KR20110106174A - 저온활성 및 고온안정성을 가지는 셀룰라아제 유전자 - Google Patents

저온활성 및 고온안정성을 가지는 셀룰라아제 유전자 Download PDF

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KR20110106174A
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Abstract

본 발명은 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)으로부터 분리한 신규한 셀룰라아제 효소 및 상기 효소를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 셀룰라아제 효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용하여 베타-1,4-글루칸 절편을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 셀룰라아제 효소는 고온에서 높은 안정성을 유지하면서 동시에 저온에서도 높은 활성을 유지할 수 있기 때문에, 저온공정이 필요한 세제, 발효 산업뿐만 아니라, 식품첨가물 및 사료첨가물로서 유용하게 사용될 수 있고, 나아가 화석연료인 석유와 석탄을 대체할 차세대 에너지원으로, 식물 및 해조류의 바이오메스를 분해하여 에탄올을 생산하는 산업에 유용하게 사용 되어질 수 있다.

Description

저온활성 및 고온안정성을 가지는 셀룰라아제 유전자{COLD-ACTIVE AND THERMOSTABLE CELLULASE GENE}
본 발명은 저온에서 높은 활성을 가지면서 동시에 고온에서도 안정성을 가지는 셀룰로오스 가수분해 효소에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)에서 분리한 신규한 셀룰라아제 효소 및 상기 효소를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 셀룰라아제 효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용하여 베타-1,4-글루칸 절편을 생산하는 방법에 관한 것이다.
셀룰로오스는 포도당이 베타-1,4-글루코사이드 결합으로 연결된 선형의 다당류로, 식물 뿐만 아니라 해조류 (특히 녹조류에 많이 존재함)의 세포벽을 형성하는 주요성분으로 헤미셀룰로오스와 함께 구조지지와 같은 기능을 수행한다. 이들 다당류는 최근에 바이오연료를 추출할 수 있는 바이오메스로서 주목을 받고 있으며, 미생물이나 초식동물의 중요한 에너지원으로 작용한다(Lin et al., Applied Microbiology and biotechnology, 69, 627-642, 2006).
이러한 다당류를 분해하는 효소 즉, 셀룰라아제는 셀룰로오스에 존재하는 베타-1,4-글루코시드 결합을 가수분해하는 효소로서, 가수분해 작용 패턴에 따라 엑소-베타-1,4-글루카나아제 (EC 3.2.1. 91), 엔도-베타-1,4-글루카나아제 (EC 3.2.1.4) 및 셀로비아제 (EC 3.2.1.21)로 분류된다. 엑소-베타-1,4-글루카나아제는 셀룰로오스 주요성분인 베타-1,4-글루칸의 비환원성 말단부터 절단하여 글루코오스를 생산한다. 반면에 엔도-베타-1,4-글루카나아제는 베타-1,4-글루칸을 무작위적으로 가수분해하여 셀룰로올리고당 (cellulooligosaccaride)을 생산하며, 셀로비오올리고당 (cellobiooligosaccharide)은 셀로비아제에 의해 글루코오스를 생산한다. 이들 효소는 서로 상호작용함으로써, 최종적으로 글루코오스 생산량을 향상시킨다 (Henrissat et al., Bio/Technology., 3, 722-726, 1985).
한편, 셀룰라아제는 다양한 분야에 활용될 수 있는데, 예를 들어 세제, 펄프 및 제지산업, 가축의 사료와 식품산업 등에 유용하게 사용된다. 또한 화석원료인 석유와 석탄을 대체할 차세대 에너지원으로, 식물의 바이오매스(biomass)를 분해하여 에탄올을 생산하는 산업에서 셀룰라아제의 활용이 핵심기술로 쓰이고 있다. 이런 다양한 분야에서 셀룰라아제의 효율적 활용을 위해서는 효소 분자의 열적 안정성이 무엇보다 중요하다. 특히 그 중에서도 60℃ 이상에서 장시간 활성을 유지하는 내열성과 함께 0℃~10℃ 의 저온 조건에서 높은 활성을 가지는 셀룰라아제는 저온 공정이 필요한 세제, 발효 산업뿐만 아니라, 식품첨가물 및 사료첨가물로서 유용하기 때문에 매우 유리하다. 따라서 내열성과 함께 특별히 저온에서 높은 활성을 가지는 셀룰라아제에 대한 탐색 및 연구개발이 산업체에서는 큰 관심의 대상이다.
지금까지 내열성 셀룰라아제는 다양한 고온성 미생물에서 밝혀졌는데, 주로 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물(Tomme et al., Adv Microb Physiol., 37, 1-81, 1995)에서 많은 연구가 진행되어 왔고, 식물 (Brummell et al., Enzym Covers Biomass Fuels Prod., 566, 100-129, 1994) 및 원생동물 (Moriya et al., Gene, 210, 221-227, 1998)에도 존재한다. 최근에는 연체동물 (Suzuki et al., Eur J Biochem., 270, 771-778, 2003), 극피동물 (Nishida et al., Biochimie., 89, 1002-1011, 2007) 및 곤충 (Watanabe et al., Nature, 394, 330-331 1998)등에서 분리 및 정제되어 효소적 특성이 밝혀졌다.
그러나, 종래에 알려진 셀룰라아제들은 대부분 60℃이상의 중온 및 고온에서 높은 활성을 보이지만, 그 이하의 저온 특히 0℃~10℃의 저온 조건에서는 활성이 매우 낮은 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 고온에서 높은 안정성을 유지하면서 동시에 저온에서도 높은 활성을 유지할 수 있는 셀룰라아제 유전자를 찾고자 수년 동안 연구한 결과, 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)의 유전체 염기서열을 분석하는 과정에서, 셀룰라아제 유전자를 찾게 되었고, 또한 이 과정에서 이 효소의 활성을 세포 수준에서 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)로부터 유래한 신규한 셀룰라아제 효소를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 셀룰라아제 효소를 인코딩하는 유전자, 즉 핵산 분자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 셀룰라아제 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체 또는 균주를 배양하여 재조합 셀룰라아제를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 셀룰라아제 효소를 이용하여 셀룰로오스 및 베타-글루칸류를 절단함을써, 베타-1,4-글루칸 절편을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 기타 실시예들의 구체적인 사항들은 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 도면들에 포함되어 있다.
먼저, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 셀룰라아제 효소에 관한 것이다.
본 발명자들은 남극에 서식하는 남극톡토기로부터 전체 RNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하였고, 이를 클로닝하여 약 2000여개의 클론들을 수득한 후, 이것의 염기서열을 확보하였고, 이 유전자로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열을 분석함으로써, 지금까지 알려진 것과는 다른 신규의 셀룰라아제 효소를 분리하는데 성공하였다(실시예 1).
본 발명의 셀룰라아제 효소는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내며, 동시에 고온안정성 및 저온활성을 유지하는 범위 내에서의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 서열번호 2의 아미노산 서열 중의 어떤 아미노산 잔기가, 기능적으로 동등한 다른 아미노산으로 치환된 형태의 기능적으로 동등한 단백질 분자 및 동일한 또는 유사한 활성을 나타내는 단백질 절편 또는 유도체까지도 포함한다. 당해 분야에 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 염기서열이 셀룰라아제 아미노산 서열로부터 유추된 유전암호의 중첩에 의한 염기서열도 포함하는 것을 충분히 이해할 수 있을 것이다.
가장 바람직하게, 본 발명의 구체적인 실시양태에서는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 셀룰라아제 효소를 제공한다. 서열번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 가지는 셀룰라아제 효소는 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)로 부터 분리한 것일 수도 있지만, 인공적으로 합성하는 것도 가능하다.
본 발명의 셀룰라아제 효소는 활성 온도범위가 0oC 내지 80 oC 이고, 더욱 바람직하게는 30oC 초과 내지 50 oC 미만에서 최적의 효소 활성을 가지며, 가장 바람직하게는 40 oC 에서 최고의 효소 활성을 가진다. 특히, 최고 효소 활성에 대비하여, 0℃~10℃ 조건에서 60% 초과 내지 80% 미만의 효소 활성을 가진다. 즉, 0 oC에서 효소 활성이 약 60% 이상 유지되므로, 본 발명에 따른 효소는 저온활성을 가지는 특징이 있다(도 5 b).
또한, 본 발명의 셀룰라아제 효소는 60 oC 이상의 고온에서도 열안정성을 가지는 특징을 가지고 있다. 즉, 최고 효소 활성에 대비하여, 60℃ 조건에서 8시간 이상 90%이상의 효소 활성을 가지며, 70℃~80℃ 조건에서는 4시간 동안 50% 이상의 효소 활성을 가진다(도 5 c).
이와 같이, 본 발명에 따른 셀룰라아제 효소는 0oC 내지 10 oC의 저온에서 높은 효소 활성을 유지하면서, 60oC 이상의 고온에서도 적어도 4시간 이상의 효소활성을 나타내는 저온활성 및 고온안정성을 가지는 것이 특징이다.
한편, 본 발명에 있어서 "셀룰라아제 효소"와 함께 쓰이는 용어, "저온성(psychrophile)", "저온활성(cold active)" 및 "저온에 대한 안정성 또는 내성"은 모두 동일한 의미로 사용되고 있으며, 바람직하게는 0 oC에서 효소 활성이 약 60% 이상 유지되거나, 보다 바람직하게는 0℃~10℃ 조건에서 60% 초과 내지 80% 미만의 효소 활성을 가지는 셀룰라아제 효소를 나타낼 때 사용된다. 또한, "내열성(heat-resistance)", "호열성(thermophilic)" 및 "열에 대한 안정성 또는 내성(thermostable or thermoresistant)"은 모두 동일한 의미로 사용되고 있으며, 바람직하게는 60 oC 이상, 보다 바람직하게는 최고 효소 활성에 대비하여 60℃ 조건에서 8시간 이상 90%이상의 효소 활성을 가지며, 가장 바람직하게는 70℃~80℃ 조건에서 4시간 동안 50% 이상의 효소 활성을 가지는 셀룰라아제 효소를 나타낼 때 사용된다.
또한, 본 발명의 셀룰라아제는 활성 pH 범위가 2 내지 10이고, 바람직하게는 pH 3초과 내지 5미만의 범위에서 80% 이상의 활성을 가지며, 더욱 바람직하게는 pH 3.5에서 최고의 활성을 가진(도 5 a). 이러한 활성 pH 범위는 종래의 다른 셀룰라아제의 것과 전혀 상이한 것으로서, 산성 조건의 환경에서 우수한 기능을 가질 수 있는 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상술한 본 발명의 셀룰라아제 효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 유전자 또는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에서, "핵산 분자"는 DNA 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열은 도 1에 나타난 염기서열과 동일하다.
한편, 셀룰라아제 효소를 인코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 보다 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 셀룰라아제 효소를 인코딩하는 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 당업계에 통상적으로 알려진 의미로 사용된다. "벡터"는 일반적으로 세포의 중심 대사의 일부분이 아닌 유전자를 포함하기도 하는 외래 염색체 요소로서, 보통 원형의 이중가닥 DNA이다. 상기 요소는 자가복제서열, 게놈삽입서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 원형, 단일 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일반적으로, 상기 벡터는 적당한 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 서열, 선택성 마커, 및 자가복제 또는 염색체 삽입을 허용하는 서열이 포함된다. 적절한 벡터는 전사 개시 조절을 포함하는 유전자의 5'영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3'을 포함한다.
상기 "적당한 조절 서열"은, 상기 폴리뉴클레오티드가 전사 및 번역될 수 있도록 조절기능을 하는 서열을 말한다. 상기 조절 서열에는 예를 들면, 리보좀 결합 서열 (RBS), 프로모터 및 터미네이터가 포함된다. 상기 프로모터는 본 발명의 유전자의 전사의 개시를 지시할 수 있는 서열이면, 어느 것이나 될 수 있다. 또한, 상기 터미네이터 영역은 바람직한 숙주세포의 다양한 유전자로부터 유래하는 것일 수 있으며, 또한 선택적으로 필요하지 않을 수도 있다.
본 발명의 실시예에서는, PCR 산물을 클로닝하기 위하여 T7 lac 프로모터를 가진 pET-28a(+) 벡터를 사용하였고, 이를 셀룰라아제 유전자와 재조합한 pET-CaCEL를 최종 발현벡터로 이용하였다. 상기 pET-28a(+) 벡터는 강력한 T7 lac 프로모터를 사용하여 재조합 단백질 발현에 적합하도록 고안되었다는 점에서 본 발명의 벡터로 사용하기에 적절하나, 이에 제한되지 않으며 다른 벡터를 사용하여 유전자를 발현시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 균주를 제공한다. 즉, 상기 발현벡터를 도입하여 형질전환된 형질전환체를 제공할 수 있다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균, 원핵생물, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물세포 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 재조합 벡터 pET-CaCEL를 대장균 Rosetta-gami2(DE3)에 형질전환하여 재조합 균주를 얻었다(실시예 2).
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 균주를 배양하여 셀룰라아제 효소를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 a) 본 발명에 따른 셀룰라아제 효소 또는 이것을 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 균주나 세포를 배양하는 단계; b) 상기 배양된 효소 또는 균주나 세포에서 셀룰라아제 단백질의 발현을 유도하는 단계; c) 상기 셀룰라아제 단백질이 발현된 세포를 분쇄한 후 침전시켜 얻어진 상등액으로부터 단백질을 용출하는 단계; 및 d) 상기 용출된 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스 분해활성을 갖는 셀룰라아제의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 a)의 세포배양은 LB (Luria-Bertani) broth배지에서 배양 할 수 있으며, 바람직하게는 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생제를 포함한 LB broth 배지, 더욱 바람직하게는 상기 형질전환체 또는 세포를 선별적으로 증식시킬 수 있다. 그리고, 단계 b)의 단백질의 발현 유도는 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalatopyranoside)를 유도물질로 처리하여 유도할 수 있으며, 바람직하게는 IPTG를 최종농도가 0.01 내지 1 mM, 바람직하게는 0.05 내지 0.5 mM, 더욱 바람직하게는 0.1 mM 가 되도록 처리하여 유도할 수 있다. 또한, 단계 c)의 단백질 용출은 상기 단백질의 생물학적 기능에 손실을 주지 않는 무기산 또는 유기산의 염을 포함하고 있는 완충용액, 예를 들면 구연산염, 초산염, 호박산염, 유산염, 타르타르산염, 포르산염, 프로피온산염, 인산염, 또는 붕산염을 포함하는 완충용액일 수 있다. 나아가, 단계 d)의 단백질 정제는 당 업계에서 공지된 단백질 정제방법을 이용하여 정제할 수 있으며, 바람직하게는 이온교환 크로마토그래피, 겔-투과 크로마토그래피, 역상-HPLC, 및 친화성 컬럼 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법으로 정제 할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 제조된 재조합 셀룰라아제 효소를 셀룰로오즈 또는 베타-글루칸류에 처리하여, 베타-1,4-글루칸 절편을 생산하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명에 따른 셀룰라아제는 저분자량의 다당류로 전환시키는 효소적 공정에서, 상기 효소의 적합한 효소반응조건에서 접촉시킴으로써 용이하게 저분자량의 다당류를 수득할 수 있다(실시예 3). 상기 효소반응조건에 있어서, 셀룰라아제의 최적 pH 범위는 2-10이고, 바람직하게는 pH 3내지 5이며, 더욱 바람직하게는 pH 3.5 이며; 최적 온도범위는 0 내지 80 oC이고, 바람직하게는 30내지 60 oC 이며, 더욱 바람직하게는 40 oC이다. 또한 여러가지 금속 이온은 효소활성에 큰 영향을 미치지 않는다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 셀룰라아제 효소는 저온의 온도에서 높은 활성을 유지하면서 고온에서도 높은 안정성을 유지 할 수 있기 때문에, 저온공정이 필요한 세제, 발효 산업뿐만 아니라, 식품첨가물 및 사료첨가물로서 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 화석연료인 석유와 석탄을 대체할 차세대 에너지원으로, 식물 및 해조류의 바이오메스를 분해하여 에탄올을 생산하는 산업에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)로부터 분리한 셀룰라아제의 코딩 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면으로서, 단일선은 예측된 시그널 펩타이드를, * 표시는 종결코돈 (TAA)을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 남극톡토기로부터 분리한 셀룰라아제의 아미노산 서열과 글리코실 하이드롤라아제 그룹 45에 존재하는 곰팡이, 곤충 및 곤충 내 서식하는 원생동물 유래 셀룰라아제의 아미노산 서열의 상동성 분석을 나타낸 도면으로서, 음영부위는 각 효소 사이의 보전된 잔기를, * 표시는 효소 활성에 중요한 촉매활성 잔기를 각각 나타낸다. 아미노산 서열 위의 숫자는 보존된 이황화결합 위치를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 셀룰라아제 효소를 생산하기 위한 재조합 발현벡터 (pET-CaCEL)의 제조 과정 및 개열지도를 나타낸 도면이다.
도 4는 도 3의 발현벡터에 의해 형질전환된 Rosetta-gami2(DE3) 균주에서 발현된 셀룰라아제를 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 셀룰라아제 효소의 (a)pH, (b)온도 및 (c)열안정성(60℃ : ● 표시, 80℃ : ○표시)에 따른 활성변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 셀룰라아제 효소에 의해 가수분해된 셀로올리고당(Cellooligosaccaride)과 CMC의 분해산물을 박막크로마토그래피로 분석한 것으로, 분해 작용 기작을 나타내는 TLC (Thin Layer Chromatography) 결과이다. 마커로서, G1 은 포도당 (글루코스), G2는 셀로비오스, G3는 셀로트리오스, G4는 셀로테트라오스, G5는 셀로펜타오스 및 G6는 셀로헥사오스를 각각 가리킨다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 남극톡토기( C. antarcticus ) 유래의 셀룰라아제 유전자 분리 및 아미노산 서열분석
1-1: 시료 준비 및 전체 RNA 분리
사우스 쉐틀랜드 아이슬랜드(South Shetland Island)에 위치한 남극세종과학기지 주변의 이끼로부터 남극톡토기(C. antarcticus)를 수집한 후, 곧바로 99.9% 알코올에 첨가하여 -70℃에서 보관하였다. 급속동결된 상기 남극톡토기로부터 전체 RNA를 분리하기 위하여, 알코올을 완전히 제거한 후 트리졸(Trizol) 용액(Invitrogen, 미국)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 1% 포름알데하이드 아가로스 겔에서 그 순도를 확인한 후, ND-1000 분광분석기(Nanodrop, 미국)을 이용하여 그 양을 측정하였다.
1-2: cDNA 라이브러리 제작 및 셀룰라아제 클론 유전자 분석
Creator SMART cDNA 라이브러리 키트(Clontech, 미국)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 합성하였다. cDNA를 합성한 후 양쪽 말단에 어뎁터 DNA를 연결하였고, 이를 SfiI 제한효소(Promega, 미국)로 절단하여 pDNR-LIB 벡터에 연결한 후 DH5α 균주에 형질전환하였다. 이로부터 약 2000여개의 발현 유전자가 클로닝된 클론을 얻었고, Big dye terminator키트(PE Applied Biosystems) 및 자동서열분석기(ABI3100)를 이용하여 상기 클론들의 서열을 분석하였다. 분석된 염기서열들은 NCBI 데이터베이스, Pfam 데이터베이스 및 ExPASy 프로테오믹스 데이터베이스를 각각 이용하여 셀룰라아제 유전자의 서열과 비교분석하였다. 상기 약 2000여개 클론들의 염기서열을 분석한 결과, 본 발명의 셀룰라아제 유전자는 전체 781 bp의 전장서열을 가지며, 16개의 시그널 펩타이드를 포함하는 225개의 아미노산 서열(서열번호 2), 이를 코딩하는 678bp의 개방해독틀(ORF, 서열번호 1) 외에 18 bp로 구성된 5'- 말단 과 3'-말단에 폴리아데닐레이션A를 포함하는 103 bp의 폴리뉴클레오티드로 구성됨을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
1-3: 상동성 분석
상기 남극톡토기 셀룰라아제의 아미노산 서열은 글리코실 하이드롤라아제 그룹 45에 속하는 효소들과 약 40-60%의 높은 서열 상동성을 보인다(도 2). 도 2는 본 발명에 따른 남극극토기 유래의 셀룰라아제를 이와 유사한 아미노산 서열을 갖는 Syncephalastrum racemosum (61%, GenBank accession number, ABU49185), Melanocarpus albomyces (52%, GenBank accession number, CAD56665)과 같은 곰팡이와 곤충(Apriona germari, 47-48%, GenBank accession number, AAR22385 또는 AAU44973)과 원생동물(Mastotermes darwiniensis, 49%, GenBank accession number, CAD39197-8 또는 Reticulitermes speratus, 53%, GenBank accession number, BAA98043) 유래의 글리코실 하이드롤라아제 그룹 45 효소의 아미노산 서열과 비교한 것이다.
남극극토기 유래의 셀룰라아제는 효소활성에 중요한 Asp29과 Asp139의 두 잔기(Koshland, P. J., Biol. Rev., 28: 416-436, 1953) 및 Thr25부터 Ala37까지의 활성부위가 글리코실 하이드롤라아제 그룹 45 의 균주와 같이 모두 보존되었다. 또한, 전형적인 글리코실 하이드롤라아제 그룹 45 존재하는 활성모티프 (catalytic active motif) 인 T-T-R-Y-X-D(X는 어떠한 아미노산도 가능하다는 것을 의미함)가 T-T-R-Y-W-D로 잘 보존됨을 확인할 수 있었다(도 2). 이는, 남극톡토기 유래의 셀룰라아제가 글리코실 하이드롤라아제 그룹 45에 속하는 효소임을 의미한다.
실시예 2: 남극톡토기 유래의 셀룰라아제 유전자의 클로닝, 단백질 발현 및 정제, 및 효소활성 분석
남극톡토기 셀룰라아제를 코딩하는 유전자의 개방해독틀에서 시그널 시퀀스가 제거된 성숙된 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위하여, 정방향 프라이머(5' -NNNNNNCCATGGTAACATCTGGCTCCGGTGT-3' 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(5’-NNNNNNCTCGAGAGGTCCAGGAGTTCTGACGC-3' 서열번호 4)를 이용하여 증폭하였다. 상기 정방향 및 역방향 프라이머의 밑줄 친 부분은 각각 NcoI 및 XhoI제한효소의 인지부위를 가리키며, PCR 산물을 NcoI 및 XhoI으로 절단한 후 동일효소로 절단된 pET-28a(+) 벡터(Novagen, 미국)에 클로닝 하기 위하여 설계되었다(도 3).　 도 3은 본 발명의 세룰라아제를 발현하는 발현벡터의 클로닝 과정 및 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3과 같은 방법으로 클로닝한 후, 최종 발현벡터인 pET-CaCEL를 제조하였으며, 상기 벡터의 서열분석 및 발현을 위해서 숙주세포인 Rosetta-gami2(DE3) 대장균에 형질전환하여 형질전환체를 제조하였다. 형질전환된 세포내에서 셀룰라아제 단백질 발현은 0.1 mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가한 후 10℃에서 5일 동안 배양함으로써 유도하였다. 상기 세포를 4℃, 4,000g에서 20분간 원심분리하여 침전시킨 후 100mM 염화나트륨 및 5 mM 이미다졸 (Sigma, 미국)이 첨가된 20 mM 트리스-HCl 완충용액(pH 7.9)에서 재현탁하여 초음파를 이용하여 상기 세포를 분쇄하였다.
분쇄 후, 4℃, 17,000g에서 1시간 동안 원심분리하여 얻어진 상등액을 금속친화성 레진(Ni-NTA His-Bind Resin, Novagen, 미국)을 가진 컬럼에 통과시킨 후 20 mM 이미다졸이 첨가된 100mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스-HCl 완충용액(pH 7.9)으로 세척하였고, 300 mM 이미다졸이 첨가된 상기 완충용액으로 셀룰라아제를 용출하였다. 용출된 단백질 용액은 20 mM 트리스-HCl 완충용액(pH 7.9)에 평형화 된 Superdex-G75 컬럼 (GE-Healthcare, 미국) 을 통해 용출된 후 순수하게 정제된 단백질 용액을 회수 하였다.
단백질 농도는 브래드포드(Bradford, M. M., Ana. Biochem., 72: 248-254, 1976) 방법으로 측정하였고, 히스티딘-태깅된 affinity 크로마토그래피 와 Superdex-G75를 이용하여 정제된 상기 단백질을 SDS-PAGE에 전기영동하여 그 순도를 확인하였다. 그 결과, 도 4에서와 같이 상기에서 분리된 효소(CaCEL)는 약 24 kDa의 크기임을 확인하였고(도 4), 단백질 회수율은 약 6.6 %임을 확인할 수 있었다(표 1). 효소활성에 있어서 남극톡토기의 셀룰라아제 효소는 35.8 U/mg임을 확인할 수 있었다 (표 1).
[남극톡토기 유래의 셀룰라아제 효소 정제]
Purification step Total protein
(mg)		 Total activity
(U) a 		Specific activity
(U/mg)		 Yield
(%)		 Purification (fold)
Crude extract 312 b 249.9 0.8 100 1
His-tagged affinity chromatography 0.69 22.8 33.1 9.1 41.4
Superdex 75 HR column 0.46 16.5 35.8 6.6 44.8
실시예 3: 남극톡토기 유래의 셀룰라아제 효소의 생화학적 특징 분석
실시예 2에서 분리 정제된 남극톡토기의 셀룰라아제(CaCEL) 효소의 생화학적 특징을 조사하기 위하여, 1) 기질에 대한 효소 활성; 2) pH 및 온도에 따른 효소활성 변화를 각각 측정하였다. 구체적으로, 다당류인 CMC (Carboxymethyl cellulose), 리케난 (Lichenan), 베타-D-글루칸 (D-Glucan) 기질 1% (W/V)와 10 μl (1.75 μg)의 상기 효소를 50 mM의 소디움시트레이트 완충용액(pH 3.5)에서 혼합한 후 40℃에서 30분간 배양하여 상기 효소분해에 의해 유리되는 글루코오스의 환원당량을 측정하였다. 상기 환원당량은 디니트로살리실릭산(Dinitrosalicylic acid: DNS) 방법(Stalbrand, H., et al., J. Biotechnol., 29: 229-242, 1993)을 이용하여 측정하였고, 셀룰라아제 효소활성의 1단위는 분(min) 당 글루코오스 및 등가의 1μmole의 환원당을 유리시키는 효소의 양으로 정하였다.
기질에 대한 효소활성과 관련하여, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 셀룰라아제는 기질로서 CMC (Carboxymethyl cellulose, 35.8 U/mg), 리케난 (Lichenan, 20.5 U/mg), 베타-D-글루칸 (D-Glucan, 13.9 U/mg)를 분해하는 특성을 가지고 있다 (표2).
[남극톡토기 유래의 셀룰라아제 효소의 다양한 기질의 특이성]
Substrate Main linkage type Specific activity (U/mg)
CMC Beta-1,4-Glu 35.8
Lichenan Beta-1,3-1,4-Glu 20.5
Beta-D-Glucan Beta-1,4-Glu 13.9
또한, pH (도 5a) 및 온도 (도 5b)에 따른 효소활성 변화와 관련하여, 본 발명의 셀룰라아제 효소는 pH 3.5에서 최적활성을 보였고, pH 2-10 이하의 산성부터 알카리성 조건에서 비교적 효소활성을 유지하고 있다 (도 5a). 또한 상기 효소는 40℃에서 최적 활성을 보였으며, 0 내지 80℃ 온도범위에서 효소활성을 유지함을 관찰 할 수 있었다 (도 5b). 또한 0 내지 10℃의 온도에서 효소 활성의 60-80%을 유지하고 있어서, 이들 효소는 전형적인 저온활성 효소라는 것을 확인 할 수 있다. 또한 60℃는 약 8시간 이상 효소가 안정하며(● 표시), 70-80℃에서는 2-4시간 동안 열처리를 하여도 효소의 활성의 50%를 유지하고 있으며(○ 표시), 상온에서 약 1달 이상 효소활성이 유지됨을 관찰 할 수 있었다 (도 5c 참조).
이와 같은 남극톡토기 셀룰라아제의 생화학적 특징은 기존에 알려진 동일 그룹의 셀룰라아제와 현저한 차이를 보였다(표 3). 즉, 상기 효소가 저온의 온도에서 높은 활성을 유지하면서, 열에 대해 안정한 특성과 산성조건에서 높은 효소활성을 보인 반면, 곰팡이 및 곤충 유래의 셀룰라아제는 모두 40℃ 이상의 중온 또는 고온에서 최고 활성을 보였다. 그러나 이들은 효소는 저온에서 활성을 유지하지 않는다. 이는 본 발명의 셀룰라아제가 기존에 사용되는 셀룰라아제를 대체할 수 있음을 의미한다.
[남극톡토기 셀룰라아제의 생화학적 특징 비교]
Phylum Species of origin Optimum pH Optimum temperature (oC) % remaining activity
(Thermostability)		 % activity at the lowest temperaruture specific activity
(U/mg)
Arthropoda Cryptopygus antarcticus 3.5
 40 50-60% at 70oC for 4 hours 60-70% at 0-10oC 35.6
Apriona germari 6 50 Loss activity at 80oC 10 min 30% of the maximum at 30oC 812
Fungi Syncephalastrum racemosum 5~6
 70 55-60% at 70oC for 4 hours 30-40% of the maximum at 30oC 56.9
Rhizopus oryzae 5 55 n.a 20% of the the maximum at at 30oC 110
Melanocarpus albomyces 7
 70 Highly thermostable 70% at 50oC 58.8
Nematode
 Bursaphelenchus xylophilus 5.8
 60
 less 50% at 70oC for 10 min n.a
 85.2
Ampullaria crossean 5.5 50 less 10% at 50oC for 24 hour 10-15% at 25oC 146.5
실시예 4: 박막크로마토그래피를 이용한 셀룰라아제에 의한 셀룰로오스의 분해산물 확인
본 발명의 실시예에서는 셀룰라아제에 의해 가수분해된 CMC 및 셀로올리고당 (Cellooligosacchardie) 의 분해산물을 확인하기 위하여, 실시예 2에서 제조된 형질전환체에 의해 생산된 셀룰라아제에 의한 가수분해산물을 통상적으로 사용되는 박막크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography, TLC) 법을 이용하여 분석하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 셀룰라아제에 의해 가수분해된 분해산물을 박막크로마토그래피로 분석한 결과로서, 마커로서, G1 은 포도당 (글루코오스), G2는 셀로비오스, G3는 셀로트리오스, G4는 셀로테트라오스, G5는 셀로펜타오스 및 G6는 셀로헥사오스를 가리킨다. 도 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 셀룰라아제를 이용하여 G2 내지 G6 올리고당을 분해하였을 때, G2 내지 G3의 올리고당은 절단되지 않았으나, G4는 분해되어 G2를 생성하며, G5는 G2 내지 G3를 생산하고, G6는 G2내지 G4를 생산한다. 한편, 분해산물 중에 G1은 나타나지 않는다 (도 6). 이는, 본 발명의 셀룰라아제 효소가 엔도-베타-1,4-글루카나아제 라는 것을 의미하며, 또한 기질이 분해되기 위해서는 글루코오스가 최소한 4개 이상인 올리고당이 되어야 하며, CMC를 분해하였을 때, 그 분해산물은 G2, G3, G4를 임을 나타낸다.
한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
본 발명은 남극톡토기 유래의 저온활성 및 열안정성 셀룰라아제 단백질이 저온공정이 필요한 세제, 제지 및 발효 산업뿐 아니라 식품첨가물 및 사료첨가물로 유용하게 사용될 수 있을 가능성을 제공한다.
나아가 화석연료인 석유와 석탄을 대체할 차세대 에너지원으로, 식물 및 해조류로부터 바이오메스를 분해하여 에탄올을 생산하는 산업에 유용하게 사용 되어 질 수 있다. 이때, 상기 저온공정이 필요한 식품 및 발효 산업으로는 특별히 제한되는 것은 아니나, 열처리에 치명적이며 풍미를 유지해야 하는 과실추출 산업, 저온공정이 필요한 햄 및 소시지와 같은 발효육제품, 발효생식제품, 김치 및 발효주 산업을 포함할 수 있다.
또한, 상기 단백질을 식품첨가물로 사용할 경우 즉 바람직하게는 해조류를 이용한 다이어트 식품의 첨가물로 사용 되어질 수 있다. 이는, 상기 셀룰라아제를 해조류를 이용한 다이어트 식품의 첨가물로 사용할 경우, 해조류의 구조지지체인 세포벽의 주성분인 셀룰로오스를 효율적으로 분해시켜 소화효율을 증진시키고, 분해되어 생성된 다양한 형태의 올리고당이 장내에 서식하는 유용한 박테리아를 증식시켜 장내활성을 촉진하기 때문이다. 이러한 이유로, 본 발명의 셀룰라아제는 또한 해조류를 이용한 동물사료의 첨가물로도 사용될 수 있다.
<110> Korea Ocean Research & Development Institute <120> COLD-ACTIVE AND THERMOSTABLE CELLULASE GENE <130> 0001 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 678 <212> DNA <213> Cryptopygus antarcticus <400> 1 atgaaggttt tcgttgtttt ggcagctatt gtagccattg ccaatggtct aacatctggc 60 tccggtgtca cgactcggta ttgggactgc tgcaaaccct cttgctcttg gggcggaaaa 120 gcttcggtaa ctaagccggt gcgaacatgc aaagccaatg gcaacaccac aattgattcc 180 aacactcaaa gcgggtgcaa tggaggctct tcatacgtct gcaatgacca acaacccttc 240 acccaaggaa acgttggata tggtttcgcc gctgctagca tttctggcca gccagagtcc 300 caaacatgct gtgcctgtta tgagatgact ttcactaaca ctgcgatttc tggtcaaaaa 360 atgattgtcc aagttaccaa caccggttct gacttgaatg gtaaccattt cgatctgatg 420 attcccggag gtggagtagg tatctttaac ggatgtcaat ctcaatgggg tgctccttct 480 aatggatggg gtcaacgtta cggtggaata agcagccaaa gtgagtgcaa ccaacttcca 540 acaagtcttc gagccggatg caattggcgt tttggatggt tcaagaatgc tgataatccc 600 agcatgaaat ttacgcaggt cagatgccct accattttga cccagaagag tcaatgcgtc 660 agaactcctg gaccttaa 678 <210> 2 <211> 225 <212> PRT <213> Cryptopygus antarcticus <400> 2 Met Lys Val Phe Val Val Leu Ala Ala Ile Val Ala Ile Ala Asn Gly 1 5 10 15 Leu Thr Ser Gly Ser Gly Val Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys 20 25 30 Pro Ser Cys Ser Trp Gly Gly Lys Ala Ser Val Thr Lys Pro Val Arg 35 40 45 Thr Cys Lys Ala Asn Gly Asn Thr Thr Ile Asp Ser Asn Thr Gln Ser 50 55 60 Gly Cys Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Val Cys Asn Asp Gln Gln Pro Phe 65 70 75 80 Thr Gln Gly Asn Val Gly Tyr Gly Phe Ala Ala Ala Ser Ile Ser Gly 85 90 95 Gln Pro Glu Ser Gln Thr Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Met Thr Phe Thr 100 105 110 Asn Thr Ala Ile Ser Gly Gln Lys Met Ile Val Gln Val Thr Asn Thr 115 120 125 Gly Ser Asp Leu Asn Gly Asn His Phe Asp Leu Met Ile Pro Gly Gly 130 135 140 Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Gln Ser Gln Trp Gly Ala Pro Ser 145 150 155 160 Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Gln Ser Glu Cys 165 170 175 Asn Gln Leu Pro Thr Ser Leu Arg Ala Gly Cys Asn Trp Arg Phe Gly 180 185 190 Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Met Lys Phe Thr Gln Val Arg 195 200 205 Cys Pro Thr Ile Leu Thr Gln Lys Ser Gln Cys Val Arg Thr Pro Gly 210 215 220 Pro 225 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 3 nnnnnnccat ggtaacatct ggctccggtg t 31 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 4 nnnnnnctcg agaggtccag gagttctgac gc 32

Claims (12)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 셀룰라아제 효소.
  2. (a) 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)로부터 분리되고,
    (b) 최적 효소 활성 온도가 30℃ 초과 내지 50℃ 미만이며,
    (c) 최고 효소 활성에 대비하여, 0℃~10℃ 조건에서 60% 초과 내지 80% 미만의 효소 활성을 가지는 셀룰라아제 효소.
  3. 제2항에 있어서, (d) 최고 효소 활성에 대비하여, 60℃ 조건에서 8시간 이상 90%이상의 효소 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제 효소.
  4. 제2항에 있어서, (d) 최고 효소 활성에 대비하여, 70℃~80℃ 조건에서 4시간 동안 50% 이상의 효소 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제 효소.
  5. 제2항에 있어서, (d) 최적 효소 활성 pH가 3 초과 내지 5미만인 것을 특징으로 하는 셀룰라아제 효소.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 셀룰라아제 효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 셀룰라아제 효소를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  9. 제8항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.
  10. 제9항에 따른 형질전환체가 대장균 Rosetta-gami2 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 균주.
  11. 제9항의 형질전환체를 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 셀룰라아제의 제조방법.
  12. 제11항의 방법에 따라 제조된 재조합 셀룰라아제 효소를 셀룰로오즈 또는 베타-글루칸류에 처리하여, 베타-1,4-글루칸 절편을 생산하는 방법.











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