CN102245763A

CN102245763A - 解纤维热酸菌木聚糖酶

Info

Publication number: CN102245763A
Application number: CN2009801513115A
Authority: CN
Inventors: R·E·佩拉莱斯; A·M·柏瑞; J·V·小佩拉莱斯; R·D·巴拉博特
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-11-05
Publication date: 2011-11-16
Also published as: AU2009330641A1; WO2010074821A8; CA2746929A1; US8778649B2; US20130295619A1; EP2367935A1; MX2011006723A; EP2367935A4; NZ593541A; US20100184161A1; WO2010074821A1

Abstract

公开了一种源于解纤维热酸菌的嗜热内切-β-1，4-木聚糖酶。该木聚糖酶在最佳温度90℃和最适pH值范围约4.5至6.0条件下表现出木聚糖酶活性。分离的木聚糖酶用于木质纤维素材料的水解。

Description

解纤维热酸菌木聚糖酶

相关申请的交叉引用

本发明要求2008年12月22日递交的申请号为61/203,528的美国临时申请的优先权，它的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及木聚糖酶及其表达和使用方法。具体地，本发明涉及嗜热木聚糖酶(Xyl-1)及来自解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)中的同系物，以及这些酶在水解木质纤维素中的用途。

技术背景

木质纤维素是一种由纤维素，半纤维素和木质素组成的植物生物量。木质纤维素作为可发酵生物量的丰富廉价原料存在。然而，木质纤维素在利用上的一个障碍是其内部纤维素和半纤维素与木质素的紧密交联。分解木质纤维素(比如从木质素中分离纤维素和半纤维素)需要大量能量，因此常常是无效率的。对木质纤维素生物量的有效利用将会增强生物转化过程的经济竞争力，使之可与石油化工过程相抗衡。已经证明木聚糖酶可用于有效分解木质纤维素。

木聚糖酶在生物技术和工业应用的众多领域都有重要作用，其包括在纸浆和造纸工业中预漂牛皮纸浆，纺织工业中复原纤维素纤维，增强动物饲料和青贮饲料的消化性，净化果汁和啤酒，分离谷物麸质和淀粉，烘焙工业中的各种应用，以及用于药理应用和食品添加剂的低聚木糖产物(1、2、9、14和21)。此外，近期对从木质纤维素植物生物量中生产生物燃料的研究，使木聚糖酶成为新的关注焦点(5)。Collins等人(4)近来对来自六种不同家族的木聚糖酶的物理化学性和功能性特征，作用机制和工业应用进行了重新考察。

木聚糖酶产物普遍从里氏木霉(Trichoderma reesei)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株E58中获得，这两种菌株都来自加拿大福林泰克公司的菌种保藏。尽管两种真菌都是胞外木聚糖酶的丰富的产物，但是真菌生长和酶的产生只能在嗜温温度下(比如28℃)进行。因此，真菌生长中发酵需要大量冷却水，并且其易于受到细菌污染。在产生木聚糖酶时也会有热不稳定情况，在50℃下培养半小时，酶活性将丧失90％以上。因此，使用这些酶对木质纤维素进行酶解必须在大概37至45℃的低温度条件下进行。这样做反过来又降低水解效率，使水解过程中无菌条件成为必要，并阻碍酶在无取代物情况下延长使用。但是，可以通过使用嗜热木聚糖酶来获得高效率水解。

从近期研究可知，从真菌和细菌微生物中已经鉴定出了几种嗜热木聚糖酶(图1)。比如，专利号为5,935,836的美国专利公开了从柔曲马杜拉放线菌中分离出的一种最适pH值为6.0至7.0，最适温度范围为70至80℃的嗜热木聚糖酶。另外，专利号为5,395,765的美国专利公开了从红嗜热盐菌属(Rhodothermus)中分离的一种在pH值5至8下具有活性，在85℃至100℃温度范围内具有热稳定性的木聚糖酶。然而，有较高酸性pH值范围的木聚糖酶是发酵过程中利用半纤维素生物量的理想选择。

在Mohagheghi等人的文章中描述(12)了嗜热纤维素分解菌解纤维热酸菌，并且在Shiang等人的文章中描述(19)了纤维素酶产物。但是，两篇文献都未描述在低pH和高温条件下可发挥作用的纯化的木聚糖酶。专利号为5,902,581的美国专利公开了一种来自解纤维热酸菌的在pH值3.6至4.2的条件下具有活性，在70℃至80℃的温度范围内具有热稳定性的木聚糖酶。但是，这种解纤维热酸菌在温度高于80℃或pH值在4.5至6.0的条件下不具有最佳活性。

发明内容

本发明在此公开一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶，该木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％或至少93％的序列同源性。更优选的，该重组内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少95％、至少97％、或至少99％的序列同源性。在一特别优选实施例中，该重组内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：1。

在特定实施例中，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列的一个区域都符合共有序列：脯氨酸-Xaa₁-脯氨酸-Xaa₂-脯氨酸(SEQ IDNO：40)。优选的，Xaa₁和Xaa₂各自独立地选自无氨基酸，任意一个氨基酸，任意两个氨基酸或任意三个氨基酸。在优选实施例中，上述任何一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列的第一个谷氨酸对应于SEQ ID NO：1的谷氨酸-142的位置，第二个谷氨酸对应于SEQ ID NO：1的谷氨酸-259的位置。优选的，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列区域位于第一个谷氨酸和第二个谷氨酸之间。在特定实施例中，第一个谷氨酸位于具有天冬氨酸-缬氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-谷氨酸的序列(SEQ ID NO：25)的氨基酸区域内，第二个谷氨酸位于具有苏氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列(SEQ ID NO：26)的氨基酸区域内。

在其他优选实施例中，Xaa₁是选自组氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种氨基酸，Xaa₂是选自亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸，脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸中的一种氨基酸。在特别优选实施例中，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列区域是脯氨酸-组氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸(SEQ ID NO：27)。

在另一些实施例中，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶在pH值约为3至9下具有活性。在优选实施例中，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶具有最适pH值约4.5至6.0。在还一些实施例中，上述任何一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶有40至48kD分子量。在另一些实施例中，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶在至少80℃的温度下具有活性。优选的，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶在至少80℃至120℃的温度下具有活性。在特别优选实施例中，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶在约90℃的温度下具有最佳活性。

在其他实施例中，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶在培养至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟、至少90分钟、至少2小时、至少5小时、至少8小时、至少12小时、至少24小时、或至少48小时后，在90℃下保持至少50％的初始活性。

在还一些实施例中，上述任一种重组的内切-β-1，4-木聚糖酶在木聚糖存在时，在90℃下具有约90分钟的半衰期。在优选实施例中，木聚糖为桦木木聚糖，山毛榉木木聚糖或燕麦木聚糖。

在特定实施例中，上述任一种重组的内切-β-1，4-木聚糖酶还包括具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的一个信号肽序列。

在还一些实施例中，上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶具有选自木质纤维素生物量、含木聚糖材料或含木葡聚糖材料的底物。

本发明还涉及一种包括编码上述任一种重组内切-β-1，4-木聚糖酶的核酸分子的重组细胞。

本发明进一步涉及一种表达核酸分子的重组细胞，所述核酸分子的核苷酸序列，与SEQ ID NO：4或其互补序列的SEQ ID NO：5具有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、或至少93％的序列同源性。优选的，该核酸分子的核苷酸序列，与SEQ ID NO：4或其互补序列的SEQ ID NO：5具有至少95％、至少97％、或至少99％的序列同源性。在一个特别优选实施例中，该核酸分子的核苷酸序列是SEQ ID NO：4或其互补序列的SEQ ID NO：5。

本发明还涉及一种通过使重组内切-β-1，4-木聚糖酶与木质纤维素发生反应来水解木质纤维素的方法。所述重组内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％、或至少99％的序列同源性。优选的，将木质纤维素与重组内切-β-1，4-木聚糖酶在至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃、或至少100℃的温度下，pH值范围约4.5至6.0的条件下发生反应。在一个特别优选实施例中，重组内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：1。

本发明进一步涉及一种通过使重组内切-β-1，4-木聚糖酶与木质纤维素发生反应来水解木质纤维素的方法。优选的，将木质纤维素与重组内切-β-1，4-木聚糖酶在至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃、或至少100℃的温度下，pH值范围约4.5至6.0的条件下发生反应。

在其他实施例中，上述任一种方法中的木质纤维素的来源选自白桦木、燕麦、柳枝稷、玉米秸秆、芒属、能源甘蔗、高粱、桉树、柳树、甘蔗渣、杂交白杨、短期轮作木本作物、针叶软木、作物残留物、庭园废物或其组合。在还一些实施例中，上述任一种方法中的重组内切-β-1，4-木聚糖酶还包括有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的一个信号肽序列。

附图说明

图1是一个比较各种木聚糖酶的表格，所有木聚糖酶都在最适温度100℃以下。MW＝分子量；T opt＝最佳温度范围；H opt＝最适ph值范围。

图2示出了解纤维热酸菌xyl-1基因Acel_0372的示意图。

图3是琼脂糖凝胶成像，其示出了xyl-1基因Acel_0372的PCR扩增结果。泳道1是分子量标记；泳道2和3是以包含两种不同浓度的解纤维热酸菌的基因组DNA作为模板进行扩增得到的PCR产物。

图4是琼脂糖凝胶成像，其示出了纯化包含扩增的xyl-1基因Acel_0372的纯化的质粒克隆的结果。最左侧的泳道是分子量标记(以kb为单位)；泳道1和泳道3至8包含正确的pK19(2.5kb)的构建体，所述pK19构建体包含用SacI和XbaI酶切后的1.4-kb的PCR产物。泳道2是不包含1.4-kb的PCR产物的pK19构建体。

图5(A)和5(B)示出了从解纤维热酸菌中扩增的PCR产物的核苷酸编码序列(SEQ ID NO：4)，从解纤维热酸菌中扩增的PCR产物的核苷酸互补序列(SEQ ID NO：5)，以及由解纤维热酸菌中扩增的PCR产物编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

图6(A)，6(B)和6(C)示出了在解纤维热酸菌中的Xyl-1表达。(A)示出了xyl-1基因的RT-PCR分析。(B)示出了一个内部对照持家基因gyrB的RT-PCR分析。M：分子量DNA梯，泳道1至4：指数生长期样品，泳道5至8：平稳增长期样品，泳道9：非RT阴性对照样品以用来确定不存在基因组DNA污染。泳道1和泳道5：燕麦木聚糖生长培养物样品，泳道2和泳道6：纤维二糖生长培养物，泳道3和泳道7：纤维素生长培养物，泳道4和泳道8：葡萄糖生长培养物。(C)示出了通过串联质谱分析法从解纤维热酸菌上清液中分离出Xyl-1蛋白质(389aa)的肽覆盖表征。阴影框表示N-端信号肽，黑框表示从光谱中鉴定出的五个不重叠肽的位置。这些肽的序列如下：1：HGNPPYHPPADSLR(SEQ ID NO：6)，2：WQVVEPTQGTYDWSGGDR(SEQ ID NO：7)，3：LVQFAQEHGQLVR(SEQ ID NO：8)，4：HIVDEVTHFK(SEQ ID NO：9)和5：PAYTALQQTLALAAGAPHR(SEQ ID NO：10)。

图7示出了介于Acel_0373与Acel_0372(xyl-1)之间的开放读码框中的全部451-bp非编码区。该序列包含xyl-1启动区。推定的-10和-25序列用黑体示出，推定的Shine-Dalgarno序列核糖体结合位点(RBS)也用黑体示出。Xyl-1蛋白质编码区在序列末端用黑体箭头示出。三个反向重复序列(IR-1、IR-2和IR-3)用粗体字和黑框示出。IR-1：GAAACTTTC(SEQID NO：11)，IR-2：TTTCCGAAA(SEQ ID NO：12)，IR3：TCCGAAAATTTCGGA(SEQ ID NO：13)。

图8(A)和8(B)示出了用FPLC在65℃下热处理15分钟后Xyl-1的纯化。(A)示出了在FPLC期间，来自离子交换柱的蛋白质洗脱随着KCl浓度被增加而进行。黑线是280nm的紫外线吸光率，细灰线表示传导率，粗灰线表示KCl梯度。(B)示出了52℃下的活性数据图表(在410nm处测定的活性)，使用pH值5.2来鉴定包含Xyl-1的馏分，然后将它们合并浓缩。

图9(A)和9(B)示出了大肠杆菌中Xyl-1的纯化。(A)示出了考马斯染色凝胶。(B)示出了凝胶试验(在52℃，pH值5.2条件下进行)。最左侧泳道是分子量标记(以kD为单位)。CCE是来自大肠杆菌克隆体的细胞粗提取物；ΔH是在热处理后(65℃下处理15分钟)来自大肠杆菌克隆体的细胞粗提取物；Main是来自离子交换柱的浓缩活性馏分；Side是浓缩侧馏分。星号表示Xyl-1。

图10示出了通过羟基磷灰石色谱的Xyl-1的纯化。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(10％凝胶)分析显示分子量标记(泳道1)，来自DH5α(pK19-xyl-1)的细胞粗提取物(泳道2)，来自DH5α(pK19-xyl-1)经过热处理(65℃下处理20分钟后离心)的细胞粗提取物(泳道3)，来自羟基磷灰石柱的浓缩馏分(泳道4)。

图11示出了在不同pH值和温度条件下部分纯化的Xyl-1的相对活性。该活性相对于每一pH值下的最高活性。

图12示出了Xyl-1与其他木聚糖酶的多序列比对。使用Clustal X版本2.0将Xyl-1的A 295氨基酸片段(残基67-361)与11种其他同系物比对(26)。星号(*)表示完全保守位点，冒号(：)和句号(。)分别表示高度和低度保守位点。A_ce序列上方的线表示包含三个脯氨酸的五种氨基酸的独特Xyl-1区。蛋白质使用的缩写和登录号如下：A_ce(解纤维热酸菌11B Xyl-1，GI：117927581)(SEQ ID NO：28)；C_ac(Catenulispora acidiphila DSM44928，GI：229247007)(SEQ ID NO：29)；C_sp(纤维微杆菌属HY-12，GI：162414427)(SEQ ID NO：30)；C_fi(粪肥杆菌ATCC 484，GI：73427793)(SEQ ID NO：31)；S_th(热紫链霉菌，GI：38524461)(SEQ ID NO：32)；T_au(嗜热子囊菌，GI：13432255)(SEQ ID NO：33)；P_ch(白腐菌，GI：167599628)(SEQ ID NO：34)；T_al(白色嗜高温菌，GI：1621277)(SEQID NO：35)；S_av(除虫链霉菌，GI：29828638)(SEQ ID NO：36)；C_ad(Cryptococcus adeliensis，GI：2624008)(SEQ ID NO：37)；U_ba(未培养的细菌，GI：18476191)(SEQ ID NO：38)；T_ma(海栖热袍菌，GI：71041762)(SEQ ID NO：39)。

图13(A)和13(B)是琼脂糖凝胶成像，其示出了大肠杆菌细胞粗提取物中的胶内木聚糖酶活性试验。泳道ST是分子量标准(以kD为单位)；(A)中泳道1是来自载体对照菌株的细胞粗提取物；泳道2是来自Xyl-1克隆的细胞粗提取物；(B)中泳道3是来自载体对照菌株经过热处理(65℃下处理15分钟)的细胞粗提取物；泳道4是来自Xyl-1克隆经过热处理的细胞粗提取物。在52℃，pH值5.2条件下进行试验。

图14是聚丙烯酰胺凝胶成像，其示出了在凝胶试验中来自大肠杆菌克隆体和热酸菌属(在纤维二糖上生长后)浓缩的培养物上清液中的木聚糖酶活性。泳道ST是分子量标准(以kD为单位)；泳道1是热酸菌属的培养物上清液；泳道2是Xyl-1克隆体的培养物上清液；泳道3是大肠杆菌载体对照的培养物上清液。在52℃，pH值5.2条件下进行试验。

图15是聚丙烯酰胺凝胶成像，其示出了在pH值5.2下的凝胶试验中，在0至100℃的温度范围下大肠杆菌细胞粗提取物的重组Xyl-1活性。

图16是聚丙烯酰胺凝胶成像，其示出了在凝胶试验中，在pH值范围3-10条件下大肠杆菌细胞粗提取物的重组Xyl-1活性。在52℃下进行试验。

图17是聚丙烯酰胺凝胶成像，其示出了在大肠杆菌细胞粗提取物中的重组Xyl-1经过热处理(在80℃下处理20分钟)活性。在52℃，pH值5.2条件下进行试验。

图18示出了大肠杆菌细胞粗提取物经过热处理20分钟后的重组Xyl-1活性。在52℃，pH值5.2条件下进行试验。

图19示出了在0至120℃的温度范围内，pH值5.2条件下，大肠杆菌细胞粗提取物的重组Xyl-1的比活性。

图20(A)和20(B)示出了纯化的Xyl-1的温度和pH值数据图表。(A)是pH值范围3至6；(B)是pH值范围7至10。结果是以燕麦作为底物并且使用还原糖测定的至少三个独立实验数据的平均值。注意A和B的活性范围不同。误差线表示标准偏差。

图21(A)和21(B)示出了重组Xyl-1的热稳定性。(A)是用木聚糖底物获得的克隆的Xyl-1的稳定特征。将纯化的Xyl-1用燕麦木聚糖(浅灰)、桦木木聚糖(灰)或磷酸盐缓冲液(白)以1∶20比例稀释，在90℃下按图表示的时间培养。通过还原糖试验测定速率，与未加热的Xyl-1(黑)相对应。结果是三个独立实验数据的平均值，误差线表示标准偏差。(B)是Xyl-1在3.8％浓度的燕麦木聚糖存在时保留的活性。在90℃下Xyl-1的半衰期似乎大约为1.5小时。

图22(A)和22(B)示出了与燕麦木聚糖(A)和桦木木聚糖(B)发生反应的Xyl-1活性TLC时间进程结果。TLC如在材料和方法中所述被处理。泳道1和泳道8是标准化合物：X1木糖，X3木三糖，X4木四糖。泳道2是未反应的木聚糖；泳道3至7是在纯化的Xyl-1存在时培养增加的时间。泳道3，10分钟；泳道4，20分钟；泳道5，40分钟；泳道6，60分钟；泳道7，240分钟。

序列表简要说明

SEQ ID NO：1示出了没有N-端信号序列的Xyl-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2示出了N-端Xyl-1信号序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3示出了由从解纤维热酸菌中扩增的PCR产物编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4示出了从解纤维热酸菌扩增的PCR产物的核苷酸编码序列。

SEQ ID NO：5示出了从解纤维热酸菌扩增的PCR产物的核苷酸互补序列。

SEQ ID NO：6示出了用串联质谱分析法从解纤维热酸菌培养物上清液中鉴定出的五个不重叠Xyl-1肽中的第一个Xyl-1肽氨基酸序列。

SEQ ID NO：7示出了用串联质谱分析法从解纤维热酸菌培养物上清液中鉴定出的五个不重叠Xyl-1肽中的第二个Xyl-1肽氨基酸序列。

SEQ ID NO：8示出了用串联质谱分析法从解纤维热酸菌培养物上清液中鉴定出的五个不重叠Xyl-1肽中的第三个Xyl-1肽氨基酸序列。

SEQ ID NO：9示出了用串联质谱分析法从解纤维热酸菌培养物上清液中鉴定出的五个不重叠Xyl-1肽中的第四个Xyl-1肽氨基酸序列。

SEQ ID NO：10示出了用串联质谱分析法从解纤维热酸菌培养物上清液中鉴定出的五个不重叠Xyl-1肽中的第五个Xyl-1肽氨基酸序列。

SEQ ID NO：11示出了位于xyl-1启动区内的三个反向重复序列中的第一个(IR-1)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12示出了位于xyl-1启动区内的三个反向重复序列中的第二个(IR-2)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13示出了位于xyl-1启动区内的三个反向重复序列中的第三个(IR-3)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14示出了用于PCT扩增Acel_0372的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15示出了用于PCT扩增Acel_0372的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：16示出了特异于xyl-1基因的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17示出了特异于xyl-1基因的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：18示出了正向gyrB基因特异引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：19示出了反向gyrB基因特异引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：20示出了推定的xyl-1核糖体结合位点(RBS)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：21示出了在解纤维热酸菌16S核糖体rRNA3’端处发现的保守序列的核苷酸序列(互补于RBS)。

SEQ ID NO：22示出了重组Xyl-1的N-端序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23示出了GH10家族木聚糖酶的第一个谷氨酸活性位点区域的保守氨基酸序列。

SEQ ID NO：24示出了GH10家族木聚糖酶的第二个谷氨酸活性位点区域的保守氨基酸序列。

SEQ ID NO：25示出了Xyl-1的第一个谷氨酸活性位点区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：26示出了Xyl-1的第二个谷氨酸活性位点区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27示出了包含接近Xyl-1的第一个谷氨酸活性位点的三个脯氨酸的区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：28示出了Xyl-1的295个氨基酸的片段(比如残基67-361)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：29示出了Catenulispora acidiphila DSM 44928(GI：229247007)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：30示出了纤维微杆菌属HY-12(GI：162414427)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：31示出了粪肥杆菌ATCC 484(GI：73427793)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：32示出了热紫链霉菌(GI：38524461)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：33示出了嗜热子囊菌(GI：13432255)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：34示出了白腐菌(GI：167599628)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：35示出了白色嗜高温菌(GI：1621277)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：36示出了除虫链霉菌(GI：29828638)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：37示出了Cryptococcus adeliensis(GI：2624008)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：38示出了未得到培养物的细菌(GI：18476191)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：39示出了海栖热袍菌(GI：71041762)木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：40示出了Xyl-1脯氨酸丰富的共有序列的氨基酸序列。

发明详述

定义

如本文所使用的，术语“热稳定的”是指在65℃下培养15分钟后的木聚糖酶活性阈值电平。

如本文所使用的，术语“活性的”和“活性”是指在胶内木聚糖酶试验或如下所述的还原糖测定中得到阳性结果的内切-β-1，4-木聚糖酶。

如本文所使用的，术语“活性百分比”是指，在指定的实验条件下测定的内切-β-1，4-木聚糖酶活性值与基线木聚糖酶活性值的比值。在实验条件下测定的木聚糖酶活性值除以基线木聚糖酶活性值，再乘以100，以获得活性百分比。如本文所使用的，术语“基线木聚糖酶活性”和“基线对照”是指内切-β-1，4-木聚糖酶在55℃，pH值5.2的条件下10分钟产生的木聚糖酶活性值。

如本文所使用的，术语“半衰期”是指，在指定的温度条件下内切-β-1，4-木聚糖酶活性下降50％(与基线对照相比)的必要持续时间。

如本文所使用的，术语“最佳活性”是指，在指定的温度范围或pH值范围内的木聚糖酶最大活性。

如本文所使用的，术语百分比“同源”，“同源百分比”和“序列同源性百分比”被定义为在一组参考核酸或氨基酸序列和至少另外一组核酸或氨基酸序列之间的同源值。序列同源性百分比可以通过比较两组最佳比对序列测定。其中，与不含有增加或缺失片段的参考序列(比如一公开的核酸或氨基酸序列)比较时，被比较的序列一部分可能含有增加或缺失(即空白)片段，从而形成两组序列的最佳比对。通过测定两组序列中产生的同源核酸或氨基酸残基位点数得到匹配位点数，用匹配位点数除以总位点数，再乘以100，得到序列同源性百分比。当使用以下序列比较算法中的一种或使用人工排列和目测检查来测定被比较和比对的序列达到最大相关或指定区域时，如果两组序列有相同核酸或氨基酸残基(即，在指定区域内，或非指定区域整组序列内具有75％序列同源性)的指定百分比，那么这两组序列具有同源百分比。

适用于测定序列同源性百分比的算法的一个例子是BLAST算法，该算法在Altschul等人于1977年发表的Nuc.Acids Res.25：3389-3402中进行描述。运行BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心公开获得。BLASTN程序(被用于核酸序列)以字长(W)为11，期望(E)或10，M＝5，N＝-4及两个链的比值的默认值使用。对于氨基酸序列，BLASTN程序以字长(W)为3，期望(E)为10，和BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff于1989年发表的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)对比(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝-4及两个链的的比值的默认值使用。

解纤维热酸菌XYL-1木聚糖酶

以下将描述大量典型的构图，参数，和类似信息。然而应该被认同的是，这种描述并不旨在限制本发明的范围，而是旨在为典型实施例作出描述。

解纤维热酸菌11B(ATCC 43068)是一种起初从黄石国家公园的酸性温泉中分离出来的嗜热细菌。许多热稳定的内切纤维素酶都是由这种有机物产生的，这些酶用于在生产乙醇或其他碳氢化合物以制作生物燃料的过程中降解纤维素。解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)11B(以下指A.cellulolyticus)已经完成测序(Refseq NC_008578)，并且该序列已经被注释。该序列和序列注释为有潜在用处的酶(公开的登录号为NC_008578)的调控和生产提供信息。在这些有潜在用处的酶中，解纤维热酸菌序列注释预测出一个单独的推定的内切-β-1，4-木聚糖酶，其由Acel_0372(来自解纤维热酸菌基因组注释)编码。有理由相信，之前没有关于内切-β-1，4-木聚糖酶被克隆的报告，而且预测的分子量与之前公开的解纤维热酸菌木聚糖酶(美国专利号5,902,581)不一致。因此，这种预测的内切-β-1，4-木聚糖酶是从解纤维热酸菌中克隆而得，作为重组蛋白进行表达。

由Acel_0372编码的表达的蛋白质被定义为糖基水解酶家族10(GH10)内切-β-1，4-木聚糖酶。这种解纤维热酸菌GH10家族木聚糖酶被命名为Xyl-1。Xyl-1的特征显现出它是一种嗜热木聚糖酶，其最适温度是90℃，最适pH值范围是4.5至6.0。Xyl-1的另一个特征是在25至120℃的温度范围内，pH值3至9的条件下保留木聚糖酶活性。Xyl-1还具有约40至48kD的分子量。此外，Xyl-1与美国专利号5,902,581中公开的解纤维热酸菌木聚糖酶不同，其温度范围高于美国专利号5,902,581中公开的解纤维热酸菌木聚糖酶70至80℃的温度范围，其pH值酸性低于比美国专利号5,902,581中公开的木聚糖酶3.6至4.2的pH值范围，其体积小于美国专利号5,902,581中公开的木聚糖酶50-55kD的体积。

令人惊奇和意外的是，解纤维热酸菌产生第二种木聚糖酶(即Xyl-1)，与之前定义的木聚糖酶(美国专利号5,902,581)的在最适温度和pH值范围上不同。

如前所述，Xyl-1用于在生产乙醇或其他碳氢化合物以制作生物燃料的过程中降解(比如水解)包含木聚糖的材料、包含木葡聚糖的材料、和包含木质纤维生物量的材料。比如，Xyl-1可用于水解桦木、燕麦、柳枝稷、玉米秸秆、芒属、能源甘蔗、高粱、桉树、柳树、甘蔗渣、杂交白杨、其他短期轮作木本作物、不同种类的针叶软木、作物残留物或庭园废物里的木质纤维生物量，以改进这些底物中发酵糖的有效性。在工业应用中，水解步骤优选在50至100℃的温度范围内和酸性pH值范围的条件下进行。Xyl-1在宽温度范围和pH值范围内的稳定性使其在工业加工中被广泛应用。此外，Xyl-1在波动条件下提供长期持续的木聚糖酶活性，能应用于大型生物转化系统中。这些条件进一步允许其能够利于联合木质纤维素水解与木质纤维素发酵。

Xyl-1也可用于造纸工序步骤中的木质纤维纸浆漂白，通过让饲料更易消化来改进动物饲料，或者Xyl-1可作为洗涤剂组成成分使用。

本发明中公开的木聚糖酶，可以通过下面的非限制性实施例来更好的理解它们的制作方法和使用方法。

具体实施例

实施例1：Xyl-1的克隆

根据解纤维热酸菌11B基因组注释，Acel_0372编码一个预测的分泌的木聚糖酶(Xyl-1)。为了克隆Acel_0372，将解纤维热酸菌11B(ATCC43068)基因组DNA如前所述(15)进行纯化，设计低核苷酸引物以使用PCR扩增完整的Acel_0372，来自解纤维热酸菌中的预测的1.4kb的Xyl-1基因(图2)。使用的引物对是正向Xyl(5’-GTG GTG GAG CTC GCA ATTCGT TCA CGT TGA GG-3’)(SEQ ID NO：14)，和反向Xyl(5′-GTG GTGTCT AGA ACC ATC GAG TGG GAG TGA CG-3’)(SEQ ID NO：15)。下划线序列表示增加的用于克隆的酶切位点，其分别为SacI和XbaI。使用Pfu按如下程序进行PCR扩增：在95℃下最初变性持续3分钟，然后95℃，1分钟、55℃，1分钟、70℃，1分钟进行25个循环、最终在70℃下延伸5分钟。PCR得到一个1.4-kb产物，即xyl-1基因(图3)。用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，Calif.)将获得的1.4-kbPCR产物从琼脂糖凝胶中纯化，用SacI和XbaI消化，连接到SacI-XbaI-消化的pK19上(16)。通过标准程序(18)将质粒DNA转化进入大肠杆菌DH5α细胞。克隆体用SacI和XbaI酶切进行确定。

在包含xyl-1基因的阳性的pK19克隆体上进行DNA序列分析(图5)。在加利福尼亚大学戴维斯测序研究所用带有应用生物系统3730号自动测序器进行自动荧光的DNA测序。使用载体NTI软件系列(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)进行核苷酸和氨基酸序列分析。xyl-1基因的完整序列与报道中的Acel_0372序列一致。

实施例2：Xyl-1在解纤维热酸菌中的表达

材料和方法

解纤维热酸菌培养物在如前所述的补充矿物质的培养基(12)中生长。单独提供燕麦木聚糖酶、纤维素、纤维二糖或葡萄糖作为浓度0.5％的碳源。让细胞生长到中间指数期或平稳期，在4℃下，10,000x g离心15分钟获得细胞。将细胞沉淀冷冻在液氮中，在无菌砂存在下，用液氮中预冷的研钵和杵将细胞磨碎破坏。用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)提取RNA，用不含核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶(Qiagen)酶切几轮，再用RNeasy PlantMini Kit清洗。对燕麦木聚糖或者纤维素上的培养物，将高分子量聚乙二醇(最终浓度1％w/v)加到细胞裂解液中以减少污染的基因组DNA数量。结果发现，几轮脱氧核糖核酸酶切完全消除DNA污染。使用AgilentBioanalyzer 2100(Agilent Technologies)分析RNA的质量，并使用分光光度计(Thermo Scientific)对RNA量化。

使用特异于xyl-1基因的引物(引物：5’-CAAAGGAAAGATCTGGCAATG-3’(SEQ ID NO：16)和5’-TGAGCATCCCGTCGTAGTAGT-3’(SEQ ID NO：17))通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，从100ng总RNA样品中扩增一个485bp的产物。使用Qiagen OneStep RT-PCR kit进行操作。在琼脂糖凝胶上对扩增的产物进行分析，用红色凝胶成像系统(Alpha Innotech)对其拍照。使用gyrB基因特异性引物5’-GACCCGACCGAGGTTTATTAC-3’(SEQ ID NO：18)和5’-GCCGAACTTGTTCACCAAATA-3’(SEQ ID NO：19)扩增一个270bp产物。该产物用于RNA装载的标准化同时用于xyl-1表达的半定量。为了生物学上重复实验，使用在培养菌完全生长条件下独立提取的第二批RNA重复RT-PCR反应。两次实验获得相同的结果，示出了重复实验之一的数据。

对于蛋白质组学分析，解纤维热酸菌在燕麦木聚糖酶上生长到平稳期，通过离心获得培养物上清液。用超过滤器搅拌超细过滤带有5kDa分子量微孔的聚醚砜膜细胞来浓缩培养物上清液至50倍。为了鉴定在浓缩的培养物上清液中的蛋白质，在加利福尼亚大学戴维斯蛋白质组学核心研究所对样品进行液相色谱分析，再进行串联质谱分析(LC/MS/MS)。

结果

在燕麦木聚糖、纤维素、纤维二糖和葡萄糖上生长的培养菌指数期及平稳期中，研究解纤维热酸菌xyl-1基因的转录表达。RT-PCR分析显现xyl-1在木聚糖和纤维素上生长的培养菌中表达(图6A)。在平稳期的纤维二糖上生长的培养菌中xyl-1基因也以低水平表达。在任何时候的葡萄糖上生长的培养菌中或在指数期的纤维二糖上生长的培养菌中均未监测出基因表达。在木聚糖和纤维素上生长的培养菌中，在指数期和平稳期生长时段内，xyl-1表达似乎基本上是相同的。使用gyrB基因作为内部对照标准化xyl-1基因表达水平(图6B)。

串联质谱光谱证实Xyl-1在培养物上清液中存在(图6C)，并表明靶定分泌蛋白的N-端25个氨基酸信号肽从成熟蛋白质中分开。

实施例3：xyl-1基因启动子的序列分析

xyl-1基因被确定在负链上，被负链上的分开的位于上游基因的147bp和下游基因的451bp所隔开。两种侧翼基因功能都与木聚糖酶不相关。因此，xyl-1并未显现出是基因簇或操纵子的一部分。对451bp上游启动区的分析显现编码起始的推定的Shine-Dalgarno核糖体结合位点(RBS)6个核苷酸上游。RBS序列(5’TGGAGG 3’)(SEQ ID NO：20)是在解纤维热酸菌16S核糖体rRNA3’端发现的保守CCTCCT(序列特征编号：21)序列的互补序列，两者只有一个碱基不匹配(图7)。推定的-35和-10序列也被鉴定(图7)，其能够与紧密相关的放射菌类，链霉菌属(20)中提出的共有序列启动子基序良好匹配，并且可能是解纤维热酸菌xyl-1基因的σ⁷⁰启动子序列。

在EMBOSS中使用回文序列软件在xyl-1的启动区发现几个小的反向重复(17)。这些反向重复中，与链霉菌属GH10家族木聚糖酶启动区比较之后(6)，发现三个反向重复(图7)是保守的。三个反向重复序列，IR-1、IR-2和IR-3，在xyl-1启动子分别与框1、框2和框3的共有序列相匹配，这三种共有序列被描述用于链霉菌属中的一些GH10家族木聚糖酶基因(6)。但是，在两种生物体中的这些推定的调控元件的长度和位置差别很大。在xyl-1启动子中，末段IR-1序列形成一个短回文序列(5’GAAA-C-TTTC 3’)(SEQ ID NO：11)，下游IR-3回文序列延伸成三个核苷酸长度(5’TCCGAAA-A-TTTCGGA 3’)(SEQ ID NO：13)，而在链霉菌属中框3回文序列比框1长一个核苷酸长度。解纤维热酸菌IR-2序列(5’TTTC-C-GAAA 3’)(SEQ ID NO：12)几乎与链霉菌属框2序列相同。但是，不像在链霉菌属中框1和框2被各自分离约10bp，xyl-1的IR-2元件与IR-1重叠(图7)。此外，在解纤维热酸菌中，IR-1和IR-2区域位于推定的-35和-10元件下游，更接近于编码起始位点，而两个相关框都是启动子的上游，远离链霉菌属中的第一个密码子。

实施例4：Xyl-1蛋白质的纯化

材料和方法

含有克隆的xyl-1基因的大肠杆菌DH5α在30℃下，在含有10mM葡萄糖，1mM硫胺素和100μg/ml卡那霉素的最少盐培养基中培养48小时。离心(在4℃下以14,000xg离心15分钟)获得细胞，用10mM磷酸盐缓冲液洗涤一次，在相同的缓冲液中重悬，并在-20℃下冷冻保存。将冷冻细胞悬浮液从冷冻箱中移出，然后在冰上解冻。然后将解冻的细胞下悬浮液一次通过弗氏压碎器，其保持内部细胞压力恒定18,000psi。在6℃下，以48,000xg离心90分钟清除细胞碎片和薄膜。将得到的细胞粗提取物通过在65℃下培养20分钟进行热处理。在4℃下，以14,000xg离心15分钟除去不溶物。在4℃下使用自动FPLC系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)进行纯化过程。将细胞提取物应用于包含Unosphere Q(Bio-RadLaboratories)的约100ml(柱床体积)的柱。Unosphere Q已用10mM磷酸盐缓冲液(pH值5.2)预平衡。将未结合的蛋白质用100ml同样的缓冲液以1.0ml/分钟的速率洗脱。将结合的蛋白质用从0到10M线性梯度的KCl在磷酸盐缓冲液中以同样的速率洗脱，并收集5ml馏分。

结果

将大肠杆菌克隆的提取物在65℃下热处理15分钟，然后将提取物装载到离子交换柱上。洗脱的Xyl-1蛋白质呈现一个活性主尖峰(图8)。这种热处理清除了许多大肠杆菌蛋白质，得到高纯度的Xyl-1(图9)。使用SDS-PAGE分析测定，浓缩的蛋白质纯度＞90％。(图9和图10)。从4L大肠杆菌培养菌中得到约2mg纯化的Xyl-1。在SDS凝胶上重组Xyl-1具有大约40-48kD的分子量(图9和图10)，这与根据加工的蛋白质氨基酸序列的推定所预测的分子量(40.3kD)一致。

部分纯化的Xyl-1的温度vs.PH值分布图证明，酶活性具有宽温度范围，最佳活性约在90℃下，也具有宽pH值范围，最佳pH值在4.5至6.0范围内(图11)。

实施例5：Xyl-1的N-端氨基酸序列分析

从大肠杆菌中纯化的重组Xyl-1样品，如实施例4所描述，用于测定Xyl-1(一种细胞外酶)是否能在大肠杆菌中被恰当加工。在聚偏氟乙烯膜(ProBlott；Applied Biosystems)上对纯化的蛋白质进行SDS-PAGE和电印迹处理后，在加利福尼亚大学戴维斯分子结构研究所的自动测序器(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上用Edman降解纯化的Xyl-1测定其N-端氨基酸序列。

发现在大肠杆菌中表达的重组Xyl-1的N-端序列是HGNPPYHPPAD(SEQ ID NO：22)。该序列的第一个氨基酸映射到氨基酸序列全长的位点26上，表示预测的Xyl-1信号序列恰当从异种宿主大肠杆菌中裂解(图5)。这表示大肠杆菌细胞用裂解信号序列来加工Xyl-1，该信号序列为分泌的信号序列。由于本实施例使用的是天然解纤维热酸菌11B木聚糖酶，在大肠杆菌中表达的Xyl-1缺少分泌的信号序列。

实施例6：Xyl-1氨基酸序列分析

对解纤维热酸菌GH10家族木聚糖酶Xyl-1氨基酸序列进行BLAST检索。最热门的是来自另一种放射菌类的木聚糖酶，Catenulisporaacidiphila DSM 44928，该序列与Xyl-1具有75％的序列同源性。第二个热门的是近期来自放射菌类纤维微杆菌属HY-12的生物化学特征的木聚糖酶，该序列与Xyl-1具有55％的序列同源性(13)。将Xyl-1与以上两种同系物，以及其他在Xyl-1的167和284位置以保守谷氨酸活性位点存在的功能性特征GH10家族木聚糖酶一起进行多序列分析。预测的谷氨酸活性位点周围的区域在GH10序列中十分保守，第一个谷氨酸周围的保守基序是DVVNE(SEQ ID NO：23)，第二个谷氨酸周围的保守基序是TELD(SEQ IDNO：24)。Xyl-1在两个区域内具有缬氨酸-丙氨酸和亮氨酸-丙氨酸这两种取代，分别得到DVANE(SEQ ID NO：25)和TEAD(SEQ ID NO：26)(图12)。未特征化的C.acidiphila同系物也具有这些取代。

应该理解的是，本发明公开的同源内切-β-1，4-木聚糖酶可能有第一个谷氨酸，对应于SEQ ID NO：1的谷氨酸-142的位置。优选的，第一个谷氨酸位于具有天冬氨酸-缬氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-谷氨酸序列(SEQ ID NO：25)的氨基酸区域内。本发明公开的同源内切-β-1，4-木聚糖酶可能有第二个谷氨酸，对应于SEQ ID NO：1的谷氨酸-259的位置。优选的，第二个谷氨酸位于具有苏氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列(序列特征编号：26)的氨基酸区域内。

将Xyl-1与未特征化的(C_ac，S_av)，嗜冷菌的(C_ad)，嗜温菌的(C_fi)，中度嗜热的(C_sp，P_ch，S_th，T_al，T_au)，热稳定的(A_ce，T_ma，U_ba)木聚糖酶比较进行多氨基酸序列比对。不同木聚糖酶氨基酸组成分析显示，在Xyl-1(A_ce)中，不耐热的残基丝氨酸和苏氨酸比例，与在Xyl-1(A_ce)最近的序列同系物C_ac中相比大幅度下降(图12)。这两种氨基酸相似的不足诠释在之前T_ma(7)蛋白质中曾记录过，被认为有助于形成高热稳定性。但是，大多数记录的为T_ma提供热稳定性的其他特点在Xyl-1中无法确定。

经过测定，Xyl-1包含一个具有5个氨基酸的区域，PHPLP(SEQ ID NO：27)，不同于该序列的两个最近同系物(C_ac和C_sp)，也不同于其他GH10家族的木聚糖酶，而是立刻成为第一个谷氨酸活性位点下游(图12)。氨基酸区域包含交替位置的三个脯氨酸。对其他木聚糖酶序列的更近一次观察显示，除来自真菌Catenulispora acidiphil、Cryptococcus adeliensis、白腐菌和一种有一个与第一个谷氨酸活性位点相近的单个脯氨酸的未得到培养物的细菌(U_ba)之外，没有一种其他比对生物体在15个活性位点的残基内具有脯氨酸(图12)。包含与第一个谷氨酸活性位点相近的三个脯氨酸的独特区域对Xyl-1的热稳定性有重要作用。脯氨酸残基由于刚性构象影响蛋白质折叠，已经证明其可以提高蛋白质的热稳定性(22)。可能的情况是，围绕Xyl-1的活性位点的多脯氨酸限制蛋白质结构主链的灵活性，从而提高该蛋白质的热稳定性。

本发明公开的同源内切-β-1，4-木聚糖酶可能有一个氨基酸区域，包含三个脯氨酸，其具有与SEQ ID NO：27至少80％同源性的氨基酸序列。优选的，氨基酸区域具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列。此外，同源内切-β-1，4-木聚糖酶可能有一个氨基酸区域，包含三个脯氨酸，其具有与SEQ ID NO：27同源的氨基酸序列，其中氨基酸序列在任何一个脯氨酸中有一个保守的氨基酸取代物。同源内切-β-1，4-木聚糖酶可能有一个氨基酸区域，包含三个脯氨酸，其具有与SEQ ID NO：27同源的氨基酸序列，其中两个非脯氨酸氨基酸区域可能是任一个氨基酸。

实施例7：Xyl-1活性试验

材料和方法

使用之前所述酶谱法的修正版本监控Xyl-1活性(8)。简言之，使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％)分离蛋白质。凝胶运行后，将其置于10mM磷酸盐缓冲液(pH 5.2)中，在52℃下轻微震动培养15分钟。除去缓冲液用1％木聚糖(来自10mM磷酸盐缓冲液[pH 5.2]中的燕麦(Sigma)的1％木聚糖)替代，在52℃下轻微震动培养15分钟。除去木聚糖溶液，用蒸馏水简单冲洗凝胶。然后将凝胶置入一种刚果红溶液中(水中含0.2％)，在室温下轻微震动培养20分钟。用1M NaCl让凝胶脱色直到可以看见“清晰的”条带。为测试酶具有活性的温度范围，在4℃至100℃的温度范围内，在pH值5.2的热水浴或冷水浴中进行凝胶试验。在0℃下的冰浴中监控酶活性。将所有溶液预培养至试验温度。使用pH值2.0至10的磷酸盐缓冲液修正试验来测试酶的pH值范围。

结果

使用燕麦木聚糖酶作为底物，对表达重组Xyl-1(参见实施例1)的转化的大肠杆菌进行木聚糖酶活性的测试。带有克隆基因的大肠杆菌提取物具有木聚糖酶活性(在52℃，pH值5.2下测试)，随后在65℃下热处理15分钟保留酶活性(图13)。只带有pK19(载体对照)的菌株提取物没有显示酶活性。用桦木木聚糖酶(数据未显示)观察酶活性。在大肠杆菌培养物上清液中显示出一些蛋白质，其展现的电泳迁移率与浓缩解纤维热酸菌培养物上清液中显示出的输出的木聚糖酶的电泳迁移率相同(图14)，该培养物上清液来自以纤维二糖作为碳源生长的细胞。

实施例8：Xyl-1的最佳活性

材料和方法

使用实施例7中所述的酶谱法测定胶内木聚糖酶活性。

用还原糖测定的修正版本来量化活性(11)。在无缓冲的10mM磷酸盐溶液中加入1％木聚糖制成木聚糖底物(燕麦木聚糖或桦木木聚糖，Sigma)。在55℃下轻微震动20分钟培养成浆液。将不溶物放置在室温下。除去上清液，用HCl或NaOH调节pH值。将2ml悬浮液倒入一个有螺丝帽的管中，在所需温度下水浴培养10分钟。加入木聚糖酶，在不同时间点取200μl样品，然后加入800μl PABAH(在0.5M NaOH中含0.5％对羟基苯甲酸酰肼)。将样品煮沸到刚好5分钟，在室温下冷却10分钟，测定410nm处的吸光度。将结果与木糖的标准曲线进行比较。在不同温度和pH值下实施试验来测定木聚糖酶具有活性的温度和pH值。在121℃下在高压灭菌器中测试活性。为了实施该试验，在冰上混合各组分，并置入高压灭菌器内，设置121℃处理10分钟。用之前所述的PABAH的存在来测定还原糖释放量。使用牛血清白蛋白做标准，用Bradford方法(3)测定蛋白质浓度。

结果

用酶谱法试验测定表达重组Xyl-1的转化的大肠杆菌细胞粗提取物在0至100℃温度范围下具有木聚糖酶活性(图15)。利用酶谱法，观察到在pH值4.5至6.0的范围内Xyl-1具有最佳活性，但是在pH值3至9的范围内显示出很强的活性(图16)。在不存在底物的情况下，将提取物在80℃下热处理20分钟，Xyl-1保留活性(图17)。在这些条件下，Xyl-1保留了整个活性约59％的活性(图18)。但是，在不存在木聚糖的情况下，将提取物在100℃下热处理20分钟，没有活性保留(图18)。进一步调查研究表明，木聚糖的存在使Xyl-1在高温下保持稳定。具体地，还原糖测定显示，在木聚糖存在使其保持稳定的情况下，Xyl-1在约90℃下具有最佳活性，比55℃下测定的活性高出约225％(图19)。

用还原糖测定测定，在55至100℃范围内用底物培养时，来自细胞粗提取物的Xyl-1比活性很高，在约90℃下具有最佳活性(图19)。细胞粗提取物内的Xyl-1比活性用每分钟每mg未纯化蛋白质mg木糖测定。在高压灭菌器中测试活性，以测试在温度高于100℃的活性(高压灭菌器温度设在121℃)，即使在高压灭菌器中Xyl-1也保留一些活性(900μg木糖/每分钟/mg蛋白质)。

用还原糖测定来使纯化的Xyl-1活性具有的温度和pH值范围的特征化。纯化的Xyl-1在30至100℃的温度范围内具有活性，其最佳活性的温度约在90℃(图20)。用每分钟每mg未纯化蛋白质mg木糖测定纯化的Xyl-1比活性。观察到最佳活性在pH值4.5至6.0的范围内(图20A)，但在pH值3至9的范围内显示出很强的活性(图20B)。酶的最适pH值随试验温度发生变化。在100℃下，Xyl-1在pH值4至6的范围内具有活性，并在pH值5.0时活性最佳。同时也注意到，随试验温度下降，Xyl-1在较高pH值(pH7至10)时具有活性(图20B)。在试验最后测定试验混合物的pH值，没有在试验中发现pH值在pH值3至8的范围内有很大变化。在最后pH值9试验中pH值恒定为8.6.

实施例9：Xyl-1热稳定性研究

材料和方法

用10mM磷酸盐缓冲液(pH值6)或者浓度4％的燕麦或桦木木聚糖的10mM磷酸盐缓冲液(pH值6)以1∶20比例稀释纯化的Xyl-1(1mg/ml)，混合，在冰上培养最少15分钟以确保Xyl-1与木聚糖在热处理前有充分时间相互作用。将等份的对照物和木聚糖预处理的Xyl-1在90℃下培养10分钟、20分钟、40分钟或60分钟后，立刻返回冰上。然后在90℃和pH值6下用还原糖测定(之前实施例5中所述)测定活性。

结果

研究木聚糖底物对Xyl-1热稳定性的作用(图21A)。在木聚糖不存在时，Xyl-1在90℃下培养10分钟、20分钟、40分钟和60分钟后，分别保留74±18％、63±12％、24±3％和5±1％的活性(图21A)。相反，在燕麦或桦木木聚糖存在时，即使在90℃下培养1小时也没有检测到很大的活性丧失情况。其他未作为Xyl-1的底物使用的多聚糖(微晶纤维素纤维二糖，胶质[KELCO ZN 85192 A]，和羟甲基化纤维素[Fluka])没有使Xyl-1稳定(数据未显示)。这些结果表明，木聚糖底物在高温下很大程度稳定纯化的Xyl-1。

在燕麦木聚糖存在时，在90℃下延长培养时间后，Xyl-1活性分析表明，在燕麦木聚糖存在时Xyl-1的半衰期约为1.5小时(图21B)。

实施例10：用Xyl-1的木聚糖裂解模式分析

材料和方法

使用如前所述的薄层色谱法(TLC)(10)分析木聚糖的水解产物。使用燕麦木聚糖和桦木木聚糖(在pH值6下，10mM磷酸盐缓冲液中浓度2％)各自作为底物。将纯化的Xyl-1加入木聚糖底物中在90℃下培养。在不同时间点上取样，放入干燥的冰异丙醇浴器内快速冷冻并在-20℃下保存。将样品在冰上解冻，洒在硅胶盘上。显影溶剂是氯仿、醋酸和水(6∶7∶1)的混合物。将溶剂前端迁移到TLC盘顶部，然后让TLC盘风干。为促进溶解，将每张色谱图以这种方式处理共三次。在乙醇和硫酸比例分别是95∶5的溶液中浸渍色谱图来检测水解产物，在105℃下培养5分钟。从Megazyme国际爱尔兰有限公司(Wicklow，Ireland)中得到木糖低聚物标准(木三糖和木四糖)。

结果

根据木糖、木三糖和木四糖标准(图22)的TLC迁移率比较分析，鉴定出桦木木聚糖水解的主要产物是木二糖和木四糖。少量木糖、木三糖和可能是木五糖的产物也是从桦木木聚糖中成形。增加点可能显示在完整的多聚糖内有酰化或经过糖侧基的木聚糖主链木糖残基(比如葡萄糖醛酸)。燕麦木聚糖的主要产物在木糖和木三糖之间有R_f值。这些也表明，在完整的多聚糖内有Xyl-1反应或经过糖侧基的主链木糖残基(比如阿糖残基)的酰化低聚糖产物。

结果证明Xyl-1是一个内切反应木聚糖酶。

实施例11：木质纤维素材料的木聚糖酶水解作用与发酵作用相耦合

木质纤维材料，比如柳枝稷和玉米秸秆，可以用设计为表达重组的Xyl-1的发酵有机物处理，该重组Xyl-1的提取物中包含酶或纯化酶。可通过将柳枝稷或玉米秸秆与设计为表达酶的有机物组合来进行处理。可选地，在木质纤维发酵过程中，可加入重组Xyl-1。

参考文献

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Claims

1.一种重组的内切-β-1，4-木聚糖酶，其包含与SEQ ID NO：1具有80％序列同源性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶最适pH值约为4.5至6.0。

3.根据权利要求1或2所述的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶具有约为40至48kD的分子量。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶在至少80℃下具有活性。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶在木聚糖存在时，在90℃下的半衰期约为90分钟。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的木聚糖酶，其中，所述重组的内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列范围遵循共有序列：脯氨酸-Xaa₁-脯氨酸-Xaa₂-脯氨酸(SEQ ID NO：40)，其中，Xaa₁和Xaa₂各自独立地选自无氨基酸、任意一个氨基酸、任意两个氨基酸和任意三个氨基酸组成的组中。

7.根据权利要求6所述的木聚糖酶，其中，所述重组的内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列含有在SEQ ID NO：1的谷氨酸-142相应位置的第一个谷氨酸，和在SEQ ID NO：1的谷氨酸-259相应位置的第二个谷氨酸，其中，所述重组的内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列的区域位于第一个谷氨酸和第二个谷氨酸之间。

8.根据权利要求6所述的木聚糖酶，其中，Xaa₁是选自由组氨酸、赖氨酸和精氨酸组成的组中的一种氨基酸，Xaa₂是选自由亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组中的一种氨基酸。

9.根据权利要求6所述的木聚糖酶，其中，所述重组的内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列的区域是脯氨酸-组氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸(SEQID NO：27)。

10.根据权利要求1到9任一项所述的木聚糖酶，其中，所述重组的内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同源性。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的木聚糖酶，其中，所述重组的内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：1。

12.一种重组细胞，其包括编码权利要求1至10中任一项所述的重组的内切-β-1，4-木聚糖酶的核酸分子。

13.一种水解木质纤维素的方法，该方法包括：

-将木质纤维素与包括一个与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同源性的氨基酸序列的重组的内切-β-1，4-木聚糖酶发生反应，其中，所述的木质纤维素与重组木聚糖酶在至少80℃下，pH值范围约4.5至6.0的条件下发生反应。

14.据权利要求13所述的方法，其中，所述木质纤维素的来源选自白桦木、燕麦、柳枝稷、玉米秸秆、芒属、能源甘蔗、高粱、桉树、柳树、甘蔗渣、杂交白杨、短期轮作木本作物、针叶软木、作物残留物、庭园废物及其组合组成的组中。

15.要求13或14所述的方法，其中，所述重组的内切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：1。