KR101250828B1 - 신규한 키티나아제 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고온 및 산성 pH 조건에서 키틴 분해능을 갖고, E. coli 발현 시스템(expression system)에서 발현될 수 있는 키티나아제 및 상기 키티나아제 유전자를 이용하여 제조한 재조합 생촉매에 관한 것으로서, 본 발명은 신규한 키티나아제 또는 상기 키티나아제를 암호화하는 유전자를 제공함으로써 의약품 분야 및 기능성 식품 분야를 포함한 키티나아제가 응용되는 다향한 산업분야에 이용될 수 있다.

Description

신규한 키티나아제 및 그 용도{A CHITINASE AND A USE OF THE SAME}

본 발명은 고온 및 산성 pH에서 키틴 분해능 및 키토산 분해능을 갖는 키티나아제; 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터; 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체; 상기 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 키티나아제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 키틴 분해능 및 키토산 분해능을 갖는 생촉매에 관한 것이다.

키틴(GlcNAc)은 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine, NAG)이 β-1,4 결합으로 연결된 선형 중합체(linear polymer)인 천연 고분자 물질(biopolymer)이다. 상기 키틴은 게, 새우, 곤충 등의 갑각류와 거미, 개미, 메뚜기 등의 곤충의 주요 외피 구성 성분이고, 곰팡이나 세균 또는 녹조류 등의 미생물의 세포벽을 구성하는 물질이며, 자연계에 셀룰로우스 다음으로 많이 존재하는 고분자 물질이다. 또한, 키토산은 키틴의 아세틸기가 탈락된 형태의 중합체이다. 상기 키틴은 물속 생물권에서만 약 100 억톤 이상이 매년 생산되는 것으로 추정되고 있다.

상기 키틴은 최근에 중요한 천연자원으로서 그 응용성이 점차 증가되고 있다. 특히, 키틴의 가수분해에 의해 생산되는 D-글루코사민(D-glucosamine, DGA)과 D-글루코사민의 아세틸화 형태인 N-아세틸글루코사민은 퇴행성 관절염에 뛰어난 효과를 나타낼 뿐만 아니라 항염증, 심장보호, 간장보호, 물질동화 촉진에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 키틴의 단량체인 N-아세틸글루코사민은 생체 내 결합조직이나 힘줄, 연골조직 등의 당단백질을 만드는 주요성분으로 작용하는데, N-아세틸글루코사민을 포함하는 당단백질은 세포와 세포 사이를 연결하는 결합물질로서 조직이나 기관의 완전한 유지에 필수적이다. 또한, N-아세틸글루코사민은 소화관의 점막을 구성하는 주요성분으로 소화관의 궤양치료에도 도움을 주며 체내에서 N-아세틸글루코사민이 D-글루코사민보다 점막세포에서의 이동률이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 따라서, N-아세틸글루코사민이 D-글루코사민보다 생물 신소재로서의 효용가치가 더욱 높을 것으로 판단된다.

또한, 상기 키토산은 생체의 자연적인 치유 능력을 활성화하는 기능과 함께 생체리듬을 조절해주는 것으로 보고되어 있다. 또한, 체내에 과잉된 유해 콜레스테롤의 탈콜레스테롤 효과, 혈당조절 효과, 간 기능 개선 효과 및 항암 효과가 있고, 혈압상승의 원인이 되는 염화물 이온을 흡착하여 체외로 배출시킴으로써 혈압 상승 억제 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

상기한 바와 같이, 키틴은 자연계에서 풍부하게 존재하고, 지금도 계속해서 엄청난 양이 생산되고 있을 뿐만 아니라, 다양한 생리활성을 가지고 있으므로, 이들의 처리 및 재활용이 요구되고 있다.

상기 키틴 및 키토산의 활용과 관련하여, 상기 키틴 또는 키토산은 물에 용해되지 아니할(insoluble) 뿐만 아니라, 위장에서 분비되는 소화효소에 의해 분해되지 않는 고분자 물질로, 셀룰로오스와 같이 사람의 위장관에서 소화흡수되지 못한다는 단점이 있다. 따라서, 자연계에 풍부하게 존재할 뿐만 아니라, 다양한 생리활성을 가지는 키틴 또는 키토산을 생체 내에서 활성물질로서 효율적으로 이용하기 위해서는 그들의 올리고당 즉, 키틴 올리고당(chitin oligosaccharide)을 생산할 필요가 있다.

자연계에서 풍부할 뿐만 아니라, 키틴 또는 키토산과 같이 다양한 생리활성을 갖는 키틴 올리고당 또는 N-아세틸글루코사민은 의약용 및 기능성 식품 소재로서의 효용가치가 주목받고 있다.

상기 키틴 올리고당 또는 N-아세틸글루코사민은 현재 키틴을 산을 이용하여 가수분해하는 산 가수분해법(acid hydrolysis)에 의해 생산되고 있다. 상기 산 가수분해법은 주로 키틴을 6N 내지 12N 농도의 염산(HCl)을 이용하여, 60 내지 80℃의 조건에서 처리하는 방법으로 수행되고 있다.

상기 산 가수분해법의 경우, 산 가수분해 과정에서 키틴이 단당으로 분해되는 동시에 탈아세틸화가 일어나 N-아세틸글루코사민과 D-글루코사민이 동시에 생성된다는 문제점이 있다. 산 가수분해 조건을 달리 할 경우, N-아세틸글루코사민과 D-글루코사민의 상대적인 비율을 변화시킬 수 있으나, 상기 D-글루코사민의 생성량을 줄이기 위해, 상기 탈아세틸화를 억제하는 경우 즉, 산의 농도를 낮추거나 반응온도를 낮추느니 경우, 키틴으로부터 얻어지는 N-아세틸글루코사민의 양 즉, N-아세틸글루코사민의 생산효율이 낮아지는 문제점이 있다.

상기 산 가수분해법은 상기와 같은 문제점 외에도, 고농도의 산을 사용하기 때문에 장치의 부식이나 작업상의 위험이란 공정 상의 문제점, 인체에 유해한 불순물인 산성 폐기물(acidic wastes)의 발생과 같은 환경적인 문제점 및 산성 폐기물의 제거를 위한 복잡한 정제공정 및 N-아세틸글루코사민의 정제를 위한 공정의 필요 등에 따른 높은 생산가격과 같은 경제적인 문제점이 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 최근에는 효소를 사용하여 키틴을 분해하는 방법 이 제시되고 있다. 효소 가수분해법은 키틴 가수분해 효소인 키티나아제를 이용하여 키틴을 분해하는 방법으로, 상기 키티나아제에 의한 효소 가수분해법은 키틴 분해과정에서 N-아세틸글루코사민의 탈아세틸화가 진행되지 않아, 부산물에 해당하는 D-글루코사민이 생기지 않으므로, 정제공정이 매우 단순할 뿐만 아니라, 높은 수율로 키틴 분해산물인 키틴 올리고당 또는 N-아세틸글루코사민을 생산할 수 있고, 고농도의 산 대신에 자연계에 존재하는 효소를 이용하는 것이므로 환경상의 문제점이나 공정 상의 문제점이 발생되지 않는다는 장점이 있다.

그러나, 아직까지 이러한 효소들을 효율적으로 생산하고 이들을 이용하여 키틴 올리고당 또는 N-아세틸글루코사민을 경제적으로 생산하는 기술이 개발되지 않아 산업적으로 적용되지 못하고 있는 실정이다.

상기 키티나아제를 이용하여 키틴 올리고당 또는 N-아세틸글루코사민을 경제적으로 생산하는 기술을 개발하기 위해서는 키틴의 가수분해가 용이한 조건 즉, 고온 및 산성 pH에서 높은 반응 효율을 가지면서도, Escherichia coli expression system(E. coli expression system)과 같은 효소를 고효율로 생산할 수 있을 뿐만 아니라 세포 내 과정에서 효소의 생물학적 활성을 강화할 수 있는 발현 시스템에서 발현될 수 있는 키티나아제의 개발이 시급히 요구되고 있다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 키틴 분해 활성을 가지고, 키틴의 분해가 용이한 고온 및 산성 조건 일 예로, 40℃ 이상의 온도 및 pH 4 내지 pH 6의 pH 조건에서도 키틴 분해능이 유지되며, 발현 시스템, 구체적으로 Escherichia coli expression system(E. coli expression system)에서 고효율로 발현이 가능한 키티나아제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 키티나아제의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 신호서열이 포함된 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 각각의 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 각각의 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 키티나아제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 키틴 분해능 및 키토산 분해능을 갖는 생촉매를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키틴 가수분해능을 가지고, 40℃ 내지 60℃의 고온 조건 및 pH 4 내지 pH 6의 산성 pH조건에서도 우수한 가수분해 활성이 유지될 뿐만 아니라, 고효율 발현 시스템인 Escherichia coli 발현 시스템(E. coli expression system)에서 고효율로 발현될 수 있는 키티나아제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 키티나아제의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 신호서열이 포함된 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 각각의 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 각각의 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 키티나아제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 키틴 분해능 및 키토산 분해능을 갖는 생촉매를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 자연에 풍부하게 존재할 뿐만 아니라, 매년 엄청난 양이 자연계에서 생산되어 그 처리방법이 제공되어야 할 뿐만 아니라, 다양한 기능성을 가지고 있고, 특히 그 가수분해산물(키틴 올리고당 또는 N-아세틸글루코사민)이 우수한 기능성을 가지나, 인체가 생산되는 효소 중로는 가수분해되지 않는 비수용성 즉, 불용성(insoluble)의 천연고분자(biopolymer)인 키틴의 가수분해방법 특히, 효소를 이용한 가수분해방법을 연구하던 중, 40℃ 내지 60℃의 고온 조건 및 pH 4 내지 pH 6의 산성 pH조건에서도 우수한 가수분해 활성이 유지될 뿐만 아니라, 기존 키틴 가수분해효소와 달리 고효율 발현 시스템인 Escherichia coli 발현 시스템(E. coli expression system)에서 고효율로 발현될 수 있는 조건을 확립하여, Escherichia coli 발현 시스템을 통해 고효율로 발현시킬 수 있는 키티나아제를 발견하고 이의 유전자 서열을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 있어서, 키틴은 환형동물, 원형동물, 절지동물이나 연체동물의 외피, 곰팡이와 같은 균류나 세균의 세포벽에 존재하는 뮤코다당의 1종으로, N-아세틸글루코사민이 β-1,4결합으로 중합된 천연고분자(biopolymer)이다. 상기 키틴은 셀룰로오스 다음으로 자연계에 많이 존재하는 고분자로, 물에 녹지 않고(insoluble), 반응성이 약하며, 셀룰로오스보다도 안정하다. 상기한 바와 같이, 지구상의 키틴 존재량은 놀랄 만큼 많고, 갑각류의 한 무리인 개각목의 동물만으로도 1년동안 수천억 톤(ton)의 키틴을 생산하는 것으로 보고되고 있다.

본 발명에 있어서, 키티나아제(chitinase)는 키틴을 가수분해하는 가수분해효소로, 일반적으로 N-아세틸글루코사민 중합체의 β-1,4 결합을 가수분해하는 효소이다. 키틴을 가수분해하는 효소인 리조짐(lysozyme)가 구분되며, 주로 키틴, 콘드로이틴과 그 수용성 유도체인 글리콜 키틴을 가수분해하나, 펩티드글리칸은 분해하지 못하는 것으로 보고되고 있다.

본 발명에 있어서, 배양물이란 세포, 바람직하게는 미생물, 더욱 바람직하게는 바실러스 속(Bacillus sp) 미생물 유래 키티나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양한 배양배지를 의미하며, 상기 배양배지는 배양된 미생물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 무세포(cell-free) 배양액이란 세포 또는 미생물을 배양한 배양배지에서 배양된 미생물을 제거한 것을 의미한다. 상기 배양배지는 동물세포나 식물세포 또는 세균 등을 포함하는 미생물을 배양하는데 필요한 영양소가 포함되어 있는 고체 조성물 또는 액체 조성물을 의미하며, 바람직하게는 액체 조성물일 수 있다. 본 발명에 있어서 농축액이란, 상기 배양물 또는 무세포 배양액을 농축한 것을 의미한다.

본 발명의 키티나아제는 바실러스 속(Bacillus sp) SC081 균주로부터 클로닝(cloning)된 것으로, 상기 키티나아제는 총 1,791 bp의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 것이고, 596개의 아미노산으로 번역되며, 약 65.5kDa의 크기를 갖는다. 상기 키티나아제는 앞 부분에 99bp의 신호서열을 가지며, 글리코실 가수분해 부위(glycosyl hydrolase domain), 피브로넥틴 타입 3 부위(fibronectin type 3, FN3) 및 키틴/셀룰로스-결합 부위(chitin.cellulose-binding domains)을 가진다.

상기 신호서열을 포함한 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3의 서열을 갖는 총 1,791 bp의 폴리뉴클레오타이드이고, 본 발명의 키티나아제는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 키틴 가수분해효소이며, 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 갖는 총 1,692 bp의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 키틴 가수분해효소이다.

상기 키티나아제는 최적 반응온도가 50℃이고, 40 내지 60℃에서 우수한 가수분해활성을 가지며, pH 4 이상에서도 최적 반응 pH인 pH 8의 활성을 기준으로 약 50% 이상의 효소 활성이 유지되며, Escherichia coli 발현 시스템에서 고효율로 생산이 가능한, 키틴 분해능 및 키토산 분해능을 갖는 특징을 가지고 있다.

상기 키티나아제는 키틴 분해능 및 키토산 분해능이 우수하여 기존의 산 분해법의 문제점을 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 고온 및 산성 조건에서도 효소의 활성이 유지되어 키틴 분해활성이 우수하고, 기존 보고된 키티나아제와 달리 Escherichia coli 발현 시스템에서 고효율로 생산이 가능하여 종래 문제가 되었던 효소 분해법의 낮은 효율성이란 문제점을 해결할 수 있으며, 종래 보고된 키티나아제와 달리 키틴과 키토산 모두를 분해할 수 있으므로 다양한 목적으로 사용될 수 있어서, 산업적으로 다양하게 응용될 수 있을 것이다.

본 발명의 한천분해효소는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 키티나아제다. 상기 키티나아제는 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클로오타이드는 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이다.

또한, 본 발명은 상기 키티나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 신호서열이 포함된 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 서열번호 3에 기재된 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

또한, 본 발명은 키틴 분해능 및 키토산 분해능을 갖는 생촉매에 관한 것이다. 상기 생촉매는 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 서열, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 벡터, 상기 각각의 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 각각의 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 각각의 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 키티나아제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 키틴 분해능 및 키토산 분해능을 갖는 생촉매일 수 있다.

상기 키티나아제는 바람직하게는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가진 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 아미노산을 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 뉴클레오타이드를 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 신호서열이 포함된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성과 신호서열 부위에 의해 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 키티나아제가 세포 외로 배출되는 특성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 뉴클레오타이드를 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 효소 생촉매 개발을 위한 분리 및 정제 과정에 의한 비용의 증가 및 활성 손실 문제점을 해결하기 위하여, 상기 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 신호서열이 포함된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 재조합 키티나아제 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 상기 벡터의 제조 및 형질전환체의 제조는 통상의 유전공학적 방법에 따라 제조된다.

상기 발현벡터는 사용하는 숙주에 따라 적절히 선택할 수 있고, 형질전환체에서 단백질을 발현시킬 수 있는 통상의 발현벡터가 모두 적용 가능하며, 일 예로 상기 형질전환체에 의해 발현된 단백질을 정제할 수 있는 융합 파트너(fusion-tag)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터일 수 있다. 구체적으로는, 대장균의 경우에는 도입된 외래 유전자를 형질전환체에서 수용성 형태로 고효율로 발현시킬 수 있는 pBADNH, pET 11a, pET 16b, pET 21a(Novagen Co., Germany), pGEX 4T-1(GE Healthcare, USA) 또는 pHCE 19(BioLeaders Co., 대한민국)일 수 있고, 바람직하게는 pBADNH, pET 11a 또는 pET 16b 일 수 있다.

상기 형질전환체는 상기 발현벡터를 이용하여 제조한 것으로 상기 형질전환체의 제조에 사용되는 숙주는 대장균 또는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주와 같은 원핵세포 또는 효모, 곰팡이 등의 진핵세포 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는 상기 발현벡터는 pBADNH 벡터에 서열번호 2의 키티나아제를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 삽입시킨 것 또는 pBADNH 벡터에 서열번호 3의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 삽입시킨 것이고, 상기 숙주는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 일 예로 E. coli MC1061 또는 E. coli DE5α일 수 있다.

상기 형질전환체를 이용하여 키티나아제를 생산하는 방법은 상기 형질전환체를 배양배지를 이용하여 배양하고, 상기 배양배지에 포함된 키티나아제 또는 상기 형질전환체 내에 존재하는 키티나아제를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 배양배지, 배양조건 및 배양방법은 형질전환체의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 서열번호 2의 키티나아제를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 3의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 pBADNH에 삽입시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 제조된 재조합 벡터를 E.coli MC1061에 도입시켜 형질전환체를 제조하는 단계 및 상기 형질전환체를 배양배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 상기 서열번호 2의 키티나아제를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 3의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 pBADNH에 삽입시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 제조된 재조합 벡터를 E.coli MC1061에 도입시켜 형질전환체를 제조하는 단계 및 상기 형질전환체를 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는 재조합 키티나아제를 생산방법일 수 있다.

상기 재조합 키티나아제는 운동성을 가지고, 키틴 분해 활성을 가지며, 상기 제조합 키티나아제 방법에 의해 수용성(soluble)의 키티나아제가 높은 수율로 제조될 수 있는 것으로 확인되었다.

상기 형질전환체를 배양배지에서 배양하는 단계와 관련하여, 상기 배양배지는 아라비노스가 0.175%(w/v) 내지 0.215%(w/v)의 함량(아라비노스 중량/배양액 부피)으로 포함된 배지일 수 있고, 상기 배양 조건은 26℃ 내지 30℃일 수 있으며, 상기 배양시간은 3시간 30분 내지 4시간 30분일 수 있다.

상기 형질전환체에 의해 발현되는 방법으로 제조된 재조합 키티나아제는 종래 알려진 통상의 방법으로 정제할 수 있지만, 정제하지 않고 전세포 또는 이의 배양물이나 이의 무세포 배양액 형태로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 키티나아제에 관한 발명이다.

상기 발현벡터는 pBADNH 벡터, pET 11a 벡터 또는 pET 16b 벡터에 서열번호 3의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터일 수 있다. 상기 형질전환체는 숙주 세포에 상기 발현벡터가 형질전환된 것, 바람직하게는 상기 발현 벡터가 형질전환된 대장균, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드가 pBADNH 벡터에 삽입된 재조합 벡터로 형질전환된 E. coli MC1061일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 키틴 분해 활성 또는 키토산 분해 활성을 갖는 생촉매에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 키티나아제, 상기 재조합 키티나아제 및 상기 생촉매로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 함유하는 키틴 분해용 조성물 및/또는 키토산 분해용 조성물을 제공한다. 상기 분해용 조성물은 키틴 및 키토산 모두를 분해할 수 있으므로, 키틴 또는 키토산을 독립적으로 분해하거나, 키틴 및 키토산 모두를 분해하기 위해 사용될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 신규한 키티나아제는 고온, 구체적으로 키틴의 가수분해 반응성이 개선되는 50℃에서 최적 활성을 가지고, 40℃ 내지 60℃에서 우수한 가수분해 활성이 유지되며, 산성 pH, 구체적으로 pH 4 내지 pH 6에서도 우수한 가수분해 활성이 유지될 뿐만 아니라, 고효율 발현 시스템인 Escherichia coli 발현 시스템(E. coli expression system)에서 고효율로 발현될 수 있으므로, 본 발명의 신규한 키티나아제 및 상기 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 이용한 형질전환체 및 생촉매는 키틴 올리고당 또는 N-아세틸글루코사민이 사용되는 의약품, 기능성 식품 또는 화장품 등의 다양한 분야에서 사용될 수 있으므로, 그 산업적 가치가 매우 크다 할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키티나아제(scchi-1)의 염기서열을 나타낸 그림으로, 상기 염기서열 밑줄에 상기 염기서열에 의해 암호화(codon)되는 아미노산 서열을 기재하였고, 점(dot)으로 표시된 부위는 신호서열을 의미하고, 정지코톤(stop codon)은 별표로 표시하였으며, 네모상자로 표시된 부분은 키티나아제의 글리코실 가수분해 부위(glycosyl hydrolase domain)를 의미하고, 밑줄로 표시된 부분은 피브로넥틴 타입 3 부위(fibronectin type 3, FN3)를 의미하며, 굵은 글씨체(bold)로 표시된 부분은 키틴/셀룰로스-결합 부위(chitin.cellulose-binding domains)를 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환된 균체(E. coli MC1061)를 이용하여 아라비노스 함량에 따른 재조합 단백질(H₆SCChi-1)의 생산량을 측정한 사진으로, 좌측 숫자는 단백질 크기(kDa)를 의미하고, 상부의 숫자는 아라비노스의 함량을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환된 균체(E. coli MC1061)를 이용하여 온도 및 시간에 따른 재조합 단백질(H₆SCChi-1)의 생산량을 측정한 사진으로, 좌측 숫자는 단백질 크기(kDa)를 의미하고, 상부에 M은 마커(marker)를 의미하며, 밑줄 위의 숫자는 반응온도를 나타내고, 밑줄 아래 숫자는 반응시간을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환된 균체(E. coli MC1061)를 이용하여 생산된 재조합 단백질(H₆SCChi-1)을 정제한 결과를 SDS-PAGE 상에 나타낸 사진으로, 상기 Lane M은 단백질 마커(size marker)이고, 상기 Lane 1 및 상기 Lane 2는 SDS-PAGE 후, 코마시블루 염색약으로 염색한 결과이고, 상기 Lane 3 및 상기 Lane 4는 글리콜 키틴이 포함된 SDS-PAGE 겔을 이용하여 SDS-PAGE한 결과이며, 상기 Lane 5는 Ni^{2 +} affinity 크로마토그래피를 이용하여 정제된 재조합 단백질을 SDS-PAGE 후, 코마시블루 염색약으로 염색한 결과이고, 상기 Lane 1 및 Lane 3은 아라비노스로 발현을 유도하지 않은 세포 분해물(cell lysate)이고, 상기 Lane 2 및 Lane 4는 아라비노스를 이용하여 발현을 유도한 후, 28℃에서 4시간 동안 배양한 형질전환체의 세포 분해물(cell lysate)을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 재조합 키티나아제(H₆SCChi-1)의 최적 반응 온도를 측정한 결과를 최적 반응온도(50 ℃)를 기준으로 비교값으로 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 재조합 키티나아제(H₆SCChi-1)의 최적 반응 pH를 측정한 결과를 최적 반응 pH(pH 8)를 기준으로 비교값으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 키티나아제의 기질별 가수분해 활성을 측정한 결과를 나타낸 사진으로, 1은 아라비노스로 효소 생산을 유도한 형질전환체의 세포 분해물을 의미하고, 2는 아라비노스로 효소 생산을 유도하지 않은 형질전환체의 세포 분해물을 의미하며, 3은 B. atrophaeus SC081의 세포외 단백질(세포 배양액)을 의미하고, A는 0.1%의 교질 키틴이 기질인 경우를 의미하고, B는 0.1%의 글리콜 키틴(glycol-chitin)이 기질인 경우를 의미하며, C는 0.1%의 수용성 키토산(soluble chitosan)이 기질인 경우를 의미하고, D는 0.1%의 글리콜 키토산(glycol-chitosan)이 기질인 경우를 의미한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 키티나아제의 기질별 가수분해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프로, SCChi-1은 아라비노스로 효소 생산을 유도한 형질전환체의 세포 분해물을 의미하고, SC081은 B. atrophaeus SC081의 세포외 단백질(세포 배양액)을 의미하며, 상기 좌측의 수치는 최적 효소 활성을 기준으로 측정된 상대적 효소 활성을 의미한고, 아래 수치는 반응시간(min)을 의미한다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것을 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 키틴 분해능을 갖는 미생물의 분리

1-1. 시료

실험에 사용된 시료(reagent) 및 화학물질(chemicals)은 모두 Sigma 사(Sigma Chemical Co., USA) 및 Difco laboratories(USA)에서 구입하였다. 또한, 형질전환체에서 효소 발현을 유도한 L-아라비노스(L(+)-arabinose) 및 글리콜 키틴(Glycol chitin) 제조를 위한 글리콜 키토산(glycol chitosan)은 Sigma 사에서 구입하였고, 수용성 키토산(soluble chitosan, pH 5.0)은 키토산 분말로부터 제조하였다.

실험에 사용된 발현 벡터를 포함한 플라스미드는 다음과 같다. 클로닝 벡터로 사용된 pGEM-T벡터(pGEM-T easy vector)는 Promega 사(Promega Co., USA)에서 구입하였고, 재조합 단백질의 발현 벡터(expression vector of fusion protein)로 사용된 벡터는 삽입되는 유전자의 아미노 말단(amino-terminus)에 융합 파트너인 6 X His(hexahistidine tag)를 갖는 pBADNH 벡터(pBADNH vector)를 사용하였다. 상기 융합 파트너를 갖는 pBADNH 벡터에 의해 생산된 6 X His-tagged 가수분해효소의 정제를 위해 Ni-NTA matrices(Qiagen 사, 캐나다) 및 imidazole(Sigma 사, USA)를 이용하였다.

상기 재조합 벡터의 제조 및 발현을 위해 사용된 숙주(host)는 각각 E. coli DH5α 및 E. coli MC1061를 사용하였다. 상기 재조합 벡터로 숙주를 형질전환시킨 형질전환체는 암피실린(50 ㎍/ml)이 포함된 LB 아가 플레이트(LB agar plate)에서 배양하여 분리하였다.

1-2. 키틴 분해능을 갖는 미생물의 분리

본 발명의 새로운 키티나아제를 클로닝하기 위하여, 한국 전통의 조선 간장(Korean traditional soy sauce)을 중심으로 시료를 채취하였고, 1L의 증류수에 트립토판(trypton) 10g, NaCl 10g, 효소 추출물(yeast extract) 5 g 및 아가(agar) 15 g이 포함된 LB 아가 배지에 1%의 교질 키틴(colloidal chitin)을 첨가한 배지를 이용하여 상기 시료로부터 키틴 분해능(chitinolytic)을 가진 균주를 분리하였다. 상기 균주 중에서 배지에 가장 큰 분해환(clear zone)을 형성하는 균주를 분리하여, 동정하였으며, 상기 균주는 그람 양성(gram-positive)으로 16S rRNA를 이용한 검색결과, B. atrophaeus 균주로 확인되어 B. atrophaeus SC081로 명명하였다.

< 실시예 2> 키티나아제의 유전자 서열 분석

B. atrophaeus SC081 균주 유래 키티나아제의 염기서열을 분석하기 위하여, 하기 표 1의 프라이머를 제작하였으며, 상기 프라이머를 이용하여 PCR(polymer chain reaction)을 수행하여, 키티나아제 추정 염기서열 부위를 증폭하였다.

Primers	서열 (5′ → 3′)	서열번호
F	ATGAAAAAAGTGTTTTCAA	4
R	TTATTTGCAATCACCAAT	5

보다 상세하게는, 기존 보고된 키티나아제의 아미노산을 암호화하는 유전자 서열을 조사하여, 상기 조사된 서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 상기 표 1과 같이 제작하였다.

상기 PCR에 사용된 주형 DNA(template DNA)는 상기 B. atrophaeus SC081 균주로부터 genomic DNA를 G-spin^TM for Bacteria kit(iNtRON biotechnology, 대한민국)를 이용하여 추출하여 사용하였다. 상기 PCR 반응은 95℃ 에서 5분 동안 변성시킨 후, 95℃에서 40초 및 56℃에서 40초간 30회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 2분간 반응시키는 방법으로 수행하였다.

상기 PCR 산물은 정제 후 pGEM easy T vector로 클로닝하고, 상기 클로닝된 벡터를 E. coli DH5α에 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 E. coli DH5α를 배양한 후, QIAprep spin miniprep kit(Qiagen 사, USA)를 이용해 클로닝된 벡터를 수집하였다.

상기 수집된 클로닝 벡터는 마크로젠 사(대한민국)에 의뢰하여 ABI 377 DNA sequencer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 또한, 상기 B. atrophaeus SC081 균주 유래 키티나아제의 ORF(open reading frame)은 (ORF) NCBI의 BLAST(N) program을 이용하여 분석하였고, 아미노산 서열 분석은 GenBank의 Swiss-Prot databases를 이용하여 분석하였으며, 신호서열은 Signal P3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 이용하여 분석하였고, 특정 도메인(domain)은 BLAST program(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 분석하였다.

상기 염기서열 분석 결과를 포함한 분석 결과를 도 1에 나타내었다.

상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 B. atrophaeus SC081 균주 유래 키티나아제의 분석 결과 이론적으로 65.5 kDa의 크기를 갖는 563개(서열번호 2)의 아미노산을 암호화하는 1,692bp(서열번호 1)의 키티나아제 부분 염기 서열이 확인되었다. 또한, 상기 키티나아제를 암호화하는 폴리뉴틀레오타이드는 N-말단에 99개의 염기서열을 갖는 신호서열이 추가된 폴리뉴클레오타이드(서열번호 3)로 확인되었으며, 이를 도 1에 함께 나타내었다. 상기 서열이 확인된 키티나아제를 scchi-1이라 명명하였다.

상기 scchi-1의 염기서열의 앞 부분(N-terminal)에는 99 bp의 신호서열이 존재하고, 상기 아미노산 서열 중 33번째의 알라닌(Ala-33)과 34번째의 세린(Ser-34) 사이에서 절단될 것으로 예상되었다. 상기 서열은 알라닌과 알라닌 사이에 아미노산이 하나 존재하는 Ala-X-Ala 서열(Ala-X-Ala sequence)이 포함되어 있으므로, 단백질의 분비(secretion)와 관련된 신호서열일 것으로 추측되었다. 따라서, 상기 서열에 의하여 본 발명의 키티나아제 즉, scchi-1이 세포 외로 배출될 수 있을 것으로 예상되었다.

또한, 상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 scchi-1은 34번째 세린(Ser-34) 잔기로부터 448번째 프롤린(Pro-448) 잔기에 위치한 글리코실 가수분해 부위(glycosyl hydrolase domain), 458번째 세린(Ser-458) 잔기로부터 539번째 트레오닌(Thr-539) 잔기에 위치한 피브로넥틴 타입 3 부위(fibronectin type 3, FN3) 및 549번째 리신(Lys-549) 잔기로부터 582번째 류신(Leu-582) 잔기에 위치한 키틴/셀룰로스-결합 부위(chitin.cellulose-binding domains)를 가지는 것으로 확인되었다.

< 실시예 3> 키티나아제 유전자 클로닝 및 대장균에서의 단백질 발현 분석

상기 실시예 2에서 증폭시킨 상기 B. atrophaeus SC081 균주 유래 키티나아제인 scchi-1의 코딩 부위(coding region) 및 신호서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열(서열번호 3)을 갖는 PCR 증폭산물을 발현용 vector인 pBADNH에 DNA 결합효소(T4 DNA ligase, Takara 사, 대한민국)를 이용하여 클로닝한 후, 이를 이용하여 발현용 숙주인 E. coli MC1061을 형질전환시켰다.

보다 구체적으로, 상기 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머에 포함된 제한효소 부위를 절단할 수 있는 제한효소인 Sac I 및 Sph I으로 상기 실시예 2에서 PCR을 이용하여 증폭한 서열번호 3의 신호서열을 포함하는 scchi-1와 pBADNH를 처리한 후, 각각 제한효소 처리한 scchi-1 PCR 산물과 pBADNH vector를 T4 DNA ligase(Takara 사, 대한민국)를 가지고 ligation하였다. 상기 제조된 재조합 벡터는 E. coli MC1061에 형질전환 하였다. 상기 형질전환된 E. coli MC1061은 암피실린이 포함된 LB 배지(LB medium)을 이용하여 37℃ 조건에서 16시간 동안 배양한 후, 상기 형질전환체가 OD₆₀₀ =0.5(mid-log phase)까지 37℃에서 진탕 배양하였다.

상기 배양 후, 아라비노스(arabinose)를 0.1%(w/v), 0.15%(w/v) 및 0.2%(w/v) 농도로 각각 첨가하고, 28℃ 및 37℃의 조건에서 2시간, 4시간 및 6시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 15,000 x g의 조건에서 5분 동안 원심분리하여 균체를 수득하였다. 상기 균체에 25 mM Tris-Cl 및 1 mM EDTA가 포함된 lysis buffer(pH 7.5)를 첨가하고 초음파 처리한 후, 15,000 x g의 조건에서 25분 동안 원심분리하여 침전된 불용해성 물질(insoluble material)을 제거하고, 상등액(supernatant)만을 분리하여 세포 분해물(cell lysate)을 수득하여 조효소액을 제조하였다. 상기 수득된 세포 분해물에 포함된 단백질의 함량은 전기영동을 수행한 후 염색하고, Bio-Rad protein assay kit(Bio-Rad사, USA)을 이용하여 bovine serum albumin을 표준 물질로 하여 측정하였다. 상기 측정결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다.

상기 도 2 및 도 3에 나타낸 결과, 효소를 위한 최적 생산 조건은 아라비노스(arabinose)를 0.2%(w/v) 농도로 첨가하는 것으로 나타났다. 또한, 반응조건과 관련된 최적 반응조건은, 28℃에서 4시간 동안 배양하는 것으로 확인되었다.

상기 pBADNH vector를 이용하여 6 His-tag이 결합된 재조합 효소인 H₆SCChi-1를 분석하기 위하여, SDS-PAGE와 zymogram 분석을 실시하였다.

상기 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 10% SDS-polyacrylamide gel 및 Multiphor II system(Amersham Pharmacia Biotech 사, USA)를 이용하여 수행하였다. 상기 SDS-PAGE 후에, 상기 겔을 0.05% Coomassie brilliant blue R-250를 이용하여 염색하였다. 상기 zymogram 분석은 SDS-PAGE sample buffer에 상기 조효소액을 첨가한 후, 80℃에서 5분간 가열하고, 0.1% 글리콜 키틴(glycol chitin)이 포함된 10% polyacrylamide gel을 이용하여 분리한 후, 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 2.5 % Triton X-100이 포함된 재고정 완충액(refolding buffer)에 함침시켜 37℃에서 밤샘(overnight )반응시켰다. 상기 반응 후, 겔을 증류수로 세척하고, Coomassie brilliant blue R-250를 이용하여 염색하였다. 2시간 후, 메탄올과 아세트산이 포함된 증류수로 세척하여 염색약을 제거한 후, 분해환(lytic zone)을 확인하였다. 상기 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 재조합 단백질은 약 62.5 kDa이고, 표준 단백질(standard calilbration protein)을 이용하여 측정한 결과 운동성(motility)을 가지며, 키틴 분해능을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 실험결과, 상기 재조합 단백질의 발현을 유도하지 않은 경우에 비하여 발현을 유도한 경우 현저하게 발현량이 증가되는 것이 확인되었다.(Lane 1 및 Lane 2)

또한, 본 발명의 재조합 단백질의 제조방법에 의해 바실러스 SC081에서 세포외로 분비되는 것으로 예상되었던 키티나아제는 일반적으로 E. coli를 이용하는 재조합 단백질을 생산하는 경우 불용성의 군집형태로 생산되는 것과 달리, 수용성으로 숙주인 E. coli 내부에서 분비되는 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 높은 수율로 재조합 단백질인 재조합 키티나아제를 생산할 수 있는 것으로 평가되었다.

< 실시예 4> 재조합 키티나아제의 최적 조건 및 분해 패턴 확인

본 발명의 키티나아제의 최적 반응 조건을 확인하기 위하여, 온도, pH 및 금속이온 첨가의 조건을 각각 달리하면서, 상기 실시예 3의 방법으로 제조된 키티나아제 활성을 측정하였다.

4-1 재조합 효소의 정제

상기 실시예 3과 같이 상기 서열번호 3의 신호서열을 포함하는 scchi-1가 포함된 재조합 pBADNH 벡터로 형질전환된 E. coli MC1061를 OD₆₀₀=0.5(mid-log phase)까지 37℃에서 진탕 배양 후, 아라비노스(arabinose)를 0.2%(w/v) 농도로 첨가하고, 28℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 10,000 x g의 조건에서 5분 동안 원심분리하여 균체를 수득하였다. 상기 균체에 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl 및 20 mM imidazole이 포함된 protein extraction lysis buffer(pH 7.5)를 첨가하고 초음파 처리한 후, 15,000 x g의 조건에서 25분 동안 원심분리하여 침전된 불용해성 물질(insoluble material)을 제거하고, 상등액(supernatant)만을 분리하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 상기 재조합 키티나아제의 정제는 니켈 컬럼(Ni-NTA)을 이용해 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 수행하고, 250 mM imidazole을 이용하여 분리한 후, 25 mM Tris-Cl(pH 7.5) 및 1 mM EDTA이 포함된 단백질 버퍼를 이용하여 투석하는 방법으로 수행하였다. 상기 6his-tag이 연결되어있는 재조합 단백질을 정제한 결과를 도 4에 나타내었다(Lane 5). 상기 도 4에 나타낸 정제된 단백질의 SDS-PAGE 수행 결과, 상기 단백질의 순도는 약 99%인 것으로 확인되었다.

4-2 최적 온도 조건 측정

교질의 키틴(colloidal chitin)을 기질로 하여 키틴 분해 활성을 측정하였다.

보다 구체적으로, 1.0 %의 교질 키틴이 포함된 25 mM Tris-Cl(pH 7.5)에 상기 정제된 재조합 효소를 함께 첨가한 후, 20℃, 30℃, 37℃, 40℃, 50℃ 및 60℃로 온도를 변동시킨 온도조건 및 pH 7.5의 pH 조건에서 30분간 반응시킨 후, 5분간 반응용액을 끓여 반응을 종료시켰다. 냉각 후, 반응물을 원심분리하고, 상등액에 포함된 환원당을 디니트로살리실 산 측정법(modified dinitrosalicylic acid method)으로 측정하였다. 상기 효소의 활성은 D-glucose를 이용하여 같은 방법을 수행한 결과를 기준 그래프(calibration curve)로 하여 구하였다. 상기 측정된 효소의 활성은 최적 활성을 100%로 하여 비교한 값으로 나타냈으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 최적 온도 조건은 50℃인 것으로 확인되었다. 또한, 해당 온도 조건에서 30분 동안 유지한 후의 반응 활성과 관련하여, 30℃ 내지 60℃의 조건에서 최적 온도 조건인 50℃에서의 활성 즉, 초기 활성의 약 60% 이상이 유지되는 것으로 확인되었다.

4-3 최적 pH 조건 측정

교질의 키틴(colloidal chitin)을 기질로 하여 키틴 분해 활성을 측정하였다. 상기 측정은 반응 조건을 37℃ 온도조건 및 pH 2.0 내지 pH 10.0의 구간에서 pH를 변동시킨 pH 조건에서 반응시킨 후, 상기 실시예 4-2의 방법으로 효소 활성을 측정하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 최적 pH 조건은 pH 8인 것으로 확인되었고, pH 5.5 내지 pH 10의 조건에서 최적 pH 조건인 pH 8에서의 활성 즉, 초기 활성의 약 60% 이상이 유지되는 것으로 확인되었다. 특히, pH 4 이상에서는 30분간의 처리에도 약 50% 이상의 반응활성이 유지되어 산성 조건에서 유효하게 반응하는 것으로 확인되었다.

상기 실험 결과에 의하면, 본 발명의 키티나아제는 다양한 온도 조건 및 pH 조건에서도 안정적으로 반응하며, 반응성이 유지되는 것으로 확인되었다. 또한, 최적 반응 조건은 50℃ 및 pH 8이나, 40℃ 내지 60℃의 온도 조건 및 은 pH 4 내지 pH 10의 pH 조건에서 유효하게 반응할 수 있으므로, 다양한 반응 조건에서 이용할 수 있으며, 키틴의 분해활성이 높은 고온 및 산성 조건에서도 활용이 가능할 것으로 평가된다.

4-4 기질 특성 확인 1

다양한 물질을 기질로 하여 본 발명의 키티나아제의 분해 활성을 아가 측정법(agar diffusion method)을 이용하여 측정하였다.

보다 구체적으로, 0.1%의 교질 키틴, 0.1%의 글리콜 키틴(glycol-chitin), 0.1%의 수용성 키토산(soluble chitosan, pH 5.0) 및 0.1%의 글리콜 키토산(glycol-chitosan)이 포함된 5 cm 두께의 1% 아가 플레이트(agar plate)에 상기 실시예 4-1에서 정제하기 전 아라비노스로 효소 생산을 유도한 형질전환체의 세포 분해물 효소 20 ㎍과 실시예 3에서 제조된 아라비노스로 효소 생산을 유도하지 않은 형질전환체의 세포 분해물 20 ㎍ 및 상기 실시예 1의 B. atrophaeus SC081의 세포외 단백질 즉, 배양액을 떨어뜨렸다(spot). 상기 배지를 37℃의 조건에서 1시간 또는 2시간 동안 배양한 후, 25 mM Tris-Cl(pH 7.5)에 용해된 0.01% Calcofluor white M2R을 이용하여 염색하였다. 상기 염색 후, 상기 염색용액을 제거하고, 증류수로 플레이트를 세척하였다. UV-transilluminator를 이용하여 분해환(clearing zone)을 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 측정된 활성은 환원당을 디니트로살리실 산 측정법(modified dinitrosalicylic acid method)으로 측정한 결과를 D-glucose를 이용하여 같은 방법을 수행한 결과를 기준 그래프(calibration curve)로 하여 구하여, 상대값으로 나타내었다.

상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 아라비노스로 효소 생산을 유도한 형질전환체의 세포 분해물의 경우, 교질 키틴에 대해서 가장 우수한 분해 활성을 나타내었고, 교질 키틴 및 수용성 키토산에 대해 우수한 분해 활성을 나타내었다(도 7 A 및 도 7 C). 상기 도 7 C에서 확인된 바와 같이, 산성 조건에서의 글리콜 키틴산에 대한 가수분해능이 우수한 것으로 확인되었다. 한편, 아라비노스로 효소 생산을 유도하지 않은 형질전환체의 세포 분해물 및 B. atrophaeus SC081의 세포외 단백질 즉, 배양액의 경우 가수분해능이 확인되지 아니하였다. 상기 결과로부터, 아라비노스로 효소 생산을 유도하는 경우, 효소 생산량 즉, 단위 부피당 효소의 함량 및 효소의 활성이란 측면에서 매우 우수한 것으로 확인되었다.

4-5 기질 특성 확인 2

상기 실시예 4-4의 결과를 추가로 확인하기 위하여, 0.1%의 교질 키틴 및 0.1%의 수용성 키토산(soluble chitosan, pH 5.0)이 포함된 25 mM Tris-Cl(pH 7.5)에 상기 실시예 4-1에서 정제하기 전 아라비노스로 효소 생산을 유도한 형질전환체의 세포 분해물 효소 20 ㎍ 및 상기 실시예 1의 B. atrophaeus SC081의 세포외 단백질을 각각 첨가하고 환원당을 디니트로살리실 산 측정법(modified dinitrosalicylic acid method)으로 측정하는 실시예 4-2의 방법으로 가수분해 활성을 측정하고, D-glucose를 이용하여 같은 방법을 수행한 결과를 기준 그래프(calibration curve)로 하여 구하여, 가수분해 활성을 나타내었고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

상기 도 8에 나타낸 바와 같이, 시간이 증가함에 따라 분해력도 증가하였고, 아라비노스로 효소 생산을 유도한 형질전환체의 세포 분해물의 경우 가수분해 활성이 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.

보다 구체적으로, 상기 아라비노스로 효소 생산을 유도한 형질전환체의 세포 분해물의 경우, 본 발명의 재조합 효소의 유래인 B. atrophaeus SC081의 야생형(wild type) 키티나아제 즉, 균주 배양물 보다 모든 종류의 기질에 대해 현저하게 우수한 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 특히, 키토산 즉, 수용성 키토산 보다 교질 키틴에 대해서 가수분해 활성이 뛰어난 것으로 확인되었다.

일반적으로 키티나아제의 경우에는 키틴에 대한 가수분해 활성을 가지는 것으로 보고 되어 있으나, 본 발명의 재조합 효소의 경우에는 키틴 뿐만 아니라 키토산에 대해서도 가수분해 활성을 가지고 있어, 기질의 범위가 통상의 키티나아제 보다 넓다는 우수한 특성을 갖는다.

<110> Cheju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A CHITINASE AND A USE OF THE SAME <130> KP20100043 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1692 <212> DNA <213> sschi-1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1689) <400> 1 agt tct gac aaa agt tat aaa atc atc ggc tac tat ccg tcc tgg ggc 48 Ser Ser Asp Lys Ser Tyr Lys Ile Ile Gly Tyr Tyr Pro Ser Trp Gly 1 5 10 15 gct tat gga agg gat ttt caa gta tgg gat atg gat gct tct aaa gtc 96 Ala Tyr Gly Arg Asp Phe Gln Val Trp Asp Met Asp Ala Ser Lys Val 20 25 30 agc cat att aat tat gca ttt gct gat att tgc tgg gag ggg agg cat 144 Ser His Ile Asn Tyr Ala Phe Ala Asp Ile Cys Trp Glu Gly Arg His 35 40 45 gga aac cct gat ccg aca ggc ccg aat ccc cag aca tgg tct tgc cag 192 Gly Asn Pro Asp Pro Thr Gly Pro Asn Pro Gln Thr Trp Ser Cys Gln 50 55 60 gat gaa aac gga gtg att gat gtt cca aat gga tca atc gtt atg ggg 240 Asp Glu Asn Gly Val Ile Asp Val Pro Asn Gly Ser Ile Val Met Gly 65 70 75 80 gac cca tgg atc gat gtg caa aag tca aat gcc gga gat act tgg gat 288 Asp Pro Trp Ile Asp Val Gln Lys Ser Asn Ala Gly Asp Thr Trp Asp 85 90 95 gag ccg att cgg ggc aac ttt aaa caa cta ttg aag ctg aaa aag aac 336 Glu Pro Ile Arg Gly Asn Phe Lys Gln Leu Leu Lys Leu Lys Lys Asn 100 105 110 cat cct cat ttg aaa aca ttc ata tca gtt ggc gga tgg agt tgg tca 384 His Pro His Leu Lys Thr Phe Ile Ser Val Gly Gly Trp Ser Trp Ser 115 120 125 aat cgc ttt tca gat gtt gcg gca gat cct gcg gca aga gag aat ttt 432 Asn Arg Phe Ser Asp Val Ala Ala Asp Pro Ala Ala Arg Glu Asn Phe 130 135 140 gct gct tca gca gta gat ttt tta aga aaa tat ggg ttt gat ggg gtc 480 Ala Ala Ser Ala Val Asp Phe Leu Arg Lys Tyr Gly Phe Asp Gly Val 145 150 155 160 gac ctt gac tgg gaa tac ccg gtt agt gga ggg ctg ccg gga aac agc 528 Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ser Gly Gly Leu Pro Gly Asn Ser 165 170 175 acc cgt ccg gag gat aag aga aac tac acg cta ctc ttg cag gat gtg 576 Thr Arg Pro Glu Asp Lys Arg Asn Tyr Thr Leu Leu Leu Gln Asp Val 180 185 190 cga gaa aag ctt gac gcc gca gaa gcg aag gat ggc aag aaa tac ttg 624 Arg Glu Lys Leu Asp Ala Ala Glu Ala Lys Asp Gly Lys Lys Tyr Leu 195 200 205 ctg acg atc gcc tcc ggc gcc agt cct gaa tat gta agc aac act gaa 672 Leu Thr Ile Ala Ser Gly Ala Ser Pro Glu Tyr Val Ser Asn Thr Glu 210 215 220 tta gat aag att gct gaa acc gtt gat tgg att aac att atg acc tat 720 Leu Asp Lys Ile Ala Glu Thr Val Asp Trp Ile Asn Ile Met Thr Tyr 225 230 235 240 gac ttt aat ggc gga tgg caa agt ata agc gca cat aat gcc cca tta 768 Asp Phe Asn Gly Gly Trp Gln Ser Ile Ser Ala His Asn Ala Pro Leu 245 250 255 ttc tat gat cca aaa gcg aaa gaa gcc ggc gtt cca aac gct gag aca 816 Phe Tyr Asp Pro Lys Ala Lys Glu Ala Gly Val Pro Asn Ala Glu Thr 260 265 270 ttt aac att gaa agc acc gtg aag cgc tac aag gaa gcc ggt gtc aaa 864 Phe Asn Ile Glu Ser Thr Val Lys Arg Tyr Lys Glu Ala Gly Val Lys 275 280 285 gcg gac aaa tta gtg ctt ggc aca ccg ttc tat ggc aga ggc tgg agc 912 Ala Asp Lys Leu Val Leu Gly Thr Pro Phe Tyr Gly Arg Gly Trp Ser 290 295 300 aat tgt gag cct gca gac aac gga gaa tat caa aaa tgc cga ccg gct 960 Asn Cys Glu Pro Ala Asp Asn Gly Glu Tyr Gln Lys Cys Arg Pro Ala 305 310 315 320 aaa gaa ggg acg tgg gaa aag ggg gta ttt gat ttt tca gat ctt gaa 1008 Lys Glu Gly Thr Trp Glu Lys Gly Val Phe Asp Phe Ser Asp Leu Glu 325 330 335 aga act aca tca ata aaa acg gat ata aaa gat att gga atg atc gag 1056 Arg Thr Thr Ser Ile Lys Thr Asp Ile Lys Asp Ile Gly Met Ile Glu 340 345 350 caa aag tgc cgt ttt tgt ata atg cgg aga atg gaa act tca tta cct 1104 Gln Lys Cys Arg Phe Cys Ile Met Arg Arg Met Glu Thr Ser Leu Pro 355 360 365 acg atg atg aag aat cat atg gat aca aaa ccg att tta att aaa tca 1152 Thr Met Met Lys Asn His Met Asp Thr Lys Pro Ile Leu Ile Lys Ser 370 375 380 aac gga tta agc ggg gct atg ttt tgg gat ttc agc ggt gat tca aat 1200 Asn Gly Leu Ser Gly Ala Met Phe Trp Asp Phe Ser Gly Asp Ser Asn 385 390 395 400 cag act ttg ctc aac aaa tta gca gcc gat tta ggg ttc gct ccg ggt 1248 Gln Thr Leu Leu Asn Lys Leu Ala Ala Asp Leu Gly Phe Ala Pro Gly 405 410 415 ggg 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Ser Asp Val Ala Ala Asp Pro Ala Ala Arg Glu Asn Phe 130 135 140 Ala Ala Ser Ala Val Asp Phe Leu Arg Lys Tyr Gly Phe Asp Gly Val 145 150 155 160 Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ser Gly Gly Leu Pro Gly Asn Ser 165 170 175 Thr Arg Pro Glu Asp Lys Arg Asn Tyr Thr Leu Leu Leu Gln Asp Val 180 185 190 Arg Glu Lys Leu Asp Ala Ala Glu Ala Lys Asp Gly Lys Lys Tyr Leu 195 200 205 Leu Thr Ile Ala Ser Gly Ala Ser Pro Glu Tyr Val Ser Asn Thr Glu 210 215 220 Leu Asp Lys Ile Ala Glu Thr Val Asp Trp Ile Asn Ile Met Thr Tyr 225 230 235 240 Asp Phe Asn Gly Gly Trp Gln Ser Ile Ser Ala His Asn Ala Pro Leu 245 250 255 Phe Tyr Asp Pro Lys Ala Lys Glu Ala Gly Val Pro Asn Ala Glu Thr 260 265 270 Phe Asn Ile Glu Ser Thr Val Lys Arg Tyr Lys Glu Ala Gly Val Lys 275 280 285 Ala Asp Lys Leu Val Leu Gly Thr Pro Phe Tyr Gly Arg Gly Trp Ser 290 295 300 Asn Cys Glu Pro Ala Asp Asn Gly Glu Tyr Gln Lys Cys Arg Pro Ala 305 310 315 320 Lys Glu Gly Thr Trp Glu Lys Gly Val Phe Asp Phe Ser Asp Leu Glu 325 330 335 Arg Thr Thr 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Gln Ala Gly Glu Ser Gly Val Trp Lys Leu Ile Gly 545 550 555 560 Asp Cys Lys <210> 3 <211> 1791 <212> DNA <213> scchi-1+signalpeptide <400> 3 atgaaaaaag tgttttcaaa caaaaagttt ctcgtttttt ctttcatttt tgcgatgatt 60 ttaagtctgt ctttttttaa tggggaaagc gcaaaagcca gttctgacaa aagttataaa 120 atcatcggct actatccgtc ctggggcgct tatggaaggg attttcaagt atgggatatg 180 gatgcttcta aagtcagcca tattaattat gcatttgctg atatttgctg ggaggggagg 240 catggaaacc ctgatccgac aggcccgaat ccccagacat ggtcttgcca ggatgaaaac 300 ggagtgattg atgttccaaa tggatcaatc gttatggggg acccatggat cgatgtgcaa 360 aagtcaaatg ccggagatac ttgggatgag ccgattcggg gcaactttaa acaactattg 420 aagctgaaaa agaaccatcc tcatttgaaa acattcatat cagttggcgg atggagttgg 480 tcaaatcgct tttcagatgt tgcggcagat cctgcggcaa gagagaattt tgctgcttca 540 gcagtagatt ttttaagaaa atatgggttt gatggggtcg accttgactg ggaatacccg 600 gttagtggag ggctgccggg aaacagcacc cgtccggagg ataagagaaa ctacacgcta 660 ctcttgcagg atgtgcgaga aaagcttgac gccgcagaag cgaaggatgg caagaaatac 720 ttgctgacga 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aaagctccat accgggccaa cgatagaagc agcaacaaac 1620 tctgatcaaa catgtgggta taacgaatgg aaagatacag ccgtctacac aggcggagac 1680 cgagtcgtct ttaacggcaa agtgtatgaa gcgaaatggt ggacgaaagg agagcagccg 1740 gatcaggctg gtgagtcggg tgtatggaaa ttaattggtg attgcaaata a 1791 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-primer <400> 4 atgaaaaaag tgttttcaa 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-primer <400> 5 ttatttgcaa tcaccaat 18

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 서열번호 3에 기재된 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
5. 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
6. 제5항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
7. 제6항의 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 제6항의 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 키티나아제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 키틴 분해능 및 키토산 분해능을 갖는 생촉매.
8. 제6항의 형질전환체를 아라비노스(arabinose)가 포함된 배지에서 배양하는 단계;
   상기 배양하는 단계에서 배양한 배양액으로부터 균체를 수득하는 과정 및 상기 수득한 균체로부터 친화성 크로마토그래피를 이용하여 재조합 키티나아제를 수득하는 과정을 포함하는 재조합 키티나아제 제조 단계; 및
   상기 재조합 키티나아제와 수용성 키토산 및 교질 키틴으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 40℃ 내지 60℃ 및 pH 4 내지 pH 6의 조건에서 반응시키는 단계;
   를 포함하는 키토산 및 키틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 가수분해물을 제조하는 방법.

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