 1 9 4 3 6 TG456“ksylanaasi D on paljon lämmönkestävämpi kuin verrok-kientsyymi Pulpzyme HB (Novo Nordisk), ja sen (ksylanaasin D) pH-optimi on hieman korkeampi.

• · ·· · • · · * · » · • · · f · t ··« ··» • t • · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · • * · • · · • · ··· • · • · ··· • · • · · • Φ * • · ··· • · * · »«· • · • » » • · t • · • · 44 1 1 9436

SEKVEN S SILIS TAU S

(1) YLEISET TIEDOT: (1) HAKIJA: (A) NIMI: Gist-brocades B.V.

(B) KATU: Wateringseweg 1 (C) KAUPUNKI: Delft (E) MAA: Alankomaat

(F) POSTINUMERO: 2611 XT

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Termostabiilit ksylanaasit (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 13 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, versio #1.25 (EPO) (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei ·· · • · · : ·' (vi) ALKUPERÄ:

: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: xynFA

··· **· • · • f ·«1 . (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 1 : • · ··· !1:1: cacackctkg tktggca 17 (2) SEKVENSSIN ID NO: 2 TIEDOT: • · · ' ' • · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *·1 (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • ·

:.V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

1 (iii) HYPOTEETTINEN: ei 45 1 1 9436 (iii) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: xynFB (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2: CATACKTTKG TTTGGCA 17 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vi) ALKUPERÄ: (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: xynR (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: TMGTTKACMA CRTCCCA 17 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 21 emäsparia *ϊ,,: (B) TYYPPI: nukleiinihappo I*.·. (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen * ·* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · » · t

V.l' (ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

• ··· . .*. (iii) HYPOTEETTINEN: ei • · · ' ' ·»· :T: (iii) anti-sense: ei (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: GF

• * • · · • · • · I" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4: * · · • * « TATNTGRSTN TMTATGGWTG G 21 • · « * • •f :.V (2) SEKVENSSIN ID NO: 5 TIEDOT: *···· * * (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia 46 119436 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: kyllä (vi) ALKUPERÄ:

(C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: GR

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5: CCGCTNCTTT GGTANCCTTC 20 (2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1065 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: . (A) ORGANISMI: ekstremofiili (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: TG456 *· • 1 ·

: ;1 (ix) ERITYISPIIRRE

rj1: (A) NIMI /TUNNUS : CDS

(B) SIJAINTI: 3..1058 (D) MUUT TIEDOT: /tuote= "ksylanaasi A" ; .1. /geeni= "xynA" ··· :T: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6: * 1 * · · • · f • · * · · • · • · ··· • · • t « · « • · ··· • • · ··· • · • · 1 • · · 9 9 47 119436 CC ATG GAC CTT TAT TCA ATC TCA GAT GAA AAT TGG GGG CAG CCT GTG 47

Met Asp Leu Tyr Ser lie Ser Asp Glu Asn Trp Gly Gin Pro Val 1 5 10 15 CCT GAT TAT AAA CTG CCA TCA CTT TGT GAA AAG TAC AAA AAC TAT TTC 95

Pro Asp Tyr Lys Leu Pro Ser Leu Cys Glu Lys Tyr Lys Asn Tyr Phe 20 25 30 AAG ATT GGA GTT GCT GTG CCC TAC AGG GCT CTG ACA AAT CCA GTT GAT 143

Lys lie Gly Val Ala Val Pro Tyr Arg Ala Leu Thr Asn Pro Val Asp 35 40 45 GTG GAG ATG ATA AAA AGG CAT TTC AAC AGC ATA ACA CCG GAG AAC GAG 191

Val Glu Met lie Lys Arg His Phe Asn Ser lie Thr Pro Glu Asn Glu 50 55 60 ATG AAA CCA GAG AGC CTT CAG CCT TAT GAA GGT GGT TTT AGC TTT AGC 239

Met Lys Pro Glu Ser Leu Gin Pro Tyr Glu Gly Gly Phe Ser Phe Ser 65 70 75 ATT GCA GAT GAG TAT ATA GAT TTT TGC AAA AAG AAC AAT ATC TCA CTG 287 lie Ala Asp Glu Tyr lie Asp Phe Cys Lys Lys Asn Asn lie Ser Leu 80 85 90 95 CGA GGG CAC ACK CTT GTT TGG CAT CAG CAA ACC CCG AGC TGG TTC TTT 335

Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Gin Gin Thr Pro Ser Trp Phe Phe 100 105 110 ACA AAT CCT GAG ACG GGC GAA AAA CTT ACT AAC AGT GAG AAG GAC AAG 383

Thr Asn Pro Glu Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asn Ser Glu Lys Asp Lys 115 120 125 RAA ATA CTA TTG GAT AGG CTA AAG AAG CAC ATC CAG ACA GTT GTT GGC 431

Xaa lie Leu Leu Asp Arg Leu Lys Lys His lie Gin Thr Val Val Gly 130 135 140 • · M · f · » • ♦ • · * · · • 1 ♦ ··· ··· • · • ♦ ··· • · ♦ • · · M· ··» • ♦ ♦ • · · • • · « • · · • 1 ··· • · • ♦ ··· • 1 • · · · · • · *·· • · • · ·2 · · * 1 ♦ * · · 2 • · 119436 48 AGG TAT AAG GGG AAA GTA TAT GCA TGG GAC GTT GTG ÄAT GAG GCG ATT 479

Arg Tyr Lys Gly Lys Vai Tyr Ala Trp Asp Vai Val Asn Glu Ala lie 145 150 155 GAT GAG AAT CAG CCG GAT GGG TAT AGA AGA AGT GAC TGG TAC AAT ATC 527

Asp Glu Asn Gin Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Ser Asp Trp Tyr Asn lie 160 165 170 175 TTR GGA CCG GAG TAC ATT GAA AAG GCA TTT ATC TGG GCG CAT GAA GCA 575

Xaa Gly Pro Glu Tyr lie Glu Lys Ala Phe lie Trp Ala His Glu Ala 180 185 190 GAC CCG AAA GCA AAG CTT TTC TAC AAT GAC TAC AGT ACA GAA GAM CCA 623

Asp Pro Lys Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Ser Thr Glu Xaa Pro 195 200 205 TAT AAA AGA GGG AAT TTA TAT ACA CTA ATT AAA AAY TTA AAA GCM AAA 671

Tyr Lys Arg Gly Asn Leu Tyr Thr Leu lie Lys Asn Leu Lys Ala Lys 210 215 220 GGT GTG CCA GTT CAT GGT GTT GGG CTT CAG TGT CAT ATT TCA CTT GAC 719

Gly Val Pro Val His Gly Val Gly Leu Gin Cys His He Ser Leu Asp 225 230 235 TGG CCG GAT GTG AGT GAA ATC GAG GAG ACT GTC AAA TTA TTT AGC AGG 767

Trp Pro Asp Vai Ser Glu He Glu Glu Thr Val Lys Leu Phe Ser Arg 240 245 250 255 ATT CCA GGA CTT GAA ATA CAC TTC ACA GAA ATT GAT ATA AGT ATT GCT 815

He Pro Gly Leu Glu He His Phe Thr Glu He Asp He Ser He Ala 260 265 270 AAA AAC ATG ACC GAT GAT GAT GCA TAT AAC CGC TAT CTT TTG ATT CAG 863

Lys Asn Met. Thr Asp Asp Asp Ala Tyr Asn Arg Tyr Leu Leu lie Gin 275 280 285 • · CAG GCA CAA AAA TTA AAA GCA ATT TTT GAT GTT TTG AAA AAG TAC AGA 911 • ·1 2 Gin Ala Gin Lys Leu Lys Ala lie Phe Asp Val Leu Lys Lys Tyr Arg • ;’j 290 295 300 ·· :3: AAT GTA GTT ACA AGT GTT ACA TTC TGG GGA CTG AAG GAT GAT TAC TCA 959 *** Asn Val Val Thr ser Val Thr Phe Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser J.J.J 305 310 315 ··· ·.1 1 TGG CTA CGG GGA GAT ATG CCA CTT TTA TTC GAT AAA GAC TAC CAG CCA 1007

Trp Leu Arg Gly Asp Met Pro Leu Leu Phe Asp Lys Asp Tyr Gin Pro 320 325 330 335 • ♦ • ♦ « **♦1 AAG TTT GCG TTC TGG AGC TTA ATT GAC CCA TCA GTT GTC CCA AAA GAG 1055 *·1 I J Lys Phe Ala Phe Trp Ser Leu He Asp Pro Ser Val Val Pro Lys Glu *" 340 345 350 • · • · · *·1·1 TAATGGATCC 1065 ··· • · • · «·1 • · · • f · 2 · · 3 • · 49 119436 (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 351 emäsparia (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7:

Met Asp Leu Tyr Ser Ile Ser Asp Glu Asn Trp Gly Gin Pro Vai Pro 15 10 15

Asp Tyr Lys Leu Pro Ser Leu Cys Glu Lys Tyr Lys Asn Tyr Phe Lys 20 25 30

Ile Gly Vai Ala Vai Pro Tyr Arg Ala Leu Thr Asn Pro Vai Asp Vai 35 40 45

Glu Met Ile Lys Arg His Phe Asn Ser Ile Thr Pro Glu Asn Glu Met 50 55 60

Lys Pro Glu Ser Leu Gin Pro Tyr Glu Gly Gly Phe Ser Phe Ser Ile 65 70 75 80

Ala Asp Glu Tyr Ile Asp Phe Cys Lys Lys Asn Asn Ile Ser Leu Arg 85 90 95

Gly His Thr Leu Vai Trp His Gin Gin Thr Pro Ser Trp Phe Phe Thr 100 105 110 ·· · • · · * l Asn Pro Glu Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asn Ser Glu Lys Asp Lys Xaa :115 120 125 ··· * · *···1 Ile Leu Leu Asp Arg Leu Lys Lys His Ile Gin Thr Vai Vai Gly Arg : 130 135 140 ·«« • · · * Tyr Lys Gly Lys Vai Tyr Ala Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala Ile Asp 145 150 155 160 • · V.: Glu Asn Gin Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Ser Asp Trp Tyr Asn Ile Xaa .2·. 165 170 175 • · • 1 1

Gly Pro Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Phe Ile Trp Ala His Glu Ala Asp 180 185 190 • 1 • · • · · · • 1 1 • · · • · v 2 • · 50 119436

Pro Lys Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Ser Thr Glu Xaa Pro Tyr 195 200 205

Lys Arg Gly Asn Leu Tyr Thr Leu lie Lys Asn Leu Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Val Pro Val His Gly Val Gly Leu Gin Cys His lie Ser Leu Asp Trp 225 230 235 240

Pro Asp Val Ser Glu lie Glu Glu Thr Val Lys Leu Phe Ser Arg lie 245 250 255

Pro Gly Leu Glu lie His Phe Thr Glu lie Asp lie Ser lie Ala Lys 260 265 270

Asn Met Thr Asp Asp Asp Ala Tyr Asn Arg Tyr Leu Leu lie Gin Gin 275 280 285

Ala Gin Lys Leu Lys Ala lie Phe Asp Val Leu Lys Lys Tyr Arg Asn 290 295 300

Val Val Thr Ser Val Thr Phe Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Trp 305 310 315 320

Leu Arg Gly Asp Met Pro Leu Leu Phe Asp Lys Asp Tyr Gin Pro Lys 325 330 335

Phe Ala Phe Trp Ser Leu lie Asp Pro Ser Val Val Pro Lys Glu 340 345 350 » · (2) SEKVENSSIN ID NO: 8 TIEDOT: • · • · : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: "I (A) PITUUS: 1633 emäsparia ϊ.,.ϊ (B) TYYPPI: nukleiinihappo . .·. (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen '"·· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ··· • · ·

* * (ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei • ♦ « • · j***: (iii) ANTI-SENSE: ei • (vi) alkuperä: (A) ORGANISMI: ekstremofiili (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: TG456 (ix) erityispiirre:

,1*. (A) NIMI/TUNNUS: CDS

(B) SIJAINTI: 1..1632 (D) MUUT TIEDOT: /osittainen 51 119436 /tuote= "ksylanaasi B" /geeni= "xynB" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:8: TGT ACC ATA AAA TGG CAG CAA ACA GTT CCA TCT GGG GTT TGG ACA GAA 48

Cys Thr Ile Lys Trp Gin Gin Thr Val Pro Ser Gly Val Trp Thr Glu 15 10 15 GTT TCT GGT TCA TAT ACA GTA CCA CAG ACA GCA ACC CAG CTC ATA TTC 96

Val Ser Gly Ser Tyr Thr Val Pro Gin Thr Ala Thr Gin Leu lie Phe 20 25 30 TAT GTG GAA TCG CCA AAT GCA ACA CTT GAC TTT TAC CTT GAC GAC TTT 144

Tyr Val Glu Ser Pro Asn Ala Thr Leu Asp Phe Tyr Leu Asp Asp Phe 35 40 45 ACT GTA ATA GAC AAA AAC CCG GTT ACA ATA CCT GCT GCG GCA AAA GAG 192

Thr Val lie Asp Lys Asn Pro Val Thr lie Pro Ala Ala Ala Lys Glu 50 55 60 CCA GAG TTG GAG ATT CCA TCA CTT TGC CAG CAA TAC AGC CAG TAC TTT 240

Pro Glu Leu Glu lie Pro Ser Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Gin Tyr Phe 65 70 75 80 TCA ATT GGT GTT GCA ATA CCA TAT AGA GTG CTC CAA AAC CCG GTA GAA 288

Ser lie Gly Val Ala lie Pro Tyr Arg Val Leu Gin Asn Pro Val Glu 85 90 95 AGA GCA ATG GTT TTA AAG CAT TTC AAC AGT ATT ACT GCT GAA AAT GAG 336

Arg Ala Met Val Leu Lys His Phe Asn Ser lie Thr Ala Glu Asn Glu 100 105 110 ATG AAG CCC GAT GCT ATA CAA AGA ACA GAA GGG CAG TTC AAT TTC GAT 384 , Met Lys Pro Asp Ala lie Gin Arg Thr Glu Gly Gin Phe Asn Phe Asp 115 120 125 ·· ♦ • ♦ 9 ί .1 GTT GCA GAC CAG TAT GTT GAC TTT GCA CAG AGC AAT AAT ATT GGA ATA 432 • Val Ala Asp Gin Tyr Val Asp Phe Ala Gin Ser Asn Asn lie Gly lie *·:·1 130 135 140 ··· • 1 • 9 *" AGA GGT CAT ACA CTG GTT TGG CAT CAA CAA ACT CCA GAT TGG TTT TTC 480

Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Gin Gin Thr Pro Asp Trp Phe Phe .···, 145 150 155 160 • m · CAG CAT TCT GAC GGT TCG CCA CTT GAT CCA AAC AAT TCT GAA GAC AAG 528

Gin His Ser Asp Gly Ser Pro Leu Asp Pro Asn Asn Ser Glu Asp Lys ies 170 175 • « • 99 9 9 • 9 • 99 9 9 9 9 9 9 • 99 9 9 9 99 9 9 9 9 99 9 9 • 1 • · · • · · • · 52 119436 CAG CTT TTG AGA AAT AGG TTA AAA ACA CAC ATT CAG ACA CTT GTT GGA 576

Gin Leu Leu Arg Asn Arg Leu Lye Thr His lie Gin Thr Leu Val Gly 180 185 190 AGA TAT GCA GAG AAA GTT TAT GCA TGG GAT GTT GTA AAT GAA GCA ATT 624

Arg Tyr Ala Glu Lys Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala lie 195 200 205 GAT GAA AAT CAA CCG GAT GGA TAT AGA AGA AGT GAA TGG TAC AGA ATT 672

Asp Glu Asn Gin Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Ser Glu Trp Tyr Arg lie 210 215 220 TTA GGA CCA ACT CCA GAA ACA GGC GGA ATA CCA GAG TAT ATA ATC CTT 720

Leu Gly Pro Thr Pro Glu Thr Gly Gly lie Pro Glu Tyr lie lie Leu 225 230 235 240 GCA TTC CAG TAT GCA CGG GAA GCT GAC CCG AAC GCA AAA CTT TTC TAC 768

Ala Phe Gin Tyr Ala Arg Glu Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Phe Tyr 245 250 255 AAC GAT TAC AGC ACT GAA AAT CCA AAG AAG AGA CAG TTT ATT TAC AAC 816

Asn Asp Tyr Ser Thr Glu Asn Pro Lys Lys Arg Gin Phe lie Tyr Asn 260 265 270 ATG GTC AAA GCT TTG CAT GAT AGA GGT CTC ATT GAT GGT GTT GGT CTG 864

Met Val Lys Ala Leu His Asp Arg Gly Leu lie Asp Gly Val Gly Leu 275 280 285 CAG GGA CAT ATT AAT GTG GAT TCG CCT GCA GTC AAA GAA ATA GAA GAT 912

Gin Gly His lie Asn Val Asp Ser Pro Ala Val Lys Glu lie Glu Asp 290 295 300 ACA ATC AAT TTA TTC AGC ACA ATA CCG GGT CTT CAA ATT CAA ATA ACA 960 , Thr lie Asn Leu Phe Ser Thr lie Pro Gly Leu Gin lie Gin lie Thr *·1'ϊ 305 310 315 320 : ,· GAG CTT GAT ATC AGC GTA TAT ACA AGC AGC ACT CAG CAA TAT GAC ACA 1008 . .·. Glu Leu Asp lie Ser Val Tyr Thr Ser Ser Thr Gin Gin Tyr Asp Thr *·!·* 325 330 335 ··« • · *··.1 TTA CCA CAG GAT ATT ATG ATT AAA CAG GCT TTA AAA TTC AAA GAG CTG 1056 ; ·"· Leu Pro Gin Asp lie Met lie Lys Gin Ala Leu Lys Phe Lys Glu Leu *··’ 340 345 350 • · · • i « TTT GAA ATG TTA AAG CGC CAC AGC GAC AGA ATC ACA AAT GTT ACA CTT 1104

Phe Glu Met Leu Lys Arg His Ser Asp Arg lie Thr Asn Val Thr Leu 355 360 365 • · t ♦ ♦ ;***. TGG GGT CTC AAA GAT GAT TAT CCA TGG CTG TCA AAA GAT AGA AGT AAC 1152 ·1· Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Pro Trp Leu Ser Lys Asp Arg Ser Asn .V. 370 375 380 • · • f ··· • · • · • It • · • 4 · • · · # · · 53 119436 TGG CCA CTG CTA TTT GAT AGT AAC TAC CAG GCA AAA TAC AAT TAC TGG 1200

Trp Pro Leu Leu Phe Asp Ser Asn Tyr Gin Ala Lys Tyr Asn Tyr Trp 385 390 395 400 GCT ATT GTA GAA CCT TCG GTG TTG CCT GTT GCT ATA AAT AAG GGA TAT 1248

Ala Ile Val Glu Pro Ser Val Leu Pro Val Ala lie Asn Lys Gly Tyr 405 410 415 GCG AAC AAT GCA CAG CCA AGA ATT GAT GGG ATT ATG GAT AAA GAA TAC 1296

Ala Asn Asn Ala Gin Pro Arg lie Asp Gly lie Met Asp Lys Glu Tyr 420 425 430 AAA GGA ACC ATT CCA CTT TCG GTT TTG AAT GAT GCA GGG CAG GAT ATT 1344

Lys Gly Thr lie Pro Leu Ser Val Leu Asn Asp Ala Gly Gin Asp lie 435 440 445 GCT CAG GTA AGG GCA CTG TGG AGT GGC AAT GAG CTT TGT CTT TAT GTC 1392

Ala Gin Val Arg Ala Leu Trp Ser Gly Asn Glu Leu Cys Leu Tyr Val 450 455 460 ACT GTA AAT GAT TCA AGT GTG GAT GCT AAC AAT GAT AGG GTT GTA ATT 1440

Thr Val Asn Asp Ser Ser Val Asp Ala Asn Asn Asp Arg Val Val lie 465 470 475 480 TTC ATT GAT CAG GAC AAT GGA AAG TTG CCA GAG TTA AAA GAT GAT GAC 1488

Phe lie Asp Gin Asp Asn Gly Lys Leu Pro Glu Leu Lys Asp Asp Asp 485 490 495 TTC TGG GTT TCA ATT TCG AGA AAT GGC ACA AAG AAT CAA TCC AAA ACT 1536

Phe Trp Val Ser lie Ser Arg Asn Gly Thr Lys Asn Gin Ser Lys Thr 500 505 510 GGC TAT GTA AAA GAT TAT GTA GTG TTA CAG CAA TTA AAT GGA TAT ACA 1584

Gly Tyr Val Lys Asp Tyr Val Val Leu Gin Gin Leu Asn Gly Tyr Thr 515 520 525 « · : ATG GAG GTT AAG CTG CTT TTA AAC AAC AGT TTA GCA ATT AAC ACA AAT 1632 ·*, Met Glu Val Lys Leu Leu Leu Asn Asn Ser Leu Ala lie Asn Thr Asn :.,,ί 530 535 540 · A 1633 • · · « * · • · · ·*.*. (2) SEKVENSSIN ID NO: 9 TIEDOT: • t ·[”* (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 544 aminohappoa ί^ί : (Β) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · ··· .*. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 9 : • · 54 119436

Cys Thr Ile Lys Trp Gin Gin Thr Val Pro Ser Gly Val Trp Thr Glu 15 10 15

Val Ser Gly Ser Tyr Thr Val Pro Gin Thr Ala Thr Gin Leu lie Phe 20 25 30

Tyr Val Glu Ser Pro Asn Ala Thr Leu Asp Phe Tyr Leu Asp Asp Phe 35 40 45

Thr Val lie Asp Lys Asn Pro Val Thr lie Pro Ala Ala Ala Lys Glu 50 55 60

Pro Glu Leu Glu lie Pro Ser Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Gin Tyr Phe 65 70 75 80

Ser lie Gly Val Ala lie Pro Tyr Arg Val Leu Gin Asn Pro Val Glu 85 90 95

Arg Ala Met Val Leu Lys His Phe Asn Ser lie Thr Ala Glu Asn Glu 100 105 110

Met Lys Pro Asp Ala lie Gin Arg Thr Glu Gly Gin Phe Asn Phe Asp 115 120 125

Val Ala Asp Gin Tyr Val Asp Phe Ala Gin Ser Asn Asn lie Gly lie 130 135 140

Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Gin Gin Thr Pro Asp Trp Phe Phe 145 150 155 160 • •«If • » • ·Β· Gin His Ser Asp Gly Ser Pro Leu Asp Pro Asn Asn Ser Glu Asp Lys ί V 165 170 175 « · · "I Gin Leu Leu Arg Asn Arg Leu Lys Thr His lie Gin Thr Leu Val Gly 180 185 190

• I I

**· Arg Tyr Ala Glu Lys Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala lie v : 195 200 205 t Asp Glu Asn Gin Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Ser Glu Trp Tyr Arg lie :Y: 210 215 220 • · ··· • · *···’ Leu Gly Pro Thr Pro Glu Thr Gly Gly lie Pro Glu Tyr lie lie Leu .V. 225 230 235 240 • « t • · :***; Ala Phe Gin Tyr Ala Arg Glu Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Phe Tyr *·* 245 250 255 • t • · · • « · • · m *··· · • · 55 119436

Asn Asp Tyr Ser Thr Glu Asn Pro Lys Lys Arg Gin Phe lie Tyr Asn 260 265 270

Met Val Lys Ala Leu His Asp Arg Gly Leu Ile Asp Gly Val Gly Leu 275 280 285

Gin Gly His lie Asn Val Asp Ser Pro Ala Val Lys Glu lie Glu Asp 290 295 300

Thr lie Asn Leu Phe Ser Thr lie Pro Gly Leu Gin lie Gin lie Thr 305 310 315 320

Glu Leu Asp lie Ser Val Tyr Thr Ser Ser Thr Gin Gin Tyr Asp Thr 325 330 335

Leu Pro Gin Asp lie Met lie Lys Gin Ala Leu Lys Phe Lys Glu Leu 340 345 350

Phe Glu Met Leu Lys Arg His Ser Asp Arg lie Thr Asn Val Thr Leu 355 360 365

Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Pro Trp Leu Ser Lys Asp Arg Ser Asn 370 375 380

Trp Pro Leu Leu Phe Asp Ser Asn Tyr Gin Ala Lys Tyr Asn Tyr Trp 385 390 395 400

Ala lie Val Glu Pro Ser Val Leu Pro Val Ala lie Asn Lys Gly Tyr 405 410 415 • · ,. . Ala Asn Asn Ala Gin Pro Arg lie Asp Gly lie Met Asp Lys Glu Tyr * v 420 425 430 J · · "1 Lys Gly Thr lie Pro Leu Ser Val Leu Asn Asp Ala Gly Gin Asp lie 435 440 445 • · ·

Ala Gin Val Arg Ala Leu Trp Ser Gly Asn Glu Leu Cys Leu Tyr Val ϊΤ: 450 455 460

Thr Val Asn Asp Ser Ser Val Asp Ala Asn Asn Asp Arg Val Val lie :Y: 465 470 475 480 • · ··· • · *···1 Phe lie Asp Gin Asp Asn Gly Lys Leu Pro Glu Leu Lys Asp Asp Asp :1:1· 485 490 495 m ♦ *·· * · • · ·1♦ • · • « · • · · • · · 56 119436

Phe Trp Vai Ser Ile Ser Arg Asn Gly Thr Lys Asn Gin Ser Lys Thr 500 505 510

Gly Tyr Vai Lys Asp Tyr Vai Val Leu Gin Gin Leu Asn Gly Tyr Thr 515 520 525

Met Glu Val Lys Leu Leu Leu Asn Asn Ser Leu Ala lie Asn Thr Asn 530 535 540 (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1125 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: ekstremofiili (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: TG456 (ix) ERITYISPIIRRE: • * (A) NIMI/TUNNUS: CDS: ·*·*; (B) SIJAINTI: 1..1125 [I (D) MUUT TIEDOT: /osittainen ’.j.: /tuote= "ksylanaasi C" .··*. /geeni= "xynC" ··· : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:10: • •e • ·· »li *·* * CGC GAG TTA TTA CTT TAT GTT GAG GCG CAA AAT GCA AAT TTG GCT TTC 48

Arg Glu Leu Leu Leu Tyr Vai Glu Ala Gin Asn Ala Asn Leu Ala Phe 15 10 15 * · • « · I · · I.J TGG GTT GAT GAT TTA AAG ATT TAT GAT TTA TCC AAG CTG GCT GAA CCT 96

Trp Vai Asp Asp Leu Lys Ile Tyr Asp Leu Ser Lys Leu Ala Glu Pro 20 25 30 * • · · « · · GAA TGG GAG ATA CCA TCT TTG ATA GAA AAG TAT AAA GAT TAT TTC AAA 144 *>4i* Glu Trp Glu Ile Pro Ser Leu Ile Glu Lys Tyr Lys Asp Tyr Phe Lys *·* 35 40 45 • · • · · • · « * \ GTA GGG GTA GCT TTG TCT TAC AAA AGC ATT GCT YCT GAT ACA GAG AAG 192 *!**ί Vai Gly Vai Ala Leu Ser Tyr Lys Ser Ile Ala Xaa Asp Thr Glu Lys 50 55 60 57 119436 AÄG ATG GTT TTG AAG CAT TTC AAT AGT ATT ACT GCA GGG AAT GAA ATG 240

Lys Met Vai Leu Lys His Phe Asn Ser Ile Thr Ala Gly Asn Glu Met 65 70 75 80 AAA CCA TCA GAG TTA CTT ATC AGT GAA AAT AAT TAT AAC TTT AGT AAA 288

Lys Pro Ser Glu Leu Leu Ile Ser Glu Asn Asn Tyr Asn Phe Ser Lys 85 90 95 GCA GAT GAA TTT GTA AAT TTT GCA ACA AGT AAC AAC ATT GCC ATC AGA 336

Ala Asp Glu Phe Vai Asn Phe Ala Thr Ser Asn Asn Ile Ala Ile Arg 100 105 110 GGT CAT ACA CTG GTT TGG CAT GAG CAA ACA CCC GAC TGG TTT TTC AAG 384

Gly His Thr Leu Vai Trp His Glu Gin Thr Pro Asp Trp Phe Phe Lys 115 120 125 GAT GCA AAT GGA AAT ACC TTG AGC AAG GAT GCA TTG CTA AGC AGA TTA 432

Asp Ala Asn Gly Asn Thr Leu Ser Lys Asp Ala Leu Leu Ser Arg Leu 130 135 140 AAG CAG TAT ATT TAT ACG GTA GTG GGA AGA TAT AAA GGG AAG GTT TAT 480

Lys Gin Tyr Ile Tyr Thr Vai Vai Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Vai Tyr 145 150 155 160 GCA TGG GAT GTG GTA AAT RAA GCA ATA GAT GAA AGT CAA GGT AAT GGA 528

Ala Trp Asp Vai Vai Asn Xaa Ala Ile Asp Glu Ser Gin Gly Asn Gly 165 170 175 TTC AGG AGA TCT AAC TGG TAC AAC ATT TGT GGT CCC GAA TAT ATT GAA 576

Phe Arg Arg Ser Asn Trp Tyr Asn Ile Cys Gly Pro Glu Tyr Ile Glu 180 185 190 AAG GCT TTT ATA TGG GCA CAT GAR GCC GAT CCA GAC GCA AAA TTG TTT 624

Lys Ala Phe Ile Trp Ala His Glu Ala Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe 195 200 205 tt* TAC AAC GAT TAC AAC ACA GAA AAC AGT CAG AAG AGA CAG TTT ATT TMC 672 : * : Tyr Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Asn Ser Gin Lys Arg Gin Phe Ile Xaa * I 210 215 220 • · · • « » ··· AAG ATG ATT AAG AGT CTC AAG GAA AAA GGT GTT CCA ATT CAT GGA ATA 72 0 *..** Asn Met Ile Lys Ser Leu Lys Glu Lys Gly Vai Pro Ile His Gly Ile . 225 230 235 240 • · · * * * {*·*· GGA TTG CGG TGT CAT ATA AAT CTT GAT TGG CCC TCG ATT AGC GAG ATA 768

Gly Leu Arg Cys His Ile Asn Leu Asp Trp Pro Ser Ile Ser Glu Ile 245 250 255 • · ·,*,* GAG AAC ACC ATA AAA TTG TTC AGC TCT ATA CCT GGA TTG GAG ATA CAC 816 ,*··, Glu Asn Thr Ile Lys Leu Phe Ser Ser Ile Pro Gly Leu Glu Ile His *···* 260 265 270 • · * · · • · · • · • t«

• I

• · • · · • · • ' 9 · • · · 9 9 9 9·*·· • · 58 119436 ATT ACG GAG CTT GAT ATG AGT TTT TAT CAG TGG GGT TCG AGT ACC AGT 864 lie Thr Glu Leu Asp Met Ser Phe Tyr Gin Trp Gly Ser Ser Thr Ser 275 280 285 TAT TCA ACG CCA CCM AGA GAT CTC CTG ATA AAA CAG GCA ATG AGA TAT 912

Tyr Ser Thr Pro Pro Arg Asp Leu Leu lie Lys Gin Ala Met Arg Tyr 290 295 300 AAG GAG TTA TTC GAT TTA TTT AAA AAG TAC AAT GTA ATA ACT AAT GTA 960

Lys Glu Leu Phe Asp Leu Phe Lys Lys Tyr Asn Vai Ile Thr Asn Val 305 310 315 320 ACA TTC TGG GGA CTA AAG GAT GAT TAC TCA TGG CTG AGT CAA AAC TTT 1008

Thr Phe Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Trp Leu Ser Gin Asn Phe 325 330 335 GGA AAA AGT GAT TAC CCG TTG TTA TTT GAT GGA AAC TAT AAG TCA AAA 1056

Gly Lys Ser Asp Tyr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Lys 340 345 350 TAT GCC TTT TGG AGC CTG ATT GAG CCA ACT GTG GTG CCG GTT ACC GGT 1104

Tyr Ala Phe Trp Ser Leu He Glu Pro Thr Val Val Pro Val Thr Gly 355 360 365 CAT AGC TGT TTT TGC GCC ATG 1125

His Ser Cys Phe Cys Ala Met 370 375 (2) SEKVENSSIN ID NO:ll TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 375 aminohappoa ***** (B) TYYPPI: aminohappo JV. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini ··· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 11: • · · • · · ··· ·.* * Arg Glu Leu Leu Leu Tyr Vai Glu Ala Gin Asn Ala Asn Leu Ala Phe 15 10 15 • · *,·#ϊ Trp Vai Asp Asp Leu Lys Ile Tyr Asp Leu Ser Lys Leu Ala Glu Pro .·**. 20 25 30 • · *··

Glu Trp Glu Ile Pro Ser Leu Ile Glu Lys Tyr Lys Asp Tyr Phe Lys *·*.* 35 40 45 ··· • e • ♦ *·* Vai Gly Vai Ala Leu Ser Tyr Lys Ser Ile Ala Xaa Asp Thr Glu Lys :Yj 50 55 60 • · ·*··· • · 59 119436

Lys Met Vai Leu Lys His Phe Asn Ser lie Thr Ala Gly Asn Glu Met 65 70 75 80

Lys Pro Ser Glu Leu Leu lie Ser Glu Asn Asn Tyr Asn Phe Ser Lys 85 90 95

Ala Asp Glu Phe Val Asn Phe Ala Thr Ser Asn Asn lie Ala lie Arg 100 105 110

Gly His Thr Leu Val Trp His Glu Gin Thr Pro Asp Trp Phe Phe Lys 115 120 125

Asp Ala Asn Gly Asn Thr Leu Ser Lys Asp Ala Leu Leu Ser Arg Leu 130 135 140

Lys Gin Tyr lie Tyr Thr Val Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Val Tyr 145 150 155 160

Ala Trp Asp Val Val Asn Xaa Ala lie Asp Glu Ser Gin Gly Asn Gly 165 170 175

Phe Arg Arg Ser Asn Trp Tyr Asn lie Cys Gly Pro Glu Tyr lie Glu 180 185 190

Lys Ala Phe lie Trp Ala His Glu Ala Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe 195 200 205

Tyr Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Asn Ser Gin Lys Arg Gin Phe lie Xaa 210 215 220

Asn Met lie Lys Ser Leu Lys Glu Lys Gly Val Pro lie His Gly lie 225 230 235 240 • 1 ·· · • Gly Leu Arg Cys His lie Asn Leu Asp Trp Pro Ser lie Ser Glu lie , .·. 245 250 255 • · t *·· ί***ϊ Glu Asn Thr lie Lys Leu Phe Ser Ser lie Pro Gly Leu Glu lie His **! 260 265 270 f · « • · ♦ ··· .·:·. He Thr Glu Leu Asp Met Ser Phe Tyr Gin Trp Gly Ser Ser Thr Ser * 275 280 285

Tyr Ser Thr Pro Pro Arg Asp Leu Leu He Lys Gin Ala Met Arg Tyr '·1·1 290 295 300 «·· • · • # β· Lys Glu Leu Phe Asp Leu Phe Lys Lys Tyr Asn Val He Thr Asn Val :Vs 305 310 315 320 • · ··· • · **..1 Thr Phe Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Trp Leu Ser Gin Asn Phe 325 330 335 • 1 · • 1 60 119436

Gly Lys Ser Asp Tyr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Lys 340 345 350

Tyr Ala Phe Trp Ser Leu lie Glu Pro Thr Vai Val Pro Val Thr Gly 355 360 365

His Ser Cys Phe Cys Ala Met 370 375 (2) SEKVENSSIN ID NO:12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1244 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: ei (iii) ANTI-SENSE: ei (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: ekstremofiili (C) YKSITTÄINEN ISOLAATTI: TG456

(ix) ERITYISPIIRRE

(A) NIMI/TUNNUS : CDS

(B) SIJAINTI: 1..1107 *:·*: (D) MUUT TIEDOT: /osittainen /tuote= "ksylanaasi D" : .* /geeni= "xynD" * • · · *":* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:12: • · • · ΦΦ* : aaa gtc ttg ctg gct gct ctg atg tgt gtt gtg ttg gct AAT CCT TTT 48 “* Lys Vai Leu Leu Ala Ala Leu Met Cys Vai Vai Leu Ala Asn Pro Phe : : : 1 5 10 15 • TAT GCA CAG GCA GCC ATG AGA TTT ACC TCT AAT GCÄ ACT GGG ACA TAC 96

Tyr Ala Gin Ala Ala Met Thr Phe Thr Ser Asn Ala Thr Gly Thr Tyr *·*.* 20 25 30 ΦΦ· • Φ ·;·' GAT GGT TAC TAC TAC GAG TTG TGG AAG GAC ACA GGG AAT ACT ACC ATG 144

Asp Gly Tyr Tyr Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Thr Gly Asn Thr Thr Met *.*.* 35 40 45 • · • · *”·* ACA GTT GAC ACA GGA GGA AGA TTT AGC TGT CAG TGG AGT AAC ATT AAC 192

Thr Vai Asp Thr Gly Gly Arg Phe Ser Cys Gin Trp Ser Asn Ile Asn V.: 50 55 60 Φ Φ Φ 61 119436 AAT GCA CTC TTC AGA ACA GGT AAA AAG TTT AGC ACT GCA TGG AAT CAG 240

Asn Ala Leu Phe Arg Thr Gly Lys Lys Phe Ser Thr Ala Trp Asn Gin 65 70 75 80 CTT GGG ACT GTA AAG ATT ACC TAC TCT GCT ACC TAC AAT CCA AAT GGC 288

Leu Gly Thr Vai Lys Ile Thr Tyr Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Asn Gly 85 90 95 AAT TCC TAT CTC TGC ATT TAT GGA TGG TCA AGA AAT CCA CTT GTT GAA 336

Asn Ser Tyr Leu Cys Ile Tyr Gly Trp Ser Arg Asn Pro Leu Vai Glu 100 105 110 TTT TAT ATC GTT GAA AGC TGG GGC TCA TGG CGT CCG CCC GGG GCA ACG 384

Phe Tyr Ile Vai Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr 115 120 125 TCA CTT GGC ACT GTA ACA ATT GAT GGA GCA ACA TAT GAT ATT TAT AAG 432

Ser Leu Gly Thr Vai Thr Ile Asp Gly Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys 130 135 140 ACA ACT CGT GTT AAT CAG CCA TCT ATC GAA GGA ACA AGA ACA TTT GAT 480

Thr Thr Arg Vai Asn Gin Pro Ser Ile Glu Gly Thr Arg Thr Phe Asp 145 150 155 160 CAG TAC TGG AGT GTT AGG ACA TCA AAG AGA ACA AGT GGT ACT GTT ACT 528

Gin Tyr Trp Ser Vai Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Vai Thr 165 170 175 GTA ACT GAT CAT TTC AAA GCA TGG GCT GCA AAA GGT TTG AAC CTG GGT 576

Vai Thr Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Ala Lys Gly Leu Asn Leu Gly 180 185 190 ACA ATT GAC CAG ATT ACA CTC TGT GTG GAA GGY TAC CAR AGC AGC GGC 624

Thr Ile Asp Gin Ile Thr Leu Cys Vai Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly . 195 200 205 • ·· . TCA GCA AAT ATA ACA CAG AAT ACA TTT ACT ATT GGT GGT TCG AGT AGT 672 • 1.· Ser Ala Asn Ile Thr Gin Asn Thr Phe Thr Ile Gly Gly Ser Ser Ser , .·. 210 215 220 * · · ·* .***. GGC TCA AGT AAT GGT TCA AAT AAC GGT TCA AAT GAT GGT TCC AAT GGA 720 · **· Gly Ser Ser Asn Gly Ser Asn Asn Gly Ser Asn Asp Gly Ser Asn Gly : :1: 225 230 235 240 • · · •#1 1 GGA ACA AAT GCA GGA ATT TCA ACY GCA AGC AGG ATA GAA TGT GAA AGT 768

Gly Thr Asn Ala Gly Ile Ser Thr Ala Ser Arg Ile Glu Cys Glu Ser 245 250 255 * · · *·’·1 ATG TCG CTC AGC GGY CCT TAT GTT TCA AGA ATT ACT TAT CCA TTT AAT 816 ; **; Met Ser Leu Ser Gly Pro Tyr Vai Ser Arg Ile Thr Tyr Pro Phe Asn 'I1 260 265 270 * 1 • Φ · • · · • · • · · * · • · • · · • ·

* t I

• · 1 • · · 62 119436 GGT ΑΤΑ GCA CTT TAT GCG AAC GGA GAT AGA GCA ACG GCA AAT GTA AAC 864

Gly lie Ala Leu Tyr Ala Asn Gly Asp Arg Ala Thr Ala Asn Val Asn 275 280 285 TTT TCA GCA AGC CGT AAC TAT ACT TTT AAA TTA CGT GGA TGT GGA AAT 912

Phe Ser Ala Ser Arg Asn Tyr Thr Phe Lys Leu Arg Gly Cys Gly Asn 290 295 300 AAC AAT AAT TTG GCA TCA GTT GAT TTA CTG ATA GAT GGA AAG AAA GTA 960

Asn Asn Asn Leu Ala Ser Val Asp Leu Leu lie Asp Gly Lys Lys Val 305 310 315 320 GGT TCG TTC TAT TAT AAG GGA ACA TAT CCT TGG GAA GCY TCT ATA AAT 1008

Gly Ser Phe Tyr Tyr Lys Gly Thr Tyr Pro Trp Glu Ala Ser lie Asn 325 330 335 AAT GTG TAT GTA AGT GCA GGT ACC CAC AGA GWG GAG CTT GTA CTT TCT 1056

Asn Val Tyr Val Ser Ala Gly Thr His Arg Xaa Glu Leu Val Leu Ser 340 345 350 GCT GAT AAT GGT ACA TGG GAT GTC TAT GCG GAT TAT TTG TTA ATA CAA 1104

Ala Asp Asn Gly Thr Trp Asp Val Tyr Ala Asp Tyr Leu Leu lie Gin 355 360 365 TGAAATTCGG AAATGTTTTT AAAAATACTG CTTCGRAGAA GCAGGTATTT TTTTATGTTC 1164 ACTATTATAA AGCGATTGAA GTCAGTCTTA GTTCATCCTA GTTGTTCTTC ARACCGRTCA 1224 TAGCTGTTTC CKGCGCCATG 1244 (2) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ·***: (A) PITUUS: 368 aminohappoa l (B) TYYPPI: aminohappo *.·,· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ··· *···: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · · .*.*.** (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 13: • · v • · · • . . Lys Vai Leu Leu Ala Ala Leu Met Cys Vai Vai Leu Ala Asn Pro Phe \V 15 10 15 • · e • · **' Tyr Ala Gin Ala Ala Met Thr Phe Thr Ser Asn Ala Thr Gly Thr Tyr 20 25 30 • · · • · • · · ϊφ##ϊ Asp Gly Tyr Tyr Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Thr Gly Asn Thr Thr Met ·* 35 40 45 • · ·

Thr Vai Asp Thr Gly Gly Arg Phe Ser Cys Gin Trp Ser Asn Ile Asn * : 50 55 60 1 1 9436 63

Asn Ala Leu Phe Arg Thr Gly Lys Lys Phe Ser Thr Ala Trp Asn Gin 65 70 75 80

Leu Gly Thr Val Lys lie Thr Tyr Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Asn Gly 85 90 95

Asn Ser Tyr Leu Cys lie Tyr Gly Trp Ser Arg Asn Pro Leu Val Glu 100 105 110

Phe Tyr lie Val Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr 115 120 125

Ser Leu Gly Thr Val Thr lie Asp Gly Ala Thr Tyr Asp lie Tyr Lys 130 135 140

Thr Thr Arg Val Asn Gin Pro Ser lie Glu Gly Thr Arg Thr Phe Asp 145 150 155 160

Gin Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr 165 170 175

Val Thr Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Ala Lys Gly Leu Asn Leu Gly 180 185 190

Thr lie Asp Gin lie Thr Leu Cys Val Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly 195 200 205

Ser Ala Asn Ile Thr Gin Asn Thr Phe Thr He Gly Gly Ser Ser Ser 210 215 220

Gly Ser Ser Asn Gly Ser Asn Asn Gly Ser Asn Asp Gly Ser Asn Gly 225 230 235 240 *:··; Gly Thr Asn Ala Gly Ile Ser Thr Ala Ser Arg He Glu Cys Glu Ser .. . 245 250 255 • · · Φ · • · . Met Ser Leu Ser Gly Pro Tyr Vai Ser Arg He Thr Tyr Pro Phe Asn '·:·* 260 265 270 ··· • · • · . Gly He Ala Leu Tyr Ala Asn Gly Asp Arg Ala Thr Ala Asn Val Asn *.ί.: 275 280 285 ··« • · ♦ ♦ · · * Phe Ser Ala Ser Arg Asn Tyr Thr Phe Lys Leu Arg Gly Cys Gly Asn 290 295 300 • · • · ♦ • ·* Asn Asn Asn Leu Ala Ser Val Asp Leu Leu He Asp Gly Lys Lys Val I***: 305 310 315 320 ··· J*:*: Gly Ser Phe Tyr Tyr Lys Gly Thr Tyr Pro Trp Glu Ala Ser He Asn 325 330 335 • · • ♦ ···

Asn Val Tyr Val Ser Ala Gly Thr His Arg Xaa Glu Leu Val Leu Ser V.· 340 345 350

Ala Asp Asn Gly Thr Trp Asp Val Tyr Ala Asp Tyr Leu Leu He Gin 355 360 365

Claims (15)

119436

1. Ksylanaasi, tunnettu siitä, että sillä on merkittävä ligniiniä poistava aktiivisuus lämpötilassa 80 °C tai yli ja 5 pH:ssa 9 ja se käsittää aminohapposekvenssin, joka on ainakin 70-prosenttisesti identtinen SEQ ID NO:13:ssa esitetyn aminohapposekvenssin kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ksylanaasi, jonka puoliin-10 tumisikä 80 °C:ssa, pH:ssa 9,0 on yli 10 minuuttia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen ksylanaasi, tunnettu siitä, että 15 a) ksylanaasi on G-tyypin ksylanaasi, ja b) ksylanaasi on peräisin termofiilisestä organismista, jonka optimikasvulämpötila on yli 65 °C.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen ksylanaasi, tunnettu siitä, 20 että termofiilinen organismi on anaerobinen. ···.! 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen ksylanaasi, tunnettu siitä, :v. että ksylanaasin puoliintumisikä 80 °C:ssa, pH:ssa 7,0 on yli • · • · . · 10 minuuttia. • · · • ♦ ♦ ::: 25 • · ···* 6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen ksylanaasi, tunnettu siitä, • · · *·|·* että ksylanaasin puoliintumisikä 65 °C:ssa, pH:ssa 9,0 on yli ♦ · · V * 10 minuuttia. V.* 30 7. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen ksyla- naasi, tunnettu siitä, että ksylanaasi on peräisin talletus- Λ numerolla CBS 211.94, 212.94, 213.94, 214.94, 215.94 tai • · · l.l 216.94 talletetusta kannasta. • » • · ···

8. Eristetty ja puhdistettu DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, ·"·; että se koodaa jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mu kaista ksylanaasia. 65 1 1 9436

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka on vähintään 80-prosenttisesti identtinen SEQ ID N0:12:ssa esitetyn sekvenssin kokonaisen koodaavan 5 sekvenssin kanssa.

10. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukaisen DNA-sekvenssin.

11. Mikrobi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transfor moitu patenttivaatimuksen 10 mukaisella vektorilla tai sisältää heterologisena DNArna patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukaisen sekvenssin.

12. Eristetty mikro-organismi, tunnettu siitä, että se on an aerobinen ja termofiilinen bakteeri, ja sillä on talletus-numero CBS 211.94, 212.94, 213.94, 214.94, 215.94 tai 216.94.

13. Menetelmä ksylanaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, 20 että viljellään patenttivaatimuksen 12 mukaista mikro-organismia tai patenttivaatimuksen 11 mukaista isäntäsolua sopivassa kasvatusalustassa ja kerätään entsyymi sen jälkeen tal- *:**: teen. ·· · • * · • · • · . 25 14. Menetelmä ksylaanin hajottamiseksi, jossa menetelmässä ··· ,···. saatetaan ksylaania sisältävä koostumus kosketukseen jonkin • · * patenttivaatimuksista 1-7 mukaisen ksylanaasin kanssa. • · · ··· ··« • · · • 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, jossa ksyla- 30 naasia käytetään lämpötilassa 80 °C tai korkeammassa lämpö- • f * •V tilassa. • M • » • · ·«· 1 Menetelmä ligniinin poistamiseksi puusellusta, tunnettu • « t • · ,···. siitä, että puusellu saatetaan kosketukseen jonkin patentti- • · *" 35 vaatimuksista 1-7 mukaisen ksylanaasin kanssa lämpötilassa 80 *.V °C tai yli, sellaisissa olosuhteissa, jotka mahdollistavat *·**· ksylanaasin aktiivisuuden. 66 1 1 9 4 3 6

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksylanaasia käytetään ennen vaihetta, jossa ligniini poistetaan hapella, sen aikana tai sen jälkeen.

18. Ksylaanin hajottamiseen tai puusellun käsittelyyn sovel tuva koostumus, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksista l-7 mukaista ksylanaasia.

19. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukaisen ksylanaasin tai 10 patenttivaatimuksen 11 mukaisen mikrobi-isäntäsolun käyttö ksylaanin hajottamiseksi tai ligniinin poistamiseksi puusel-lusta. • · ·· · • · 1 • · • · • · · • · · ··· ··· • · • · ··1 • ♦ · • · ♦ ♦ ·· ··· • · · • · · • · • · · • 1 1 ♦ · • · • » ··1 • · * · · • · 1 • · ··· • » • · ··· • · · • · e • · « « · 119436