KR102594729B1 - 식품 등급 균주를 통한 고온저항성 κ-카라기나제 생산 방법 - Google Patents

식품 등급 균주를 통한 고온저항성 κ-카라기나제 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 N-말단 신호전달 펩타이드 유전자, 서열번호 1로 표시되는 cgkA 유전자 및 C-말단 6 × His tag 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 효모 균주, 상기 재조합 효모 균주를 이용한 κ-카라기나제(κ-carrageenases) 생산 방법 및 상기 생산방법에 의해 생산된 엔도-타입(endo-type) κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 제공하는 데에 있다. 본 발명은 식품 등급 균주를 통한 고온저항성 κ-카라기나제 생산 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 해양 박테리아 비브리오 속(Vibrio sp.) SY01로부터 κ-카라기나제 유전자인 cgkA를 클로닝하여, 식품 등급 균주인 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에서 분비 발현시켰다. 정제된 CgkA는 고온-저항성 효소이고, 재조합 CgkA는 엔도-타입 효소로서 주요 효소적 산물은 κ-카라디아오스(κ-carradiaose)였고, κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)가 최소 기질이었다. 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 분석 결과, κ-카라디아오스는 항산화 활성을 나타냈다. 이에, CgkA는 항산화 κ-COS의 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

식품 등급 균주를 통한 고온저항성 κ-카라기나제 생산 방법{Method for producing a thermo-tolerant κ-carrageenase via a food-grade host}
본 발명은 식품 등급 균주를 통한 고온저항성 κ-카라기나제 생산 방법에 관한 것이다.
주로 홍조류로부터 추출되는 황산화된 선형 다당류인 카라기난(carrageenan)은 식품 첨가물, 안정화제 및 유화제로 상업적으로 사용된다. 에스테르 설페이트기의 수 및 3,6-안하이드로-α-D-갈락토피라노스(3,6-anhydro-α-D-galactopyranose; 3,6-AG)의 존재에 따라, 카라기난은 κ-, ι- 및 λ-카라기난으로 나누어진다. κ-카라기난 폴리머는 많은 에스테르 설페이트기 (25-30%) 및 3,6-AG (28-35%)를 포함하는데, 이는 우수한 겔화 능력 및 생물학적 활성을 제공한다. 이에, 기능성 식품으로서, κ-카라기난은 미국 식품의약국(Food and Drug Administration; FDA)에 의해 일반적으로 안전하다고 간주되는 물질(generally regarded as safe; GRAS)이다.
κ-카라기나제(κ--Carrageenases)는 κ-카라기난의 β-글리코시드 연결을 절단하여, 반응생성물로서 낮은 중합도(degrees of polymerization; DP)의 κ-카라기난 올리고당(κ-carrageenan oligosaccharides; κ-COSs)을 생산한다. κ-COSs는 항산화, 항바이러스, 항종양 및 항염증 특성을 포함한 다양한 생물학적 활성을 나타낸다. 지금까지, 보고된 모든 κ-카라기나제는 탄수화물-활성 효소(carbohydrate-active enzymes; CAZy) 데이터베이스 내의 글리코시드 하이드로라제(glycoside hydrolase; GH) 패밀리 16에 속한다. κ-카라기나제를 사용한 효소 가수분해는 다당류를 κ-COSs로 분해시키는데 유리한 과정이다. 산 가수분해와 비교하여, 효소 가수분해는 다음과 같은 많은 장점이 있다. (i) 다당류의 α-1,3 골격 구조의 왜곡 없이, β-1,4 글리코시드 밴드를 특이적으로 분해; (ii) 에스테르 설페이트기 및 3,6-AG의 완전한 보존; (iii) 산성 시약의 대량 소비 없는 환경친화적 공정; 및 (iv) 온순 조건 하에서 쉽게 조절되는 반응 생성물. 그럼에도 불구하고, 보고된 κ-카라기나제의 반응 산물은 일반적으로 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose), κ-카라헥사오스(κ-carrahexaose) 및 κ-카라옥타오스(κ-carraoctaose)의 혼합물이었다. 올리고당 분리는 매우 어려운데, 올리고당의 구조-기능 관계 상의 연구에 한계가 있다. 따라서 κ-COS 적용에 있어 큰 도움이 되는, 단일 균질 산물을 얻을 수 있는 κ-카라기나제를 발굴하는 것이 중요하다.
지금까지, 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas), 스와넬라(Shewanella), 조벨리아(Zobellia)와 같은 여러 종류의 해양 박테리아가 κ-카라기나제를 생산하는 것으로 보고되어 왔다. 천연 미생물 세포로부터의 κ-카라기나제 생산성은 실질적인 요구를 거의 충족시킬 수 없다. κ-카라기나제의 생산성을 높이는 것은 그의 적용 가치를 얻기 위한 전제조건이다. 이전 연구에서, 대부분의 재조합 κ-카라기나제는 대장균(Escherichia coli)에서 이종 발현되었는데, 이는 약한 분비능, 엔도톡신 합성 및 세포벽 발열물질(pyrogens)의 존재로 인해 산업적 생산에 있어서는 일반적으로 한계가 있다.
한국공개특허 제10-2014-0099629호(2014.08.13 공개)
본 발명의 목적은 N-말단 신호전달 펩타이드 유전자, 서열번호 1로 표시되는 cgkA 유전자 및 C-말단 6 × His tag 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 효모 균주, 상기 재조합 효모 균주를 이용한 κ-카라기나제(κ-carrageenases) 생산 방법 및 상기 생산방법에 의해 생산된 엔도-타입(endo-type) κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 효모 균주를 배양하여 얻어진 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 및 정제된 κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물 또는 식품 첨가제를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 N-말단 신호전달 펩타이드 유전자, 서열번호 1로 표시되는 cgkA 유전자 및 C-말단 6 × His tag 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 효모 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 효모 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 재조합 효모 균주로부터 CgkA를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 κ-카라기나제(κ-carrageenases) 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된 엔도-타입(endo-type) κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 효모 균주를 배양하여 얻어진 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 및 정제된 κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 효모 균주를 배양하여 얻어진 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 및 정제된 κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명의 목적은 N-말단 신호전달 펩타이드 유전자, 서열번호 1로 표시되는 cgkA 유전자 및 C-말단 6 × His tag 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 효모 균주, 상기 재조합 효모 균주를 이용한 κ-카라기나제(κ-carrageenases) 생산 방법 및 상기 생산방법에 의해 생산된 엔도-타입(endo-type) κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 제공하는 데에 있다. 본 발명은 식품 등급 균주를 통한 고온저항성 κ-카라기나제 생산 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 해양 박테리아 비브리오 속(Vibrio sp.) SY01로부터 κ-카라기나제 유전자인 cgkA를 클로닝하여, 식품 등급 균주인 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에서 분비 발현시켰다. 정제된 CgkA는 고온-저항성 효소이고, 재조합 CgkA는 엔도-타입 효소로서 주요 효소적 산물은 κ-카라디아오스(κ-carradiaose)였고, κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)가 최소 기질이었다. 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 분석 결과, κ-카라디아오스는 항산화 활성을 나타냈다. 이에, CgkA는 항산화 κ-COS의 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 κ-카라기나제들의 진화적 분석 결과를 나타낸다. (A) κ-카라긴(κ-carrageen) 폴리머 및 카라테트라오스(carratetraose)의 화학구조에 대한 모식도를 나타낸다. (B) CgkA와 다른 κ-카라기나제들의 계통수를 나타낸다.
도 2은 CgkA와 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)의 서열 로고 분석 및 분자 도킹 결과를 나타낸다. (A) CgkA와 보고된 다른 κ-카라기나제들의 서열 로고 분석 결과를 나타낸다. (B) κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)와 결합하는 CgkA의 촉매성 산을 나타낸다. (C) 효소/기질 상호작용을 나타내는 모식도이다.
도 3은 재조합 CgkA의 분비성 발현 및 정제 결과를 나타낸다. (A) 배지 내로 분비되는 κ-카라기나제 활성에 대한 시간 곡선을 나타낸다. (B) 정제된 CgkA (6 × His tag으로 재조합)의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 재조합 CgkA의 생화학적 특성 분석 결과를 나타낸다. (A) CgkA의 최적 온도 분석 결과를 나타낸다. (B) CgkA의 열-안정성 분석 결과를 나타낸다. (C) 및 (D) 열-불활성화된 CgkA의 효소 활성에 대한 반응 온도(C) 및 시간(D)의 효과 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 CgkA의 반응 패턴 및 반응 산물 분석 결과를 나타낸다. CgkA의 반응 산물에 대한 TLC 분석 (A), SE-HPLC 분석(B) 및 ESI-MS 분석(C) 결과를 나타낸다.
도 6은 효소성 카라비오스(κ-carrabiose)의 항산화 활성 분석 결과를 나타낸다. (A) 효소성 κ-COS (κ-COS-E) 및 산-가수분해된 κ-COS (κ-COS-A)의 TLC 분석 결과를 나타낸다. (B) ABTS 방법을 사용하여 CgkA 항산화 활성을 시험관 내(In vitro) 분석 결과를 나타낸다. (C) Caco-2 세포에 대한 분석 결과를 나타낸다. (D) 섬유아세포에 대한 분석 결과를 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 해양 박테리아 비브리오 속(Vibrio sp.) SY01로부터 새로운 GH 패밀리 16의 κ-카라기나제-코딩 유전자를 클로닝하였고, 식품 등급 숙주인 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에서 발현시켰다. 분비된 CgkA는 엔도-타입 효소로서, 주요 산물로 κ-카라디아오스(κ-carradiaose)을 얻을 수 있었다(반응 산물의 87.6%). 또한, CgkA는 열-안정성 특성을 나타냈는데, 이는 항산화 κ-COS를 생산하는 데 있어, 생물공학적으로 적용하기 위한 좋은 후보라는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 N-말단 신호전달 펩타이드 유전자, 서열번호 1로 표시되는 cgkA 유전자 및 C-말단 6 × His tag 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
상기 N-말단 신호전달 펩타이드 유전자는 서열번호 2로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 1로 표시되는 cgkA 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CgkA 단백질을 코딩한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 효모 균주를 제공한다.
상기 효모는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 효모 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 재조합 효모 균주로부터 CgkA를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 κ-카라기나제(κ-carrageenases) 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된 엔도-타입(endo-type) κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 제공한다.
바람직하게는, 상기 κ-카라기나제(κ-carrageenases)는 열-안정성 효소이며, κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)를 최소 기질로 하고, 최종 효소 반응 산물은 κ-카라디아오스(κ-carradiaose)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 효모 균주를 배양하여 얻어진 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 및 정제된 κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물인 경우, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 김치, 젓갈을 포함한 발효제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 효모 균주를 배양하여 얻어진 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 및 정제된 κ-카라기나제(κ-carrageenases)를 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명의 식품 첨가제는 식품에 추가적으로 첨가되는 보존료, 살균제, 산화 방지제, 향신료, 조미료, 감미료, 착향료, 팽창제, 강화제, 개량제, 유화제, 여러 가지 영양제, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색료, 발색제, 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 소포제, 용제, 이형제, 방부제, 품질 개량제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 있으며, 식품에 침지, 분무 또는 혼합하여 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. κ- 카라기나제 코딩 유전자의 서열 분석
본 발명에 사용된 해양 박테리아 Vibrio sp. SY01은 황해 퇴적물로부터 분리되었다. 상기 균주는 China Center for Type Culture Collection에 보존되었다(CCTCC, No. M2018769). 본 발명자들의 이전 연구에서, Vibrio sp. SY01 균주는 게놈 서열이 분석되었다. 유전자 발현 프라이머(PcgkA-EF and PcgkA-ER)는 표 1에 기재하였다. CgkA 단백질의 신호전달 펩타이드는 SignalP (version 5.1) server로 분석하였다. CgkA의 도메인 분석은 NCBI 데이터베이스의 Conserved Domain Database (CDD) 비교를 기반으로 하였다. CgkA의 이론적 등전점(isoelectric point; pI) 및 이론적 분자량(molecular weight; Mw)을 추가 분석하기 위해서, Expasy website (https://www.expasy.org/)의 pI/Mw Tool을 사용하였다. 유사 단백질 서열을 검색하기 위해서, NCBI의 BLAST 알고리즘을 사용하였다. 다중 서열 비교는 ClustalX (version 2.1)를 사용하여 분석하였다. CgkA 및 이전에 보고된 GH 패밀리 16의 κ-카라기나제에 대한 계통수는 MEGA 내 bootstrapping neighbor-joining method을 사용하여 작성하였다(version 6.0).
Primer name Primer sequences (5'-3')
PcgkA-EF CATG CCATGGATGCTGGGCACCCCGAGCC
PcgkA-ER CCG CTCGAGGTTCACGGTGATCATCA
2. 분자 모델링 및 도킹 분석
κ-카라기나제 CgkA의 3차원(three-dimensional; 3D) 구조는 Modeller 9.18 package (https://salilab.org/modeller/)를 사용하여 상동성 모델링 방법에 의해 확립되었다. 90.48%의 서열 동일성 범위를 갖는 슈도알테로모나스 카라기노보라(Pseudoalteromonas carrageenovora; PDB ID: 5OCQ) 유래 κ-카라기나제의 결정 구조를 주형으로 선택하였다. 최적 DOPE 점수를 가진 구조를 추가 도킹 분석을 위해 선택하였다. 리간드[κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)]는 ChemDraw Ultra (version 12.0)로 그렸다. 이후, 도킹을 위해 AutodockVina (version 1.1.2)를 사용하였다. 도킹 파라미터는 표 2에 나타냈다. 상기 툴은 결합 모드 및 친화도를 예측하여 새로운 결합체를 식별한다. Pymol (version 0.99)은 도킹 솔루션을 시각화하고, 그래픽 표시 및 그림 표현을 구축하는데 사용하였다.
Parameters Value
X coordinate of the center 26.324
Y coordinate of the center 13.146
Z coordinate of the center 69.289
size in the X dimension 22 Å
size in the Y dimension 22 Å
size in the Z dimension 22 Å
-maximum number of binding modes to generate 10
maximum energy difference between the best binding mode and the worst one displayed 4 kcal/mol
exhaustiveness 32
3. 재조합 CgkA의 분비성 발현 및 정제
코돈 최적화 후, N-말단 XPR2 신호전달 펩타이드 유전자 및 C-말단 6 × His tag를 가진 cgkA 유전자는 Synbio Technologies (Suzhou, China)에서 합성되었다. 합성된 DNA 단편은 pM06 플라스미드를 가진 URA-균주로 형질전환되었고, 형질전환체들은 yeast nitrogen base (YNB) plate에서 추가 스크리닝되었다. 최대 세포외 κ-카라기나제 생산능을 위해, Y. lipolytica A102를 선택하였고, 이후 추가 발효를 위해, 포스페이트 완충액 내 글루코스(glucose in phosphate buffer; GPPB) 배지에서 배양하였다. 발효 48시간 후, 처리된 효모는 원심분리(12,000 rpm, 10분)를 통해 제거하였다. 수확된 발효 상등액은 Ni-NTA column (GE Healthcare, USA)에 로딩되었고, 이후 용출 완충액(150 mM imidazole in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0)으로 AKTA150 FPLC system (GE Healthcare, USA)에서 용출하였다. 정제된 CgkA의 Mw는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 통해 분석하였다.
정제된 효소를 사용하여 추가 분석을 수행하였다. CgkA 활성의 최적 온도는 포스페이트 완충액 (pH 7.5)에서, 0 내지 70℃ 범위의 여러 온도에서 결정되었다. CgkA의 열안정성을 분석하기 위해서, 효소는 0 - 70℃로 1시간 동안 반응시켰고, 잔여 활성은 40℃에서 측정하였다. CgkA 활성의 최적 pH는 다양한 완충액으로 40℃에서 분석하였다: 50 mM citrate buffer (pH 4.0 - 6.6), 50 mM phosphate buffer (pH 6.0 - 8.0), 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2 - 9.0) 및 50 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.0 - 11.0). CgkA의 pH 안정성을 평가하기 위해서, 효소는 4℃에서, pH 4.0 내지 11.0의 상기 완충액들로 6시간 동안 반응시켰고, 잔여 효소 활성은 최적 조건에서 측정하였다.
열-처리된 CgkA의 활성에 있어 저온의 효과를 확인하기 위해서, 효소를 5분 동안 열처리하고, 0, 10, 20, 30, 40℃에서 0 - 60분 동안 즉시 반응시켰다. 잔여 활성은 최적 조건에서 측정하였다. 음성 대조군으로, 열처리 후 즉시 잔여 활성을 측정하여, 저온 반응의 영향을 확인하였다. 열처리하지 않은 효소의 활성은 100%로 가정하였다.
CgkA 효소 활성에 있어, 여러 금속 이온, 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS) 및 EDTA (1 mM)의 효과는 기질 용액에서 측정하였다. CgkA의 기질 특이성은 κ-카라기난, ι-카라기난, λ-카라기난 및 아가로스를 기질로 사용하여 시험하였다. CgkA의 반응속도 상수는 κ-카라기난 농도를 달리하여 측정하였다(0.1 내지 8 mg/mL).
4. κ- 카라기나제 활성 측정
CgkA 활성은 3,5-디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid; DNS) 방법을 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 900 μL의 κ-카라기난 기질(0.2% (w/v) in 50 mM phosphate buffer, pH 7.5)을 100 μL의 적절하게 희석된 효소와 40℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 750 μL의 DNS를 반응 혼합물에 첨가하였고, 10분 동안 끓였다. 그 후, 반응 혼합물을 12,000 g로 5분 동안 원심분리하여, 침전물을 제거하였고, 520 nm에 측정하였다. D-갈락토스(D-galactose)는 표준 곡선을 만들기 위해 사용하였다. 1 유닛(1 U)의 κ-카라기나제 활성은 상기 조건하에서 분당 1 μmol 환원당(D-갈락토스에 해당)을 생산하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.
5. 작용 패턴, 반응 산물 및 최소 기질 분석
CgkA의 작용 패턴을 확인하기 위해서, 상대 점도에 대한 점도 측정 분석을 Ostwald viscometer (No.1; Shibata Scientific Technology Ltd, Fukuoka, Japan)를 사용하여 수행하였다. 100 mL κ-카라기난 용액(5 g/L)에 첨가된 5 mL CgkA (5 U/mL)를 사용하여 반응을 수행하였다. 반응 시스템은 40℃에서 60분 이상 반응시켰다. 분해 반응에 따라, 20 mL의 반응 산물을 여러 시간(1, 5, 10, 15, 30, 60분)에서 제거하여, 상대 점도를 측정하였다.
박막 크로마토그래피(Thin-layer chromatography; TLC)를 수행하여, CgkA에 대한 작용을 추가 분석하였다. CgkA 용액 (1 mL, 20 U)을 10 mL 기질 (2 mg/mL of κ-카라기난 in 20 mM phosphate buffer, pH 7.5)과 혼합하였고, 40℃에서 여러 시간 동안 반응시켰으며, 0, 1, 5, 10, 15, 30, 60 분에 샘플링 하였고, 이후에는 12시간 까지 매시간 샘플링 하였다. 반응 산물은 HPTLC plate (Merck, Darmstadt, Germany) 상에서 TLC를 사용하여 분석하였는데, n-부탄올/포름산/물 (2:1:1, by vol)로 진행하였다. 80℃에서 30분 동안 건조 및 염색 후, 디페닐아민/아닐린/포스페이트 시약으로 TLC 플레이트를 가시화하였다. CgkA의 최종 산물을 분석하기 위해서, 12시간 후의 반응 산물을 AKTA Avant 150 platform (GE Health, USA) 상의 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(size-exclusion high-performance liquid chromatography; SE-HPLC)를 통해 시차 굴절 검출기가 장착된 Superdex peptide 10/300TM column (GE Health, USA)을 이용하여 추가 분석하였다. 이동상은 0.2 M 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)이었다. 컬럼 압력은 1.5 MPa으로 제한되었고, 유속은 0.5 mL/min이었다. 또한, 최종 산물은 음이온-전기 분무 이온화 질량분석법(electrospray ionization mass spectroscopy; ESI-MS)을 통해 분석하였다.
6. 다양한 κ-COS의 항산화 분석
산-가수분해 κ-COS(Acid-hydrolyzed κ-COS; κ-COS-A)는 κ-카라기난(5 g / 500 mL)으로 0.1 M HCl에서 60℃로 반응시킨 후, 4시간 동안 강하게 혼합하였다. 얼음 수조에서 0.1 M NaOH로 중화시켜 반응을 종결시켰다. 이후, Bio-gel-P2 column을 사용하여, κ-COS-A1 및 κ-COS-A2로 가수분해물을 분리하였다. 주로 κ-카라비오스(κ-carrabiose)인, 효소성 κ-COS(Enzymatic κ-COS; κ-COS-E)는 CgkA에 의해 제조되었고, κ-COS-E1으로 명명되었다. 분리된 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)는 κ-COS-E2로 명명되었다. 이후, κ-COS-A 및 κ-COS-E는 모두 탈이온화된 물에 용해되었고, ABTS 방법에 의한 총 항산화능 분석 키트로 시험관 내(in vitro) 산화 저항성을 측정하였다.
또한, 인간 대장암 세포주 (Caco-2) 및 정상 인간 대장 섬유아세포주 (CDD-18Co)에서 항산화 실험을 수행하였다. 세포 배양, 동결보존 및 계대배양은 제품 매뉴얼에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 2.0 mL 세포(5 × 103 cells/well)를 6-웰 플레이트에 첨가하였고 12시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 총 2 mL H2O2 (100 nM/mL)을 각 웰에 첨가하였고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후, 각 웰을 신선한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)로 교체하였다. 동시에, 500 μg/mL 농도로 κ-COS-A1, κ-COS-A2, κ-COS-E1 및 κ-COS-E2을 해당 웰에 처리하였고, 24시간 동안 배양을 유지하였다. 세포 배양이 완료된 후, 상등액 내 T-SOD 및 GSH-Px의 함량을 분석 키트를 사용하여 측정하였다.
< 실시예 1> 서열 분석
세포 외 알긴산 분해효소(alginate lyase) 활성을 가진 해양 박테리아 Vibrio sp. SY01은 이전에 본 발명자 연구실에서 분리되었다. 추가적인 탄소 선별 분석에서, 상기 균주가 κ-카라기난도 분해할 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명에서는, 추정되는 κ-카라기나제-코딩 유전자인 cgkA를 상기 균주로부터 확인하였다. 추정되는 κ-카라기나제인 CgkA는 387개의 아미노산 잔기로 구성되었고, Mw 및 pI는 43,487 Da 및 9.37로 각각 계산되었다. BLAST 분석 및 NCBI CDD에서 비교 결과, CgkA는 GH 패밀리 16 효소로 밝혀졌고, 이는 슈도알테로모나스 카라기노보라(Pseudoalteromonas carrageenovora)(Genbank CAA50624, 89% 상동성) 유래 PcCgkA와 높은 상동성을 보였다. κ-카라기나제의 기작은 도 1A에 나타냈다. 또한, CgkA 및 다른 보고된 GH 패밀리 16 κ-카라기나제들을 포함하는 계통수를 작성하였다(도 1B). CgkA 및 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas) 속 유래 다른 전형적인 κ-카라기나제(GenBank: AFV39914, CAA50624, BAJ61957, ADA83458 and ADD92366)는 큰 클러스터를 형성하였다. GH 패밀리 16 κ-카라기나제들의 촉매 챔버는 이중 치환 기작을 담당하는 특징적인 세작용기 촉매(catalytic triade) ExDxxE를 갖고 있다. 서열 로고 분석 및 다중 서열 비교 분석에 따르면, GH 패밀리 16 κ-카라기나제들에서 보존되는 촉매 잔기(Glu-153, Asp-155 및 Glu-158) 및 기질-상호작용 잔기(Glu-52, Gly-55, Tyr-54, Trp-57, Tyr-136, Ile-139, Tyr-151, Gln-161, His-173, Trp-184, Arg-186, Arg-250, Trp-256, Gln-260 및 Phe-261)가 CgkA의 아미노산 서열에서도 나타났다(도 2A). 상기 결과는 CgkA가 GH 패밀리 16 κ-카라기나제들의 새로운 멤버라는 것을 나타낸다.
상기 효소와 기질의 추정적인 상호작용 기작을 분석하기 위해서, CgkA 및 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)의 분자 도킹은 AutodockVina에서 수행되었다. CgkA 내 필수 잔기 Glu-153은 촉매성 친핵체(catalytic nucleophile)이고, Glu-158은 산/염기 촉매이며, Asp-155는 탈당화 단계를 가속화시킨다. 도 2B에서 나타낸 바와 같이, κ-카라테트라오스(κ-carratetraose) 내 Glu-153 및 β-1,4-글루코시드 결합 사이의 거리(2.7 Å)는 수소 결합과 공존할 수 있다. 전형적인 GH 패밀리 16 κ-카라기나제의 촉매 기작에 있어서, Glu-158 및 절단 사이트는 항상 6.0 Å 거리에 해당하는 단일 물 분자에 의해 분리된다. 또한, 소수성 상호작용을 하는 15개의 잔기 및 수소 결합을 하는 3개의 잔기(Gly-55, Tyr-151 및 Phe-261)를 포함하는, 18개의 잔기가 기질 결합에 관여하는 것으로 밝혀졌다(도 2C). 상기 결과는 CgkA가 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose) 기질과 강하게 결합하여, 가수분해를 촉진시킨다는 것을 나타낸다.
< 실시예 2> 재조합 CgkA의 분비성 발현 및 정제
최근, 여러 κ-카라기나제들이 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas), 스와넬라(Shewanella) 및 조벨리아(Zobellia)를 포함하는 해양 박테리아로부터 분리되고 동정되었다. 비록 상기 효소들이 여러 해양 박테리아로부터 분리되었으나, 천연 미생물 세포 유래 κ-카라기나제의 생산성은 실질적인 요구를 거의 충족시킬 수 없다. κ-카라기나제의 생산성을 높이는 것은 그의 적용 가치를 달성하기 위한 전제조건이다. 지금까지, 많은 κ-카라기나제가 E. coli에서 이종 발현되었는데, 이는 약한 분비능, 엔도톡신 합성 및 세포벽 발열물질(pyrogens)의 존재로 인해 산업적 생산에 있어서는 일반적으로 한계가 있다. 여러 문헌에서, κ-카라기나제의 이종 발현을 시도하였고, 재조합 DNA 기술의 등장으로 이종 발현에 의한 κ-카라기나제 생산성이 일부 향상되었다. 하지만, 세포 외부에서 재조합 단백질의 분비를 가능하게 하는 효과적인 신호 전달 서열의 부족은 산업 공정 생산에 있어 주요한 한계이다. 이에, 발현 시스템을 재구축하고, 배양 조건을 최적화하는 것은 중요한 전략이다.
효모 Y. lipolytica는 "일반적으로 안전하다고 간주되는 물질"(generally regarded as safe; GRAS)에 해당하는 미생물로 분류되고, 많은 박테리아 및 진균 유전자들을 효과적으로 세포 외 발현시키기 위한 우수한 숙주로서 과학적으로 증명되었다. 본 발명에서는, 적합한 κ-카라기나제를 얻고, 안정성을 확보하기 위해서, κ-카라기나제 CgkA의 유전자를 효모 균주에서 최적화하고 발현시켰다. 도 3A에서 나타낸 바와 같이, GPPB 배지(인산 완충액 내 글루코스)에서 60분 동안 배양 후, 재조합 균주 A102에서 κ-카라기나제 활성은 18.9 g/L 바이오매스로 1.3 U/mg 단백질을 획득하였다. 상기 활성은 이전 연구의 재조합 E. coli BL21(DE3)-pET22(+)-cgkA 균주 (1.16 U/mL) 보다 거의 10배 정도 높게 나타났다. CgkA 정제에 대한 요약은 표 3에 나타냈다. 이후, 분비성 CgkA 상등액(1 L)은 Ni-NTA Sepharose를 통해 정제하였고, 최종 수율은 91.9%이었다. 정제된 CgkA의 특정 활성은 12.5 U/mg이었다. SDS-PAGE 분석에서 나타낸 바와 같이, 단일 밴드는 약 43.0 kDa의 분자량으로 나타났고, 이는 이의 이론적 분자량(43,487 Da)과 일치하였다(도 3B).
Purification step Total activity (U) Total protein
(mg)		 Specific activity (U/mg) Recovery (%)
Crude extract 11500 8582 1.3 100
Ni-NTA Sepharose 10564 843 12.5 91.9
< 실시예 3> 정제된 CgkA의 생화학적 특성 분석
CgkA의 최적 반응 온도는 40℃이었고(도 4A), 40℃에서 1시간 동안 반응 후, 효소 활성의 74.1%가 존재하였다(도 4B). CgkA는 pH 7.5의 포스페이트 완충액에서 최고 활성을 나타냈고, 5.0 내지 9.0의 pH 범위에서 안정성을 보였다. 서열 비교 분석 결과, P. carrageenovora 유래 PcCgkA 및 CgkA는 높은 서열 상동성(89%)을 가졌다. PcCgkA의 최적 온도는 CgkA와 동일한 40℃였다. 하지만, CgkA (pH 7.5) 및 PcCgkA (pH 6.0) 사이의 최적 pH는 상이하였다. CgkA 활성에 대한 금속 이온, EDTA 및 SDS의 영향을 시험하기 위한 반응들이 수행되었다.
가열 처리된 CgkA의 회복 활성에 있어 저온의 영향을 확인하기 위해서, 효소는 5분 동안 열처리되었고, 즉시 저온(0 - 40℃)에서 30분 동안 반응시켰다. 도 4C에서 나타낸 바와 같이, 0 내지 40℃ 사이에서 배양 후, CgkA 활성은 15.9 - 56.6% 회복되었다. 최적 반응 온도는 20℃이었다. 반응 온도가 증가할수록, 회복 비율은 떨어졌다. 최적 반응 시간을 확인하기 위해서, 열-불활성화된 CgkA를 여러 시간 범위(1 내지 60분)로 20℃에서 반응시켰다. 도 4D에서 나타낸 바와 같이, 열 회복 비율은 반응시간이 늘어날수록 점차적으로 향상되었다(0 - 30분). 30분 동안 반응 후, 피크 회복 활성은 59.9%를 나타냈다. 60분 동안 반응을 지속한 결과, 회복 활성은 약간 감소하는 것으로 나타났다. 열 회복은 끓여서 불활성화시킨 후 회복될 수 있는 효소 활성에 대한 것이다. 기질 점도를 낮추기 위해 일시적인 고온 처리가 필요한데, 열 회복 활성을 가진 효소는 생촉매로서 우수한 잠재력을 가지고 있다. 이전 연구에서, alginate lyase 및 ι-카라기나제를 포함하는 많은 열-회복성 효소들을 클로닝하고 특성을 분석하였으나, κ-카라기나제의 열 회복성에 대해서는 거의 보고된 적이 없다. 본 발명의 결과는 CgkA가 열-회복성 활성을 가진 것으로 나타났으며, 이는 이후 적용에 있어서 우수한 후보물질이라는 것을 나타낸다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 일반적으로 효소 활성은 K+, Ca2 +, 및 Mg2 +에 의해 활성화되고, SDS 뿐만 아니라 Li+, NH4+, Zn2 +, Cu2 +, Mn2 +, Fe3 +, Al3 + 및 EDTA에 의해 억제된다. 비록 CgkA의 효소 활성이 특정 NaCl 농도에서 향상되었으나, 상기 활성이 NaCl에 의존적이지는 않다. CgkA의 기질특이성은 여러 형태의 카라기난 및 아가로스를 사용하여 시험하였다. CgkA는 엄격한 기질 특이성을 갖는 κ-카라기나제이다. 비록 유사한 백본의 다당류라 하더라도, ι-, λ-카라기난 또는 아가로스는 분해하지 않고, κ-카라기난을 선택적으로 분해한다. κ-카라기난에 대한 CgkA의 동력학 파라미터는 여러 기질 농에서 측정하였고, Lineweaver-Burk 식에 따라 계산하였다. Km, Vmax 및 Kcat 수치는 각각 2.37 mg/mL, 141.9 μmol/min/mg 및 71.1 μmol/min/mg이었다. 이전에 보고된 다른 κ-카라기나제의 Km 및 Vmax 수치와 비교한 결과는 표 5에 나타냈다. κ-카라기나제인 CgkA는 κ-카라기난 기질에 대해 보다 높은 친화도를 나타냈다.
Additives Concentration ( mM ) Relative activity ( % )
Control -- 100.0±3.74
NaCl 1 103.2±1.4
100 200.7±4.7
300 229.9±12.9
500 259.1±7.8
700 231.9±3.2
900 158.3±9.2
KCl 1 120.7±2.93
LiCl 1 47.5±6.9
NH4Cl 1 48.6±7.62
ZnCl2 1 19.8±1.2
CuCl2 1 14±2.42
MnCl2 1 51.4±5.69
CaCl2 1 122.3±2.66
MgCl2 1 130.3±6.88
FeCl3 1 74.7±6.26
AlCl3 1 83.9±6.48
EDTA 1 19.8±8.3
SDS 1 12.5±4.81
Enzyme
 Source Km
(mg/ml)		 Vmax
(μmol/min/mg)		 Kcat
(μmol/min/mg)
CgkA Vibrio sp. SY01 2.37 141.9 71.1
CgkNJ Vibrio sp. NJ-2 2.54 138.89 -
CgkLL1 P. porphyrae 4.4 - -
CgkHC4 Tamlana sp. HC4 7.63 - -
CgkAJ5 Pseudoalteromonas sp. AJ5-13 9.8 - -
Cgksyn P. elongata 6.6 4 -
< 실시예 4> CgkA의 반응 패턴 및 반응 산물 분석
CgkA의 반응 패턴을 확인하기 위해서, 점도 측정 분석을 사용하였다. κ-카라기난 용액의 점도는 CgkA를 첨가한 후 처음 10분 동안 빠르게 감소하였고, 이후 50분 동안 천천히 변화하였는데, 환원당의 양은 60분 동안 천천히 증가하였다. 상기 결과는 CgkA가 엔도-타입 효소라는 것을 나타낸다. 다른 반응 시간에 따른 CgkA 산물을 TLC로 분석하였다(도 5A). 우선, 분해 시간이 증가할수록 큰 중간체가 나타났다. 반응이 진행될수록, CgkA는 큰 중간체를 올리고당으로 분해시켰다. 최종적으로 CgkA의 완전한 효소 가수분해를 통해 κ-카라비오스(κ-carrabiose)를 생산하였다. 상기 결과는 CgkA가 엔도-타입 효소라는 것을 추가적으로 나타낸다.
CgkA의 최종 반응 산물을 확인하기 위해서 SE-HPLC를 사용하였다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, κ-카라비오스(κ-carrabiose)가 주요 산물로 밝혀졌다(전체 산물의 86.7%). 추가적으로, 음이온 ESI-MS를 통해 반응 산물을 추가적으로 확인하였다. 도 5C에서 나타낸 바와 같이, 403.0 m/z에서의 주요 피크는 네오-κ-카라비오스(neo-κ-carrabiose)에 해당하였다. 상기 모든 결과에서 CgkA의 주요 산물은 κ-카라비오스(κ-carrabiose)인 것으로 나타났다. CgkA의 최소 분해 기질을 확인하기 위해서, Biogel P2 컬럼 상에서 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)를 분리하였다. 도 5D에 나타낸 바와 같이, CgkA는 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)를 κ-카라비오스(κ-carrabiose)로 분해할 수 있었다. 효소 산물 비교 분석 결과, CgkA의 최소 기질은 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)였다(도 5A). κ-카라기난 다당류에서 κ-카라비오스(κ-carrabiose)는 최소 반복 유닛이었다. 보고에 따르면, κ-카라기나제의 최소 기질은 κ-카라헥사오스(κ-carrahexaos) 또는 κ-카라옥타오스(κ-carraoctaose)이었는데, 이는 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose)를 추가적으로 가수분해할 수 없었다.
본 발명에서, 본 발명자들은 CgkA가 주요 산물로서 κ-카라비오스(κ-carrabiose)를 생산한다는 것을 밝혀냈다(전체 산물의 86.7%). 또한, 이의 활성은 NaCl에 의존적이지 않았다. 이러한 특성은 산물 분리의 어려움을 감소시켰고, 이후 올리고당 분리에 대한 문제를 해결하였다.
< 실시예 5> 효소성 κ- 카라비오스(κ-carrabiose)의 항산화 활성 분석
이전 보고에 따르면, κ-COS는 강한 항산화 활성을 가지고, 시험관 내(in vitro) 실험에서, 수퍼옥사이드 자유 라디컬 소거 활성, 하이드록실 자유 라디컬 소거 활성 및 DPPH 자유 라디컬 소거 활성의 항산화 특성을 효과적으로 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명에서, 본 발명자들은 시험관 내(in vitro)에서, 효소성 산물인 κ-COS-E가 산-가수분해된 κ-COS-A에 비해 상당히 효과적인 자유 라디컬 소거 효과를 갖는다는 것을 입증하였다(도 6A). 한편, κ-COS-E1 (주로, κ-카라비오스) 및 κ-COS-E2 (주로, κ-카라테트라오스)는 유사한 자유 라디컬 소거 효과를 나타냈다.
본 발명에 있어서, 인간 대장암세포주(Caco-2) 및 정상 인간 대장 섬유아세포주(CDD-18Co)에서 T-SOD 및 GSH-Px의 보호 활성에 대한 κ-COS-A 및 κ-COS-E의 효과는 도 6C 및 도 6D에 나타냈다. 상기 결과는 세포를 H2O2로 반응(대조군)시킨 후, 세포로부터 방출된 T-SOD 및 GSH-Px의 양은 상당히 감소하는 것으로 나타났다. κ-COS 첨가시, T-SOD 및 GSH-Px의 생산은 대조군에 비해 상당히 증가하였다. 상기 결과는 κ-COS-A 및 κ-COS-E 모두가 T-SOD 및 GSH-Px의 생산을 통해 산화-손상으로부터 세포를 보호할 수 있다는 것을 나타낸다. 한편, κ-COS-E는 κ-COS-A에 비해 우수하고, κ-COS-E1 및 κ-COS-E2 사이의 유의적 차이는 없었다. κ-카라디아오스(κ-carradiaose)는 κ-카라기난의 최소 구성 유닛이다. 상기 모든 결과는 CgkA 분해를 통한 κ-카라디아오스(κ-carradiaose)는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 모두에서 효과적인 항산화 활성을 나타냈다. 본 발명에서, CgkA는 주요 산물로서 κ-카라디아오스(κ-carradiaose)를 특이적이고 효과적으로 생산할 수 있고, 이는 κ-COS의 프로바이오틱 개발 공정에 기여할 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, SOOKMYUNG WOMEN'S UNIVERSITY <120> Method for producing a thermo-tolerant k-carrageenase via a food-grade host <130> ADP-2020-0415 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1164 <212> DNA <213> Vibrio sp. SY01 <400> 1 atgctgggca ccccgagcct ggcccgcagc cagagcggcg acaacgccaa gccgctgacc 60 gccaagccgg gcgaaaagtg gaccatcaag tggaaccgca gcgacgactt cgacggcgac 120 ctggtggact ggaagaagtg gaacttccag accgaaaact acggcgtgtg gagctggcgc 180 aacgaaaacg ccaccgtgag caacggcaag ctgaagctga ccaccaagcg cgaaacccac 240 aaccgcacct tctgggacgg ctgcaaccag cagcaggtgg ccaactaccc gctgtactac 300 accagcggcg tggccaagag ccgcgccacc ggcaactacg gctactacga agcccgcatc 360 aagggcgcca gcaccttccc gggcgtgagc ccggccttct ggatgtacag caccatcgac 420 cgcagcctga ccaaggaagg cgacgtgcag tacagcgaaa tcgacgtggt ggaactgacc 480 cagaagagcg ccgtgcgcga aagcgaccac gacctgcaca acatcgtggt gaagaacggc 540 aagccgacct ggatgcgccc gggcagcttc ccgcagacca accacaacgg ctaccacctg 600 ccgttcgacc cgcgcaacga cttccacacc tacggcgtga acgtgaccaa ggacgacatc 660 acctggtacg tggacggcgt gcaggtgggc tacaagaaga acctgtactg gcaccgccag 720 atgaacctga ccctgagcca gggcctgcgc gccccgcaca ccgaatggcg ctgcaaccag 780 ttctacccga gcgccaacaa gagcgccgaa ggcttcccga ccagcatgga agtggactac 840 gtgcgcacct gggtgaaggt gggcaacaac aacagcgacc cgggcgaagg ccagagctgc 900 ccgaacacct tcgtggccgt gaacagcgtg cagctgagcg ccgccaagca gaccctgcgc 960 aagggccaga gcaccaccct gaacaccaac gtgctgccgg cctgcgccac caacaagaac 1020 gtggtgtaca gcaccagcaa caagaacgtg gccaccgtga ccaacgaagg cgtggtgaag 1080 gccaagaaca agggcagcgc caccatcacc gtgaagacca agaacaaggg caagaccgac 1140 accgtgatga tcaccgtgaa ctaa 1164 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal signal peptide gene <400> 2 atgaagcttg ccactgcttt tactattctc actgctgttc ttgct 45 <210> 3 <211> 387 <212> PRT <213> Vibrio sp. SY01 <400> 3 Met Leu Gly Thr Pro Ser Leu Ala Arg Ser Gln Ser Gly Asp Asn Ala 1 5 10 15 Lys Pro Leu Thr Ala Lys Pro Gly Glu Lys Trp Thr Ile Lys Trp Asn 20 25 30 Arg Ser Asp Asp Phe Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Lys Lys Trp Asn 35 40 45 Phe Gln Thr Glu Asn Tyr Gly Val Trp Ser Trp Arg Asn Glu Asn Ala 50 55 60 Thr Val Ser Asn Gly Lys Leu Lys Leu Thr Thr Lys Arg Glu Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Thr Phe Trp Asp Gly Cys Asn Gln Gln Gln Val Ala Asn Tyr 85 90 95 Pro Leu Tyr Tyr Thr Ser Gly Val Ala Lys Ser Arg Ala Thr Gly Asn 100 105 110 Tyr Gly Tyr Tyr Glu Ala Arg Ile Lys Gly Ala Ser Thr Phe Pro Gly 115 120 125 Val Ser Pro Ala Phe Trp Met Tyr Ser Thr Ile Asp Arg Ser Leu Thr 130 135 140 Lys Glu Gly Asp Val Gln Tyr Ser Glu Ile Asp Val Val Glu Leu Thr 145 150 155 160 Gln Lys Ser Ala Val Arg Glu Ser Asp His Asp Leu His Asn Ile Val 165 170 175 Val Lys Asn Gly Lys Pro Thr Trp Met Arg Pro Gly Ser Phe Pro Gln 180 185 190 Thr Asn His Asn Gly Tyr His Leu Pro Phe Asp Pro Arg Asn Asp Phe 195 200 205 His Thr Tyr Gly Val Asn Val Thr Lys Asp Asp Ile Thr Trp Tyr Val 210 215 220 Asp Gly Val Gln Val Gly Tyr Lys Lys Asn Leu Tyr Trp His Arg Gln 225 230 235 240 Met Asn Leu Thr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ala Pro His Thr Glu Trp 245 250 255 Arg Cys Asn Gln Phe Tyr Pro Ser Ala Asn Lys Ser Ala Glu Gly Phe 260 265 270 Pro Thr Ser Met Glu Val Asp Tyr Val Arg Thr Trp Val Lys Val Gly 275 280 285 Asn Asn Asn Ser Asp Pro Gly Glu Gly Gln Ser Cys Pro Asn Thr Phe 290 295 300 Val Ala Val Asn Ser Val Gln Leu Ser Ala Ala Lys Gln Thr Leu Arg 305 310 315 320 Lys Gly Gln Ser Thr Thr Leu Asn Thr Asn Val Leu Pro Ala Cys Ala 325 330 335 Thr Asn Lys Asn Val Val Tyr Ser Thr Ser Asn Lys Asn Val Ala Thr 340 345 350 Val Thr Asn Glu Gly Val Val Lys Ala Lys Asn Lys Gly Ser Ala Thr 355 360 365 Ile Thr Val Lys Thr Lys Asn Lys Gly Lys Thr Asp Thr Val Met Ile 370 375 380 Thr Val Asn 385

Claims (9)

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  5. N-말단 신호전달 펩타이드 유전자, 서열번호 1로 표시되는 cgkA 유전자 및 C-말단 6 × His tag 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 재조합 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주로부터 발현되어 분비된 재조합 엔도-타입(endo-type) κ-카라기나제(κ-carrageenases)와 κ-카라테트라오스(κ-carratetraose) 기질을 반응시키는 단계를 포함하는 κ-카라비오스(κ-carrabiose) 생산 방법.
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