CN105531364A - 从细杆菌属hy-17菌株生产的新的耐碱性糖苷水解酶第10家族木聚糖酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从细杆菌属(Micobacterium？sp.)HY-17菌株分离的属于糖苷水解酶第10家族(glycoside？hydrolase？family？10,GH10)的新的具有耐碱性质的木聚糖酶，具体而言，所述木聚糖酶是在碱性环境下具有稳定性、对多样的木聚糖有效进行加水分解、对β葡聚糖进行加水分解、对纤维二糖进行分解的新的酶。因此，本发明的木聚糖酶可以用作食品产业用酶、饲料用酶、生物量预处理酶、木浆工序用等在多样的产业群中有用的酶。

Description

从细杆菌属HY-17菌株生产的新的耐碱性糖苷水解酶第10家族木聚糖酶
技术领域
本发明涉及一种从细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17菌株分离的属于糖苷水解酶第10家族(glycosidehydrolasefamily10,GH10)的新的具有耐碱性质的木聚糖酶。
背景技术
为了把多样的碳源用作原料而进行着大量研究。这种原料中包含的淀粉系(Starch)多糖(polysaccharides)容易加水分解，主要在食品产业利用。因此，为了在多样的产业群中把碳源用作原料，非淀粉系多糖(Nonstarchpolysaccharides)的必要性正在抬头。
木聚糖(Xylan)作为非淀粉系多糖，存在于木质、植物以及谷物副产物中。非淀粉系多糖可以分为纤维素(cellulose)和半纤维素(hemicellulose)，半纤维素的重要成分为木聚糖(xylan)。木聚糖酶是把这种木聚糖(xylan)加水分解成木糖、木二糖等的酶。
木聚糖酶在食品产业中能够用于改善高粘度多糖体(highviscouspolysaccharide)的物性和色度，并且在低聚木糖制造工序中使用。另外，使饲料的加水分解效率增大，通过改善动物的肠内流动性与增大消化效率，能够把多样的谷物或谷物副产物用作饲料原料。
最近，在工业用酶相关部分，以绿色技术为基础，正在逐渐从化学(chemical)使用环境向生物学(biological)使用环境变化。工业用木聚糖酶在从木浆(pulp)中去除了半纤维素的木质素-多糖复合体(ligninpolysaccharidecomplex)的漂白(bleaching)工序中使用。就木浆的漂白工序而言，为有效去除木质素，传统上利用有机溶剂，但这种工序对环境有害。另外，在生物能源产业中，从利用甘蔗或玉米的第一代生物能源，到利用诸如非木质或木质的难分解性半纤维素的第二代生物能源，必不可少的木聚糖酶的利用价值正在增大。因此，可以利用木聚糖酶，开发有效的环保工序。
木聚糖(xylan)作为植物系生物量的主要成分，可以利用木聚糖酶(xylanase)将其加水分解。对以β-1,4-木糖结构结合的木聚糖进行加水分解的糖苷水解酶(glycosidehydrolasefamily,GHfamily)已知有5、8、10、11、30以及43共6种(http://www.cazy.org,Luo等人,2010)。其中，木聚糖酶的代表性家族为糖苷水解酶(GHfamily)第10和11家族。
与碳水化合物聚合物(carbohydratepolymer)的解聚(depolymerization)相关的β-1,4-木聚糖酶(β-1,4-xylanase)，为了根据各个产业性利用价值而利用，生物化学特性极为重要。特别是酶的使用量根据工序中的pH而增减，因而在多样的pH区域需要稳定的酶。
因此，本发明人确认了细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17菌株来源的属于糖苷水解酶-10(GH-10domain)的耐碱性的新内切-β-1,4-木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase)，分析了其基因序列和氨基酸序列。另外，分析了关于所述木聚糖酶基质的特性及温度和关于pH的特性，确认了在工业上有用，从而完成了本发明。
发明内容
(要解决的技术问题)
本发明的目的是提供一种生产木聚糖酶的细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17菌株(KCTC12338BP)。
本发明的又一目的是提供一种从所述菌株生产的具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶(xylanase)。
本发明的又一目的是提供一种木聚糖酶生产方法，包括：
步骤i)，把包含了具有记载为对所述木聚糖酶进行编码的序列号8的碱基序列的多核苷酸的重组表达载体导入宿主细胞，培养转化株后，进行离心分离而收得粗酶液；及
步骤ii)，在所述步骤i)收得的粗酶液中，对木聚糖酶进行精制。
本发明的又一目的是提供一种包含木聚糖酶作为有效成分的饲料添加剂。
本发明的又一目的是提供一种包含木聚糖酶作为有效成分的食品添加剂。
本发明的又一目的是提供一种包含木聚糖酶作为有效成分的造纸工序用组合物。
本发明的又一目的是提供一种生产木聚糖酶的细杆菌属HY-17菌株(KCTC12338BP)的用途。
本发明的又一目的是提供一种从细杆菌属HY-17菌株(KCTC12338BP)生产的具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶(xylanase)的用途。
本发明的又一目的是提供一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作饲料添加剂的有效成分的用途。
本发明的又一目的是提供一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作食品添加剂的有效成分的用途。
本发明的又一目的是提供一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作造纸工序用组合物的用途。
(解决问题的手段)
为了解决所述课题，本发明提供一种生产木聚糖酶的细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17菌株(KCTC12338BP)。
另外，本发明提供一种从所述菌株生产的具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶(xylanase)。
优选所述木聚糖酶具有记载为序列号8的碱基序列，但不限定于此。
另外，本发明提供一种木聚糖酶生产方法，包括：
步骤i)，把包含了具有记载为对所述木聚糖酶进行编码的序列号8的碱基序列的多核苷酸的重组表达载体导入宿主细胞，培养转化株后，进行离心分离而收得粗酶液；及
步骤ii)，在所述步骤i)收得的粗酶液中，对木聚糖酶进行精制。
另外，本发明提供一种包含木聚糖酶作为有效成分的饲料添加剂。
另外，本发明提供一种包含木聚糖酶作为有效成分的食品添加剂。
另外，本发明提供一种包含木聚糖酶作为有效成分的造纸工序用组合物。
另外，本发明提供一种生产木聚糖酶的细杆菌属HY-17菌株(KCTC12338BP)的用途。
另外，本发明提供一种从细杆菌属HY-17菌株(KCTC12338BP)生产的具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶(xylanase)的用途。
另外，本发明提供一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作饲料添加剂的有效成分的用途。
另外，本发明提供一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作食品添加剂的有效成分的用途。
另外，本发明提供一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作造纸工序用组合物的用途。
(发明的效果)
本发明作为与从细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17菌株分离的属于糖苷水解酶第10家族(glycosidehydrolasefamily10,GH10)的酶具有同源性的新的木聚糖酶，具体而言，所述木聚糖酶是在碱性环境下具有稳定性、对多样的木聚糖有效进行加水分解、对β葡聚糖进行加水分解、对纤维二糖进行分解的新的酶。因此，本发明的木聚糖酶可以用作食品产业用酶、饲料用酶、生物量预处理酶、木浆工序用等在多样的产业群中有用的酶。
附图说明
图1是显示本发明中分离的新木聚糖酶(XylH)的基因序列的图。
图2是显示本发明中分离的新木聚糖酶(XylH)的氨基酸序列的图。
图3是为了调查本发明的木聚糖酶(XylH)的最佳反应条件而以桦木木聚糖(birchwoodxylan)为基质，显示对反应pH与温度的影响的图。
具体实施方式
下面详细说明本发明。
本发明提供一种生产木聚糖酶的细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17(Micobacteriumsp.HY-17)菌株(KCTC12338BP)。
另外，本发明提供一种从所述菌株生产的具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶(xylanase)。
另外，本发明提供一种生产木聚糖酶的细杆菌属HY-17菌株(KCTC12338BP)的用途。
另外，本发明提供一种从细杆菌属HY-17菌株(KCTC12338BP)生产的具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶(xylanase)的用途。
优选所述木聚糖酶具有记载为序列号8的碱基序列，但不限定于此。
优选所述木聚糖酶为42kda的分子量，但不限定于此。
优选所述木聚糖酶在pH5.5至pH10.0表现出最大活性，但不限定于此。
优选所述木聚糖酶在60℃表现出最大活性，但不限定于此。
优选所述木聚糖酶表现出内切-β-1,4-木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase)活性，但不限定于此。
优选所述木聚糖酶为糖苷水解酶-10结构域(glycosidehydrolase-10domain,GH-10domain)，但不限定于此。
在本发明的具体实施例中，本发明人在细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17菌株(保藏号:KCTC12338BP)的基因组DNA中，利用以GH10(glycosidehydrolasefamily10)系列的木聚糖酶的基因序列为基础制作的引物，扩增对木聚糖酶蛋白质进行编码的多核苷酸序列并进行克隆(GenBankaccessionnumber:KF233593)后，分析基因序列，在NCBI数据库中，利用蛋白质blast调查(Proteinblastsurvey)，分析氨基酸序列的结果，确认了木聚糖酶(XylH)为属于GH10的活性结构域。另外，在基因序列分析中，确认了由1167bp的ORF(openreadingframe，开放阅读框架)或388个氨基酸构成，确认了分子量为41,584Da、pI4.84。在SignalP3.0数据库中调查分泌信号区域的结果，确认了木聚糖酶最终由358个氨基酸构成，确认了分子量为38,632Da、pI4.67(参照图1及图2)。
另外，为了确认木聚糖酶的最佳反应条件，以桦木木聚糖(birchwoodxylan)为基质，确认对反应pH和温度的影响的结果，确认了所述木聚糖酶(XylH)在pH9.0,60℃下显示出最高活性，在pH5.5～10.0范围内，在1小时期间75％以上的活性。另外，确认了在pH4.5～11范围内保持50％以上的活性，在反应温度方面，在37～50℃下，在1小时期间保持90％以上的残存活性(参照图3)。
另外，利用DNS定量法确认木聚糖酶对多样的木聚糖及糖基质的分解能的结果，确认了评价的木聚糖物质中，燕麦木聚糖被木聚糖酶最有效地加水分解，山毛榉木聚糖、桦木木聚糖依次表现出加水分解活性。另外，确认了对大麦来源的葡聚糖(β-1,3/β-1,4-d-glucanfrombarley)、PNP-纤维二糖甙(PNP-cellobioside)、PNP-吡喃木糖苷(PNP-xylopyranoside)表现出高活性(参照表1)。
另外，利用高效液相色谱(Hihgperformanceliquidchromatography,HPLC)分析法确认木聚糖分解产物的特性的结果，确认了对桦木木聚糖的加水分解产物表现为X2(71.2％(w/v))和X3(28.8％(w/v))。另外，确认了所述木聚糖酶具有转糖基作用(transxylosylation)活性(参照表2)。
因此，本发明从细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17(Micobacteriumsp.HY-17)菌株(KCTC12338BP)确认了属于糖苷水解酶-10(GH-10domain)的耐碱性的新的内切-β-1,4-木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase)，进行了其基因序列与氨基酸序列分析，分析了关于所述木聚糖酶基质的特性及温度和关于pH的特性，从而确保了可以把所述木聚糖酶有用地用于多样的产业群。
另外，本发明提供一种木聚糖酶生产方法，包括：
步骤i)，把包含了具有记载为对权利要求2的木聚糖酶进行编码的序列号8的碱基序列的多核苷酸的重组表达载体导入宿主细胞，培养转化株后，进行离心分离而收得粗酶液；及
步骤ii)，在所述步骤i)收得的粗酶液中，对木聚糖酶进行精制。
优选所述宿主细胞是在由包括大肠杆菌在内的原核细胞、包括酵母、动物细胞及昆虫细胞在内的真核细胞构成的组中选择的某一种，但不限定于此。
本发明确认了对从细杆菌属HY-17菌株分离的新木聚糖酶进行编码的新基因的碱基序列，因而如果利用所属技术领域公知的通常方法，则可以制作包含所述基因的重组载体。本发明的重组载体可以利用商用化的载体，但并非限定于此，所属领域的技术人员制造适合的重组载体并利用也无妨。
在所述方法中，优选所述步骤ii)以包括如下a)至c)步骤的方法执行，但不限定于此：
a)在对所述转化株的培养液进行离心分离而收得的上层液中加入沉淀剂，诱导水溶性蛋白质沉淀的步骤；
b)从所述步骤a)的沉淀物中去除不溶性沉淀物后，进行透析而收得粗酶液的步骤；及
c)用柱色谱法对所述步骤b)的粗酶液进行精制的步骤。
在所述方法中，优选培养基在所属领域的技术人员公知的常用培养基中选拔适合本发明的细杆菌属HY-17菌株或本发明的转化株的培养基加以使用。
在所述方法中，作为步骤a)的沉淀剂，可以使用在由硫酸铵、丙酮、异丙醇、甲醇、乙醇、聚乙二醇构成的组中选择的某一种。所述沉淀可以以利用了具有多样孔径大小(poresize)的膜的超滤法替代进行浓缩。
在所述方法中，步骤c)的柱色谱法可以利用选自由硅胶、葡聚糖凝胶、RP-18、聚酰胺、Toyopearl及XAD树脂构成的组的填充剂，执行柱色谱法并进行精制。柱色谱法可以根据需要而选择适宜的填充剂实施多次。
另外，本发明提供一种包含木聚糖酶作为有效成分的饲料添加剂。
另外，本发明提供一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作饲料添加剂的有效成分的用途。
本发明的新木聚糖酶确认具有特异性，高效分解木聚糖，从而可以把所述木聚糖酶有效地用作饲料添加剂。
诸如猪或鸡的单胃动物(non-ruminant)的饲料没有能够分解植物细胞壁的酶，进入细胞壁内的谷物淀粉或蛋白质利用效率很低，本发明的饲料添加剂添加于诸如猪或鸡的单胃动物(non-ruminant)的饲料中，对作为细胞壁主要成分的木聚糖进行糖化，从而能够提高饲料的价值。
本发明的作为饲料添加剂有效成分的木聚糖酶，优选相对于将添加的饲料，按0.01至10重量份构成，更优选木聚糖酶按0.05至5重量份构成，最优选木聚糖酶按0.12重量份构成。
另外，所述饲料添加剂可以追加性地含有单胃动物允许的载体。在本发明中，可以直接添加所述饲料添加剂，或添加公知的载体、稳定剂等，也可以根据需要，添加维生素、氨基酸类、矿物质等各种养分、抗氧化剂及其它添加剂等，其形状可以为粉体、颗粒、丸、悬浮液等适当的状态。当供应本发明的饲料添加剂时，可以针对单胃动物而单独或混合于饲料中进行供应。
另外，本发明提供一种包含木聚糖酶作为有效成分的食品添加剂组合物。
另外，本发明提供一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作食品添加剂的有效成分的用途。
本发明的新木聚糖酶确认具有特异性，高效分解木聚糖，从而可以把所述木聚糖酶有用地用作食品添加剂组合物。
另外，本发明提供一种包含木聚糖酶作为有效成分的造纸工序用组合物。
另外，本发明提供一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作造纸工序用组合物的用途。
本发明的新木聚糖酶确认具有特异性，高效分解木聚糖，从而可以把所述木聚糖酶有用地用作造纸工序用组合物。
下面根据实施例，详细说明本发明。
不过，下述实施例只是具体地对本发明进行举例，本发明的内容并非限定于实施例。
<实施例1>生产木聚糖酶(Xylanase)的细杆菌属(Micobacteriumsp.)菌株的分离
本发明人从蝼蛄的肠内共生微生物中分离了具有使木聚糖加水分解的酶活性的微生物。
具体而言，为了选择性分离使木聚糖加水分解的微生物，把M9mineralsaltsagarmedium(Difco)用作基本培养基，使用了含有5g/Lyeastextract(Difco)和2g/Lazo-xylan(Megazyme)的选择培养基。在选择培养基中，把微生物悬浮液以系列稀释法(serialdilutionmethod)在生理食盐水中稀释后，在各个选择培养基中各喷注100μl，在25～35℃下培养18～36小时时间。在各个培养基中，对形成有因azo-xylan分解而出现的透明环的微生物群落(colony)进行了选择性分离。为了鉴定分离的微生物，以27F引物(序列号：1)和1492R引物(序列号：2)对，执行了对16SrDNA序列的PCR。通过PCR而确保的16SrDNA序列，利用ABIprismBigDyeTerminatorCylcle测序准备反应试剂盒和ABI3730x1DNAanalyzer(应用生物系统公司)进行了分析。最终确保的16SrDNA序列，在NCBI数据库的Blast程序和EzTaxon服务器的基因登记号(Genebank)中分析了基因序列。对分解木聚糖的菌株的16SrDNA序列进行分析的结果，鉴定为细杆菌属(Micobacteriumsp.)，命名为细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17，保藏于作为国际保藏机构的韩国生命工学研究院内基因银行(保藏号:KCTC12338BP)。
序列号1：5`-AGACTTTGATCMTGGCTCAG-3`；及
序列号2：5`-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3`。
<实施例2>木聚糖酶(Xylanase)的克隆
在分解木聚糖的细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17菌株(保藏号:KCTC12338BP)的基因组DNA中，利用以GH10(glycosidehydrolasefamily10)系列的木聚糖酶的基因序列为基础制作的引物，扩增并克隆了对木聚糖酶蛋白质进行编码的多核苷酸序列。
具体而言，从所述菌株分离基因组DNA后，以所述基因组DNA为模板，利用10×缓冲液(MgCl2)、2.5mMdNTPs、5×缓冲液、FastStartTaqDNA聚合酶(Roche)以及MF-10正向引物(序列号：3)与MR-10逆向引物(序列号：4)对，执行了对木聚糖酶基因的PCR。此时，PCR条件是在95℃下变性5分钟，在95℃下变性30钞钟，在50℃下退火30秒钟，在72℃下伸展40秒钟，以该条件反复35次后，在72℃下执行最后伸展7分钟。把通过所述PCR而收得的375bp的木聚糖酶的PCR产物，利用DNAWalkingSpeedUppremixkit(Seegene，韩国)执行基因组步移(Genomewalking)及巢式-PCR(nested-PCR)，收得对全体xy1K2基因的PCR产物。利用DNAWakling法而确保的全体序列，利用FMF引物(序列号：5)与RMF引物(序列号：6)对，在95℃下变性5分钟，在95℃下变性30秒钟，在50℃下退火30秒钟，在72℃伸展40秒钟，以该条件反复35次后，在72℃下执行最后伸展7分钟，以该条件执行PCRd而确保了xylH基因。
把所述全体XylH基因的PCR产物及pET-28a(+)载体(Novagen，美国)，用NdeI及HindIII限制酶分别截断后进行了精制。把所述精制的载体及PCR产物，各使用约100ng，添加TaKaRa公司的连接酶(ligase)1unit，在16℃下反应了16个小时。连接(ligation)反应后，在BL21(Novagen)中进行转化，在含有卡那霉素的平板中甄别后，用适当的限制酶截断，确保了盛装有所需DNA切片的质体，通过DNA测序(sequencing)，最终确认了克隆。然后，把所述制造的表达载体命名为“pET-XylH”。另外，所述的木聚糖酶基因序列在基因银行登记了其序列(GenBankaccessionnumber:KF233593)。
序列号3：5`-TGGGACGTCSTCAACGAG-3`；
序列号4：5`-GACGTCSGCCTCSGTGAC-3`；
序列号5：5`-CATATGGCGCCTCCCGGATTCAGC-3`；及
序列号6：5`-AAGCTTTCAGCCGCGTCGGGGC-3`。
<实施例3>木聚糖酶(Xylanase)的精制
对使所述<实施例2>中制造的pET-XylH表达载体在大肠杆菌中过表达的重组XylH(rXylH)进行了分离。
具体而言，把使各表达载体转化的大肠杆菌接种于液体LB培养基后，在37℃下摇晃并进行了培养。当各个大肠杆菌培养液的OD600值达到0.4至0.5时，添加1.0mM的IPTG后，在30℃下再摇晃并培养了5小时。对所述培养液进行离心分离，用声波粉碎机粉碎细胞后观察的结果，rXylH用包含20mM咪唑(imidazole)、0.5M氯化钠的20mM磷酸钠缓冲溶液(sodiumphosphatebufferpH7.4)使活性化包涵体(inclusionbodies)可溶化。把可溶化的rXylH细胞粉碎物利用HisTrapHP(GEHealthcare,瑞典)(5-ml)柱进行重折叠及精制后，执行了液体色谱分析(LC)系统(安发玛西亚生物技术公司，瑞典)。执行作为公知方法的利用了HiLoad26/60Superdex200prep-grade(安发玛西亚生命科学公司，瑞典)柱的凝胶透过色谱分析，确认了精制的rXylH蛋白质的电泳同质性。把所述精制的rXylH蛋白质，利用bradford试剂(Bio-Rad，美国)对蛋白质进行定量后，进行冻结干燥，保管于-20℃下。
<实施例4>木聚糖酶(Xylanase)的活性测量
为了测量木聚糖酶的活性，使用了DNS(Dinitrosalicylicacid，二硝基水杨酸)定量法(MillerGL,Anal.Chem.,55:952-959,1959)。
具体而言，在包含1％(w/v)山毛榉木聚糖(beechwoodxylan)的50mM甘氨酸氢氧化钠缓冲溶液(glycine-NaOHbufferpH9.0)中，放入按步骤稀释的100μl的酶溶液，在55℃下反应15分钟后，添加750μl的DNS(3,5-Dinitrosalicylicacid，3,5-二硝基水杨酸)溶液，在100℃下放置5分钟后，在吸光度540nm下进行了测量。酶的1单位(unit)是按在1分钟时间使1μmol还原糖放出的酶的量加以确定。
<实施例5>木聚糖酶(Xylanase)的特性分析
<5-1>序列分析
本发明人在NCBI数据库中，利用蛋白质blast调查(Proteinblastsurvey)，分析了氨基酸序列。
其结果如图1及图2所示，确认了本发明的木聚糖酶(XylH)是属于GH10的活性结构域。另外，在基因序列分析中，确认了由1167bp的ORF(openreadingframe)或388个氨基酸构成，确认了分子量为41,584Da、pI4.84。在SignalP3.0数据库中调查分泌信号区域的结果，确认了木聚糖酶最终由358个氨基酸构成，确认了分子量为38,632Da、pI4.67(图1及图2)。
<5-2>木聚糖酶的生物化学特性
为了确认本发明的木聚糖酶(XylH)的最佳反应条件，以桦木木聚糖(birchwoodxylan)为基质，确认对反应pH和温度的影响。
具体而言，酶活性最佳pH使用50mM柠檬酸钠缓冲溶液(sodiumcitratebuffer)(pH3.5-5.5)、50mM磷酸钠缓冲溶液(sodiumphosphatebuffer)(pH5.5-7.5)、50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(Tris-HClbuffer)(pH7.5-9.0)及50mM甘氨酸氢氧化钠缓冲溶液(glycine-NaOHbuffer)(pH9.0-10.5)，在55℃下反应15个小时并进行了测量。
另外，为了确认酶对pH的稳定性，在按各个pH调配的缓冲溶液中，在4℃下放置1小时时间后，在<实施例4>的条件下测量了酶活性，酶的最佳反应温度在30～70℃范围内按5℃间隔测量了酶活性，对温度的稳定性是按各个温度(37、45、50、55、60℃)，反应15、30、60分钟时间，并测量了残存活性。
其结果如图3所示，本发明的木聚糖酶(XylH)在pH9.0、60℃下显示出最高活性，在pH5.5～10.0范围内，在1小时时间显示出75％以上的活性。另外，确认了在pH4.5～11范围内，保持50％以上的活性，在反应温度方面，确认了在37～50℃下，在1小时期间保持90％以上的残存活性(图3)。
<5-3>木聚糖酶的基质特异性
利用所述<实施例4>的DNS定量法，确认了本发明的木聚糖酶(XylH)对多样的木聚糖及糖基质的分解能。利用山毛榉木聚糖(beechwoodxylan)、桦木木聚糖(birchwoodxylan)、燕麦木聚糖(oatspeltxylan)等多样的1％(w/v)木糖聚合物)和淀粉(starch)、果胶(pectin)、葡聚糖(glucan)等的1％(w/v)聚合物，以及5mMPNP(p-nitrophenyl)糖衍生物等，确认了基质特异性。把含有包括各个基质的在50mM甘氨酸氢氧化钠缓冲溶液(glycine-NaOHbufferpH9.0)中稀释的酶溶液(0.05ml)的标准分析混合物(0.5ml)，在45℃下执行10分钟时间酶反应并进行了比较。对木聚糖或PNP-糖衍生物的木聚糖酶活性1单位(unit)，定义为在标准分析条件下，1分钟生产1μmol的还原糖或PNP所需的酶的量。
其结果如表1所示，在评价的木聚糖物质中，燕麦木聚糖被木聚糖酶(XylH)最有效地加水分解，山毛榉木聚糖、桦木木聚糖依次表现出加水分解活性。另外，确认了对大麦来源的葡聚糖(β-1,3/β-1,4-d-glucanfrombarley)、PNP-纤维二糖甙(PNP-cellobioside)、PNP-吡喃木糖苷(PNP-xylopyranoside)表现出高活性(表1)。
【表1】
<5-4>木聚糖分解产物的特性
以与所述<实施例4>相同的方法，以桦木木聚糖(birchwoodxylan,BX)、木二糖(xylobiose,X2)、木三糖(xylotriose,X3)、木四糖(xylotetraose,X4)以及木五糖(xylopentose,X5)为基质，把反应混合物在100℃下加热5分钟，使酶反应停止后，把加水分解产物在溶出溶液A(0.05％泡沫酸/灭菌水)溶出溶液B(0.05％泡沫酸/灭菌水：乙腈/甲醇＝6:4)的流动相的条件下，执行利用了AsahipakNH2P-502D柱(5μm,2.0×150mm,Shodex)的高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)分析法，并进行了测量(KimDY等人,2011)。
其结果如表2所示，确认了对桦木木聚糖的加水分解产物表现为X2(71.2％(w/v))和X3(28.8％(w/v))。在对木二糖、木三糖等的低聚木糖(xylooligosaccharides)的加水分解活性中，对木三糖(xylotriose)的加水分解产物分别为X2(45.8％(w/v))、X3(38.9％(w/v))、X4(12.3％(w/v))及X5(3.1％(w/v))，对木四糖(xylotetraose)的加水分解产物分别为X2(34.1％(w/v)、X3(38.3％(w/v)、X4(22.7％(w/v))及X5(5.0％(w/v))，对木五糖(xylopentose)的加水分解产物分别为X2(25.9％(w/v))、X3(35.9％(w/v))、X4(23.4(w/v))、X5(12.1％(w/v))及X6(2.8％(w/v))。这种结果确认了所述木聚糖酶具有转糖基作用(transxylosylation)活性(表2)。
【表2】
【产业实用性】
本发明的与从细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17菌株分离的GH10(glycosidehydrolasefamily10)系列的酶具有同源性的新的耐碱性木聚糖酶，可以有用地应用于诸如物性改良与低聚糖生产工序等的食品产业、用于饲料用谷物利用的饲料产业、用于替代化学工序的木浆和生物能源用原料预处理工序所需的预处理工序等多种工序。因此，通过利用酶的工序，能够开发更环保的工序，通过改良消化效率而提高家畜健康，提高各种谷物或副产物的附加价值。
委托机关名：韩国生命工学硏究院
受托号码:KCTC12338BP
受托日期:20121217
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
国际表格
在根据细则第7.1条发出的原始保藏的情况下的接收
致：
大韩民国
大田市儒城区学院路125号302-806
韩国生命工学研究院
朴镐用

Claims (18)

1.一种生产木聚糖酶的细杆菌属(Micobacteriumsp.)HY-17(Micobacteriumsp.HY-17)菌株(KCTC12338BP)。
2.一种从权利要求1的菌株生产的具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶(xylanase)。
3.根据权利要求2所述的木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶为42kda的分子量。
4.根据权利要求2所述的木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶在pH5.5至pH10.0表现出最大活性。
5.根据权利要求2所述的木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶在60℃表现出最大活性。
6.根据权利要求2所述的木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶表现出内切-β-1,4-木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase)活性。
7.根据权利要求2所述的木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶为糖苷水解酶-10结构域(glycosidehydrolase-10domain,GH-10domain)。
8.一种木聚糖酶生产方法，包括：
步骤i)，把包含了具有记载为对权利要求2的木聚糖酶进行编码的序列号8的碱基序列的多核苷酸的重组表达载体，导入宿主细胞，培养转化株后，进行离心分离而收得粗酶液；及
步骤ii)，在所述步骤i)收得的粗酶液中，对木聚糖酶进行精制。
9.根据权利要求8所述的木聚糖酶生产方法，其特征在于，所述步骤i)的宿主细胞是在由包括大肠杆菌在内的原核细胞、酵母、动物细胞及昆虫细胞构成的组中选择的某一种。
10.根据权利要求8所述的木聚糖酶生产方法，其特征在于，所述步骤ii)以包括如下a)至c)的步骤的方法执行：
a)在对权利要求8的转化株的培养液进行离心分离而收得的上层液中加入沉淀剂，诱导水溶性蛋白质沉淀的步骤；
b)从所述步骤a)的沉淀物中去除不溶性沉淀物后进行透析而收得粗酶液的步骤；及
c)用柱色谱法对所述步骤b)的粗酶液进行精制的步骤。
11.一种包含权利要求2的木聚糖酶作为有效成分的饲料添加剂。
12.一种包含权利要求2的木聚糖酶作为有效成分的食品添加剂。
13.一种包含权利要求2的木聚糖酶作为有效成分的造纸工序用组合物。
14.一种生产木聚糖酶的细杆菌属HY-17菌株(KCTC12338BP)的用途。
15.一种从细杆菌属HY-17菌株(KCTC12338BP)生产的具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶(xylanase)的用途。
16.一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作饲料添加剂的有效成分的用途。
17.一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作食品添加剂的有效成分的用途。
18.一种用于把具有记载为序列号7的氨基酸序列的木聚糖酶用作造纸工序用组合物的用途。
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