CN108018237A - 一种碱性木聚糖酶的高产菌株及其筛选方法、以及木聚糖酶的制备方法 - Google Patents

一种碱性木聚糖酶的高产菌株及其筛选方法、以及木聚糖酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种碱性木聚糖酶的高产菌株及其筛选方法、以及木聚糖酶的制备方法，所述碱性木聚糖酶的高产菌株为蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01，其保藏编号为CCTCC M 2017762。本发明提供的碱性木聚糖酶的高产菌株，通过发酵培养后获得的木聚糖酶，具有最适pH为8.0、最适温度为50℃的特性，并且在pH为10.0、温度为50℃的缓冲液中保持1h后的木聚糖酶仍有41.44％的相对酶活力；在温度为80℃、pH为8.0的缓冲液中保温1h后的木聚糖酶仍有56.82％的相对酶活力，具有良好的碱耐受性及热稳定性，所述碱性木聚糖酶的高产菌株的最终发酵产酶水平为36.85U/mL。

Description

一种碱性木聚糖酶的高产菌株及其筛选方法、以及木聚糖酶 的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种碱性木聚糖酶的高产菌株及其筛选方法、以及木聚糖酶的制备方法。
背景技术
木聚糖酶(1,4β-D xylanase,EC3.2.1.8)属水解酶类，是将木聚糖降解为低聚木糖或木糖的复合酶系。该酶在自然界的来源广泛，诸如细菌(如枯草芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、拜氏梭菌、耐盐高温双岐菌)、真菌(如木霉、青霉、米曲霉、黑曲霉、土曲霉)、放线菌、蜗牛等。木聚糖酶有重要的工业价值，已应用于食品、造纸、饲料、能源和环境众多领域，尤其是在食品制作和纸浆生物漂白中有着不可小觑的重要性。
不同来源的木聚糖酶的最适pH不一样，真菌则接近于酸性，大部分放线菌和细菌接近于中性，大大制约了木聚糖酶在工业中高温高碱性环境下的应用。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种碱性木聚糖酶的高产菌株及其筛选方法、以及木聚糖酶的制备方法，旨在提高木聚糖酶的耐碱性和热稳定性。
为实现上述目的，本发明提出一种碱性木聚糖酶的高产菌株，所述碱性木聚糖酶的高产菌株为蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01，其保藏编号为CCTCC M2017762。
本发明还提出一种如上述的碱性木聚糖酶的高产菌株的筛选方法，包括如下步骤：
将活性污泥接入液体无机盐培养基中，于28℃、170r/min摇床培养7d后，将培养物接入液体无机盐培养基中进行5～6次传代培养；
将经过传代培养的培养物稀释成稀释菌液，取稀释菌液涂布至无机盐培养基平板，于28℃条件下培养5d；
挑取无机盐培养基平板上透明圈较大的单菌落，经过分离、纯化后，获得筛选菌株；
将筛选菌株接入种子培养基中，于28℃、170r/min摇床培养24h后，加入0.1g/L的木聚糖诱导培养24h，并将培养物接入产酶培养基中，于28℃、170r/min摇床培养48h后，用DNS方法测定木聚糖的产量，筛选高活性菌株，即为碱性木聚糖酶的高产菌株。
优选地，所述液体无机盐培养基包括以下浓度的组分：木聚糖1g/L、硝酸钾1g/L、氯化钠0.2g/L、磷酸氢二钾0.5g/L和硫酸铵0.3g/L；所述液体无机盐培养基的pH值为8.5。
优选地，所述无机盐培养基为向所述液体无机盐培养基中加入质量分数为2％的琼脂粉所得的培养基。
优选地，所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L和氯化钠5g/L；所述种子培养基的pH值为8.5。
优选地，所述产酶培养基包括以下组分：葡萄糖1.5g/L、酵母粉4g/L、硫酸镁1g/mL、氯化钠0.5g/mL、磷酸氢二钾1g/mL、氯化钙15g/mL，木聚糖0.01g/L以及玉米浆15mL；所述产酶培养基的pH值为8.0。
本发明还提出一种木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
将如上述的碱性木聚糖酶的高产菌株接入种子培养基中，于28℃、170r/min摇床培养24h后，加入0.1g/L的木聚糖诱导培养24h，并将培养物接入产酶培养基中，于28℃、170r/min培养48h后，取发酵液进行分离、纯化，获得木聚糖酶。
优选地，所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L和氯化钠5g/L；所述种子培养基的pH值为8.5。
优选地，所述产酶培养基包括以下组分：葡萄糖1.5g/L、酵母粉4g/L、硫酸镁1g/mL、氯化钠0.5g/mL、磷酸氢二钾1g/mL、氯化钙15g/mL，木聚糖0.01g/L以及玉米浆15mL；所述产酶培养基的pH值为8.0。
本发明提供的碱性木聚糖酶的高产菌株，通过发酵培养后获得的木聚糖酶，具有最适pH为8.0、最适温度为50℃的特性，并且在pH为10.0、温度为50℃的缓冲液中保持1h后的木聚糖酶仍有41.44％的相对酶活力；在温度为80℃、pH为8.0的缓冲液中保温1h后的木聚糖酶仍有56.82％的相对酶活力，具有良好的碱耐受性及热稳定性，所述碱性木聚糖酶的高产菌株的最终发酵产酶水平为36.85U/mL。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例3中蛾微杆菌YD01在无机盐平板上的形态图；
图2为本发明实施例3中蛾微杆菌YD01的革兰氏染色结果图；
图3为本发明实施例3中蛾微杆菌YD01的16S rRNA基因序列；
图4为本发明实施例2中不同筛选菌株的24h培养物的吸光度；
图5为本发明实施例2中1#菌株的不同单菌落的酶活力；
图6为本发明实施例4中木聚糖酶的最适pH；
图7为本发明实施例4中木聚糖酶的最适温度；
图8为本发明实施例5中不同pH条件下的木聚糖酶的相对酶活力；
图9为本发明实施例5中不同温度条件下的木聚糖酶的相对酶活力。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种碱性木聚糖酶的高产菌株，所述碱性木聚糖酶的高产菌株为蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01，其保藏编号为CCTCC M2017762，保藏日期为2017年12月8日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，具体地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学内。
蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01的形态、生理生化特征及16S rRNA序列对比结果如下：
蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01的菌落呈杆状较湿润、较光滑、较粘稠、易挑起、质地均匀、菌落正反面及中央部位的颜色一致，在无机盐平板上形成均匀、水解圈较大且透明的单菌落，如图1所示。以革兰氏阳性枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌为对照，对YD01进行革兰氏染色，结果为紫色，如图2所示，表明YD01为G+菌。图2中，(a)为蛾微杆菌YD01，(b)为枯草芽孢杆菌，(c)为大肠杆菌。
蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01的生理生化特征如表1所示。蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01的葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖发酵实验，结果均为阳性；H2S实验阳性，V-P试验阴性；37℃加热能存活；能运动。
表1蛾微杆菌YD01的生理生化特征
生理生化特征 结果 生理生化特征 结果
葡萄糖 + H2S +
L-阿拉伯糖 + V-P -
D-木糖 + 37℃加热 +
蔗糖 + 运动 +
对蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01菌落进行PCR扩增16S rRNA基因后，然后将PCR产物经过凝胶电泳回收后送生工测序，其基因序列如图3所示，经BLAST同源分析对比显示YD01菌和微杆菌属其他种的菌株的一致性较高，有同源性，结合菌落形态、颜色及革兰氏染色结果确定菌属，该菌为微杆菌属Microbacterium。
本发明提供的碱性木聚糖酶的高产菌株，通过发酵培养后获得的木聚糖酶，具有最适pH为8.0、最适温度为50℃的特性，并且在pH为10.0、温度为50℃的缓冲液中保持1h后的木聚糖酶仍有41.44％的相对酶活力；在温度为80℃、pH为8.0的缓冲液中保温1h后的木聚糖酶仍有56.82％的相对酶活力，具有良好的碱耐受性及热稳定性，所述碱性木聚糖酶的高产菌株的最终发酵产酶水平为36.85U/mL。
本发明还提出一种如上述的碱性木聚糖酶的高产菌株的筛选方法，在发明提供的碱性木聚糖酶的高产菌株的筛选方法的一实施例中，所述碱性木聚糖酶的高产菌株的筛选方法包括如下步骤：
步骤S10、将活性污泥接入液体无机盐培养基中，于28℃、170r/min摇床培养7d后，将培养物接入液体无机盐培养基中进行5～6次传代培养；
其中，所述活性污泥来源于武汉某造纸厂。从武汉某造纸厂的活性污泥和污水排放口附近的泥土中分别多点采样，作为筛选所述碱性木聚糖酶的高产菌株的原材料。然后将采取的活性污泥接种于液体无机盐培养基中进行摇床培养(28℃、170r/min条件下培养7d)，再将摇床培养的培养物接入液体无机盐培养液中进行传代培养，并重复5～6次传代培养。
在步骤S10中，所述液体无机盐培养基包括以下浓度的组分：木聚糖1g/L、硝酸钾1g/L、氯化钠0.2g/L、磷酸氢二钾0.5g/L和硫酸铵0.3g/L；所述液体无机盐培养基的pH值为8.5，剩余成分为水。
步骤S20、将经过传代培养的培养物稀释成稀释菌液，取稀释菌液涂布至无机盐培养基平板，于28℃条件下培养5d；
将步骤S10中经传代培养的培养物10倍逐级稀释成不同浓度梯度的稀释菌液，取稀释倍数为10-6～10-8的稀释菌液，将稀释菌液涂布于无机盐培养基平板上，放入培养箱中，于28℃条件下培养5d。
在步骤S20中，所述无机盐培养基为向所述液体无机盐培养基中加入质量分数为2％的琼脂粉所得的培养基。
步骤S30、挑取无机盐培养基平板上透明圈较大的单菌落，经过分离、纯化后，获得筛选菌株；
经过无机盐培养基平板培养后，挑取透明圈较大的并具有细菌形态的单菌落，经过分离、纯化后，获得的筛选菌株即为产木聚糖酶的菌株。此时筛选的产木聚糖酶的菌株还需要进一步筛选，从而获得高产碱性木聚糖酶的菌株。
步骤S40、将筛选菌株接入种子培养基中，于28℃、170r/min摇床培养24h后，加入0.1g/L的木聚糖诱导培养24h，并将培养物接入产酶培养基中，于28℃、170r/min摇床培养48h，用DNS方法测定木聚糖的产量，筛选高活性菌株，即为碱性木聚糖酶的高产菌株。
将步骤S30获得的筛选菌株接入种子培养基中进行摇床培养(28℃、170r/min条件下培养24h)，加入0.1g/L的木聚糖诱导培养24h后，再接入产酶培养基中进行摇床培养(28℃、170r/min条件下培养48h)，测定培养物在波长600nm处的吸光度(OD600)，同时将发酵液于6000r/min条件下离心10min，取粗酶液，用DNS定糖法测其酶活力。根据酶活力测试结果，选取酶活力最高的菌株作为碱性木聚糖酶的高产菌株。
在步骤S40中，所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L和氯化钠5g/L；所述种子培养基的pH值为8.5。
在步骤S40中，所述产酶培养基包括以下组分：葡萄糖1.5g/L、酵母粉4g/L、硫酸镁1g/mL、氯化钠0.5g/mL、磷酸氢二钾1g/mL、氯化钙15g/mL，木聚糖0.01g/L以及玉米浆15mL；所述产酶培养基的pH值为8.0。
本发明还提出一种木聚糖酶的制备方法，在本发明提供的木聚糖酶的制备方法的一实施例中，所述木聚糖酶的制备方法包括如下步骤：
将如上述的碱性木聚糖酶的高产菌株接入种子培养基中，于28℃、170r/min摇床培养24h后，加入0.1g/L木聚糖诱导培养24h，并将培养物接入产酶培养基中，于28℃、170r/min培养48h后，取发酵液进行分离、纯化，获得木聚糖酶。
具体操作如下：将上述步骤S40获得的碱性木聚糖酶的高产菌株的菌液涂布于无机盐培养基平板(无机盐培养基同步骤S20)上，于28℃培养5d，然后挑选平板上的单菌落接种于种子培养基中进行摇床培养(28℃、170r/min条件下培养24h)，再加入0.1g/L的木聚糖诱导培养24h后，将培养物接入产酶培养基中培养(28℃、170r/min条件下培养48h)，最后将发酵液于6000r/min离心10min，得到的上清粗酶液即为通过本发明提供的木聚糖酶的制备方法得到的木聚糖酶产物。
其中，所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L和氯化钠5g/L；所述种子培养基的pH值为8.5。
其中，所述产酶培养基包括以下组分：葡萄糖1.5g/L、酵母粉4g/L、硫酸镁1g/mL、氯化钠0.5g/mL、磷酸氢二钾1g/mL、氯化钙15g/mL，木聚糖0.01g/L以及玉米浆15mL；所述产酶培养基的pH值为8.0。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1产木聚糖酶菌株的分离
(1)采样：从武汉某造纸厂的活性污泥和污水排放口附近的泥土中分别多点采样，作为筛选产木聚糖酶菌株的原材料。
(2)培养基配制：
液体无机盐培养基：木聚糖(桦木木聚糖，购自Sigma公司)1g/L、硝酸钾1g/L、氯化钠0.2g/L、磷酸氢二钾0.5g/L以及硫酸铵0.3g/L；调节pH值为8.5。
无机盐培养基：向上述的液体无机盐培养基中加入质量分数为2％的琼脂粉。
(3)菌株分离：分别称取10g活性污泥，接种于250mL的液体无机盐培养基中，于28℃、170r/min摇床培养7d；取5mL培养物接入液体无机盐培养基中进行传代培养，重复5～6次并将培养物稀释成不同浓度梯度的稀释菌液，在10-6～10-8梯度取稀释菌液0.2mL涂布于无机盐培养基平板，放入培养箱中于28℃培养5d；然后挑取透明圈较大的并具有细菌形态的单菌落进行分离、纯化，直至得到均匀的单菌株(7株，分别标记为1#～7#菌株)，即为产木聚糖酶菌株，于-20℃保藏。
实施例2高产木聚糖酶菌株的筛选及木聚糖酶的制备
(1)培养基配制：
液体无机盐培养基：木聚糖(桦木木聚糖，购自Sigma公司)1g/L、硝酸钾1g/L、氯化钠0.2g/L、磷酸氢二钾0.5g/L以及硫酸铵0.3g/L；调节pH值为8.5。
无机盐培养基：向上述的液体无机盐培养基中加入质量分数为2％的琼脂粉。
种子培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L和氯化钠5g/L；调节pH值为8.5。
产酶培养基：葡萄糖1.5g/L、酵母粉4g/L、硫酸镁1g/mL、氯化钠0.5g/mL、磷酸氢二钾1g/mL、氯化钙15g/mL，木聚糖0.01g/L以及玉米浆15mL；调节pH值为8.0。
(2)菌株初筛：将实施例1中分离得到的不同菌株(7株，1#至7#菌株)分别接入50mL的种子培养基中，于28℃、170r/min摇床培养24h；然后加入3mL浓度为0.1g/L的木聚糖(桦木木聚糖，购自Sigma公司)诱导培养24h；取0.1mL培养物接种到100mL的产酶培养基中，于28℃、170r/min摇床培养24h后，分别测定每一株产木聚糖酶菌株培养物在600nm处的吸光度(OD600)，测定结果如图4和表2所示。其中，吸光度测定选用紫外可见分光光度计(LAMBDATM25Series UV/Vis Spectrophotometers,PerkinElmer,USA)进行测定。
表2实施例2中不同初筛菌株的24h培养物的吸光度
菌株编号 1# 2# 3# 4# 5# 6# 7#
OD600 0.233 0.155 0.193 0.188 0.151 0.112 0.112
由图4和表2可知，实施例1中筛选的7株菌株中，生长情况及酶活力最高的为1#菌株，命名为蛾微杆菌YD01。
(3)木聚糖酶制备：将上述步骤(2)得到的1#菌株涂布于无机盐培养基平板上培养(28℃培养5d)，随机挑选3个单菌落(1#-a、1#-b和1#-c)分别接种于50mL的种子培养基中，于28℃、170r/min摇床培养24h，然后加入3mL的浓度为0.1g/L的木聚糖(桦木木聚糖，购自Sigma公司)诱导培养24h后，取1mL菌液接种至200mL的产酶培养基中，于28℃、170r/min培养48h后，将发酵液于6000r/min条件下离心10min，取上清粗酶液(即为木聚糖酶产物)，测试粗酶液中的酶活力，结果如图5和表3所示。其中，酶活力的测试选用DNS定糖法，具体方法如下：
实验组：取0.5mL稀释粗酶液入试管，加入1.0mL浓度为5mg/mL的木聚糖溶液(桦木木聚糖，购自Sigma公司)，摇匀，于50℃水浴反应30min，加入2.5mL DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸，分析纯，购自中国医药集团上海化学试剂公司)摇匀后沸水浴加热10min，待冷却至室温后加入8.5mL蒸馏水定容到12.5mL，摇匀，测定540nm处吸光度。每组三重复，取其平均值。
空白对照组：预先将酶加热失活处理，其余步骤同实验组。
将每分钟生成1μmol还原糖(以木糖计)所需酶量定义为1个酶活力单位(U)，酶活计算公式为：E＝D*(A+I)/S*1000/W木/t。
式中，E为样品酶活力，D为稀释倍数(200)，A为酶液反应的OD值，S为标准曲线的斜率，I为标准曲线的截距，W木为木糖的分子量(150.13)，t为反应时间；其中，还原糖(木糖)标准曲线方程为：y＝1.7100x-0.1115，R2＝0.9949。
表3实施例2中1#菌株的不同单菌落的酶活力
菌落编号 1#-a 1#-b 1#-c
酶活力(U/mL) 29.21 36.85 25.32
由图5和表3可知，将蛾微杆菌YD01进行无机盐平板涂布培养后，随机挑3个单菌落，扩大培养后测酶活力，酶活力最高可达36.85U/mL。
实施例3菌株鉴定
(1)菌种培养基形态特征鉴定
将实施例2获得的蛾微杆菌YD01菌液划线于LB培养基平板，于28℃培养24h，观察菌落形状、大小、颜色、水溶性色素等特征，进行革兰氏染色。其中，LB培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L以及琼脂粉20g/L；调节pH值为7。
观察结果如图1和图2所示，蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01的菌落呈杆状较湿润、较光滑、较粘稠、易挑起、质地均匀、菌落正反面及中央部位的颜色一致，在无机盐平板上形成均匀、水解圈较大且透明的单菌落；以革兰氏阳性枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌为对照，对YD01进行革兰氏染色，结果为紫色，表明YD01为G+菌。
(2)菌落PCR扩增及16s rRNA测序
将实施例2获得的蛾微杆菌YD01菌液划线于无机盐平板，于28℃培养24h，经煮沸法提取基因组RNA。采用细菌通用引物27F(正向引物27F，5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，购自武汉生工生物工程有限公司)和1492R(反向引物1492R，5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，购自武汉生工生物工程有限公司)PCR扩增16S rRNA。
其中，扩增仪为Power Cycler Gradient SL扩增仪，购自德国耶拿分析仪器股份有限公司。
PCR扩增体系(50uL)包括ddH2O(三蒸水)37.7μL，10×PCR缓冲液(由浓度分别为500mM的KCl、100mM的Tris-HCl(pH为8.3)以及15mM的MgCl2组成)5μL，引物P1(27F)、P2(1492R)各1μL，10mM的dNTP Mix(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的预混溶液，其中每种成分的浓度均为10mM)1μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，模板4μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。
扩增产物送交生工武汉测序部测序。测序结果提交GenBank(Accession Number：MF443454)，进行BLAST比对分析，蛾微杆菌YD01的16S rRNA基因序列如图3所示。
由图3可知，蛾微杆菌YD01的16S rRNA基因序列长度约1433bp；由BLAST比对分析显示YD01菌和微杆菌属其他种的菌株之间具有较高的一致性，具有同源性。结合菌落形态、颜色及革兰氏染色结果确定菌属，该菌为微杆菌属Microbacterium。
(3)生理生化鉴定分析
糖、醇类发酵实验，H2S实验，细菌运动性观察实验，V-P实验，加热存活试验，均参照《微生物学实验技术》进行，试验结果如表1所示。根据表1中的试验结果，并参照微杆菌属不同种的特征确定YD01菌种。
实施例4木聚糖酶最适pH、最适温度测试
(1)分别配制pH为6.0、7.0、8.0、9.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液和pH为10.0的甘氨酸-NaOH缓冲液，将实施例2中获得的粗酶液加到相应pH值的缓冲液中，然后按照实施例2中提供的DNS定糖法测定50℃条件下的酶活力，测试结果如图6和表4所示。
表4实施例4中木聚糖酶的最适pH
pH值 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
酶活力(U/mL) 24.37 27.13 33.42 29.84 29.21
由图6和表4可知，由实施例2制备的木聚糖酶的最适作用pH为8.0。
(2)将实施例2获得的粗酶液分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下，并按照按照实施例2中提供的DNS定糖法测定pH为8.0条件下的酶活力，测试结果如图7和表5所示。
表5实施例4中木聚糖酶的最适温度
温度(℃) 40 50 60 70 80
酶活力(U/mL) 24.10 34.20 30.15 29.84 29.06
由图7和表5可知，有实施例2制备的木聚糖酶的最适作用温度为50℃。实施例5木聚糖酶pH稳定性与温度稳定性测试
(1)将实施例2中获得的粗酶液分别加入实施例4中步骤(1)所述的pH分别为6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的缓冲液中，保持1h后，按照实施例2中提供的DNS定糖法测定50℃条件下的酶活力，以其最适作用温度(50℃)对应的酶活力为100％，计算相对酶活力，结果如图8和表6所示。
表6实施例5中不同pH条件下的木聚糖酶的相对酶活力
pH值 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
相对酶活力(％) 48.43 45.16 80.83 51.58 41.44
由图8和表6可知，不同pH保持1h后的木聚糖酶在最适作用pH为8.0时，有80.83％的相对酶活力，在pH为10时，仍有41.44％的相对酶活力。
(2)将实施例2中获得的粗酶液分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下保温1h后，按照按照实施例2中提供的DNS定糖法测定pH为8.0条件下的酶活力，以其最适作用pH对应(pH为8.0)的酶活力为100％，计算相对酶活力，结果如图9和表7所示。
表7实施例5中不同温度条件下的木聚糖酶的相对酶活力
温度(℃) 40 50 60 70 80
相对酶活力(％) 41.29 62.33 53.80 57.50 56.82
由图9和表7可知，保温1h后的木聚糖酶在最适作用温度50℃时，有62.33％的相对酶活力，在温度为80℃时，仍有56.82％的相对酶活力。
由以上木聚糖酶pH稳定性和温度稳定性测试结果表明，本发明实施例提供的蛾微杆菌YD01所产的木聚糖酶具备较好的耐碱性，并且在温度为40～80℃的范围内酶活保持相对稳定，表现出较好的耐高温能力。
综上所述，本发明提供的碱性木聚糖酶的高产菌株，经菌株鉴定为蛾微杆菌YD01，将此蛾微杆菌YD01通过发酵培养后获得的木聚糖酶，具有最适pH为8.0、最适温度为50℃的特性，并且在pH为10.0、温度为50℃的缓冲液中保持1h后的木聚糖酶仍有41.44％的相对酶活力；在温度为80℃、pH为8.0的缓冲液中保温1h后的木聚糖酶仍有56.82％的相对酶活力，具有良好的碱耐受性及热稳定性，所述碱性木聚糖酶的高产菌株的最终发酵产酶水平为36.85U/mL。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种碱性木聚糖酶的高产菌株，其特征在于，所述碱性木聚糖酶的高产菌株为蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)YD01，其保藏编号为CCTCC M 2017762。
2.一种如权利要求1所述的碱性木聚糖酶的高产菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
将活性污泥接入液体无机盐培养基中，于28℃、170r/min摇床培养7d后，将培养物接入液体无机盐培养基中进行5～6次传代培养；
将经过传代培养的培养物稀释成稀释菌液，取稀释菌液涂布至无机盐培养基平板，于28℃条件下培养5d；
挑取无机盐培养基平板上透明圈较大的单菌落，经过分离、纯化后，获得筛选菌株；
将筛选菌株接入种子培养基中，于28℃、170r/min摇床培养24h后，加入0.1g/L的木聚糖诱导培养24h，并将培养物接入产酶培养基中，于28℃、170r/min摇床培养48h，用DNS方法测定木聚糖的产量，筛选高活性菌株，即为碱性木聚糖酶的高产菌株。
3.如权利要求2所述的碱性木聚糖酶的高产菌株的筛选方法，其特征在于，所述液体无机盐培养基包括以下浓度的组分：木聚糖1g/L、硝酸钾1g/L、氯化钠0.2g/L、磷酸氢二钾0.5g/L和硫酸铵0.3g/L；所述液体无机盐培养基的pH值为8.5。
4.如权利要求3所述的碱性木聚糖酶的高产菌株的筛选方法，其特征在于，所述无机盐培养基为向所述液体无机盐培养基中加入质量分数为2％的琼脂粉所得的培养基。
5.如权利要求2所述的碱性木聚糖酶的高产菌株的筛选方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L和氯化钠5g/L；所述种子培养基的pH值为8.5。
6.如权利要求2所述的碱性木聚糖酶的高产菌株的筛选方法，其特征在于，所述产酶培养基包括以下组分：葡萄糖1.5g/L、酵母粉4g/L、硫酸镁1g/mL、氯化钠0.5g/mL、磷酸氢二钾1g/mL、氯化钙15g/mL，木聚糖0.01g/L以及玉米浆15mL；所述产酶培养基的pH值为8.0。
7.一种木聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将如权利要求1所述的碱性木聚糖酶的高产菌株接入种子培养基中，于28℃、170r/min摇床培养24h后，加入0.1g/L的木聚糖溶液诱导培养24h，并将培养物接入产酶培养基中，于28℃、170r/min培养48h后，取发酵液进行分离、纯化，获得木聚糖酶。
8.如权利要求7所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L和氯化钠5g/L；所述种子培养基的pH值为8.5。
9.如权利要求7所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述产酶培养基包括以下组分：葡萄糖1.5g/L、酵母粉4g/L、硫酸镁1g/mL、氯化钠0.5g/mL、磷酸氢二钾1g/mL、氯化钙15g/mL，木聚糖0.01g/L以及玉米浆15mL；所述产酶培养基的pH值为8.0。
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