KR20120098247A

KR20120098247A - 키메릭 베타-아가레이즈를 포함하는 재조합 벡터, 그 형질전환체 및 그 응용

Info

Publication number: KR20120098247A
Application number: KR1020110018080A
Authority: KR
Inventors: 한성옥; 현정은
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2012-09-05
Also published as: KR101367348B1

Abstract

본 발명은 해양 미생물 (Zobellia galactanivorans) 유래의 베타-아가레이즈(-agarase)의 활성 부위에 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 미생물 유래의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 (endo--1,4-glucanaseD, 1,4--D-glucan glucanohydrolase, carboxymethylcellulase, CMCase; EC 3.2.1.4)의 도커린 모듈이 합성된 유전자가 도입된 벡터 및 대장균 형질전환체에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환되어 단백질이 대장균에서 세포외로 분비되도록 만든 대장균 형질전환체에 관한 것이다.

Description

키메릭 베타-아가레이즈를 포함하는 재조합 벡터, 그 형질전환체 및 그 응용{Recombinant vector comprising chimeric beta-agarase-B, transformant comprising the same and use of the same}

본 발명은 키메릭 베타-아가레이즈를 포함하는 재조합 벡터, 그 형질전환체 및 그 응용에 관한 발명이다.

한천(agar)은 홍조류의 세포벽에서 주로 발견되는 다당류로, 일종의 식이섬유원이다. 한천은 소화 효소에 의해 분해되기 어려운 다당류이므로 영양원으로 제공되진 않으나, 혈중 콜레스테롤을 억제하고, 쓸개즙 산의 형태로 흡착 및 배설됨으로써 체내 콜레스테롤의 절대량을 감소시킬 수 있다고 알려져, 다이어트 식품으로 널리 이용되고 있다. 또한, 한천은 주로 미생물 배양을 위한 고체 배지에 사용되고, 제과, 제육가공에서는 안정제로 사용되며, 화장품이나 음식물에서는 겔화제로 사용되기도 한다.

한천은 약 70%의 아가로스(agarose)와 약 30%의 아가로펙틴(agaropectin)으로 구성되어 있다. 상기 아가로스는 중성 다당류로서, 상기 아가로스 내에는 갈락토스(galactose)간의 α-1,3 결합과 β-1,4결합이 번갈아 존재하고 있다. 한편, 아가로펙틴은 산성 다당류로서, 상기 아가로펙틴은 아가로스에 황산기, 구체적으로 황산염, 글루콘 산(gluconic acid)이나 파이루베이트(pyruvate)가 결합된 것이다.

상기 한천을 분해하는 효소인 아가레이즈는 결합을 분해하는 부위에 따라 알파-아가레이즈와 베타-아가레이즈로 구분될 수 있다. 상기 알파-아가레이즈는 아가로즈의 갈락토스 중합체 내의 α-1,3 결합을 분해하여, 아가로올리고당을 제조하며, 상기 아가로올리고당은 apoptosis 유도 활성, 항암활성(Kato, 2000), 항바이러스 활성, 항산화 활성(Chen et al., 2005; Kato, 2000), 면역조절 활성(Yoshizawa et al., 1995), 항알레르기 활성 및 항염증 활성 등을 가진다고 보고되어 있다. 또한, 상기 베타-아가레이즈는 아가로즈의 갈락토스 중합체 내의 β-1,4 결합을 분해하여 네오아가로올리고당을 제조하며, 상기 네오아가로올리고당은 세균성장 억제 (Kono et al., 1989),

항산화 활성, 전분노화 방지, 보습효과 (Kobayashi et al., 1997), 미백효과 (Kobayashi et al., 1997) 등의 효과를 가진다고 보고되어 있다.

상기 한천올리고당의 효과는 화장품, 제약 및 기능성 식품 등 다양한 산업에 적용이 가능하므로, 최근에는 아가레이즈를 이용하여 저부가가치의 한천을 고부가가치의 아가로올리고당으로 제조하는 것에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 목질계 섬유소는 식물의 세포벽의 구성 성분이며 셀룰로우즈와 헤미셀룰로우즈의 복합체로 이루어져 있다. 셀룰로우즈는 β-1,4-glucose 복합체이며 자연상태에서 가장 풍부한 재생가능한 물질이다 (Reiter et al. Curr OpinPlant Biol 5 (2002) 536-42). 비록 화학적 구성은 단순하지만 효율적으로 셀룰로우즈를 분해하기 위해서는 여러 개의 다른 효소들의 작용이 필요하다 (Ximenes et al. Hemicellulases and biotechnology. Recent Res Develop Microbiol 2 (1998) 165-176). 헤미셀룰로우즈에는 β-1.4-xylose 인 자일란과 β-1,4-glucose,mannose인 글루코만난 등이 있다. 대부분의 셀룰로우즈를 분해 할수 있는 혐기성 미생물들은 셀룰로좀이라는 효소복합체를 형성한다( Roy H. Doi, The Chemical Record 1(2001) 24-32). 셀룰로좀은 결정형 셀룰로우즈나 자일란, 만난, 펙틴과 같은 다양한 기질에 대하여 작용하고 셀룰로좀 형성 효소들과 지지체 단백질로 이루어져 있다. 셀룰로좀의 형성은 하나의 셀룰로좀 형성 효소의 도커린 모듈과 지지체 단백질의 여러개의 코히신 모듈중 하나의 결합으로 이루어진다. 모든 셀룰로좀 형성 효소들은 도커린 모듈을 가지고 있고 도커린 모듈이 없는 효소들은 비 셀룰로좀 형성 효소이다 (Bayer et al. Annual Review of Microbiol 58 (2004)521-554).

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 한천 분해 효소 복합체 형성이 가능한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한천 분해 효소 복합체 형성이 가능한 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 한천 분해 효소 복합체를 형성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 한천 분해 효소 복합체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 섬유소 분해효소의 도커린 모듈의 유전자와 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 키메릭 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pET22(+)cAgaB를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 베타-아가레이즈 유전자는 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 1에 기재된 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 1에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 베타-아가레이즈 유전자에 포함된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서 상기 도커린 모듈의 유전자는 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 2에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 도커린 모듈 유전자에 포함된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서 상기 재조합 벡터는 도 2에 기재된 개열지도를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환체는 DH5α(cAgaB)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 상술한 섬유소 분해효소의 도커린 모듈의 유전자와 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 키메릭 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 대장균에 형질전환한 형질 전환체를 개발하여 이를 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 유림빌딩 소재 한국미생물보존센터(KCCM)에 2011년 1월 7일 E.coli DH5α(cAgaB) 기탁번호 KCCM11164P로 기탁하였다.

또한 본 발명은 클로스트리디움 유래의 셀룰로보란스의 기본 골격 소단위체 (primary scaffolding subunit)인 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Cellulose-binding protein A) 중 셀룰로즈 결합 모듈 (Cellulose binding module; CBM)과 두 개의 코히즌 모듈(Cohesin module)을 가진 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Mini-Cellulose-binding protein A) 유전자를 포함하는 재조합벡터 pET22b(+)mCbpA를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 셀룰로즈 결합 모듈 (Cellulose binding module; CBM)의 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 3에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 셀룰로즈 결합 모듈 유전자에 포함된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 두 개의 코히즌 모듈(Cohesin module)의 유전자는 서열번호 4 또는 5에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 4 또는 5에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 코히즌 모듈 유전자에 포함된다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체로부터 분리된 키메릭 베타-아가레이즈와 상기 본 발명의 또 다른 형질전환체로부터 분리된 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Mini-Cellulose-binding protein A)를 혼합하여 한천 분해 효소 복합체를 형성하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체로부터 분리된 키메릭 베타-아가레이즈와 상기 본 발명의 또 다른 형질전환체로부터 분리된 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Mini-Cellulose-binding protein A)를 혼합하여 한천 분해 효소 복합체를 제공한다.

본 발명의 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,NB배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 본 발명의 목적하고자 하는 단백질을 균체 내에 축적시키고, 회수한다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필--D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

본 발명의 단백질의 취득은, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅 등에 의해 행할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 클로스트리디움 속 균주로부터의 섬유소 분해 효소 복합체 (셀룰로좀) 시스템을 응용하여 엔도글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈을 해양 미생물 (Zobellia galactanivorans) 유래의 베타-아가레이즈(-agarase)의 활성 부위에 연결된 키메릭-베타-아가레이즈 cAgaB 유전자를 대장균에 도입하였다. 이후, 상기 키메릭-베타-아가레이즈 유전자가 상기 대장균 균주에서 높은 수준으로 발현되어 분비되는 것을 확인하였다. 본 발명에 따라 한천 분해 효소 복합체 형성이 가능한 대장균 형질전환체 및 상기 유전자로부터 발현되는 한천 분해 효소는 식품, 화장품, 의약 산업 등에 유용하게 사용될 수 있고 특히 해양 바이오매스를 이용한 바이오 에너지 생산을 위한 동시당화발효 융합공정(SSF, simulateous saccharification and fermentation 혹은 consolidated bioprocessing)에 매우 유용한 발명인 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에서 키메릭 베타-아가레이즈 유전자와 소형 골격 단백질 유전자의 설계를 나타내는 모식도로, (A) Chimeric Agarase의 OverlapPCR을 통한 유전자 설계 그림
(B) 소형 골격 단백질의 유전자를 보여주는 설계 모식도
도 2는 본 발명에서 제시된 키메릭 베타-아가레이즈-비 유전자와 소형 골격 단백질 miniCbpA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pET22(+)cAgaB 와 pET22b(+)mCbpA의 모식도이며
도 3은 본 발명에서 제시된 재조합 벡터 pET22(+)cAgaB가 삽입된 대장균의 콜로니와 배양 농축액의 SDS-PAGA를 통한 Zymogram에서의 효소활성을 보임으로 배양액으로의 효소분비를 확인한 그림 및 pET22b(+)mCbpA가 삽입된 대장균의 배양액의 SDS-PAGE 와 His-tag 이용 정제에서 단백질을 확인한 그림으로, (A) 키메릭 아가레이즈 cAgaB (AgaB-Doc)의 자이모그램 및 할로 분석, (B) 스카폴딩 단백질 miniCbpA 의 His-태그 이용한 정제 및 발현의 전기영동분석을 나타냄. [M] 분자량 마커, [1~4] 용출 분획
도 4는 본 발명에서 발현한 효소들의 발현 및 결합을 섬유소 이용 정제 방법과 웨스턴블랏 기법으로 확인한 그림이다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 섬유소 분해효소의 도커린 모듈의 유전자, 베타- 아가레이즈 유전자의 증폭

한천 분해 효소 복합체 형성을 위한 섬유소 분해효소의 도커린 모듈의 유전자를 클로닝하기 위하여 클로스트리디움 셀룰로보란스의 지노믹디엔에이로부터 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 염기서열을 참고로 하여 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 키메릭 베타-아가레이즈 AgaB 유전자의 C-terminal 부분의 10bp 크기의 서열이, 역방향프라이머(Reverse primer)의 5'에는 제한효소 Not 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. 이후 상기 합성된 프라이머[5'TGTAGAGAAAGGATCCGCTGGCTCCG3'(서열번호 6) 및 5'GCGCGGCCGC TCAATGATGATGATGATGATGTAAAAGCATTTTTTTAAG3'(서열번호 7)]를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 212 bp의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.

조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 키메릭 베타-아가레이즈 AgaB 유전자를 클로닝하기 위하여 조벨리아 갈락토니보란스의 지노믹디엔에이로부터 시그널 펩타이드 부분을 제외한 염기서열을 참고로 하여 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 제한효소 SacI, 역방향프라이머(Reverse primer)의 5'에는 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 N-terminal 부분의 10bp 크기의 서열이 각각 삽입된 프라이머[5'GCGCGAGCTCCGGCGACAATTCAAAATTTGATA3'(서열번호 8) 및 5'CAGCGGATCCTTTCTCTACAGGTTTATAGATC3'(서열번호 9)]를 합성하였다. 이후, 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 1005bp의 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 베타-아가레이즈 AgaB 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.

그리고 클로스트리디움 유래의 셀룰로보란스의 기본 골격 소단위체 (primary scaffolding subunit)인 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Cellulose-binding protein A) 중 셀룰로즈 결합 모듈 (Cellulose binding module; CBM)과 두 개의 코히즌 모듈(Cohesin module)을 가진 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Mini-Cellulose-binding protein A) 유전자를 클로닝하기 위해 염기서열을 참고로 하여 정방향 프라이머 (Forward primer)의 5'에는 제한효소 EcoRI, 역방향 프라이머(Reverse primer)에는 제한효소 NotI 인식서열이 각각 삽입된 프라이머[5'GCGCGAATTCGCAGCGACATCATCAAT3'(서열번호 10) 및 5'GCGCGGCCGCTATAGGATCTCCAATATT3'(서열번호 11)]를 합성하였다. 그 결과 1647bp의 클로스트리디움 유래의 셀룰로보란스의 셀룰로즈-결합 단백질-에이 유전자의 일부인 mCbpA 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.

실시예 2: 섬유소 분해효소의 도커린 모듈의 유전자와 베타-아가레이즈 유전자의 연결 및 클로닝

상기 실시예 1에서 얻은 섬유소 분해효소의 도커린 모듈의 유전자와 AgaB 증폭산물을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였고 아가로스 겔 상의 DNA 절편은 Gel extraction kit (GeneAll)를 사용하여 회수하였다.

그 후 섬유소 분해효소의 도커린 모듈의 유전자와 베타-아가레이즈 유전자의 연결하기 위해 회수한 DNA 절편을 이용하여 오버렙(Overlap) PCR 반응을 수행하였다. 회수한 두 DNA 절편으로부터 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 제한효소 SacI, 역방향프라이머(Reverse primer)의 5'에는 제한효소 NotI 인식서열이 삽입되도록 프라이머[5'GCGCGAGCTCCGGCGACAATTCAAAATTTGATA3'(서열번호 12) 및 5'GCGCGGCCGC TCAATGATGATGATGATGATGTAAAAGCATTTTTTTAAG3'(서열번호 13]를 디자인하여 합성하였다. PCR 반응을 수행하여서 그 결과 1225bp의 섬유소 분해효소의 도커린 모듈의 유전자가 연결된 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 키메릭 베타-아가레이즈 AgaB 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.

그 후, 키메릭 베타-아가레이즈 AgaB 유전자는 SacI과 NotI으로 절단한 후 대장균 발현 벡터(E.coli expression vector)인 pET22b(+)에 라이게이션(ligation)시켜 에스세리시아 콜라이 (대장균, E.coli) DH5에 형질전환을 하였다. 이어 형질전환체로부터 라이게이션(ligation)된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 pET22(+)cAgaB라 명명하였고 도면 2에 도시하였다. 그리고 상기 대장균 형질전환체를 DH5/cAgaB라 명명하였다.

실시예 3: 대장균 형질전환체의 아가레이즈 활성 측정

상기 실시예 2에서 확보한 형질전환체의 효소 단백질 발현을 확인하기 위하여, 배지상에서 효소 활성대(halo) 측정, SDS-PAGE, Zymogram을 실행하였다.

대장균 형질전환체를 IPTG로 발현 유도하여 키매릭 AgaB 효소 단백질이 배양액으로 분비되도록 하는 조건을 조성하여 30℃에서 5시간 동안 진탕배양 후 원심분리하여 상등액을 준비하고 농축하여(Millipore, amicon 10kDa cut off) cAgaB 효소 단백질을 얻었다.

효소활성대(halo)를 확인하기 위해 LB한천배지를 효소반응의 기질로 사용하였다. 형질전환된 대장균의 콜로니를 LB 배지에 접종하여 24시간 동안 37℃에서 배양하고, IPTG를 함유한 LB 액상배지에서 5시간 동안 37℃에서 배양한 배양액을 농축하여 얻은 효소 단백질을 LB 한천배지에 올려 흡수시킨 후 50℃에서 24시간 반응시켰다. 0.25% Lugol solution으로 5분간 염색 후 D.W 로 여러 번 헹구어낸 후 효소활성대(halo)를 확인하였고 그 결과를 각각 도면 3-A에 도시하였다.

SDS-PAGE는 10% poly-acrylamide gel과 0.3% Agarose를 녹인 poly-acrylamide gel을 사용하여 효소 단백질을 전기영동하였다. 그 후에 정확한 위치에서의 효소발현을 확인하기 위하여 Zymogram을 실행하였고 이를 실시하기 위해 기질이 첨가된 renature buffer(100mM Succiniate, 10mM CaCl₂,1mM dTT)에 2시간 동안 1시간 마다 renature buffer를 갈아준 후 50℃에서 3시간 반응시켰다. 반응이 끝난 겔을 0.1% Lugol solution으로 5분간 염색 후 D.W. 로 수차례 헹구어내어 cAgaB 단백질 사이즈와 동일한 위치에서 효소활성대(halo)를 확인할 수 있었다. 이 결과를 도면 3-A에 도시하였다.

실시예 4:효모 형질전환체의 소형 셀룰로즈 -결합 단백질 발현

도커린 모듈이 연결된 키메릭-아가레이즈의 복합체 형성을 확인하기 위하여, 소형 셀룰로즈-결합 단백질이 가진 셀룰로스-결합 모듈(Cellulse binding module; CBM)과 셀룰로즈 사이의 상호작용을 이용한 단백질 정제를 실행하였다.

pET22b(+)mCbpA를 발현 유도하여 mCbpA 단백질이 배양액으로 분비되도록 하는 조건을 조성하여 LB 배지에 접종하여 24시간 동안 37℃에서 배양하고, IPTG를 함유한 LB 액상배지에서 5시간 동안 37℃에서 배양한 상등액을 준비하고 농축하여(Millipore, amicon 10kDa cut off) mCbpA 소형 셀룰로즈-결합 단백질을 얻었다.

셀룰로스-결합 모듈(Cellulse binding module; CBM)과 셀룰로즈 사이의 상호작용을 이용한 단백질 정제를 위해 셀룰로즈 (Sigmacell Type 50, SIGMA) 를 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 후 1몰 소듐 클로라이드(sodium chloride) 0.02몰 트리스 버퍼 (pH 8.0)로 세 번 헹구어낸 후 0.05 몰 트리스 버퍼 (pH 12.5)로 용리하였다. 이의 SDS-PAGE는 10% poly-acrylamide gel을 사용하여 효소 단백질을 전기영동하였다. 그 결과 58kDa위치에 단백질 밴드를 확인하였다. 이 결과를 도면 3-B에 도시하였다.

실시예 5:한천 분해 효소 복합체 형성의 확인

엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 연결된 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 키메릭 베타-아가레이즈 cAgaB와 소형 셀룰로즈-결합 단백질 mCbpA의 결합으로 인한 복합체의 형성을 확인하기 위해 두 단백질을 저온에서 일정 비율로 섞어 배양한 후 복합체 형성 여부를 확인하기 위해 우선 셀룰로스-결합 모듈(Cellulse binding module; CBM)과 셀룰로즈 사이의 상호작용을 이용한 단백질 정제 후에 Western-blotting을 통해 분석한. Western-blotting은 anti-His-tag primary antibody (ELPIS)와 goat anti-rabbit HRP conjugated(Santacruz) secondary antibody를 사용하였고 luminol reagent(Santacruz)로 효소 단백질의 발현을 확인하였다. 이 결과를 도면 4에 도시하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11164P

20110107

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Recombinant vector comprising chimeric beta-agarase-B, transformant comprising the same and use of the same <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1005 <212> DNA <213> Zobellia galactanivorans <400> 1 ggcgacaatt caaaatttga tagtgcaacg gatttgccgg ttgaacaaga acaagaacag 60 gaaacggaac aagagggaga acccgaagaa agttcggagc aagaccttgt cgaggaggtc 120 gattggaagg atattcccgt acccgccgat gcaggaccga atatgaagtg ggagtttcaa 180 gagatttccg ataattttga atatgaggcc cctgcggata ataaggggag tgaatttctc 240 gaaaagtggg acgattttta tcacaatgcc tgggcaggcc cagggctgac cgaatggaaa 300 cgggacaggt cctatgtagc cgatggcgag ctaaagatgt gggcgacaag aaaaccgggc 360 tccgataaaa taaacatggg gtgcattact tctaagaccc gagtggtcta tcctgtttat 420 attgaagcaa gggcaaaggt catgaactct accttggctt cggatgtttg gctcttaagt 480 gccgatgaca cccaagagat agatattcta gaggcatatg gggccgatta ttccgaaagt 540 gccggaaagg atcattccta tttttctaaa aaggtacaca taagccatca cgtctttatt 600 cgagacccat ttcaagatta tcaaccaaag gatgccggtt cttggttcga agacggcacc 660 gtctggaaca aagagttcca taggtttggt gtgtattgga gggatccatg gcatctagaa 720 tattacatag acggtgttct ggtgaggacc gtttcgggaa aggacattat cgaccccaaa 780 cactttacga atacaacgga tcccggtaat acggaaatcg atacccgcac cggtctcaat 840 aaagaaatgg atattattat caatacagaa gaccaaactt ggcggtcttc accggcctcg 900 ggtttacagt ctaataccta tacgccaacg gacaatgaat tgagcaatat agaaaacaat 960 acgttcgggg tcgattggat caggatctat aaacctgtag agaaa 1005 <210> 2 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dockerin <400> 2 gatgttaaca aagatggaaa ggtaaatgct atcgattatg cagtgcttaa atcaattctt 60 ttaggtacaa atactaacgt tgatttatca gtatcagaca tgaataagga tggtaaagta 120 aatgctttgg atttagctgt tcttaaaaaa atgctttta 159 <210> 3 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM <400> 3 gttgaatttt acaactctaa caaatcagca caaacaaact caattacacc aataatcaaa 60 attactaaca catctgacag tgatttaaat ttaaatgacg taaaagttag atattattac 120 acaagtgatg gtacacaagg acaaactttc tggtgtgacc atgctggtgc attattagga 180 aatagctatg ttgataacac tagcaaagtg acagcaaact tcgttaaaga aacagcaagc 240 ccaacatcaa cctatgatac atatgttgaa tttgga 276 <210> 4 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cohesin <400> 4 gtaacagcta caattggaaa agtacaagta aatgctggag aaacggtagc agtaccagtt 60 aacttaacaa aagttccagc agctggttta gcaacaattg aattaccatt aacttttgat 120 tctgcatcat tagaagtagt atcaataact gctggagata tcgtattaaa tccatcagta 180 aacttctctt ctacagtaag tggaagcaca ataaaattat tattcttaga tgatacatta 240 ggaagccaat taatcactaa ggatggagtt tttgcaacaa taacatttaa agcaaaagct 300 ataactggaa caactgcaaa agtaacttca gttaaattag ctggaacacc agtagttggt 360 gatgcgcaat tacaagaaaa accttgtgca gttaacccag gaacagtaac tatcaat 417 <210> 5 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cohesin <400> 5 atgcaaattt cagttggaac agcaacagta aaagctggag aaatagcagc agtgccagta 60 acattaacaa gtgttccatc aactggaata gcaactgctg aagcacaagt aagttttgat 120 gcaacattat tagaagtagc atcagtaact gctggagata tcgtattaaa tccaacagta 180 aacttctctt atacagtaaa cggaaatgta ataaaattat tattcctaga tgatacatta 240 ggaagccaat taattagtaa agatggagtt tttgtaacaa taaacttcaa agcaaaagct 300 gtaacaagca cagtaacaac accagttaca gtatcaggaa cacctgtatt tgcagatggt 360 acattagcag aagtacaatc taaaacagca gcaggtagcg ttacaata 408 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgtagagaaa ggatccgctg gctccg 26 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcgcggccgc tcaatgatga tgatgatgat gtaaaagcat ttttttaag 49 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcgcgagctc cggcgacaat tcaaaatttg ata 33 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cagcggatcc tttctctaca ggtttataga tc 32 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcgcgaattc gcagcgacat catcaat 27 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gcgcggccgc tataggatct ccaatatt 28 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gcgcgagctc cggcgacaat tcaaaatttg ata 33 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gcgcggccgc tcaatgatga tgatgatgat gtaaaagcat ttttttaag 49

Claims

섬유소 분해효소의 도커린 모듈의 유전자와 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 키메릭 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서 상기 베타-아가레이즈 유전자는 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 재조합 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서 상기 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가지는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서 상기 도커린 모듈의 유전자는 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서 상기 재조합 벡터는 도 2에 기재된 개열지도를 가지는 재조합 벡터.
제 1항의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 6항에 있어서, 상기 형질전환체는 E.coli DH5α(cAgaB) 기탁번호 KCCM11164P인 형질전환체.
클로스트리디움 유래의 셀룰로보란스의 기본 골격 소단위체 (primary scaffolding subunit)인 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Cellulose-binding protein A) 중 셀룰로즈 결합 모듈 (Cellulose binding module; CBM)과 두 개의 코히즌 모듈(Cohesin module)을 가진 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Mini-Cellulose-binding protein A) 유전자를 포함하는 재조합벡터.
제 8항에 있어서, 상기 셀룰로즈 결합 모듈 (Cellulose binding module; CBM)의 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 재조합 벡터.
제 8항에 있어서, 상기 두 개의 코히즌 모듈(Cohesin module)의 유전자는 서열번호 4 또는 서열번호 5에 기재된 염기서열을 가지는 재조합 벡터.
제6항 또는 제7항의 형질전환체로부터 분리된 키메릭 베타-아가레이즈와 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체로부터 분리된 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Mini-Cellulose-binding protein A)를 혼합하여 한천 분해 효소 복합체를 형성하는 방법.
제6항 또는 제7항의 형질전환체로부터 분리된 키메릭 베타-아가레이즈와 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체로부터 분리된 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Mini-Cellulose-binding protein A)를 혼합하여 형성된 한천 분해 효소 복합체.