CN108865945B - 耐除草剂2,4-d桂林类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

耐除草剂2,4-d桂林类芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次发现Paenibacillus类芽孢杆菌属的菌株具有抗2,4‑D作用。从广西桂林地区长期喷施除草剂2,4‑D的农田土壤中分离培养出一个新的菌株，实验证实具有耐除草剂2,4‑D功能。经鉴定确认该菌属于类芽孢杆菌属，被命名为桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1‑7)。

Description

耐除草剂2,4-D桂林类芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种新的桂林类芽孢杆菌(Paenibacillusguilinensis H1-7)。本发明还涉及该菌作为2,4-D污染环境修复的功能菌株方面的应用。
背景技术
除草剂是农田杂草防除的最主要手段，特别是长残留除草剂,由于其除草效果好、用 量少、成本低，因此在田间广泛大量使用。长残留除草剂残留药害问题已经成为农产品安 全生产以及农业可持续发展的重要障碍。
近几年，随着除草剂的大量施用，为农民提供便利的同时也伴随着抗性杂草的出现。 目前，抗性杂草的大量出现成为了备受全球关注的问题。且大量的反复使用同种除草剂， 也会导致杂草群落发生变化，耐受能力或者具有抗性的杂草增多，使得药效降低、用药量 增加成本提高，更加重了环境污染程度，对农业生产的安全问题造成了威胁。目前，采用的方法是交替使用不同种类型的除草剂。如：2,4-D等。
2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是一种人工合成的激素类的植物生长调节剂，广泛应用于多 种作物中，如水稻、小麦、高粱、甜蔗和玉米中来进行阔叶杂草的防除。2,4-D除草剂使 用已超过60年，也有部分研究表明出现耐受2,4-D的杂草，但它仍是世界上使用最广泛的除草剂种类之一。
但是除草剂2,4-D因其骨架结构为苯氧羧酸，在土壤中残效期较长，对作物影响较大， 因此筛选优良2,4-D耐受性的菌株对土壤环境修复以及克隆新的抗2,4-D基因意义重大， 可为转基因抗2,4-D作物提供新的基因资源。同时，通过对其抗2,4-D机理的研究，进一步加深人们对于2,4-D耐受性产生机理的认识，构建新的转基因生物，使其获得其它优良性状。
目前，已报道的具有2,4-D耐受性菌株有贪铜菌属(Cupriavidus)、代尔夫特菌属(Delftia) 等，还未见报道Paenibacillus类芽孢杆菌属的菌株具有抗2,4-D作用。
发明内容
本发明的目的是发现并分离出具有耐2,4-D功能的新种微生物。
本发明人从广西桂林地区长期喷施除草剂2,4-D的农田土壤中分离培养出一个新的菌 株。经鉴定确认该菌属于类芽孢杆菌属，被命名为桂林类芽孢杆菌(Paenibacillusguilinensis H1-7)【gui.lin.en’sis.N.L.masc.adj.】。
该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日 期为2018年2月8日，保藏编号为GDMCC NO.60328。
本发明发现该菌具有耐除草剂2,4-D功能。
本发明的耐除草剂2,4-D桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)具有下述特 征(以下为委托广东省微生物菌种保藏中心进行鉴定的结论)：
1.形态特征
在电子显微镜下可见，为杆状细菌(图1)。
形态学及生理生化鉴定委托广东省微生物菌种保藏中心鉴定。其中革兰氏染色鉴定方 法参照标准试剂盒说明书，经鉴定桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensisH1-7)属于 杆状的革兰氏阳性菌，可以形成芽孢(图1)，扫描电镜图片如图2所示。
2.在各种培养基上的特征
在TGY琼脂培养基上进行培养，培养温度为37℃，培养时间为12-18h，采用分区平板划线法活化菌株并得到单菌落，以观察菌落形态。菌落呈现柠檬黄色、凸起状，表面湿润，边缘整齐，无胞外分泌物(图3)。
在LB培养基上生长缓慢。
3.生理生化特征
该菌株为好氧生长，革兰氏阳性，氧化酶阳性，过氧化氢酶阳性，水解酪蛋白阳性，水解淀粉阴性。
4.碳源利用
能够以D-麦芽糖、蔗糖、D-果糖等为碳源，但不能以阿拉伯糖、D-甘露醇、甘油等为碳源。
5.其它性质
最适生长温度为37℃。细胞壁脂肪酸含有C15:0anteiso和C 16:0，其中以C 16:0为主。
6.培养条件
1)培养基：采用TGY琼脂培养基，具体配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖1g/L。
2)pH 7.0；
3)培养温度：37℃。
7.与同属菌的16S rDNA对比
与Paenibacillus vulneris CCUG 53270的相似度为97.83％；
与Paenibacillus yunnanensis YN2的相似度为96.85％；
与Paenibacillus konkukensis SK-3146的相似度为96.42％；
与Paenibacillus rigui JCM 16352的相似度为96.08％；
与Paenibacillus validu JCM 9077的相似度为95.16％；
与Paenibacillus aestuarii CJ25的相似度为94.89％等等。
桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)的16S rDNA序列长度为1532bp， 其序列如SEQ ID NO:1所示，将测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比 对，然后利用MEGA6.0软件采用临位连接法构建系统发育树，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图4所示，以确定菌株的种属关系。
经分析，桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)的16S rDNA与同属的其 它种相比，相似度均<98％。即，有显著差异。
通过结合菌体形态特征、生长条件确定其为一株新菌株，命名为桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)。
8.与近缘菌株微生物学特性比较
与类芽孢杆菌属近缘标准菌株Paenibacillus vulneris CCUG 53270和Paenibacillus yunnanensis YN2的对比实验显示：本发明发现的耐除草剂2,4-D桂林类芽孢杆菌 (Paenibacillus guilinensis H1-7)与以上两菌株的微生物学特性有显著差异(表1)。
表1与近缘菌株微生物学特性比较
Figure GDA0001799666720000031
Figure GDA0001799666720000041
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性
9.耐除草剂2,4-D功能鉴定
本发明所述的桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)与大肠杆菌(E.coli K12)菌株在同等条件下进行对比。
结果表明，受试菌和对照菌分别在含有相同浓度2,4-D的MSM液体培养基中培养，本 发明的耐除草剂2,4-D桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)培养液的OD600值均高于对照菌株E.coli K12两倍及以上(见实施例及图5)。
本发明的桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)为Paenibacillus属的革兰 氏阳性菌，该属鲜有报道具有耐2,4-D功能。通过对其耐受机理的研究，可以进一步加深 人们对于2,4-D耐受性产生机理的认识，构建新的转基因生物，使其获得其它优良性状。
因此，本发明的耐除草剂2,4-D桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensisH1-7)， 可以直接作为2,4-D环境污染修复的功能菌株，将其优良的耐受2,4-D基因转入其它生物 体中，使其可以获得优良的抗逆性状；同时，它也可能作为新的基因工程菌株，通过接受 外来其它优良基因从而获得更多的优良性状；此外，通过传统的诱变育种手段进行性状的 改良，还可以获得更多优良性状的菌株。本发明的耐除草剂2,4-D桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)可用于除草剂污染环境修复以及克隆新的除草剂抗性基 因，对研究其耐受2,4-D分子机理，促进除草剂污染环境的修复及保持良好的生态环境有 着重要意义。
附图说明
图1桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)在显微镜下的形态特征，为杆 状的革兰氏阳性菌，可以形成芽孢；
图2桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)扫描电镜图片。
图3桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)的菌落形态；
图4桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)与其它类芽孢杆菌属成员之间 的进化分析(基于16S rDNA序列分析)；
图5桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)与对照菌株大肠杆菌(E.coli K12)对2,4-D的耐受能力对比。图中黑色柱形图表示菌株H1-7在不同浓度2,4-D培养条 件下的培养液OD600值，灰色柱形图表示对照菌株E.coli K12在不同浓度2,4-D培养条件 下的培养液OD600值；
生物材料保藏信息：
名称：桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)
保藏编号：GDMCC No.60328
保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心
保藏时间：2018年2月8日。
序列信息
SEQ ID NO:1：桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)的16S rDNA的 核苷酸序列
具体实施方式
实施例1耐除草剂2,4-D类芽孢杆菌的获得
于广西桂林地区灵川县灵川镇灵宝村委阳家村长期喷施除草剂2,4-D的农田中采集土 样。称取1g土样，加入以葡萄糖和2,4-D为碳源的20mL MSM培养基中，其中葡萄糖和2,4-D在培养基中终浓度均为50mg/L，30℃220rpm下富集培养5d，取富集物200μL 继续转接，反复富集转接5次后，取富集物200μL转入20mL以2,4-D为唯一碳源的MSM 培养基中，其中2,4-D的终浓度为100mg/L，30℃220rpm下富集培养5d，取富集物200 μL继续转接，反复富集转接5次后，取200μL富集物涂布于不同2,4-D浓度梯度的MSM 无碳固体培养基上进行分离筛选，浓度分别为1.0g·L-1、2.0g·L-1、3.0g·L-1、4.0g·L-1， 30℃培养3-5天，获得本发明所述的耐除草剂2,4-D类芽孢杆菌。
委托广东省微生物菌种保藏中心对分离到的菌进行鉴定，确认该菌属于类芽孢杆菌 属，被命名为桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)。
所述培养基成分如下：
MSM无机盐培养基(无碳)：
KH2PO4 11g、K2HPO4 12g、Na2SO4 2g、NH4NO3 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g， 微量金属盐溶液1mL，ddH2O 1000mL pH 7.0
所述微量金属盐溶液是：
FeCl2·4H2O 0.3g、CoCl2·6H2O 0.038g、MgCl2·4H2O 0.02g、ZnCl2 0.014g、H3BO30.0124 g、Na2MO4·H2O 0.04g、CaCl2·2H2O 0.0034 g ddH2O 1000 mL
培养温度为37℃。
实施例2桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)的2,4-D耐受试验
1、试验方法
将本发明所述的桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)菌液通过5000×g， 10 min、4℃离心收集菌体；将菌体重悬于等体积0.1 M磷酸钾Buffer(pH 7.0)，之后再 次使用5000×g、10 min、4℃离心收集菌体，如此洗涤菌体2次；最终将菌体再次重悬于 等体积0.1 M磷酸钾Buffer(pH 7.0)。分别将菌悬液以以1％浓度转接至pH 7.0的含有 200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800m mg/L、1000 mg/L 2,4-D的TGY培养基中，37℃，180 rpm摇床培养36 h后，测定培养液的OD600(以不加2,4-D的液体培养基作为参数)
同时以大肠杆菌(E.coli K12)菌株为对照。
试验菌和对照菌各进行3组平行试验。
表2桂林类芽孢杆菌(P.guilinensis H1-7)的2,4-D耐受试验
2,4-D浓度(mg/L) 0 200 400 600 800 1000
培养液OD<sub>600</sub> 2.005 2.4025 1.1025 0.77 0.62 0.4475
培养液OD<sub>600</sub>的标准差 0216 0.1027 0.114 0.1021 0.1015 0.1027
表3大肠杆菌(E.coli K12)的2,4-D耐受实验
2,4-D浓度(mg/L) 0 200 400 600 800 1000
培养液OD<sub>600</sub> 2.32 1.2075 0.62 0.2075 0.1025 0.1
培养液OD<sub>600</sub>的标准差 0.112 0.0844 0.0835 0.0035 0.020 0.015
2、试验结果
结果显示，本发明的桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)在200mg/L、 400 mg/L、600 mg/L、800m mg/L和1000 mg/L的2,4-D浓度下，其培养液的OD600值均高于对照大肠杆菌(E.coli K12)(表2、表3)。
实施例3桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)菌株16S rDNA的提取
本发明还提供了桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)的基因组提取、16S rDNA的扩增及测序方法，具体按照下述操作进行：
1.基因组提取方法
本发明所述的桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)的基因组使用
Figure GDA0001799666720000071
公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱形)进行提取，详见其说明书。
2.PCR扩增方法
本发明所述的桂林类芽孢杆菌(Paenibacillus guilinensis H1-7)的16S rDNA的PCR 扩增所用的通用引物序列的设计参照William G.Weisburg(1991)的文章，引物由北京六合 华大基因科技有限公司合成。扩增所用的试剂盒购买于南京诺唯赞生物科技有限公司。
正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)，
反向引物1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。
表4PCR扩增体系
成分 加入量
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL
dNTPs 1μL
27F引物 1μL
1492R引物 1μL
2×Phanta Max Buffer(2×) 25μL
模板 1μL
ddH<sub>2</sub>O 定容至50μL
PCR反应程序：95℃，5min；30个循环(95℃，30s；51℃，30s；72℃1.5min)； 72℃，5min。
将扩增得到的16S rDNA序列，连接于
Figure GDA0001799666720000072
公司的pJET 1.2/blunt载体上，委托 北京六合华大基因科技有限公司对于插入序列进行测序。测序得到的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 耐除草剂2,4-D桂林类芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1532
<212> DNA
<213> 桂林类芽孢杆菌（Paenibacillus guilinensis H1-7）
<400> 1
taatggagag tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag 60
tcgagcggtc ccttcgggga tagcggcgga cgggtgagta acacgtaggc aacctgcctg 120
caagaccggg ataactatcg gaaacgatag ctaagaccgg atagctggtt tcctcgcatg 180
agggaatcat gaaacacggg gcaacctgtg gcttgcagat gggcctgcgg cgcattagct 240
agttggtagg gtaacggcct accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg 300
gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360
cgcaatggac gcaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt 420
aaagctctgt tgccagggaa gaacgccatg gggagtaact gccctgtggg tgacggtacc 480
tgagaagaaa gccccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggggcaagc 540
gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt catttaagtt tggtgtttaa 600
gcccggggct caaccccgga tcgcactgaa aactggatga cttgagtgcg ggagaggaaa 660
gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag 720
gcgactttct ggaccgtaac tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta 780
gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctagg tgttaggggt ttcgataccc 840
ttggtgccga agtaaacaca gtaagcactc cgcctgggga gtacgctcgc aagagtgaaa 900
ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cagtggagta tgtggtttaa ttcgaagcaa 960
cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct gggtgaaacg tctagagata gacgccctct 1020
tcggagcacc caagacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgac tttagttgcc agcattgagt tgggcactct 1140
agagtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggcggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200
ttatgacctg ggctacacac gtactacaat ggccggtaca acgggaagcg aagccgcgag 1260
gtggagccaa tccttagaag ccggtctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat 1320
gaagtcggaa ttgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct 1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttacaacacc cgaagtcggt ggggtaaccg 1440
caaggagcca gccgccgaag gtggggtaga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc 1500
gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct tt 1532

Claims (2)

1.桂林类芽孢杆菌（Paenibacillus guilinensis H1-7），其保藏编号为：GDMCC NO.60328。
2.权利要求1所述的桂林类芽孢杆菌（Paenibacillus guilinensis H1-7）作为耐除草剂2,4-D功能菌株的应用。
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