KR100762410B1 - 저온활성 및 내산성 베타―１，４－ｄ－만난아제, 이를코딩하는 유전자, 및 이의 용도 - Google Patents

저온활성 및 내산성 베타―１，４－ｄ－만난아제, 이를코딩하는 유전자, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)으로부터 분리한 저온활성 및 내산성 베타(beta)-1,4-D-만난아제(mannanase) 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 베타(beta)-1,4-D-만난아제(mannanase) 효소 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 상기 베타-1,4-D-만난아제 효소는 산성조건에서 내성을 갖고 저온에서 그 활성을 유지할 수 있기 때문에 저온공정이 필요한 식품, 제지 및 발효 산업뿐 아니라 식품첨가물 및 사료첨가물로서 유용하게 이용될 수 있다.
남극톡토기, 저온활성, 내산성, 베타-1,4-D-만난아제, 발현벡터, 형질전환체

Description

저온활성 및 내산성 베타―１，４－Ｄ－만난아제, 이를 코딩하는 유전자, 및 이의 용도{COLD-ACTIVE, ACIDIC BETA-1,4-D-MANNANASE, CODING GENE, AND USE THEREOF}
도 1은 남극톡토기(C. antarcticus)으로부터 분리한 베타-1,4-D-만난아제의 코딩 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면으로, 단일선은 예측된 시그널 펩타이드를, * 표시는 종결코돈을, 이중선은 예측된 폴리아닐레이션 부위를 각각 가리킨다.
도 2a 및 2b는 남극톡토기(CaMan으로 표시함)로부터 분리한 베타-1,4-D-만난아제의 아미노산 서열과 다른 종의 베타-1,4-D-만난아제의 아미노산 서열의 상동성 분석을 나타낸 도면으로, 음영부위는 각 효소 사이의 보전된 잔기를, * 표시는 효소 활성에 중요한 촉매활성 잔기를 각각 가리킨다.
도 3은　남극톡토기로부터 분리한 베타-1,4-D-만난아제(CaMan)의 계통수 (phylogenetic tree)를 나타낸 도면이다.
도 4는 베타-1,4-D-만난아제 효소를 생산하기 위한 재조합 발현벡터 (pETCaMan)의 제조 과정 및 개열 지도를 나타낸 도면이다.
도 5는 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 Rosetta(DE3) 균주에서 발현된 베타-1,4-D-만난아제를 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.
도 6은 온도(a) 및 pH(b)에 따른 본 발명의 베타-1,4-D-만난아제 효소의 활성 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)으로부터 분리한 저온활성 및 내산성 베타(beta)-1,4-만난아제(mannanase) 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체 및 이로부터 생산되는 상기 효소의 제조방법에 관한 것이다.
베타(Beta)-1,4-D-만난아제(mannanase; EC 3.2.1.78)는 코프라(copra)의 내유, 상아야자의 견과, 구아검(guar gum), 로커스트빈검(locust bean gum), 커피 및 곤약(konjak)의 뿌리 등과 같은 식물체에 존재하는 베타-만난(beta-mannan)의 베타(beta)-1,4-mannosidic linkage를 가수분해하는 효소로 알려져 있다(McCleary, B. V., Methods Enzymol., 160: 596-610, 1998). 이러한 베타-1,4-D-만난아제는 베타-만난을 함유하는 난분해성 폴리사카라이드를 분해할 수 있기 때문에 양질의 펄프를 생산하는데 사용되어져 왔으며(Paice, M. G., et al., J. Wood Chem. Technol. 4: 187-198, 1984), 인스턴트 커피, 초콜릿 및 카카오 음료를 생산하는 공정 중 원료를 추출하는 단계에서 발생되는 점성을 제거하는데 유용하게 사용되어져 왔다(Belitz, H. D & Grosch, W., 1987 및 Francoise, M., et al., Appl. Environ. Microbiol., 62: 4656-4658, 1996).　 또한, 최근에는 상기 효소에 의해 분해된 만노올리고사카라이드(mannooligosaccaride)가 장내정상 균총인 유산균(Bifidobacteria)의 증식에 유용한 에너지원임이 밝혀지게 되었다(Kobayasi, P. J., Biol. Rev., 28: 416-436, 1984).
지금까지 식물(Shimahara et al., 1975), 박테리아(Araki, 1983; Akino, T., et al., Agric. Bio. Chem., 52: 773-779, 1988; Araujo and Ward, 1990; Takahashi, R., et al., Agric. Bio. Chem., 48: 2189-2195, 1984; Oda, Y., et al., J. Ferment. Bioeng., 76: 14-18, 1993), 곰팡이(Reese, E. T. & Shibata, Y., J. Microbiol., 11: 167-, 1965; Johnson, 1990; Stalbrand, H., et al., J. Biotechnol., 29: 229-242, 1993) 및 연체동물(Yamaura and Matsumoto, 1993; Yamaura, I., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 60: 674-676, 1996; Charrier and Rouland, 2001; Xu, B., et al., Eur. J. Biochem., 269: 1753-1760, 2002; Oousuka et al., 2006)과 같은 군에서는 다양한 베타-1,4-D-만난아제 효소의 정제 및 특성이 밝혀졌으나, 그 외 다른 다세포 동물에서 상기 효소가 정제되거나 유전자 염기서열이 밝혀진 예는 아직까지 보고된 바가 없다. 또한, 종래에 알려진 베타-1,4-D-만난아제들은 대부분 중온 및 고온에서 높은 활성을 보이지만, 본 발명의 남극톡토기에서 분리된 베타-1,4-D-만난아제는 저온에서 높은 활성을 갖는 독특한 특징을 가지고 있다.
남극 또는 북극과 같은 초저온 환경에 서식하는 많은 생물들은 이러한 극한 환경 조건에서 생존하기 위해서, 생체 대사과정에 관여하는 효소들을 저온에서 높은 활성을 갖도록 하게 한다(Margesin, R. & Schinner, F., 1999; Russel, 2000; Goodchild, A., et al., Mol. Microbiol., 53: 309-321, 2004). 특히, 본 발명에서 사용된 남극에 서식하는 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)는 주로 곰팡이, 조류 및 유기퇴적물을 섭취하면서(Broady, 1979) 초냉각(supercooling) 방법에 의해 영하 20~30℃의 초저온 환경에서 생존할 수 있는 특징을 가지고 있다고 보고되었다(Block, W., et al., Experientia, 34: 1166-1167, 1978).
이에, 본 발명자들은 남극톡토기(C. antarcticus)로부터 연체동물을 제외한 다세포 동물에서 아직까지 존재한다고 보고된 바 없는, 베타-1,4-D-만난아제 유전자를 최초로 분리하여 클로닝한 후 대장균에서 발현시키고, 정제하며, 베타-1,4-D-만난아제의 효소활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 저온에서도 활성을 유지할 수 있기 때문에 저온공정이 필요한 식품, 제지 및 발효 산업뿐 아니라 식품첨가물 및 사료첨가물로서 유용하게 이용될 수 있는, 남극톡토기의 베타-1,4-D-만난아제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 남극톡토기의 베타-1,4-D-만난아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 남극톡토기의 베타-1,4-D-만난아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)로부터 유래되며, pH 2.5 내지 4 이하의 산성조건에서 안정적이며, 온도 범위 0 내지 35℃ 이하에서 효소활성을 유지하며, 및 Ca2 +, Mg2 +, Cu2 + 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속이온에서 적어도 150% 이상의 효소활성을 나타내는 저온활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)로부터 분리한 저온활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자의 핵산서열을 포함하는 벡터, 바람직하게는 pETCaMan 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 도입하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
아울러, 본 발명은 1) 상기 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)의 저온활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환체를 카나마이신이 포함된 LB(Luria-Bertani)배지에서 배양하는 단계; 2) 상기 배양액에 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalatopyranoside)를 첨가하여 단백질을 유도하는 단계; 3) 상기 세포를 침전시켜 분쇄한 후 얻어진 상등액을 금속친화성 레진을 가진 컬럼에 통과시켜 용출하는 단계 및 4) 상기 용출된 단백질을 히스티딘-태깅된 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는, 저온활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)로부터 분리한 신규한 저온활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제(mannanase)를 코딩하는 유전자를 제공한다.
남극톡토기로부터 베타-1,4-D-만난아제를 코딩하는 유전자를 분리하기 위하여, 남극에 서식하는 남극톡토기로부터 전체 RNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하였고, 이를 클로닝하여 약 2000여개의 클론들을 수득한 후 서열분석을 실시하였다. 그 결과, 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제 유전자는 전체 1,248 bp의 전장서열(서열번호 3)을 가지며, 21개의 시그널 펩타이드를 포함하는 382개의 아미노산 서열(서열번호 2), 이를 코딩하는 1,149 bp의 개방해독틀(ORF, 서열번호 1), 및 3'-말단에 폴리아데닐레이션A(aataaa)를 포함하는 1218 bp의 폴리뉴클레오티드로 구성됨을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 이때, 상기 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제를 코딩하는 유전자 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 서열의 일부가 변형된 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 코딩서열은 특별히 제한되는 것은 아니나, 연체동물, 박테리아, 곰팡이 및 식물 유래의 베타-1,4-D-만난아제 유전자 서열과 비교분석하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제 아미노산 서열은 특별히 제한되는 것은 아니나, 글리코실 하이드롤라아제 그룹 5 에 속하는 균주 즉, H. discus hannai(HdMan), B. glabrata(BgMan), M. edulis(MeMan), A. aculeatus(AaMan), A. bisporus(AbMan), L. esculentum(LeMan), H. jecorina(HjMan), T. fusca(TfMan), C. saccharolyticus(CsMan) 및 C. cellulovorans(CcMan) 유래의 베타-1,4-D-만난아제 아미노산 서열과 비교분석하는 것이 바람직하다. 상동성 분석결과, 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제의 아미노산 서열은 글리코실 하이드롤라아제 그룹 5에 속하는 균주의 베타-1,4-D-만난아제의 아미노산 서열과 각각 37.9, 37.2, 35.7, 13.8, 13, 12.6, 11.9, 9.8, 8.3 및 8%의 서열 상동성을 보였다(도 3 참조). 반면, 효소활성에 중요한 Glu181과 Glu312의 두 잔기(Koshland, P. J., Biol. Rev., 28: 416-436, 1953) 및 Gly41과 Gly76의 두 잔기(Lo Leggio, L. & Larsen, S., FEBS Letters, 523: 103-108, 2002)는 글리코실 하이드롤라아제 그룹 5 의 균주에서와 같이 모두 보존되었고, 이외에 9개의 잔기(Arg81, Asn180, Pro182, Phe276, His280, Tyr282, Pro307, Gly337 및 Trp341) 또한 보존됨을 확인할 수 있었다(도 2a 및 2b 참조). 이는, 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제가 글리코실 하이드롤라아제 그룹 5에 속하는 효소임을 의미한다. 이와 함께, 본 발명의 베타-1.4-D-만난아제는 계통발생학적으로 진핵생물내에 상기 효소가 주로 존재하는 그룹인 하위그룹 7 및 원핵생물내에 상기 효소가 주로 존재하는 그룹인 하위그룹 8에 속하지 않고, 연체동물 유래의 베타-1,4-D-만난아제와 같은 그룹(하위그룹 10)에 포함되어 있음을 확인하였는데(도 3 참조), 이는 Mytilus edulis 유래의 베타-1,4-D-만난아제가 기존의 보고와 달리 새로운 하위그룹 10에 존재한다는 보고와도 일치한다(Larsson, A. M., et al., J. Mol. Biol. 357: 1500-1510, 2006). 따라서, 도 3의 결과와 남극톡토기의 먹이습성(주로 박테리아 및 조류 등을 섭식; Broady, 1979) 등을 고려할 때, 상기 베타-1,4-D-만난아제는 남극톡토기에 존재하는 소화효소임을 확인할 수 있다. 또한, 남극톡토 기 유래의 베타-1,4-D-만난아제는 표 1에서와 같이 연체동물인 H. discus, B. glabrata 및 M. edulis의 베타-1,4-D-만난아제에 비해 아스파라긴(Asn, 10.21%), 글루타민(Gln, 5.24%) 및 세린(Ser, 10.21%)의 함량이 높고, 알기닌(Arg, 1.05%) 및 알기닌/알기닌+라이신(0.14) 비율이 상대적으로 낮으며, 소수성 아미노산 함량(37.96) 및 지방족 지수 함량(69.45)이 낮고, 두 개의 알라닌(Ala)이 세린226 및 세린227으로 치환되어 있음을 확인하였다(도 2a 및 2b 참조). 이러한 아미노산 구성은 대부분의 저온활성 단백질이 갖는 특징으로서, 단백질의 구조적 유연성(structural flexibility)을 증가시켜 저온에서 활성을 유지하도록 해준다(Cieslinki, H., et al., Protein Expr. Purif., 39: 27-34, 2005; Asgeirsson, B., et al., Comp. Biochem. Physiol. Part B, 136: 45-60, 2003; Russel, N., Extremophiles, 4: 83-90, 2000). 따라서, 본 발명의 베타-1,4-D-만난아제도 저온에서 높은 활성을 유지하기 위한 구조적 특징을 가지고 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자의 핵산서열을 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제 유전자의 코딩서열을 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, 상기에서 분리한 전장 유전자를 주형으로 cDNA를 증폭하였다. 이때, 사용된 프라이머는 각각 서열번호 4인 정방향 프라이머(5'-NNNNGGCATATGGTGAAATTATTCAGTTTC-3') 및 서열번호 5인 역방향 프라이머(5'-NNNNGGCTCGAGATTAATATTCACTGAAAC-3')를 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 발현벡터는 플라스미드, 코스미드 및 파이지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 T7 lac 프로모터를 가진 pET-24a(+) 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 도 4는 상기 발현벡터의 제작 과정 및 개열 지도를 나타낸 것이다. 또한, 상기 발현벡터를 형질전환시킬 수 있는 숙주세포로는 대장균, 원핵생물, 곰팡이, 식물 및 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 Roseetta(DE3) 대장균을 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)의 저온활성 베타-1,4-D-만난아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환체를 카나마이신이 포함된 LB(Luria-Bertani)배지에서 배양하는 단계;
2) 상기 배양액에 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalatopyranoside)를 첨가하여 단백질을 유도하는 단계;
3) 상기 세포를 침전시켜 분쇄한 후 얻어진 상등액을 금속친화성 레진을 가진 컬럼에 통과시켜 용출하는 단계 및
4) 상기 용출된 단백질을 히스티딘-태깅된 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는, 저온활성 베타-1,4-D-만난아제의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법에 의해 생산된 단백질은 0 내지 35℃ 이하의 온도, 바람직하게는 30℃에서 최적활성을 갖고, pH 2.5 내지 4 이하의 산성조건, 바람직하게는 pH 3.5에서 최적의 안정성을 보이며, Ca2 +, Mg2 +, Cu2 + 및 Zn2 +로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속이온에서 적어도 150% 이상, 바람직하게는 Ca2 + 및 Zn2 + 금속이온에 대해 각각 200% 이상의 효소활성을 보였다(표 3 참조). 이는, 본 발명의 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제(CaMan)가 종래에 보고된 베타-1,4-D-만난아제와는 상당히 다른 생화학적 특징을 가지고 있음을 의미한다. 즉, 상기 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제는 기존의 박테리아, 곰팡이, 식물 및 연체동물 유래의 베타-1,4-D-만난아제[Vibrio sp에서는 40℃(Tamaru, Y., et al., Appl. Environ. Microbiol., 61: 4454-4458, 1995); H. discu에서는 45℃; M. edulis에서는 50℃에서 최적활성을 보임]에 비해 가장 낮은 온도에서 최적활성(30℃)을 보였으며, 20℃ 이하의 저온 특히, 0-5℃에서 약 40%의 높은 활성을 나타내었다(도 6a 참조). 또한, 남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제가 pH 3.5에서 최적의 효소활성 및 산성조건에서 안정성을 갖는 특징은 대부분 중성 및 약산성에서 높은 활성을 보이는 기존의 베타-1,4-D-만난아제 즉, 박테리아는 대부분 pH 5.0-9.0(Akino, T., et al., Agric. Bio. Chem., 52: 773-779, 1988), 곰팡이는 pH 2.9-6.0(Gubitz et al., 1965 ; Reese, E. T. & Shibata, Y., J. Microbiol., 11: 167-, 1965) 및 연체동물은 pH 5.2-7.5에서 각각 효소활성을 나타낸 것과 구별된다. 또한, 상기 효소는 Ag+ 및 Hg2 + 에 의해 효소활성이 현저하게 억제되었는데(표 3 참조), 이러한 특징은 대부분의 모든 베타-만난아제 효소(Akino, T., et al., Agric. Bio. Chem., 52: 773-779, 1988; Araki, 1983; Ootsuka, S., et al., J. Biotechnol., 125: 269-280, 2006; Yamamura, I., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 60: 674-676, 1996)들과 일치한다. Ca2 + 및 Mg2 + 이온에 의한 효소활성의 증가(Araki, 1983)는 A. hydrophila 및 P. purprogenum 유래의 효소 특징과 유사한 반면,　Cu2 + 및 Zn2 + 이온에 의한 효소활성 증가는 기존에 보고된 효소 특징과는 구별된다.
또한, 본 발명의 남극톡토기 유래의 저온활성 베타-1,4-D-만난아제 단백질은 저온공정이 필요한 식품, 제지 및 발효 산업뿐 아니라 식품첨가물 및 사료첨가물로 유용하게 사용될 수 있다. 이때, 상기 저온공정이 필요한 식품 및 발효 산업으로는 특별히 제한되는 것은 아니나, 열처리에 치명적이며 풍미를 유지해야 하는 과실추출 산업, 저온공정이 필요한 햄 및 소시지와 같은 발효육제품, 발효생식제품, 김치 및 발효주 산업을 포함할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 식품첨가물로 사용할 경우 첨가되는 양은 특별히 제한되는 것은 아니며, 그 용도에 따라 다르게 이용될 수 있다. 또한, 사료첨가물로 사용할 경우, 상기 단백질을 직접 사료에 첨가하거나 또는 적당한 부형제와 혼합한 후 동결건조를 통해 고형화(또는 분말화)하여 이를 사료에 첨가하여 섭취시키는 것이 바람직하다. 상기 부형제로는 예를 들면, 옥수수분말, 대두분말 및 대두박 등을 포함할 수 있다. 사료첨가물로 사용할 경우, 상기 단백질은 특별히 제한되는 것은 아니나, 사료조성물 당 0.05중량% 이상 첨가되는 것이 바람직하다 (http://www.chemgen.com/hemicell-d.shtml;http://www.chemgen.com/docs/beta-mannanase.pdf).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 남극톡토기 ( C. antarcticus ) 유래의 베타-1,4-D- 만난아제 유전자 분리 및 아미노산 서열분석
<1-1> 시료 준비 및 전체 RNA 분리
사우스 쉐틀랜드 아이슬랜드(South Shetland Island)에 위치한 남극세종과학기지 주변의 이끼로부터 남극톡토기(C. antarcticus)를 수집한 후, 곧바로 99.9% 알코올에 첨가하여 -70℃에서 보관하였다. 급속동결된 상기 남극톡토기로부터 전체 RNA를 분리하기 위하여, 알코올을 완전히 제거한 후 트리졸(Trizol) 용액(Invitrogen, 미국)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 1% 포름알데하이드 아가로스 겔에서 그 순도를 확인한 후, ND-1000 분광분석기(Nanodrop, 미국)을 이용하여 그 양을 측정하였다.
<1-2> cDNA 라이브러리 제작 및 베타-1,4-D- 만난아제 클론 유전자 분석
Creator SMART cDNA 라이브러리 키트(Clontech, 미국)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 합성하였다. cDNA를 합성한 후 양쪽 말단에 어뎁터 DNA를 연결하였고, 이를 SfiI 제한효소(Promega, 미국)로 절단하여 pDNR-LIB 벡터에 연결한 후 DH5α 균주에 형질전환하였다. 이로부터 약 2000여개의 발현 유전자가 클로닝된 클론을 얻었고, Big dye terminator 키트(PE Applied Biosystems) 및 자동서열분석기(ABI3100)를 이용하여 상기 클론들의 서열을 분석하였다. 분석된 염기서열들은 NCBI 데이터베이스, Pfam 데이터베이스 및 ExPASy 프로테오믹스 데이터베이스를 각각 이용하여 다른 베타-1,4-D-만난아제 유전자의 서열과 비교분석하였 다. 상기 약 2000여개 클론들의 염기서열을 분석한 결과, 본 발명의 베타-1,4-D-만난아제 유전자는 전체 1,248 bp의 전장서열(서열번호 3)을 가지며, 21개의 시그널 펩타이드를 포함하는 382개의 아미노산 서열(서열번호 2), 이를 코딩하는 1,149 bp의 개방해독틀(ORF, 서열번호 1), 및 3'-말단에 폴리아데닐레이션A(aataaa)를 포함하는 1218 bp의 폴리뉴클레오티드로 구성됨을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
<1-3> 상동성 분석 및 계통수( Phylogenetic tree ) 분석
상기 남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제의 아미노산 서열은 H. discus hannai(HdMan), B. glabrata(BgMan), M. edulis(MeMan), A. aculeatus(AaMan), A. bisporus(AbMan), L. esculentum(LeMan), H. jecorina(HjMan), T. fusca(TfMan), C. saccharolyticus(CsMan) 및 C. cellulovorans(CcMan) 유래의 글리코실 하이드롤라아제 그룹 5 효소(하위그룹 10, 하위그룹 7 및 하위그룹 8)의 아미노산 서열과 상동성을 비교하였고, 그 결과 도 2에서와 같이 상기 남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제는 상기 균주의 아미노산 서열과 각각 37.9, 37.2, 35.7, 13.8, 13, 12.6, 11.9, 9.8, 8.3 및 8%의 상동성이 있음을 확인하였다. 반면, 효소활성에 중요한 Glu181과 Glu312의 두 잔기 및 Gly41과 Gly76의 두 잔기는 글리코실 하이드롤라아제 그룹 5 효소와 남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제에 모두에서 보존되어 있었고, 이 외에도 9개의 잔기(Arg81, Asn180, Pro182, Phe276, His280, Tyr282, Pro307, Gly337 및 Trp341)가 모두 보존됨을 확인할 수 있었다(도 2a 및 2b). 이는, 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제가 글리코실 하이드롤라아제 그룹 5에 속하는 효소임을 의미한다.
지금까지 베타-1,4-D-만난아제 효소는 계통발생학적으로 진핵생물내에 상기 효소가 주로 존재하는 그룹인 하위그룹(subfamily) 7 및 원핵생물내에 상기 효소가 주로 존재하는 그룹인 하위그룹 8로 구분되어 왔다(Hilge, M., et al., Structure, 6: 1433-1444, 1998). 이에, 본 발명자들은 남극톡토기에서 분리된　베타-1,4-D-만난아제가 상기 그룹에 포함되는지 혹은 다른 독립된 그룹으로 이루어져 있는지 계통수 분석을 수행하였고, 그 결과 남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제는 연체동물 유래의 베타-1,4-D-만난아제와 같은 그룹(하위그룹 10)을 이룬 반면, 박테리아(하위그룹 8)와 곰팡이 및 식물(하위그룹 7)과는 다른 그룹으로 존재하고 있음을 확인하였다(도 3).
<1-4> 아미노산 조성분석
본 발명의 베타-1,4-D-만난아제가 저온활성 단백질의 특징이 있는지 확인하기 위하여 아미노산 조성을 분석하였고, 그 결과 표 1에서와 같이 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제는 연체동물 유래의 베타-1,4-D-만난아제보다 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln) 및 세린(Ser)의 양은 높은 반면, 알기닌(Arg) 및 알기닌/(알기닌+라이신) 비율이 상대적으로 낮았고, 소수성 아미노산 함량 및 지방족 지수(aliphatic index) 함량이 낮음을 확인하였다(표 1). 또한, 두 개의 알라닌(Ala) 잔기가 세린(세린226 및 세린227) 잔기로 치환되어 있었다(표 1). 이는, 본 발명의 베타-1,4-D-만난아제가 저온에서도 높은 활성을 가질 수 있음을 시사한다.
[표 1] 아미노산 조성 비교
Figure 112006088017396-pat00001
< 실시예 2> 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D- 만난아제 유전자의 클로닝 , 발현 및 정제
남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위하여, 서열번호 4인 정방향 프라이머(5'-NNNNGGCATATGGTGAAATTATTCAGTTTC-3') 및 서열번호 5인 역방향 프라이머(5'-NNNNGGCTCGAGATTAATATTCACTGAAAC-3')를 이용하여 증폭하였다. 이때, 상기 정방향 및 역방향 프라이머의 밑줄친 부분은 각각 Nde I 및 Xho I 제한효소를 가리키며, PCR 산물을 Nde I 및 Xho I으로 절단한 후 Nde I/Xho I으로 절단된 pET-24a(+) 벡터(Novagen, 미국)에 클로닝하기 위하여 설계되었다(도 4).　 그 결과, 최종 발현벡터인 pETCaMan를 제조하였으며, 상기 벡터의 서열분석 및 발현을 위해서 숙주세포인 Rosetta(DE3) 대장균에 형질전환하여 형질전환체를 제조하였다. 상기 유전자의 발현은 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가한 후 18℃에서 24시간 동안 배양함으로써 유도하였다. 상기 세포를 4℃에서 20분간 6,000g에서 원심분리하여 수득한 후 500mM 염화나트륨 및 5 mM 이미다졸 (Sigma, 미국)이 첨가된 20 mM 트리스-HCl 완충용액(pH 7.9)에서 재현탁하였다. 초음파를 이용하여 상기 세포를 분쇄하였고, 4℃에서 20분간 17,000g에서 원심분리하여 얻은 상등액을 금속친화성 레진(Ni-NTA His-Bind Resin, Novagen, 미국)을 가진 컬럼에 통과시킨 후　60 mM 이미다졸이 첨가된 500mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스-HCl 완충용액(pH 7.9)으로 세척하였고, 1M 이미다졸이 첨가된 상기 완충용액으로 베타-1,4-D-만난아제를 용출하였다. 상기 분획물은 10% 글리세롤이 첨가된 50 mM 소디움아세테이트(pH 6.0)완충용액으로 바꿔주었다. 단백질 농도는 브래드포드(Bradford, M. M., Ana. Biochem., 72: 248-254, 1976) 방법으로 측정하였고, 히스티딘-태깅된 affinity 크로마토그래피를 이용하여 정제된 상기 단 백질을 SDS-PAGE에 전기영동하여 그 순도를 확인하였다. 그 결과, 도 5에서와 같이 상기에서 분리된 효소(CaMan)는 약 42 kDa의 크기임을 확인하였고(도 5), 단백질 회수율은 약 20.25 %임을 확인할 수 있었다(표 2).
[표 2] 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제 효소 정제
Figure 112006088017396-pat00002
< 실시예 3> 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D- 만난아제 효소의 생화학적 특징 분석
남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제(CaMan) 효소의 활성을 조사하기 위하여, 상기 효소(0.5 U/ml) 및 0.5%(w/v)의 로커스트빈검(Locust Bean Gum: LBG)을 50 mM의 소디움시트레이트 완충용액(pH 3.5)에서 혼합한 후 30℃에서 30분간 배양하여 상기 효소분해에 의해 유리되는 로커스트빈검의 환원당량을 측정하였다. 상기 환원당량은 디니트로살리실릭산(Dinitrosalicylic acid: DNS) 방법(Stalbrand, H., et al., J. Biotechnol., 29: 229-242, 1993)을 이용하여 측정하였고, 베타-1,4-D-만난아제 효소활성의 1단위는 분(min) 당 만노오스 및 등가의 1μmole의 환원당을 유리시키는 효소의 양으로 정하였다.
표 2에서와 같이, 분리된 남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제(CaMan)의 특이적 활성은 29.06 U/mg-1 이었다(표 2). 또한, 상기 효소는 30℃에서 최적 활성을 보였으며, 0 내지 5℃에서도 38-42%의 효소활성을 유지하고 있었다(도 6a). 또한, 상기 효소의 최적 pH는 3.5로서 산성 pH 조건에서는 안정적이었으나, 중성 및 염기성 pH에서는 효소활성이 거의 나타나지 않고 불안정하였다(도 6b). 또한, 금속이온에 대한 상기 효소의 활성변화를 측정한 결과, 표 3에서와 같이 무처리군에 비해 Ca2 +, Mg2 +, Cu2 + 및 Zn2 +를 처리한 군에서는 효소활성이 증가된 반면, Ag+ 및 Hg2 +를 처리한 군에서는 효소활성이 현저하게 억제됨을 확인하였다(표 3). 특히, Ca2 + 및 Zn2 +에 의해서는 효소활성이 2배 이상 증가하였다(표 3)
[표 3] 베타-1,4-D-만난아제의 활성에 대한 금속이온의 효능
Figure 112006088017396-pat00003
이와 같은 남극톡토기 베타-1,4-D-만난아제(CaMan)의 생화학적 특징은 기존에 알려진 다른 만난아제와 현저한 차이를 보였다(표 4). 즉, 상기 효소가 저온의 산성조건에서 높은 효소활성을 보인 반면, 박테리아, 균류 및 연체동물 유래의 만난아제는 모두 40℃ 이상의 중온 또는 고온에서 최고 활성을 보였으며, pH 조건이 중성, 약한 산성, 또는 염기성에서 높은 활성을 보였다(예외: Sclerotium rofsii, 산성에서 활성 보임).
[표 4] 베타-1,4-D-만난아제의 생화학적 특징 비교
Figure 112006088017396-pat00004
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의해 최초로 분리된 남극톡토기 유래의 베타-1,4-D-만난아제 효소는 저온에서 그 활성을 유지할 수 있으며, 산성조건에서도 활성이 높기 때문에 저온공정이 필요한 식품, 제지 및 발효 산업뿐 아니라 식품첨가물 및 사료첨가물로서 유용하게 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)로부터 유래되며, pH 2.5 내지 4 이하의 산성조건에서 안정적이며, 온도 범위 0 내지 35℃ 이하에서 효소활성을 유지하며, 및 Ca2+, Mg2+, Cu2+ 및 Zn2+로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속이온에서 적어도 150% 이상의 효소활성을 나타내는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 저온활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제 단백질.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 저온활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제 단백질.
  4. 삭제
  5. 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)로부터 분리한 저온활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 5항의 유전자 핵산서열을 포함하는 벡터.
  7. 삭제
  8. 제 6항의 벡터를 도입하여 형질전환된 형질전환체.
  9. 1) 제 5항에 따른 남극톡토기(Cryptopygus antarcticus)의 저온활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환체를 카나마이신이 포함된 LB(Luria-Bertani)배지에서 배양하는 단계;
    2) 상기 배양액에 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalatopyranoside)를 첨가하여 단백질을 유도하는 단계;
    3) 상기 세포를 침전시켜 분쇄한 후 얻어진 상등액을 금속친화성 레진을 가진 컬럼에 통과시켜 용출하는 단계 및
    4) 상기 용출된 단백질을 히스티딘-태깅된 친화성 크로마토그래피를 이용하 여 정제하는 단계를 포함하는, 저온 활성 및 내산성 베타-1,4-D-만난아제의 제조방법.
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